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Aug 21, 2023

Ärzte sind möglicherweise jetzt in der Lage, COVID zu erkennen

In COVID-19, Abteilung für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik, vorgestellt,

In COVID-19, Fakultät für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik, Featured, News, Forschung & Innovation 17. Dezember 2021

Z. Hugh Fan, Ph.D., Professor an der Fakultät für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik des Herbert Wertheim College of Engineering

Für diejenigen, die während der bevorstehenden Grippesaison einen Arztbesuch oder eine Klinik aufgesucht haben, ist die größte Sorge, ob ihre Symptome auf den am Arbeitsplatz verbreiteten Pilz oder auf eine mögliche COVID-19-Infektion hinweisen. Während sich Forscher darum bemühen, dieses Virus – und seine unvermeidlichen Varianten und Mutationen – zu behandeln, besteht eine der größten Herausforderungen darin, die Ursache der Krankheit schnell und genau zu diagnostizieren, damit die richtigen Behandlungsprotokolle angewendet werden können, und zwar rechtzeitig, um die Wahrscheinlichkeit einer potenziell gefährlichen Erkrankung zu verringern Komplikationen.

Unter der Leitung von Z. Hugh Fan, Ph.D., Professor am Fachbereich Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik des Herbert Wertheim College of Engineering, und Dr. John Lednicky, Forschungsprofessor am Fachbereich Umwelt und Global des College of Public Health and Health Professions Health, ein interdisziplinäres Team an der University of Florida, hat einen bahnbrechenden Diagnosetest für SARS-CoV-2 entwickelt, der schnell, zuverlässig und kostengünstig ist und in der Lage ist, zwischen COVID-19 und Influenza zu unterscheiden.

(Oben) Darstellung des kugelbasierten Ventilmechanismus, der einem Kugelschreiber ähnelt, bei dem Tinte auf das Papier verteilt wird, wenn beim Schreiben auf die Metallkugel an der Spitze gedrückt wird. Das Ventil ist geschlossen, wenn die Kugel als Stopfen für den Brunnen oben fungiert. Das Ventil wird durch den Stift in der Einheit an der Unterseite geöffnet, der die Kugel anhebt, wenn der Stift nach dem Gleiten mit der Kugel ausgerichtet ist, wodurch das Reagenz freigesetzt wird. (Mitte) Eine Probe wird in die untere Vertiefung eingeführt, anschließend wird die untere Vertiefung verschoben, um eine sequentielle Abgabe von 4 Reagenzien für die Viruslyse und RNA-Isolierung/-Reinigung zu ermöglichen. (Unten) Kolorimetrischer Nachweis mit Hilfe einer UV-Taschenlampe und die Gesamtzeit von der Probe bis zur Antwort in 50 Minuten.

Fan und sein Team demonstrierten die Fähigkeit, zwei Viren in 50 Minuten zu erkennen, ohne sperrige oder hochentwickelte Laborausrüstung oder Stromversorgung zu benötigen, und mit einer Nachweisempfindlichkeit, die der des Goldstandards RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain) ebenbürtig ist Reaktion)-Assay, der von der Weltgesundheitsorganisation und den Centers for Disease Control and Prevention empfohlen wird. Die Bemühungen werden von den National Institutes of Health unterstützt.

„Im Hinblick auf die Patientenversorgung ist diese innovative Sample-to-Answer-Plattform in mehrfacher Hinsicht eine wichtige Weiterentwicklung des bestehenden RT-PCR-Standards“, sagte Dr. Fan. „Was die Diagnose betrifft, beträgt die Bearbeitungszeit am Testort weniger als eine Stunde, verglichen mit ein bis zwei Tagen in einem externen Testlabor.“

Explosionszeichnung des Geräts bestehend aus 3 Komponenten, darunter einer Puffereinheit oben, einer Mischeinheit in der Mitte und der Detektionseinheit unten. Die Puffereinheit enthält auf jeder Seite 4 Vertiefungen zur Aufbewahrung eines Lysepuffers, eines Bindungspuffers und 2 Waschpuffer zur Probenvorbereitung. In jeder Vertiefung der Puffereinheit befindet sich am Boden eine Edelstahlkugel, die als Ventil fungiert. Die Mischeinheit verfügt auf jeder Seite über eine Mulde und wird durch die Gleitschienen auf beiden Seiten und in der Mitte unter die Puffereinheit geschoben. Die Detektionseinheit enthält ein Papierpad, das zwischen zwei thermoplastischen Folien laminiert und mit einem doppelseitigen Klebeband an der Wellschicht befestigt ist.

Das von UF entwickelte Gerät wurde kürzlich zur Peer-Review in ACS Sensors veröffentlicht, der Flaggschiff-Zeitschrift der American Chemical Society mit Schwerpunkt auf Sensorwissenschaft.

RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) ist ein Assay zum Nachweis viraler RNA. Die Methodik für RT-LAMP basierte auf dem Mechanismus hinter der automatisch zyklischen Strangverdrängungs-DNA-Synthese. Eine Polymerase führt die Reaktion durch und die Polymerase weist eine hohe Strangverdrängungsaktivität auf. Es werden auch zwei Primerpaare verwendet, ein inneres und ein äußeres Primerpaar. Diese Primer sind speziell für die Reaktion konzipiert. RT-LAMP erreicht aufgrund der Zielsequenzen eine hohe Spezifität. Im Gegensatz zu anderen Technologien erkennt RT-LAMP die Zielsequenz zu Beginn anhand von sechs unabhängigen Sequenzen, was ihr eine hohe Spezifität verleiht. Die Primererkennung des Zielgenoms führt zu einer starken kolorimetrischen Reaktion, die einen Nachweis ohne hochspezialisierte oder kostspielige Instrumente ermöglicht.

„Die RT-LAMP-Technologie hat zahlreiche Vorteile gegenüber der Standard-RT-PCR“, sagte Dr. Lednicky. „Die Kosten für Reagenzien sind im Vergleich zu einer gleichwertigen RT-PCR-Reaktion niedrig, Ergebnisse werden schneller erhalten und der Gerätebedarf für RT-LAMP ist gering, was ein großer Vorteil für Anwender in ressourcenarmen Ländern oder für den Einsatz in Arztpraxen ist.“ und Kliniken. Außerdem nehmen verpackte RT-LAMP-Reaktionen im Kit-Format nur wenig Lagerplatz ein und können gefriergetrocknet werden, wodurch die Notwendigkeit einer Gefrierlagerung entfällt.“

Foto eines zusammengebauten Geräts, bei dem die Mischeinheit in die zweite Mulde von links gleitet und die Kugeln dort anhebt. (Einschub) Draufsichtbild einer Detektionseinheit, das eine Vertiefung für die RNA-Isolierung und RT-LAMP zeigt.

Die Probe – je nach Test Abstrich, Urin, Speichel, Blut – wird entnommen und eine bestimmte Menge in die erste Kammer des Probenaufarbeitungsgeräts überführt. Anschließend wird die Probe spezifischen Flüssigkeiten ausgesetzt, die DNA oder RNA aus dem Krankheitserreger extrahieren, das extrahierte Material reinigen und in einer abnehmbaren Filtereinheit sammeln. RT-LAMP-Chemikalien werden in die abnehmbare Einheit gegeben, die Kammer mit den RT-LAMP-Flüssigkeiten wird mit Klebeband versiegelt und die letzte Einheit wird abgenommen und in eine mikrochipgesteuerte „Kaffeetasse“ gestellt, die auf eine bestimmte Temperatur vorgeheizt wird . Nach einer ausgewählten Inkubationszeit werden die Ergebnisse ermittelt und durch einen Farbumschlag angezeigt, der visuell erkennbar ist oder auch durch den Grad der Fluoreszenz erkannt/gemessen werden kann.

Durch die Verwendung von Einweggeräten im Einwegformat kann das Gerät von Krankenschwestern, Ärzten und anderen Personen verwendet werden, ohne dass eine fortgeschrittene Schulung erforderlich ist. Die Ergebnisse, ob positiv oder negativ, können visuell oder mit Hilfe einfacher Technologien wie einer Taschenlampe ermittelt werden. Die Ergebnisse können aufgezeichnet werden, indem ein iPhone oder ein ähnliches, mit einer Kamera ausgestattetes mobiles Gerät verwendet wird, um das Bild aufzunehmen, wo es zur Bestätigung der Daten an einen entfernten Standort gesendet wird.

„Unterm Strich ermöglicht das Gerät eine schnellere Analyse des genetischen Materials als herkömmliche RT-PCR und wurde erfolgreich beim Nachweis des SARS-CoV-2-Virus eingesetzt“, sagte Dr. Lednicky. „Es ist einfach, kostengünstig und erfordert keine fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten oder teure Ausrüstung. Am wichtigsten ist, dass es sehr empfindlich ist und Nachweisempfindlichkeiten liefert, die in einigen Fällen zehnmal empfindlicher sind als Standard-RT-PCR-Assays.“

Der gleichzeitige Test von SARS-CoV-2- und Influenzaviren ist derzeit nicht am Point-of-Care (POC) verfügbar, seine Varianten sind jedoch in Testlabors erhältlich und würden wahrscheinlich als „CLIA-freigestelltes“ Gerät betrachtet , zu dem auch von der FDA zugelassene Heimtests gehören. „Das Gerät könnte auch für Umweltstudien (SARS-CoV-2 in Luft, Abwasser oder anderen Matrizen) verwendet werden und kann mit anderen Erkennungsgeräten wie Luftprobenehmern verbunden/gepaart werden“, sagte Dr. Fan.

Fotos einer handelsüblichen, batteriebetriebenen Kaffeetasse, die als Wasserbad für die isotherme Verstärkung verwendet wird. (links) Die geöffnete Kaffeetasse enthält Detektionseinheiten in einem Wasserbad. Ein Bild der Erkennungseinheit ist im Einschub über dem Becher zu sehen. (rechts) Kaffeebecher ist während der RT-LAMP-Amplifikation bei 62,5 °C geschlossen.

Die Entwicklung dieses LAMP-basierten Geräts folgt auf die fortschreitenden Fortschritte der UF-Forscher bei der Früherkennung und Identifizierung gefährlicher Krankheitserreger. Vor drei Jahren leiteten Dr. Fan und Dr. Lednicky mit finanzieller Unterstützung des Staates Florida ein Forschungsteam, das ein schnelles, kostengünstiges miniaturisiertes Gerät zum Nachweis des durch Mücken übertragenen Zika-Virus entwickelte, das keine Symptome zeigt bis zu 80 Prozent der Infizierten. Die Point-of-Care-Testplattform kann zum Screening asymptomatischer Patienten vor Ort eingesetzt werden, um Fehldiagnosen zu mildern und eine weitere Übertragung zu verhindern.

Letztes Jahr entwickelten Ingenieure der Abteilung für Umweltingenieurwissenschaften an der Engineering School of Sustainable Infrastructure & Environment (ESSIE) unter der Leitung von Dr. Chang-Yu Wu einen neuartigen Virus-Aerosol-Probenehmer, der in der Luft befindliche Viren (einschließlich COVID-19) effizient sammelt – Informationen, anhand derer Gesundheitsdienstleister Risikobereiche lokalisieren und Verbesserungsmaßnahmen ermitteln können. Die Integration des neuen Probenehmers mit dem RT-LAMP-Gerät könnte möglicherweise über die Testbereiche hinaus in allgemeine öffentliche Bereiche (z. B. Flughäfen, U-Bahnen, Regierungsgebäude, Einkaufszentren) gelangen und so frühzeitig vor in der Luft befindlichen pathogenen Viren warnen und so dazu beitragen, deren Ausbreitung einzudämmen.