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Oct 24, 2023

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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 798 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Respiratory Syncytial Virus (RSV), das humane Metapneumovirus (HMPV) und das humane Parainfluenzavirus Typ eins (HPIV1) und drei (HPIV3) können bei immungeschwächten Patienten, älteren Menschen und Patienten mit einer zugrunde liegenden Lungenerkrankung schwere Erkrankungen und den Tod verursachen. Für RSV gibt es einen schützenden monoklonalen Antikörper, der klinische Einsatz ist jedoch auf Hochrisiko-Säuglingspopulationen beschränkt. Daher sind die Therapieoptionen für diese Viren bei gefährdeten Patientengruppen derzeit begrenzt. Hier präsentieren wir die Entdeckung, In-vitro-Charakterisierung und In-vivo-Wirksamkeitsprüfung von zwei kreuzneutralisierenden monoklonalen Antikörpern, von denen einer sowohl gegen HPIV3 als auch HPIV1 und der andere sowohl gegen RSV als auch HMPV gerichtet ist. Der 3×1-Antikörper ist in der Lage, mehrere Parainfluenzaviren anzugreifen; Der MxR-Antikörper weist Merkmale mit anderen zuvor beschriebenen monoklonalen Antikörpern auf, die sowohl RSV als auch HMPV neutralisieren können. Mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie haben wir Strukturen dieser Antikörper im Komplex mit ihren Antigenen mit einer Auflösung von 3,62 Å für 3 × 1, gebunden an HPIV3, und bei 2,24 Å für MxR, gebunden an RSV, erhalten, was eine strukturelle Grundlage für die In-vitro-Bindung und Neutralisierung darstellt. Zusammen könnte ein Cocktail aus 3 × 1 und MxR einen klinischen Nutzen haben, indem er einen umfassenden Schutz gegen vier der Atemwegsviren bietet, die bei gefährdeten Personen eine erhebliche Morbidität und Mortalität verursachen.

Atemwegsviren sind weltweit eine der Haupttodesursachen, mit schätzungsweise 2,7 Millionen Todesfällen im Jahr 20151. Während ein Impfstoff zur Verhinderung einer RSV-Infektion möglicherweise in Sicht ist2,3, sind schützende Impfstoffe für HMPV, HPIV3 und HPIV1 noch nicht klinisch verfügbar. Selbst wenn es schützende Impfstoffe für diese vier Atemwegsviren gäbe, wird durch die Impfung stark immungeschwächter Personen nur selten eine schützende Immunität erreicht. Darüber hinaus sind Impfungen vor immunablativen Therapien oft unwirksam oder lassen schnell nach, sodass kein dauerhafter Schutz aufrechterhalten werden kann4,5,6. Zusammengenommen stellen RSV, HMPV, HPIV1 und HPIV3 eine ernsthafte Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar und waren vor der COVID-19-Pandemie für die Mehrzahl der viralen Infektionen der unteren Atemwege bei Empfängern von hämatopoetischen Stammzelltransplantaten verantwortlich7,8. Bei Erwachsenen mit anderen Risikofaktoren ist die Krankheitslast durch HMPV und die Parainfluenzaviren ebenfalls vergleichbar mit RSV9,10. Darüber hinaus machen RSV, HMPV und die Parainfluenzaviren mit Ausnahme der Rhinoviren zusammengenommen auch die meisten Atemwegsviren aus, die vor 2020 bei hospitalisierten Erwachsenen identifiziert wurden11,12.

Während Eindämmungsstrategien während der COVID-19-Pandemie wie Maskierung, soziale Distanzierung und Schließungen zu einem Rückgang der Fälle anderer Atemwegsviren während der Erkältungs- und Grippesaison 2020–2021 führten, beginnen die Fälle von RSV, HMPV und HPIVs zu sinken Es wird erwartet, dass die Zirkulation in den nächsten Jahren wieder das Niveau vor der Pandemie erreicht9,10. Tatsächlich prognostizieren Modelle in der Zukunft große Ausbrüche von Nicht-SARS-CoV-2-Atemwegsviren aufgrund einer Zunahme der anfälligen Bevölkerung nach einer Zeit reduzierter Ausbreitung13. Da endemische Atemwegsviren dazu neigen, saisonal zu zirkulieren, können außerdem Koinfektionen mit mehr als einem Atemwegsvirus auftreten, die in gefährdeten Bevölkerungsgruppen mit schlechteren Folgen verbunden sind14,15,16.

Die Verabreichung neutralisierender monoklonaler Antikörper (mAbs) stellt eine wirksame Alternative zur Impfung zum Schutz vor Virusinfektionen dar. Obwohl der Anti-RSV-mAb Palivizumab 1998 von der FDA zur Prophylaxe bei Hochrisiko-Säuglingen zugelassen wurde17, bleibt er bei älteren immungeschwächten Kindern oder Erwachsenen relativ ungenutzt. Seit der Zulassung von Palivizumab wurden noch wirksamere mAbs gegen RSV in klinischen Studien getestet, mit dem vorrangigen Ziel, Palivizumab als Standardbehandlung zur Prophylaxe bei Hochrisiko-Säuglingen zu ersetzen. Dieser Fokus wurde zum Teil dadurch vorangetrieben, dass RSV bis zu 80 % der Bronchiolitis bei Säuglingen verursacht18,19. Bei immungeschwächten Erwachsenen ist die Atemwegsviruslandschaft jedoch viel heterogener7,8. Daher muss eine wirksame Strategie zur Reduzierung der Gesamtbelastung durch das breite Spektrum an Infektionen der unteren Atemwege bei gefährdeten Erwachsenen und immungeschwächten Patienten auf der gleichzeitigen Bekämpfung mehrerer Viren und nicht auf einem einzelnen Virus basieren. Trotz der Fortschritte in der Forschung zur RSV-Prävention ist die Rolle der passiven Immunisierung gegen andere Atemwegsviren nach wie vor unklar und in der Klinik sind derzeit keine mAbs verfügbar, die eine HMPV-, HPIV1- oder HPIV3-Infektion verhindern können.

Um effizient einen breiteren Schutz gegen diese Viren zu erreichen, haben wir versucht, kreuzneutralisierende mAbs zu identifizieren, die auf mehr als einen Virus gleichzeitig abzielen können. RSV, HMPV, HPIV3 und HPIV1 produzieren alle Fusionsproteine ​​(F) der Klasse I, bei denen es sich um essentielle Oberflächenglykoproteine ​​handelt, die darauf spezialisiert sind, die Fusion zwischen Virus- und Wirtszellmembranen während des Viruseintritts zu vermitteln. HPIV1 und HPIV3 gehören zur gleichen Respirovirus-Gattung und ihre F-Sequenzen weisen eine Aminosäuresequenzhomologie von 65 % auf. RSV und HMPV gehören zur selben Pneumoviridae-Familie und ihre F-Sequenzen weisen eine Homologie von ca. 54 % auf. Die F-Proteine ​​wechseln zwischen einer metastabilen Präfusionskonformation (preF) und einer stabilen Postfusionskonformation (postF)20,21. Da preF die Hauptkonformation infektiöser Virionen ist, sind Antikörper gegen preF tendenziell am wirksamsten bei der Neutralisierung des Virus22,23,24,25. Ähnlich wie RSV rufen die HPIV3- und HPIV1-F-Proteine ​​in der Präfusionskonformation im Vergleich zur Postfusionskonformation höhere neutralisierende Antikörpertiter hervor26. In einer früheren Studie haben wir das stabilisierte HPIV3-preF-Protein verwendet, um mehrere neutralisierende Antikörper gegen HPIV327 zu identifizieren und zu charakterisieren. Obwohl bei HMPV Antikörper, die auf die Postfusionskonformation abzielen, ebenfalls zu neutralisierenden Antikörpertitern beitragen28, löst HMPV Postfusion F keine kreuzneutralisierenden Antikörper gegen RSV29 aus. In der vorliegenden Studie nutzten wir die Homologie zwischen den verwandten F-Proteinen und konzentrierten uns auf ihre präF-Konformationen, um zwei wirksame kreuzneutralisierende mAbs, 3 × 1 und MxR, aus menschlichen Gedächtnis-B-Zellen zu identifizieren und zu klonen. 3 × 1 kreuzneutralisiert sowohl HPIV3 als auch HPIV1, während MxR effektiv sowohl HMPV als auch RSV kreuzneutralisiert. Zusammen bilden 3 × 1 und MxR einen Antikörpercocktail mit der Fähigkeit, einen gleichzeitigen Schutz gegen mehrere Viren zu erreichen, was für Risikopopulationen von Vorteil sein könnte, die bei einer Infektion mit Atemwegsviren einem erheblichen immunologischen Nachteil ausgesetzt sind.

Da praktisch alle Menschen RSV, HMPV, HPIV3 und HPIV130 ausgesetzt waren, war es nicht notwendig, die Spender vorab auf Seropositivität zu untersuchen. Da derzeit ein Mangel an mAbs gegen die Parainfluenzaviren entwickelt wird, konzentrierten wir unsere Bemühungen zunächst auf das Screening auf HPIV3/HPIV1-kreuzneutralisierende B-Zellen. Da wir nicht in der Lage waren, das HPIV1-F-Protein in der preF-Konformation zu produzieren, verwendeten wir zur Durchführung dieses Screenings allein das F-Protein von HPIV3, indem wir eine Köder-und-Schalter-Strategie nutzten (Abb. 1a, b). Hier wurden HPIV3-bindende B-Zellen isoliert, indem 200 Millionen menschliche Splenozyten mit Tetrameren von HPIV3 preF konjugiert an Allophycocyanin (APC) und Tetrameren von HPIV3 postF konjugiert an APC/Dylight755 inkubiert wurden, gefolgt von magnetischer Anreicherung mit Anti-APC-Mikrokügelchen. Neunhundert B-Zellen, die HPIV3-PräF-Tetramer, aber keine PostF-Tetramer banden, wurden einzeln in Vertiefungen sortiert, die CD40L/IL2/IL21-produzierende 3T3-Feederzellen enthielten, und dann 13 Tage lang inkubiert, um die Antikörpersekretion in Kulturüberstände zu stimulieren. Um Vertiefungen zu identifizieren, die Kandidaten-B-Zellen enthalten, die kreuzneutralisierende Antikörper exprimieren, wurden Kulturüberstände der einzeln sortierten HPIV3-bindenden B-Zellen mit lebendem HPIV1-Virus gemischt und auf ihre Fähigkeit zur Reduzierung der Plaquebildung untersucht (Abb. 1a, c). Zwei der 900 HPIV3-bindenden B-Zellen produzierten Antikörper, die HPIV1 neutralisieren konnten (Abb. 1c). Aus diesen Zellen wurden die exprimierten Gene der schweren (VH3-23) und leichten (Vλ3-19) Kette sequenziert und erfolgreich kloniert, um einen mAb mit Kreuzneutralisierungsfähigkeit gegen HPIV3/HPIV1 zu produzieren, den wir 3 × 1 nannten (Abb. 1b, C). 3 × 1 wurde aus einer B-Zelle isoliert, die den IgA-Isotyp exprimierte. Da Palivizumab und die meisten anderen mAbs, die gegen Atemwegsviren entwickelt werden, eine konstante IgG1-Region nutzen, wurde auch 3 × 1 geklont und für weitere Untersuchungen als IgG1 produziert.

ein Bait-and-Switch-Ansatz, bei dem ein einzelnes Antigen verwendet wird, um B-Zellen zu identifizieren, die ein anderes verwandtes Virus kreuzneutralisieren. HPIV3-bindende B-Zellen aus menschlicher Milz wurden mit APC-konjugierten Tetrameren von HPIV3 preF markiert. b Durchflusszytometriediagramm von HPIV3-präF-bindenden B-Zellen nach dem Gating für Lebendzellen, CD3−CD14−CD16−CD19+CD20+ (B-Zellen), IgD−/IgM− (Isotyp-umgeschaltet) und APC/Dylight755− HPIV3 postF− ( um Zellen auszuschließen, die an HPIV3 postF, APC oder Streptavidin binden). Die gebundene Fraktion enthält magnetisch angereicherte Zellen mithilfe von APC-spezifischen Mikrokügelchen. Die Zahlen in den Diagrammen sind Prozentsätze der gesamten Zellen im Tor. Das rote Kästchen zeigt die B-Zelle an, von der 3 × 1 mAb abgeleitet wurde. c Häufigkeitsverteilung von HPIV1-Plaques pro Well aus dem Neutralisationsscreen. Die gestrichelte Linie zeigt die mittlere Anzahl von Plaques in Negativkontrollvertiefungen an, die das Virus in Abwesenheit von Antikörpern enthalten. Der rote Balken enthält Daten aus der Vertiefung, die die 3 × 1-produzierende B-Zelle enthielt. d Die Bindungskinetik von 3 × 1 IgG (oben) und Fab (unten) an HPIV3 preF wurde mittels Biolayer-Interferometrie (BLI) gemessen, um scheinbare Affinitäten (KD) zu bestimmen. Die Assoziation mit 3 × 1 zu HPIV3 preF-beladener Sonde wurde 300 s lang gemessen, gefolgt von der Dissoziation 1200 s lang. Die Messungen werden gegen einen Isotyp-Kontrollantikörper normalisiert. e Vero-Zellen wurden mit HPIV3 oder HPIV1 in Gegenwart von Reihenverdünnungen von Palivizumab oder 3 × 1 infiziert. Die gepunktete Mittellinie zeigt PRNT60 an. Datenpunkte sind der Durchschnitt ± SD aus drei unabhängigen Experimenten. Panel (a), erstellt mit BioRender.com.

Obwohl wir das F-Protein von HPIV1 nicht in der preF-Konformation stabilisiert hatten, schätzten wir die scheinbare Bindungsaffinität zwischen 3 × 1 und dem F-Protein von HPIV3 in der preF-Konformation. Als IgG band 3 × 1 fest an das preF-Protein von HPIV3 (KD < 10–12 M) (Abb. 1d). Die Bindungsaffinität von 3 × 1 Fab war aufgrund der schnellen Dissoziation geringer (KD = 1,9 × 10−7 M), was darauf hindeutet, dass wahrscheinlich eine gleichzeitige Bindung beider Fabs erforderlich ist, um die Bindung aufrechtzuerhalten (Abb. 1d). Die neutralisierende Wirksamkeit von 3 × 1 wurde durch einen 60 %igen Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT60) bestimmt, bei dem lebende Viren zur Infektion von Vero-Zellen verwendet wurden. 3 × 1 hatte eine ähnlich hohe Neutralisierungskraft sowohl gegen HPIV1 als auch gegen HPIV3 mit einem PRNT60 von 352 bzw. 242 ng/ml (Abb. 1e). Weitere Untersuchungen ergaben, dass 3 × 1 die Ausbreitung von Zelle zu Zelle und die Bildung von Synzytien durch HPIV3 in der Zellkultur blockierte (Abb. S1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Epitop von 3 × 1 zwischen HPIV3 und HPIV1 funktionell konserviert sein könnte.

Da die Antigenlandschaft von HPIV3-preF nicht gut charakterisiert ist, haben wir zunächst wettbewerbsübergreifende Bindungsexperimente durchgeführt, um die Antigenstellen auf HPIV3-preF zu ermitteln, die eine Neutralisierung ermöglichen. Das Epitop für den kreuzneutralisierenden mAb 3 × 1 schien nicht mit den Epitopen von mAbs zu überlappen, die wir zuvor isoliert hatten und die an die Spitze von preF binden und HPIV3 neutralisieren (Abb. 2a)27. Allerdings schien das Epitop von 3 × 1 mit dem Epitop eines zuvor beschriebenen Antikörpers PI3-A12 zu überlappen, der an eine Antigenstelle bindet, die wir Stelle X27 nannten. Um zu bestimmen, wie 3 × 1 mit Ort X interagiert, haben wir Kryo-EM verwendet. Bei vielen HPIV3-preF-Trimerpartikeln waren <3 Fabs gebunden, obwohl das Fab während der Probenvorbereitung einen molaren Überschuss an Trimer aufwies (Abb. S3a). Wir haben eine Struktur von 1 Fab im Komplex mit HPIV3 erhalten, aufgelöst auf 3,62 Å (Abb. S2a und Tabelle S1). Wir haben auch eine Struktur von 3 an HPIV3 gebundenen Fabs erhalten; Diese Karte war auf eine Auflösung von 4,3 Å begrenzt (Abb. S2a und S3a). Wir haben keine signifikante Variation zwischen dem gebundenen preF-Protomer und dem ungebundenen preF-Protomer (RMSD = 0,721 über 360 Cα) in der C1-Struktur festgestellt. Aus diesem Grund verwendeten wir für die Modellerstellung die höher aufgelöste Struktur. 3 × 1 bindet die Domäne III von HPIV3 preF, ragt senkrecht hervor und bindet nur ein Protomer, ohne zusätzliche Kontakte zu anderen Regionen (Abb. 2b). Nur vier der sechs CDRs sind an der Bindung beteiligt, wobei CDRH1 und CRDL2 zu kurz sind, um die Glykoproteinoberfläche zu kontaktieren (Abb. 2c, d). 3 × 1 bindet Stelle Ein Vergleich mit der PI3-A12:HPIV3-Struktur zeigte, dass 3 × 1 an dieselbe Stelle bindet, jedoch relativ zu HPIV3 preF gedreht ist (Abb. S3b). Während 3 × 1 sowohl HPIV3 als auch HPIV1 neutralisiert, neutralisiert PI3-A12 nur HPIV327 und 3 × 1 weist nur geringe Ähnlichkeit der CDR-Sequenz mit PI3-A12 auf (Abb. S3c). Aufgrund des Fehlens einer hochauflösenden Struktur für den PI3-A12:HPIV3-Komplex konnten wir nicht feststellen, ob der 3 × 1 LC mit dem PI3-A12 LC oder HC überlappt. 3 × 1 und PI3-A12 binden daher möglicherweise unterschiedliche Epitope innerhalb derselben Stelle von HPIV3 preF, da sie an Schlüsselresten in 3 × 1 eine signifikante Sequenzvariation aufweisen, die die Bindung erleichtert (Abb. S3c).

eine BLI-Messung der Fähigkeit des auf der linken Seite des Diagramms aufgeführten mAb, die Bindung des oben aufgeführten mAb zu verhindern, ausgedrückt als prozentualer Abfall des maximalen Signals im Vergleich zum maximalen Signal ohne konkurrierenden mAb. b Kryo-EM-Struktur von 3 × 1 Fab im Komplex mit HPIV3 preF. Links ist eine Draufsicht der 3 × 1:HPIV3-Karte mit einem Fab (VH in Lila, VL in Rosa) und HPIV3 preF in Grautönen dargestellt. Rechts ist eine um 90° gedrehte Oberflächendarstellung des Komplexes mit Domäne III in Hellblau und Domäne II in Gelb auf einem Protomer dargestellt. Glykane werden als grüne Kugeln dargestellt. c BSA-Diagramme für jeden Fab-Rest, der mit dem preF-Protomer interagiert, auf einer Sequenzausrichtung zur Keimbahn-VH und -VL für 3 × 1. d Detailansicht der 3 × 1-Bindungsstelle, wobei nur die interagierenden CDRs im Cartoon gezeigt werden, um 60 gedreht ° aus Tafel (b). Die Kästchen zeigen die Positionen der Panels (e) und (f). e Vergrößerte Ansicht der CDRH3-Bindungsstelle, um 40° gedreht von Panel (b). f Vergrößerte Ansicht der CDRL3-Bindungsstelle, um 110° gedreht von Panel (b). e, f CDR-Reste, die keinen Kontakt mit HPIV3 preF haben, wurden der Übersichtlichkeit halber ausgeblendet.

Eine weitere Analyse der lokalen Auflösung unserer Karte ergab, dass die Bindungsstelle eine höhere Auflösung von ~3,0 Å aufwies, verglichen mit der Gesamtauflösung von 3,62 Å (Abb. S1a). Die 3 × 1 VH und VL binden zusammen spezifisch die Spalte zwischen der HRA-Helix und einem Sheet-Turn-Sheet-Motiv, einer kurzen zusammenhängenden Region von HPIV3 (Abb. S4a – d und S5a, b). Diese Region ist für die Umlagerung von preF zu postF von entscheidender Bedeutung, da sowohl die HRA-Helix als auch das Sheet-Turn-Sheet-Motiv während der Umlagerung eine Bewegung von >9 Å aufweisen26. Die HRA spielt möglicherweise auch eine Rolle bei der Neutralisierung von HPIV1, da 3 × 1 wahrscheinlich mit der HRA auf HPIV1 interagiert (Abb. S4e). Aufgrund der erheblichen Bewegung, die diese Stelle während der Fusion erfordert, und ihrer Wirksamkeit als neutralisierendes Epitop für RSV preF31 stellt die 3 × 1-Bindung an dieser Stelle eine starke strukturelle Grundlage für die hohe neutralisierende Wirksamkeit von 3 × 1 dar. Die CDRH2 und CDRH3 von 3 × 1 bilden unter Verwendung unpolarer Reste mehrere Vorsprünge in Rillen auf der Oberfläche von HPIV3 preF (Abb. 2d, e). His52AHC und Phe56HC (CDRH2) machen zusammen mit Leu100BHC und Leu100FHC (CDRH3) etwa 55 % des gesamten VH-BSA aus (Abb. 2c). Die meisten anderen kontaktierenden Reste innerhalb des VH sind polare Reste, die Kontakte mit im Allgemeinen <50 Å2 BSA bilden. Die VL-Reste von 3 × 1 bilden über polare funktionelle Gruppen und das CDR-Loop-Rückgrat Kontakte mit HPIV3 preF, wobei CDRL1 einen großen Vorsprung auf HPIV3 preF umfasst (Abb. 2c, f). Diese CDRL1-Erweiterung wird durch Arg91LC unterstützt, das Tyr31LC und Leu100FHC kontaktiert, wobei Arg91LC eine Bindung mit Asp143 von HPIV3 preF eingeht, das in HPIV1 konserviert ist (Abb. S5a – c und S6a). Wir stellen auch ein schlecht aufgelöstes Merkmal in unserer 3 × 1:HPIV3-Karte fest, bei dem es sich möglicherweise um den C-Terminus des F2-Proteins nach der Furinspaltung handelt (Abb. S7a, b). Obwohl die Dichte nicht ausreicht, um diese Region aufzubauen, könnte ihre Nähe zur 3 × 1-Bindungsstelle auf ein zusätzliches Bindungsepitop hinweisen.

Da RSV und HMPV auch bei gefährdeten Patienten erheblich zur Erkrankung beitragen, versuchten wir als nächstes, potenzielle HMPV/RSV-kreuzneutralisierende mAbs zu identifizieren, die mit 3 × 1 kombiniert werden könnten, um einen wirksamen Cocktail mit erweiterter Breite zu schaffen. Obwohl sich viele mAbs, die auf RSV und HMPV abzielen, bereits in der Entwicklung befinden, nutzten wir unseren Ansatz, indem wir fluoreszierende tetramere Sonden nutzten, um einzigartige B-Zellen zu identifizieren, die in der Lage sind, rekombinante F-Proteine ​​von RSV und HMPV in der präF-, aber nicht in der postF-Konformation zu binden. Mit APC konjugiertes RSV-preF, mit R-Phycoerythrin (PE) konjugiertes HMPV-preF, mit APC/DyLight755 konjugiertes RSV-postF und mit PE/DyLight650 konjugiertes HMPV-postF wurden vor der magnetischen Anreicherung mit 200 Millionen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gemischt Anti-PE- und Anti-APC-Mikrokügelchen. Anschließend sortierten wir einzelne isotypgewechselte B-Zellen, die in der präF-Konformation, jedoch nicht in der postF-Konformation an die F-Proteine ​​von RSV und HMPV binden, und führten anschließend eine Einzelzellsequenzierung und Klonierung ihrer B-Zellrezeptoren durch (Abb. 3a). Mit dieser Methode wurden die Allele der schweren (VH3-21) und leichten (Vλ1-40) Kette einer B-Zelle, die sowohl RSV als auch HMPV binden kann, sequenziert und als mAb kloniert, den wir MxR nannten (Abb. 3b). Diese B-Zelle exprimierte den IgG-Isotyp. Wie 3 × 1 wurde MxR kloniert und als IgG1 für weitere Untersuchungen produziert.

a RSV- und HMPV-bindende B-Zellen aus menschlichem Blut wurden mit APC-konjugierten Streptavidin-Tetrameren von biotinyliertem RSV-Präfusionsprotein (preF) und PE-konjugierten Streptavidin-Tetrameren von biotinyliertem HMPV-preF markiert. b Durchflusszytometriediagramm von RSV- und HMPV-präF-bindenden B-Zellen nach dem Gating für Lebendzellen, CD3−CD14−CD16− CD19+CD20+ (B-Zellen), IgD−/IgM− (Isotyp-umgeschaltet) und APC/Dylight755-HMPV postF − und PE/Dylight650−RSV postF− (um Zellen auszuschließen, die an RSV/HMPV postF, APC, PE oder Streptavidin binden). Die gebundene Fraktion enthält magnetisch angereicherte Zellen mithilfe von APC- und PE-spezifischen Mikrokügelchen. Die Zahlen in den Diagrammen sind Prozentsätze der gesamten Zellen im Tor. Das rote Kästchen zeigt die B-Zelle an, von der MxR-mAb abgeleitet wurde. c Scheinbare Affinität (KD) von MxR, MPE8 und D25, gemessen durch BLI. d Vero-Zellen wurden mit RSV-A, RSV-B oder HMPV in Gegenwart serieller Verdünnungen von Palivizumab (Pali.), D25, MPE8 oder MxR infiziert. Die Datenpunkte stellen den Neutralisationstiter zur Plaquereduktion um 60 % dar und stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Die Sternchen zeigen ap < 0,05 an, wenn ein zweiseitiger t-Test mit Welch-Korrektur verwendet wird. Zahlen neben Sternchen geben den genauen p-Wert an. Panel (a), erstellt mit BioRender.com.

Wir verglichen die scheinbare Bindungsaffinität von MxR mit dem RSV-spezifischen monoklonalen Antikörper D25, der unter dem Namen Nirsevimab zur Prophylaxe von RSV bei Säuglingen entwickelt wird32,33. RSV hat zwei antigenisch unterschiedliche Subtypen, A und B, die 91 % der Aminosäuresequenzhomologie innerhalb des F-Proteins aufweisen. MxR band irreversibel mit hoher scheinbarer Affinität an die preF-Proteine ​​beider RSV-Subtypen A und B (KD jeweils < 10–12 M), selbst wenn die Dissoziationszeit auf 1200 s verlängert wurde (Abb. 3c und S8a, d). Der zuvor beschriebene kreuzneutralisierende monoklonale Antikörper MPE834 zeigte ebenfalls eine hohe scheinbare Affinität für beide RSV-Subtypen A und B (Abb. 3c und S8b, e). D25 band auch stark an das preF-Protein des RSV-Subtyps B, jedoch mit einer etwa 1500-fach geringeren scheinbaren Affinität (KD = 1,5 × 10–9 M) im Vergleich zu seiner Bindung an Subtyp A (Abb. 3c und S8c, f). MxR konnte auch an das preF-Protein von HMPV binden (Abb. 3c und S8g), was angesichts der bewussten Auswahl von B-Zellen, die während der Sortierung sowohl RSV als auch HMPV binden, zu erwarten war. Im Vergleich zu MPE8 war die scheinbare Bindungsaffinität von MxR für HMPV etwa 1,6-fach stärker (Abb. 3c und S8g, h).

Da beide RSV-Subtypen weltweit zirkulieren, war es wichtig, die Neutralisierungskraft (PRNT60) von MxR für die Subtypen A und B zu bewerten. Wir haben auch die Neutralisierungskraft von MxR mit dem RSV-spezifischen monoklonalen Antikörper Palivizumab verglichen, der derzeit für RSV zugelassen ist Prophylaxe bei Hochrisikokindern. Wir fanden heraus, dass MxR den RSV-Subtyp A mit einer mindestens sechsfach höheren Wirksamkeit im Vergleich zu Palivizumab neutralisierte (Abb. 3d und S9a). Im Gegensatz zu Palivizumab, das gegen beide Subtypen eine ähnliche Wirksamkeit aufweist35, war MxR auch gegen Subtyp B hochwirksam, mit einer 12-fach höheren Wirksamkeit (Abb. 3d und S9b). Obwohl D25 eine größere neutralisierende Wirkung gegen RSV-A hatte (Abb. 3d), soll D25 eine schwächere Wirkung gegen einige RSV-B-Stämme haben und HMPV nicht neutralisieren36,37,38. MxR und MPE8 hatten eine ähnliche Wirksamkeit bei der Neutralisierung beider RSV-Subtypen A und B. MxR hatte jedoch eine mindestens fünffach höhere Wirksamkeit gegen HMPV, mit einem PRNT60 von 148 ng/ml im Vergleich zu 838 ng/ml für MPE8 (Abb. 3d und). S8c). Basierend auf der Antikörperkonzentration, die zur Neutralisierung von 60 % des Lebendvirus erforderlich ist, übertraf die Wirksamkeit von MxR gegen HMPV die relative Wirksamkeit von Palivizumab gegen RSV (Abb. 3d).

Um die Grundlage für die mit MxR beobachtete Kreuzneutralisation besser zu verstehen, haben wir eine Kryo-EM-Struktur von drei an RSV preF gebundenen MxR-Fabs mit einer Auflösung von 2,24 Å erhalten (Abb. S2b, S10 und Tabelle S1). MxR bindet hauptsächlich an die Antigenstelle III auf RSV mit einer äquatorialen Anordnung von Fabs um RSV-PräF. Die Antigenstelle III ist ein quartäres Epitop an der Verbindung der Domänen I und III eines F-Protomers und der Domäne II des im Uhrzeigersinn benachbarten F-Protomers (als II' bezeichnet) (Abb. 4a). MxR bindet mit einer Gesamt-BSA von ~1094 Å2, wobei VH ~694 Å2 und VL ~400 Å2 beisteuert, wovon ~298 Å2 mit dem Haupt-F-Protomer und ~102 Å2 mit dem benachbarten F-Protomer in Kontakt stehen. Unsere Struktur zeigte zahlreiche über die Bindungsstelle verteilte Wassermoleküle, die möglicherweise Wechselwirkungen zwischen dem Fab- und preF-Protomer vermitteln (Abb. S11). Diese wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit in Abb. 4 weggelassen. Der Bindungsmodus ist nahezu identisch mit dem zuvor berichteten kreuzneutralisierenden monoklonalen Antikörper MPE834 und dem monoklonalen Säuglingsantikörper ADI-1942539, die von derselben schweren (IGHV3-21*01) und leichten Keimbahnkette (IGLV1-40*01) abgeleitet sind ) Allele. Ein Vergleich der BSA pro Rest von RSV preF im Komplex mit MxR, MPE8 und ADI-19425 ergab gemeinsame Bindungsregionen, die eine hohe Sequenzhomologie mit HMPV aufweisen (Abb. S6b). Die Sequenz und Struktur von CDR1 und CDR2 sind bei allen drei Antikörpern nahezu identisch, wobei MxR insgesamt mehr Mutationen aus der Keimbahn aufweist als die anderen beiden (Abb. 4b, c).

a Links ist eine Draufsicht der DeepEMhanced MxR:RSV-Kryo-EM-Karte dargestellt, mit MxR VH in Dunkelrot, MxR VL in Hellrot und RSV preF in Grautönen. Es wird nur die Fv-Domäne des Fab angezeigt. Rechts ist eine um 90° gedrehte Oberflächendarstellung der Struktur dargestellt. Ein preF-Protomer ist entsprechend seiner Strukturdomänen gefärbt und ein MxR-Fv ist in einer Cartoon-Umrissdarstellung dargestellt. Die DII-Domäne des im Uhrzeigersinn benachbarten Protomers ist hellrosa und wird mit DII' bezeichnet, um sie von DII des anderen Protomers zu unterscheiden, der violett gefärbt ist. Glykane werden als grüne Kugeln dargestellt. (b) BSA-Diagramme für MxR-, MPE8- und ADI-19425-Reste, die mit RSV preF interagieren, auf einem Sequenzalignment der Keimbahn-V-Gene. Der Buchstabe H steht für Wasserstoffbrückenbindungen. Der Buchstabe S weist auf Salzbrücken hin. Die Rückstände in den farbigen Kästchen entsprechen den in den Feldern (d und e) gezeigten Rückständen. c Detaillierte Ansicht der Bindungsstelle auf RSV preF mit den CDRs von MxR, MPE8 und ADI-19425 überlagert und im Cartoon dargestellt. MPE8 in Grün und ADI-19425 in Blau werden in Transparenz angezeigt. Die Antigenstelle III ist durch die weiße Umrandung gekennzeichnet. d Vergrößerte Ansicht der CDRH3-Bindungsstelle, gedreht um 30° gegen den Uhrzeigersinn von Panel (c). e Vergrößerte Ansicht der CDRL3-Bindungsstelle, gegenüber Panel (c) um 65° im Uhrzeigersinn gedreht. Die ersten vier Reste werden nur zur Erhöhung der Klarheit und zur Veranschaulichung der Ähnlichkeit von CDRL3 zwischen Antikörpern als Hauptkette dargestellt.

Die CDRH3-Regionen von MxR, MPE8 und ADI-19425 weisen einen größeren Grad an Sequenz- und Strukturvariation auf und weisen fast keine konservierten Reste auf, obwohl sie in der Nähe der DI/DII'/DIII-Schnittstelle innerhalb der Antigenstelle III binden. An dieser Schnittstelle befindet sich ein kleiner Spalt, in den sich die CDRH3-Schleifen in unterschiedlichem Ausmaß erstrecken (Abb. 4c, d). MPE8 CDRH3 ist die längste, MxR die kürzeste und ADI-19425 eine mittlere Länge. Bemerkenswert ist, dass ADI-19425 eine Disulfidbindung zur Stabilisierung dieser Schleife verwendet, während MPE8 und MxR diese Bindung fehlen (Abb. 4d)34,39. Die durch die Disulfidbindung vorgegebene starre Geometrie kann die Fähigkeit von ADI-19425, HMPV zu binden, beeinträchtigen. Die Notwendigkeit des MPE8 CDRH3, die richtige Schleifengeometrie zu bilden, um innerhalb der Spalte der Antigenstelle III zu binden, könnte daher eine strukturelle Grundlage für die im Vergleich zu MxR verringerte Neutralisierung von HMPV durch MPE8 sein (Abb. 4c, d und 3d). Aufgrund eines relativ kürzeren CDRH3 als MPE8 bindet MxR in dieser Spalte, ohne DII' zu kontaktieren, und erfordert daher keine verlängerte Schleife, um die Bindung zu erleichtern (Abb. 4d und S6b). Nur das CDRL2 von MxR kontaktiert DII' (Abb. 4c). Wenn die CDRs dem HMPV-Protomer überlagert werden, stellen wir fest, dass die allgemeine Bindungsstelle sehr ähnlich ist und ähnliche Antigenstellenbeiträge und Restidentitäten umfasst (Abb. S12a, b). Der verfügbare Bindungsspalt ist jedoch schmaler und kürzer, was die ADI-19425- und MPE8-CDRH3-Schleifen sterisch behindern kann (Abb. S12c). Die CDRL3s zeigen auch einige Unterschiede bei den interagierenden Resten (Abb. 4e). Sowohl MPE8 als auch MxR teilen sich einen basischen Rest an Position 93LC, der nicht mit ADI-19425 geteilt wird, und alle drei Antikörper weisen leicht unterschiedliche Schleifenanordnungen in den Resten 94–96LC auf (Abb. 4e). Die Bindungsmodi der CDRL3s scheinen jedoch ähnlich zu sein, ohne die einzigartigen Merkmale, die bei den CDRH3s zu sehen sind.

Als nächstes untersuchten wir, ob die In-vitro-Bindungs- und Neutralisierungsdaten in einem Tier-Challenge-Modell zu einem In-vivo-Schutz führen würden. Obwohl sich die menschlichen Parainfluenzaviren bei Mäusen nicht vermehren, kann eine Replikation der oberen und unteren Atemwege sowohl bei Hamstern als auch bei Baumwollratten nachgewiesen werden30,40. Für RSV wurden vergleichbare Virustiter in der Lunge von Hamstern und Baumwollratten berichtet41. Obwohl in einigen Studien höhere HMPV-Titer in der Lunge von Baumwollratten im Vergleich zu Hamstern beobachtet wurden42,43, könnte dies mit Unterschieden im verwendeten Virusstamm, der Größe des Inokulums und dem Zeitpunkt der Lungenentnahme zusammenhängen. Das Hamstermodell wurde ausgiebig zur Bewertung von Impfstoffkandidaten gegen Parainfluenzaviren, RSV und HMPV44,45,46,47,48,49,50,51,52 verwendet. Da sich alle Viren in dieser Studie in Hamstern vermehren konnten44,45,51,53,54,55,56,57, führten wir präklinische Tests von MxR und 3 × 1 im Goldhamster-Modell durch. Wir führten intramuskuläre Injektionen bei Hamstern am Tag −2 durch, infizierten Hamster intranasal am Tag 0 und entnahmen Lungen und Nasenmuscheln am Tag 5 nach der Infektion, um die Wirksamkeit monoklonaler Antikörper als Prophylaxe gegen Infektionen zu beurteilen (Abb. 5a). Diese Dosierung, Art und Zeitpunkt der Verabreichung ähneln denen, die in Baumwollrattenmodellen für RSV-Infektionen verwendet werden41,58,59. Wir führten Dosisfindungsexperimente mit 3 × 1 gegen HPIV3 und MxR gegen RSV durch, wobei Palivizumab als Benchmark diente. Zwei Tage nach der intramuskulären Injektion der 5 mg/kg-Dosis bei Hamstern beobachteten wir mAb-Serumkonzentrationen von 5,1–9,7 µg/ml (Abb. 5b). Bei einer Dosis von 5 mg/kg unterdrückten MxR und 3 × 1 die Virusreplikation von HPIV3 bzw. RSV in der Lunge vollständig (Abb. 5c, d). Im Gegensatz dazu unterdrückte Palivizumab bei 5 mg/kg die Virusreplikation in der Lunge nicht vollständig, obwohl Palivizumab und MxR einen ähnlichen EC90 gegen RSV aufwiesen (Abb. 5d, e). Dies steht im Einklang mit Daten aus dem Baumwollrattenmodell, bei dem auch eine Durchbruchinfektion mit Palivizumab in einer Dosierung von 5 mg/kg beobachtet wurde60. Die prophylaktische Verabreichung von 3 × 1 bei 5 mg/kg hatte nur geringe Auswirkungen auf die Replikation in den Nasenmuscheln (Abb. 5c). Allerdings reduzierte die prophylaktische Verabreichung von MxR in einer Dosierung von 5 mg/kg die RSV-Replikation in den Nasenmuscheln um mehr als das 47-fache (Abb. 5d). Dies steht im Gegensatz zu Palivizumab, das keinen Einfluss auf die RSV-Replikation in den Nasenmuscheln hatte. Da die Dosis von 5 mg/kg die Virusreplikation von RSV und HPIV3 unterdrückte, haben wir diese Dosis auch auf HPIV1 und HMPV getestet. Die HPIV1-Replikation war in der Lunge aller Tiere bis auf eines vollständig blockiert und in den Nasenmuscheln von Hamstern, die eine 3 × 1-Prophylaxe erhielten, deutlich reduziert (Abb. 5f). Die HMPV-Replikation war in der Lunge von Hamstern, die eine MxR-Prophylaxe erhielten, um mehr als das 206-fache signifikant reduziert (Abb. 5g).

a Schematische Darstellung von Experimenten, bei denen Hamstern zwei Tage vor der intranasalen Belastung mit 105 pfu Virus intramuskulär 3 × 1 oder MxR injiziert wurde. b Serumkonzentrationen von 3 × 1 und MxR zwei Tage nach Verabreichung von mAb bei 5, 2,5 und 1,25 mg/kg wurden mittels ELISA gemessen (n = 4 Tiere/Dosis). Dosis-Wirkung von 3 × 1 (c) und MxR (d) auf die HPIV3- bzw. RSV-Replikation (n = 5 Versuchstiere/Dosis/Virus, n = 5 Nasenmuscheln/Virus der Kontrolltiere und n = 4 Lungen der Kontrolltiere). /Virus). e 90 % wirksame Konzentration (EC90) von Palivizumab gegen RSV, MxR gegen RSV und 3 × 1 gegen HPIV3 basierend auf Dosis-Wirkungs-Experimenten. f HPIV1 und (g) HMPV-Replikation nach Injektion mit 3 × 1 oder MxR bei 5 mg/kg (n = 8 Tiere/Gruppe über zwei unabhängige Experimente für HPIV1; und n = 10 tierische Nasenmuscheln/Gruppe, n = 10 Versuchstierlungen und n = 7 Kontrolltierlungen über zwei unabhängige Experimente für HMPV). Die Virustiter wurden durch Plaque-Assay in Lungen- und Nasenhomogenaten einzelner Hamster 5 Tage nach der Infektion gemessen. Gestrichelte Linien zeigen die Nachweisgrenze an. Balken stellen den Mittelwert dar und Sternchen zeigen einen zweiseitigen p < 0,05 im Mann-Whitney-Test im Vergleich zu Kontrollhamstern an, denen 1× DPBS injiziert wurde. Zahlen neben Sternchen geben den genauen p-Wert an. Panel (a), erstellt mit BioRender.com.

Bei gemeinsamer Verabreichung als Cocktail könnten MxR und 3 × 1 einen breiten Schutz gegen HMPV, RSV, HPIV3 und HPIV1 bieten. Dies ist klinisch relevant, da alle vier Viren zusammen für die Mehrzahl der schweren respiratorischen Virusinfektionen bei Empfängern hämatopoetischer Stammzelltransplantate verantwortlich sind. Im Vergleich zur gleichzeitigen Verabreichung von vier mAbs (einer pro Virus) ermöglicht die Verwendung von zwei mAbs zur Bekämpfung von vier Viren die Verabreichung einer höheren Dosis jedes mAbs, was die Wirksamkeit maximieren und gleichzeitig die Toxizität minimieren könnte. Die Verabreichung eines Cocktails könnte auch bei Koinfektionen mit mehreren Atemwegsviren nützlich sein, da Koinfektionen bei immungeschwächten Patienten mit schlechteren Ergebnissen verbunden sein können16. Wir haben daher ein HPIV3/RSV-Koinfektionsmodell bei Hamstern entwickelt, um die Wirksamkeit bei gleichzeitiger Gabe von MxR und 3 × 1 zu beurteilen. Da der Plaque-Assay zur Bestimmung der Virustiter nicht zwischen HPIV3 und RSV unterscheiden konnte, haben wir maßgeschneiderte TaqMan-Sonden entwickelt, um die einzelnen Viruslasten mittels Echtzeit-PCR zu quantifizieren. Zunächst verglichen wir die Konzentrationen von HPIV3 und RSV, die in der Lunge von Tieren nachgewiesen wurden, die mit einem oder beiden dieser Viren infiziert waren. Ähnlich wie Daten aus Humanstudien, die darauf hindeuten, dass Koinfektionen zwischen RSV und anderen Viren keinen Einfluss auf die RSV-Titer haben61, beobachteten wir im Vergleich keine Abnahme der Virusreplikation in der Lunge von Tieren, die gleichzeitig mit gleichen Mengen an RSV und HPIV3 geimpft wurden auf Tiere, die mit einem einzelnen Virus geimpft wurden (Abb. 6a, b).

Die spezifische Viruslast von HPIV3 (a) und RSV (b) in Lungenhomogenaten von Hamstern, die mit jeweils 105 pfu RSV und HPIV3 koinfiziert waren, wurde durch Echtzeit-PCR mit Hamstern verglichen, die mit 105 pfu eines einzelnen Virus infiziert waren: n = 4 Tiere/Einzelinfektion und n = 6 für die Koinfektion. c Schematische Darstellung von Experimenten, bei denen Hamstern zwei Tage vor der intranasalen Belastung jeweils 5 mg/kg 3 × 1 und MxR als Cocktail mit jeweils 105 pfu HPIV3 und RSV intramuskulär injiziert wurden. Die spezifische Viruslast von HPIV3 (d) und RSV (e) in Lungen- und Nasengewebehomogenaten wurde durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von HPIV3- bzw. RSV-spezifischen Primern bestimmt. Für HPIV3: n = 8 tierische Nasenmuscheln/Gruppe, n = 8 Versuchstierlungen und n = 7 Kontrolltierlungen über zwei unabhängige Experimente. Für RSV: n = 7 Tiere/Gruppe über zwei unabhängige Experimente. f Gesamtvirustiter durch Plaque-Assay in Lungen- und Nasenhomogenaten am Tag 5 nach der Infektion (n = 7 Tiere/Gruppe über zwei unabhängige Experimente). Gestrichelte Linien geben die Nachweisgrenze an, Balken stellen den Mittelwert dar und Sternchen kennzeichnen einen zweiseitigen p < 0,05 beim Mann-Whitney-Test im Vergleich zu Kontrollhamstern. Zahlen neben Sternchen geben den genauen p-Wert an. ns für nicht signifikant. Panel (c) erstellt mit BioRender.com.

Als nächstes injizierten wir Hamstern intramuskulär einen Cocktail aus MxR und 3 × 1 am Tag –2, co-infizierten Hamstern HPIV3 und RSV am Tag 0 und entnahmen Lungen und Nasenmuscheln am Tag 5 nach der Infektion (Abb. 6c). Der Antikörpercocktail hatte keinen Einfluss auf die HPIV3-Replikation in den Nasenmuscheln, reduzierte jedoch die Viruslast in der Lunge deutlich um mehr als das 88-fache (Abb. 6d). Der Antikörpercocktail reduzierte spezifisch die RSV-Viruslast in der Lunge und den Nasenmuscheln um mehr als das 17-fache bzw. 2,9-fache, und RSV lag in der Lunge von vier von sieben Hamstern unter der Nachweisgrenze (Abb. 6e). Mithilfe eines Plaque-Assays reduzierte der Antikörpercocktail die kombinierte Virusreplikation von HPIV3 und RSV in der Lunge bei 6 von 7 Tieren deutlich auf nicht mehr nachweisbare Werte und in den Nasenmuscheln um mehr als das Sechsfache (Abb. 6f).

Wir haben zwei antivirale kreuzneutralisierende monoklonale Antikörper isoliert: 3 × 1, der auf HPIV3 und HPIV1 abzielt; und MxR, das auf RSV und HMPV abzielt. Zusammen könnten diese beiden Antikörper einen gleichzeitigen und umfassenden Schutz gegen vier der wichtigsten Atemwegsviren bieten, von denen hämatopoetische Stammzelltransplantationspatienten und andere gefährdete Bevölkerungsgruppen betroffen sind. Zu diesem Zweck haben wir eine Köder-und-Schalter-Strategie entwickelt, die auf der Überlegung basiert, dass B-Zellen, die in der Lage sind, an ein Virus zu binden, während sie ein anderes Virus neutralisieren, mit größerer Wahrscheinlichkeit beide Viren kreuzneutralisieren. Diese Strategie führte zur Entdeckung von 3 × 1, einem monoklonalen Antikörper, der mehrere Parainfluenzaviren neutralisiert. Die Köder-und-Schalter-Strategie könnte auch ein allgemein nützlicher Ansatz zur Identifizierung kreuzneutralisierender Antikörper gegen andere Krankheitserreger in einer Situation sein, in der nicht alle Antigene bekannt oder verfügbar sind. Wir verwendeten auch magnetische Anreicherung und Zellsortierung, um seltene B-Zellen zu isolieren, die spezifisch an rekombinante Fusionsproteine ​​in der präF-Konformation, nicht jedoch in der postF-Konformation, binden konnten. Darüber hinaus nutzten wir Feederzellen, die CD40L, IL2 und IL2127,62 exprimieren, um die Antikörperproduktion einzelner B-Zellen in Kultur zu stimulieren. Zusammen ermöglichten diese Techniken die Hochdurchsatzisolierung und das Screening von B-Zellen auf Kreuzneutralisierung.

Das Targeting funktionell konservierter Epitope zwischen homologen Viren ist eine attraktive Strategie, um das Risiko der Entwicklung einer Arzneimittelresistenz aufgrund der Entstehung von Escape-Mutationen zu verringern. und kann gleichzeitig den Nutzen der Präexpositionsprophylaxe erhöhen, indem sie vor einem breiteren Spektrum von Krankheitserregern schützt. Der kreuzneutralisierende 3 × 1 mAb bindet eine Stelle auf HPIV3 preF, die wir Stelle Es ist möglich, dass 3 × 1 die Furin-Spaltungsstelle von HPIV3 bindet, insbesondere den C-Terminus des F2-Proteins, obwohl diese Region zu ungeordnet war, um effektiv modelliert zu werden. Antikörper, die phylogenetisch verwandte Viren kreuzneutralisieren, zielen tendenziell auf gut konservierte Epitope63. Die Wechselwirkung zwischen unpolaren Vorsprüngen an der schweren Kette von 3 × 1 und Rillen auf der Oberfläche könnte einen Mechanismus darstellen, der die Bindung sowohl an HPIV3 als auch an HPIV1 ermöglicht. Darüber hinaus umfasst die leichte Kette von 3 × 1 einen großen Vorsprung auf HPIV3 preF und bildet eine Wasserstoffbrücke bei Asp143, die in HPIV1 konserviert ist. 3 × 1 bindet wahrscheinlich die HRA-Helix von HPIV3 und HPIV1, einer Stelle, die während der Fusion eine erhebliche Bewegung erfährt, wenn das F-Protein von der preF- in die postF-Konformation übergeht. Weitere Strukturanalysen sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zu entwickeln, die die 3 × 1-Neutralisierung von HPIV1 vermitteln.

Der MxR-mAb neutralisiert sowohl HMPV als auch RSV und weist bemerkenswerte Ähnlichkeiten mit einem anderen Antikörper, MPE814,34 auf, einschließlich einer signifikanten Sequenzähnlichkeit, die zu vergleichbaren Bindungsarten führt. Allerdings ist MxR ein stärker somatisch hypermutierter Antikörper und erleichtert die Erkennung der Stelle III ohne das in MPE8 beobachtete erweiterte CDRH3, was eine energetisch günstigere Ortserkennung ermöglichen könnte. Dieser strukturelle Unterschied könnte die Grundlage für den beobachteten Unterschied zwischen MxR und MPE8 bei der Neutralisierung von HMPV sein, wobei MxR eine etwa 5,7-fach höhere Wirksamkeit aufweist.

Palivizumab ist derzeit der einzige von der FDA zugelassene Antikörper zur RSV-Prävention bei Hochrisiko-Säuglingen. Da der durch Palivizumab gebotene Schutz jedoch auf RSV beschränkt ist, hat es keine breite Anwendung bei immungeschwächten Kindern oder Erwachsenen gefunden, bei denen andere Viren wie HMPV, HPIV3 und HPIV1 erheblich zur Erkrankung beitragen64. Ein Cocktail aus MxR und 3 × 1 könnte daher möglicherweise diesen ungedeckten Bedarf an einem Medikament mit umfassenderem Schutz erfüllen. Die klinische Indikation für den RSV-spezifischen monoklonalen Antikörper D25, der als Nirsevimab als Ersatz für Palivizumab entwickelt wird, konzentriert sich ebenfalls auf Säuglinge33. Wir und andere haben eine verringerte Bindung von D25 an das preF-Protein des RSV-Subtyps B im Vergleich zum RSV-Subtyp A beobachtet [Abb. 3c; auch Ref. 65]. Dies ist bemerkenswert, da bei Säuglingen, die nach der Einnahme von Nirsevimab eine Durchbruchinfektion mit RSV-Subtyp B erlitten hatten, Escape-Mutationen zu D25 identifiziert wurden32. RB1 ist ein weiterer Antikörper in der klinischen Entwicklung mit gleicher Wirksamkeit gegen RSV-A und -B, neutralisiert jedoch HMPV35 nicht. Der kreuzneutralisierende MxR-Antikörper, den wir in der vorliegenden Studie beschreiben, bindet stark an die preF-Proteine ​​der beiden RSV-Subtypen A und B und neutralisiert auch HMPV. Eine Analyse potenzieller Escape-Mutationen, die klinisch auftreten könnten, und ihrer Fitnesskosten für die Virusreplikation ist ein wichtiger nächster Schritt in der Entwicklung von MxR und 3 × 1.

Um den potenziellen klinischen Nutzen der Verabreichung eines Cocktails aus MxR und 3 × 1 zum Schutz vor RSV, HMPV, HPIV3 und HPIV1 zu untersuchen, haben wir unsere In-vivo-Wirksamkeitsstudien auf die Immunprophylaxe konzentriert. Die Bedeutung der Prävention respiratorischer Virusinfektionen für gefährdete Bevölkerungsgruppen ist während der COVID-19-Pandemie immer deutlicher geworden. Ein Cocktail aus zwei SARS-CoV-2-spezifischen monoklonalen Antikörpern, der als Evusheld vermarktet wird, wurde von der FDA zur Prophylaxe bei immungeschwächten Personen zugelassen, bei denen eine schlechte Reaktion auf die Impfung zu erwarten ist. In einer Phase-III-Studie führte Evusheld, intramuskulär verabreicht als 600 mg Gesamtantikörper, zu einer relativen Risikoreduktion von 83 % bei symptomatischer COVID-1966. Aufgrund von Escape-Mutationen in der Omicron-Variante hat die FDA die Dosis auf 1200 mg Gesamtantikörper angepasst, was für eine 60 kg schwere Person einer Dosis von 20 mg/kg entspricht. In unseren In-vivo-Wirksamkeitsstudien verabreichten wir auf ähnliche Weise einen Cocktail aus zwei Antikörpern MxR und 3 × 1, jeweils 5 mg/kg, also eine Gesamtdosis von 10 mg/kg. Daher liegen die in der vorliegenden Studie getesteten Dosen im Bereich anderer Antikörper, die bereits klinisch eingesetzt werden, was Raum für eine höhere Dosierung in zukünftigen Studien am Menschen lässt. Zusammen stellen MxR und 3 × 1 vielversprechende mAb-Kandidaten für die weitere Entwicklung dar, um vor einem breiten Spektrum respiratorischer Virusinfektionen bei stark gefährdeten Patientengruppen zu schützen.

Diese Studie entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften und wurde vom Fred Hutchinson Cancer Center Institutional Review Board geprüft und genehmigt. Peripheres Blut wurde durch Venenpunktion von gesunden, HIV-seronegativen erwachsenen Freiwilligen gewonnen, die nach informierter Einwilligung an der Seattle Area Control-Studie teilnahmen (Protokoll Nr. 5567). PBMCs wurden aus Vollblut mit dem Accuspin System Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. 10771) isoliert. Studien mit menschlichen Milzen galten als Forschung an nichtmenschlichen Probanden, da das Gewebe nicht identifiziert wurde. Milzproben wurden vom Fred Hutch Institutional Review Board als nichtmenschliche Forschungsobjekte eingestuft und entsprechen der Definition der Common Rule des Office for Human Research Protections. Das Gewebe wurde anonymisiert und stammte von verstorbenen Spendern, bei denen die Milz ansonsten bei der Beschaffung anderer Organe (z. B. Leber) zur Spende entsorgt worden wäre. Gewebefragmente wurden durch ein Korbsieb geleitet, 7 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert, 3,5 Minuten lang mit ACK-Lysepuffer (Thermo Fisher, Kat.-Nr. A1049201) inkubiert, in RPMI (Gibco, Kat.-Nr. 11875093) resuspendiert und durch a geleitet gestapelte 500- und 70-µm-Zellsiebe. Die Zellen wurden in 10 % Dimethylsulfoxid in hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Gibco, Kat.-Nr. 16000044) resuspendiert und vor der Verwendung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert.

293F-Zellen (Thermo Fisher, Kat.-Nr. R79007) wurden in Freestyle 293-Medium (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 12338026) kultiviert. Vero-Zellen (ATCC CCL-81), LLC-MK2-Zellen (ATCC CCL-7.1) und HEp-2 (ATCC CCL-23) wurden in DMEM (Gibco, Kat.-Nr. 12430054), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 100, kultiviert U/ml Penicillin plus 100 μg/ml Streptomycin (Gibco, Kat.-Nr. 15140122). Obwohl HEp-2 aufgrund einer HeLa-Zellkontamination häufig fälschlicherweise identifiziert wird (iclac.org/databases/cross-contaminations/), wird HEp-2 traditionell verwendet, um RSV auf hohe Titer zu züchten.

Die rekombinanten Viren RSV-GFP, HMPV-GFP, HPIV1-GFP und HPIV3-GFP wurden bereits beschrieben46,67,68,69 und wurden jeweils vom RSV-Stamm A2 (GenBank-Zugangsnummer KT992094), HMPV CAN97-83, modifiziert (GenBank-Zugangsnummer AY297749), HPIV1/Washington/20993/1964 (GenBank-Zugangsnummer AF457102) und HPIV3 JS (GenBank-Zugangsnummer Z11575), um verstärktes GFP auszudrücken. Der RSV-Subtyp-B-Stamm 18537 (GenBank-Zugangsnummer MG813995) wurde von ATCC (Kat.-Nr. VR-1580) erhalten. Der RSV-Subtyp-B-Stamm B1 (GenBank-Zugangsnummer AF013254.1) wurde von ViraTree (Kat.-Nr. RSVB-GFP3) erhalten. HMPV, HPIV1 und HPIV3 wurden auf LLC-MK2-Zellen kultiviert und RSV wurde auf HEp-2-Zellen kultiviert. Das Virus wurde durch Zentrifugation in einem diskontinuierlichen 30 %/60 % Saccharosegradienten mit 0,05 M HEPES und 0,1 M MgSO4 (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. H4034 bzw. 230391) bei 120.000 × g für 90 Minuten bei 4 °C gereinigt. Die Virustiter wurden bestimmt, indem Vero-Zellmonoschichten in 24-Well-Platten mit seriellen 10-fachen Verdünnungen des Virus infiziert wurden und mit DMEM mit 0,8 % Methylcellulose (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. M0387) überschichtet wurden. Für Tests mit HPIV1 und HMPV waren 1,2 % von 0,05 % Trypsin (Gibco, Kat.-Nr. 25300054) im Medium enthalten. Fluoreszierende Plaques wurden 5 Tage nach der Infektion mit einem Typhoon-Scanner (GE Life Sciences) gezählt.

Expressionsplasmide für His-markierte RSV-, HMPV- und HPIV3-PräF- und PostF-Antigene wurden bereits beschrieben26,70,71. 293F-Zellen wurden mit einer Dichte von 106 Zellen/ml in Freestyle 293-Medium unter Verwendung von 1 mg/ml PEI Max (Polysciences, Kat.-Nr. 24765) transfiziert. Transfizierte Zellen wurden 7 Tage lang unter leichtem Schütteln bei 37 °C kultiviert. Der Überstand wurde durch 30-minütiges Zentrifugieren der Kulturen bei 2500 × g und anschließende Filtration durch einen 0,2-µM-Filter gesammelt. Der geklärte Überstand wurde über Nacht bei 4 °C mit Ni-Sepharose-Perlen inkubiert und anschließend mit Waschpuffer gewaschen, der 50 mM Tris, 300 mM NaCl und 8 mM Imidazol enthielt. His-markiertes Protein wurde mit einem Elutionspuffer eluiert, der 25 mM Tris, 150 mM NaCl und 500 mM Imidazol enthielt. Das gereinigte Protein wurde über eine 10/300 Superose 6 Größenausschlusssäule (GE Life Sciences, Kat.-Nr. 17–5172–01) laufen gelassen. Fraktionen, die die trimeren F-Proteine ​​enthielten, wurden gepoolt und durch Zentrifugation in einer 50-kDa-Amicon-Ultrafiltrationseinheit (Millipore, Kat.-Nr. UFC805024) konzentriert. Die konzentrierte Probe wurde in 50 % Glycerin bei –20 °C gelagert.

Gereinigte F-Antigene wurden mit einem EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotinylierungskit (Thermo Fisher, Kat.-Nr. A39257) mit einem Molverhältnis von Biotin zu F von 1:1,3 biotinyliert. Nicht konjugiertes Biotin wurde durch Zentrifugation mit einem 50 kDa Amicon Ultra entfernt Größenausschlussspalte (Millipore). Um die durchschnittliche Anzahl der an jedes F-Molekül gebundenen Biotinmoleküle zu bestimmen, wurde Streptavidin-PE (ProZyme, Kat.-Nr. PJRS25) in steigenden Konzentrationen in eine feste Menge biotinylierten F titriert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden auf einem SDS-PAGE-Gel (Invitrogen, Kat.-Nr. NW04127BOX) laufen gelassen, auf Nitrozellulose übertragen und mit Streptavidin-Alexa Fluor 680 (Thermo Fisher, Kat.-Nr. S32358) in einer Verdünnung von 1:10.000 inkubiert, um den Punkt zu bestimmen Für die Bindung des Streptavidin-Alexa Fluor 680-Reagenz stand überschüssiges Biotin zur Verfügung. Biotinyliertes F wurde mit Streptavidin-Allophycocyanin (APC) oder Streptavidin-PE im oben bestimmten Verhältnis gemischt, um Streptavidin vollständig zu sättigen, und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht konjugiertes F wurde durch Zentrifugation unter Verwendung eines 300 K Nanosep-Zentrifugalgeräts (Pall Corporation, Kat.-Nr. OD300C33) entfernt. APC/DyLight755- und PE/DyLight650-Tetramere wurden durch Mischen von F mit Streptavidin-APC, vorkonjugiert mit DyLight755 (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 62279), bzw. Streptavidin-PE, vorkonjugiert mit DyLight650 (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 62266), erzeugt. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Im Durchschnitt enthielten APC/DyLight755 und PE/DyLight650 4–8 DyLight-Moleküle pro APC und PE. Die Konzentration jedes Tetramers wurde durch Messung der Absorption von APC (650 nm, Extinktionskoeffizient = 0,6 µM−1 cm−1) oder PE (566 nm, Extinktionskoeffizient = 2,0 µM−1 cm−1) berechnet.

1–2 × 108 gefrorene PBMCs oder 4–8 × 107 gefrorene Milzzellen wurden in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und 100 U/ml Penicillin plus 100 µg/ml Streptomycin aufgetaut. Die Zellen wurden zentrifugiert und in 50 µl eiskaltem fluoreszenzaktiviertem Zellsortierungspuffer (FACS) resuspendiert, der aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 1 % neugeborenem Kälberserum (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 26010074) bestand. PostF-APC/DyLight755- und PE/Dylight650-konjugierte Tetramere wurden in einer Endkonzentration von 25 nM in Gegenwart von 2 % Ratten- und Mäuseserum (Thermo Fisher) zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden PreF-APC- und PE-Tetramer in einer Endkonzentration von 5 nM zugegeben und 25 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von einem 10-ml-Waschvorgang mit eiskaltem FACS-Puffer. Als nächstes wurden jeweils 50 μl Anti-APC-konjugierte (Miltenyi Biotec, Kat.-Nr. 130-090-855) und Anti-PE-konjugierte (Miltenyi Biotec, Kat.-Nr. 130-048-801) Mikrokügelchen hinzugefügt und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert Minuten, danach wurden 3 ml FACS-Puffer hinzugefügt und die Mischung über eine magnetisierte LS-Säule (Miltenyi Biotec, Kat.-Nr. 130-042-401) geleitet. Die Säule wurde einmal mit 5 ml eiskaltem FACS-Puffer gewaschen und dann aus dem Magnetfeld entfernt und 5 ml eiskalter FACS-Puffer wurden zweimal mit einem Kolben durch die nicht magnetisierte Säule gedrückt, um die gebundene Zellfraktion zu eluieren.

Die Zellen wurden in 50 μl FACS-Puffer, der einen Antikörpercocktail enthielt, 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, bevor sie gewaschen und auf einem FACS Aria (BD) analysiert wurden. Zu den Antikörpern gehörten Anti-IgM-FITC (G20–127, BD, Kat.-Nr. 555782, Verdünnung 1:80), Anti-CD19 BUV395 (SJ25C1, BD, Kat.-Nr. 563551, Verdünnung 1:20), Anti-CD3 BV711 (UCHT1, BD , Kat.-Nr. 563725, 1:50 Verdünnung), Anti-CD14 BV711 (M0P-9, BD, Kat.-Nr. 563372, 1:50 Verdünnung), Anti-CD16 BV711 (3G8, BD, Kat.-Nr. 563127, 1:50 Verdünnung) , Anti-CD20 BUV737 (2H7, BD, Kat.-Nr. 612849, Verdünnung 1:20), Anti-IgD BV605 (IA6–2, BD, Kat.-Nr. 563313, Verdünnung 1:50), Anti-CD27 PE/Cy7 (LG. 7F9, eBioscience, Kat.-Nr. 25-0271-82, Verdünnung 1:160) und ein fixierbarer Lebensfähigkeitsfarbstoff (Tonbo Biosciences, Kat.-Nr. 13-0870-T500, Verdünnung 1:250). B-Zellen wurden einzeln entweder in 1) leere 96-Well-PCR-Platten sortiert und sofort eingefroren, oder 2) 96-Well-Platten mit flachem Boden, die Feeder-Zellen enthielten, die einen Tag zuvor in einer Dichte von 28.600 Zellen/Well in 100 µL ausgesät worden waren IMDM-Medium (Gibco, Kat.-Nr. 31980030), das 10 % fötales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin plus 100 µg/ml Streptomycin und 2,5 µg/ml Amphotericin enthält. Auf Feeder-Zellen sortierte B-Zellen wurden 13 Tage lang bei 37 °C kultiviert.

Für einzelne B-Zellen, die sortiert und in leere 96-Well-PCR-Platten eingefroren wurden, wurde die reverse Transkription (RT) direkt nach dem Auftauen der Platten mit SuperScript IV (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 18090200)72,73 durchgeführt. Kurz gesagt, 3 µL RT-Reaktionsmix bestehend aus 3 µL 50 µM Zufallshexameren (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 48190011), 0,8 µL 25 mM Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs; Thermo Fisher, Kat.-Nr. N8080261), 1 µL (20 U) SuperScript IV RT, 0,5 µL (20 U) RNaseOUT (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 10777019), 0,6 µL 10 % Igepal (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. I8896) und 15 µL RNase-freies Wasser wurden in jede Vertiefung gegeben, die ein einzelnes enthielt B-Zellen sortiert und 1 Stunde bei 50 °C inkubiert. Bei einzelnen auf Feeder-Zellen sortierten B-Zellen wurde der Überstand nach 13 Tagen Kultur entfernt, die Platten sofort auf Trockeneis eingefroren, bei –80 °C gelagert, aufgetaut und die RNA mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen, Kat.-Nr.) extrahiert. 74034). Bei der RT-Reaktion wurde anstelle von Wasser das gesamte Eluat der RNA-Extraktion verwendet. Nach der RT wurden 2 µL cDNA zu 19 µL PCR-Reaktionsmix hinzugefügt, sodass die Endreaktion 0,2 µL (0,5 U) HotStarTaq Polymerase (Qiagen, Kat.-Nr. 203607), 0,075 µL 50 µM 3′-Reverse-Primer und 0,115 µL enthielt 50 µM 5′-Forward-Primer, 0,24 µL 25 mM dNTPs, 1,9 µL 10 × Puffer (Qiagen) und 16,5 µL Wasser. Das PCR-Programm bestand aus 50 Zyklen mit 94 °C für 30 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 55 Sekunden, gefolgt von 72 °C für 10 Minuten für schwere und leichte Kappa-Ketten. Das PCR-Programm bestand aus 50 Zyklen mit 94 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 55 Sekunden, gefolgt von 72 °C für 10 Minuten für leichte Lambda-Ketten. Nach der ersten PCR-Runde wurden 2 µL des PCR-Produkts zu 19 µL der PCR-Reaktion der zweiten Runde hinzugefügt, sodass die Endreaktion 0,2 µL (0,5 U) HotStarTaq-Polymerase, 0,075 µL 50 µM 3′-Reverse-Primer, 0,075 µL 50 µM 5′-Forward-Primer, 0,24 µL 25 mM dNTPs, 1,9 µL 10 × Puffer und 16,5 µL Wasser. Die PCR-Programme waren die gleichen wie in der ersten PCR-Runde. 4 μl des PCR-Produkts wurden auf einem Agarosegel laufen gelassen, um das Vorhandensein einer Schwerkettenbande mit ca. 500 bp oder einer Leichtkettenbande mit ca. 450 bp zu bestätigen. 5 μl aus den PCR-Reaktionen, die das Vorhandensein von Amplikons der schweren oder leichten Kette zeigten, wurden mit 2 μl ExoSAP-IT (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 78201) gemischt und 15 Minuten lang bei 37 °C und anschließend 15 Minuten lang bei 80 °C inkubiert hydrolysieren überschüssige Primer und Nukleotide. Hydrolysierte PCR-Produkte der zweiten Runde wurden von Genewiz mit dem jeweiligen Reverse-Primer sequenziert, der in der PCR der zweiten Runde verwendet wurde, und die Sequenzen wurden mit IMGT/V-Quest analysiert, um V-, D- und J-Gensegmente zu identifizieren. Gepaarte schwere Ketten-VDJ- und leichte Ketten-VJ-Sequenzen wurden mithilfe von In-Fusion-Klonierung (Clontech, Kat.-Nr. 638911)74 in von pTT3 abgeleitete Expressionsvektoren kloniert, die die konstanten Regionen von menschlichem IgG1, IgK oder IgL enthielten.

Sekretorisches IgG wurde durch Cotransfektion von 293F-Zellen in einer Dichte von 106 Zellen/ml mit den gepaarten Expressionsplasmiden der schweren und leichten Kette im Verhältnis 1:1 in Freestyle 293-Medien unter Verwendung von 1 mg/ml PEI Max produziert. Transfizierte Zellen wurden 7 Tage lang unter leichtem Schütteln bei 37 °C kultiviert. Der Überstand wurde durch 15-minütiges Zentrifugieren der Kulturen bei 2500 × g und anschließende Filtration durch einen 0,2-µM-Filter gesammelt. Die geklärten Überstände wurden dann mit Protein-A-Agarose (Thermo Scientific, Kat.-Nr. 22812) inkubiert und anschließend mit IgG-Bindungspuffer (Thermo Scientific, Kat.-Nr. 21007) gewaschen. Die Antikörper wurden mit IgG-Elutionspuffer (Thermo Scientific, Kat.-Nr. 21004) in einen Neutralisationspuffer mit 1 M Tris-Base, pH 9,0, eluiert. Der gereinigte Antikörper wurde konzentriert und der Puffer wurde unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 50 kDa in PBS ausgetauscht.

Fab wurde durch Inkubation von 10 mg IgG mit 10 µg LysC (New England Biolabs, Kat.-Nr. P8109S) über Nacht bei 37 °C und anschließende Inkubation mit Protein A für 1 Stunde bei Raumtemperatur hergestellt. Die Mischung wurde dann durch einen PVDF-Filter zentrifugiert, in PBS mit einer 30 kDa Amicon Ultra-Größenausschlusssäule konzentriert und durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung von Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences, Kat.-Nr. 17–5175–01) weiter gereinigt ) in 5 mM HEPES und 150 mM NaCl.

Bioschichtinterferometrietests (BLI) wurden auf dem Octet.Red-Instrument (ForteBio) bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 500 U/min durchgeführt. Für scheinbare Affinitätsanalysen (KD) wurden Anti-Penta-His-Einfangsensoren (ForteBio, Kat.-Nr. 18–5120) in Kinetikpuffer (PBS mit 0,01 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Tween 20 und 0,005 % NaN3, pH 7,4) geladen. mit 0,5 µM gereinigtem RSV-A, RSV-B, HMPV oder HPIV3 preF für 150 s. Nach der Belastung wurde das Basissignal 60 s lang in einem Kinetikpuffer aufgezeichnet. Anschließend wurden die Sensoren für einen Assoziationsschritt von 300 s in Kinetikpuffer mit 266,7, 133,3, 66,7, 33,3 oder 16,7 nM gereinigtem monoklonalen Antikörper eingetaucht, gefolgt von einem Eintauchen in Kinetikpuffer für eine Dissoziationsphase von mindestens 600 s. Die maximale Reaktion wurde durch Mittelung der Nanometerverschiebung über die letzten 5 s des Assoziationsschritts nach Subtraktion des Hintergrundsignals von jeder analythaltigen Vertiefung unter Verwendung eines negativen Kontroll-mAb zu jedem Zeitpunkt bestimmt. Die Kurvenanpassung wurde unter Verwendung eines 1:1-Bindungsmodells und der Datenanalysesoftware ForteBio Octet, Version 9.0, durchgeführt. Für kompetitive Bindungstests wurden Anti-Penta-His-Einfangsensoren 300 s lang in Kinetikpuffer mit 1 µM His-markiertem HPIV3 preF geladen. Nach dem Laden wurde das Basissignal 30 s lang im Kinetikpuffer aufgezeichnet. Anschließend wurden die Sensoren 300 s lang in Kinetikpuffer mit 40 µg/ml des ersten Antikörpers eingetaucht und anschließend weitere 300 s lang in Kinetikpuffer mit 40 µg/ml des zweiten Antikörpers eingetaucht. Die prozentuale Konkurrenz wurde bestimmt, indem der maximale Signalanstieg des zweiten Antikörpers in Gegenwart des ersten Antikörpers durch das maximale Signal des zweiten Antikörpers allein dividiert wurde.

Vero-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit flachem Boden doppelt ausplattiert und 48 Stunden lang kultiviert und dann mit HPIV3 bei einer MOI = 0,01 eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden fünfmal gewaschen, um das nicht adsorbierte Virus zu entfernen. 3 × 1 (10 µg/ml) oder Medium (Kontrolle) wurde zu den Zellen gegeben. Die Ausbreitung von Zelle zu Zelle und die Bildung von Synzytien wurden an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Infektion mit einem EVOS Cell Imaging System (Thermo Fisher) untersucht.

Für das Neutralisationsscreening von Kulturüberständen wurden Vero-Zellen in 96-Well-Platten mit flachem Boden ausgesät und 48 Stunden lang kultiviert. Nach 13 Tagen Kultur wurden 40 µL B-Zellkulturüberstand mit 25 µL Saccharose-gereinigtem GFP-HPIV1, verdünnt auf 2000 Plaque-bildende Einheiten (pfu)/ml, 1 Stunde lang bei 37 °C gemischt. Vero-Zellen wurden dann mit 50 µL der Überstands-/Virusmischung 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, um die Virusadsorption zu ermöglichen. Als nächstes wurde jede Vertiefung mit 100 µL DMEM überschichtet, das 0,8 % Methylzellulose und 1,2 % 0,05 % Trypsin enthielt. Fluoreszierende Plaques wurden 5 Tage nach der Infektion mit einem Typhoon-Imager gezählt.

Neutralisierende Titer monoklonaler Antikörper wurden durch einen Neutralisationstest zur Plaquereduktion um 60 % (PRNT60) bestimmt. Vero-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und 48 Stunden lang kultiviert. Monoklonale Antikörper wurden 1:4 seriell in 120 µL DMEM verdünnt und mit 120 µL Saccharose-gereinigtem RSV, HMPV, HPIV3 oder HPIV1, verdünnt auf 2000 pfu/ml, eine Stunde lang bei 37 °C gemischt. Vero-Zellen wurden mit 100 µL der Antikörper/Virus-Mischung 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, um die Virusadsorption zu ermöglichen. Jede Vertiefung wurde dann mit 500 µL DMEM mit 0,8 % Methylcellulose überschichtet. Fluoreszierende Plaques wurden 5 Tage nach der Infektion mit einem Typhoon-Imager gezählt. PRNT60-Titer wurden durch lineare Regressionsanalyse berechnet (http://exon.niaid.nih.gov/plaquereduction/).

1,47 mg RSV preF mit 1,45 mg MxR Fab wurden gemischt und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert, bevor die SEC-Reinigung über eine 10/300 Superose 6-Säule (Cytiva, Kat.-Nr. 29091596) erfolgte. Es wurde ein sehr breiter Peak eluiert, wobei die neun größten Fraktionen unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit mit einem Cutoff von 10 kDa (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. UFC8030) auf 0,22 mg/ml konzentriert wurden. Für 3 × 1 inkubierten wir 50 µg HPIV3 preF mit 150 µg 3 × 1 Fab über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln vor der SEC-Reinigung über einer Superdex 200 16/600 SEC-Säule (Cytiva, Kat.-Nr. 28989335). Ein einzelner schmaler Peak mit hohem Molekulargewicht wurde eluiert und unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit mit einem Cutoff von 10 kDa auf 0,4 mg/ml konzentriert.

Beide Komplexe wurden auf Quantifoil 1.2/1.3 UltrAu 300 Mesh-Gittern (Electron Microscopy Sciences, Kat.-Nr. Q350AR13A) unter Verwendung eines Vitrobot Mk. eingefroren. IV (Thermo Fisher) bei 22 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit. Dodecyl-β-d-maltosid (DDM) wurde der Probe 30 Minuten vor Beginn des Gefrierens zugesetzt (0,05 % Endkonzentration), und ein PELCO easiGlow™ (Tedpella, Kat.-Nr. 91000) wurde zur Glimmentladung der Gitter verwendet. Die endgültigen MxR:RSV-Gitter, die für die Sammlung verwendet wurden, wurden mit 4 µL der Probe bei 0,21 mg/ml, einer Blotzeit von 14 Sekunden, einer Blotkraft von 0 und einer Wartezeit von 5 Sekunden zwischen Auftragen und Blotting eingefroren. Die endgültigen 3 × 1:HPIV3-Gitter, die für die Sammlung verwendet wurden, wurden mit 4 µL der Probe bei 0,19 mg/ml, einer Blotzeit von 12 Sekunden, einer Blotkraft von 0 und einer Wartezeit von 15 Sekunden zwischen Auftragen und Blotting eingefroren.

Die Datensätze wurden mit einem Titan Krios G3 Kryo-Elektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) gesammelt, das bei 300 kV mit einem K3 DED (Gatan Inc.) am Pacific Northwest Center for Cryo-EM (PNCC) betrieben wird. Die Daten wurden in 50-Frame-Filmen mit serieller EM bei 92.000-facher Vergrößerung (0,514425 Å/px im Superauflösungsmodus) gesammelt. Beide Sammlungen liefen 24 Stunden lang und produzierten 6282 Filme für 3 × 1:HPIV3 und 5796 Filme für MxR:RSV. 3 × 1:HPIV3 wurde aufgrund der beim Screening beobachteten bevorzugten Ausrichtung mit einer Neigung von 30° gesammelt.

Datensätze wurden mit cryoSPARC v3.3.175 verarbeitet. Nach dem Import, der Patch-Bewegungskorrektur (auf 1,02885 Å/px gruppierte Mikroaufnahmen) und der Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurden die Mikroaufnahmen für eine CTF-Anpassung von <4 Å kuratiert. Mit dem Blob-Picker wurden etwa 50.000 Partikel ausgewählt, die einer 2D-Klassifizierung unterzogen wurden, um Vorlagen für die vorlagenbasierte Auswahl zu erstellen. Diese Picks wurden inspiziert, kuratiert und extrahiert (192-Pixel-Boxgröße bei 2,0577 Å/px) mit 1,49 Millionen Partikeln für MxR:RSV und 2,02 Millionen Partikeln für 3 × 1:HPIV3.

Nach zwei Runden der 2D-Klassifizierung mit jeweils 100 Klassen blieben 377.982 MxR:RSV-Partikel übrig, die drei gebundene Fabs zeigten. Es wurde ein einziges Ab-initio-Modell erstellt und verfeinert. Die Partikel wurden mit 1,02885 Å/px erneut extrahiert und einer lokalen CTF-Verfeinerung und einer ungleichmäßigen Verfeinerung mit C3-Symmetrie unterzogen. Anschließend wurden die Partikel mithilfe der lokalen Bewegungskorrektur weiter kuratiert und erneut extrahiert, wodurch 354.958 Partikel entstanden. Eine ungleichmäßige Verfeinerung mit einer benutzerdefinierten Maske, die die CH1-Region und die GCN4-Domäne ausschneidet, erzeugte eine geschärfte Karte (GSFSC = 0,143) mit einer Auflösung von 2,41 Å bei C1-Symmetrie und 2,24 Å bei C3-Symmetrie.

Die Vorlagengenerierung für 3 × 1:HPIV3 erzeugte eine Mischung von Klassen mit entweder einem, zwei oder drei gebundenen Fabs, die alle für die ursprüngliche Vorlagenauswahl verwendet wurden. Wir führten eine Runde der 2D-Klassifizierung mit 100 Klassen durch und wählten einzelne Partikel aus, die eine beliebige Anzahl gebundener Fabs aufwiesen, wodurch ein Stapel von 1,3 Millionen Partikeln entstand. Die Ab-initio-Modellierung ergab eine einzelne Karte mit einem Fab, der an HPIV3 preF gebunden war, und die anschließende Verfeinerung ergab eine Karte mit einer GSFSC-Auflösung von 3,7 Å bei den Cutoffs von 0,143 unter Verwendung der C1-Symmetrie. Eine zusätzliche Drei-Fab-Karte wurde mit C3-Symmetrie in ungleichmäßiger Verfeinerung auf 4,3 Å erstellt, diese Karte wurde jedoch aufgrund der geringen Auflösung nicht für den Modellbau verwendet. Kleinere Verbesserungen wurden durch die Durchführung einer homogenen C3-Verfeinerung, gefolgt von einer C3-Symmetrieerweiterung, einer 3D-Klassifizierung mit vier Klassen und der Entfernung doppelter Partikel aus der homologsten Klasse erzielt, wodurch ein Stapel von 1,04 Millionen Partikeln entstand. Die Partikel wurden mit dem Job „Local Motion Correction“ erneut extrahiert, auf 1,02885 Å/px gruppiert und die Karte mit der ungleichmäßigen C1-Verfeinerung verfeinert. Dadurch entstand unsere endgültige geschärfte Karte mit einer Auflösung von 3,62 Å (GSFSC = 0,143).

Beide endgültigen Karten wurden mit dem COSMIC2-Computer76 mit dem DeepEMhancer77-Modul weiterverarbeitet. Sowohl die DeepEM-Enhanced- als auch die CryoSPARC-Sharp-Karte wurden verwendet, um die Strukturen von MxR:RSV und 3 × 1:HPIV3 an die Karte anzupassen. Strukturverfeinerung und Validierung wurden in der Phenix78-Software-Suite und Coot79 durchgeführt. Weitere Verfeinerungen wurden in ChimeraX80 mit dem ISOLDE81-Plugin nach Bedarf vorgenommen. Die unmaskierten Halbkarten, geschärften Karten und die verwendeten Masken wurden im PDB und EMDB hinterlegt. Alle Grafiken wurden in Pymol82 erstellt. Die Diagramme wurden mit GraphPad Prism 9 erstellt. Die Analyse vergrabener Oberflächen wurde mit dem PDBePISA83-Server durchgeführt.

Alle Verfahren wurden vom Fred Hutch Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institution und der National Institutes of Health durchgeführt. Goldhamster (Mesocricetus auratus) wurden intranasal mit 100 µL 105 pfu RSV, HMPV, HPIV3 oder HPIV1 infiziert. Die Probengrößen (insgesamt n = 24 für Serumantikörperkonzentrationsexperimente, n = 96 für Einzelinfektionsexperimente und n = 24 für Koinfektionsexperimente) stimmten mit zuvor veröffentlichten Experimenten überein, in denen die Wirksamkeit monoklonaler RSV-Antikörper im Baumwollrattenmodell getestet wurde58. 59,84,85. In dieser Arbeit wurden nur männliche Tiere (4–8 Wochen alt) untersucht, da bei Erwachsenen mit RSV, HMPV, HPIV3 oder HPIV kein Zusammenhang zwischen Geschlecht und klinischen Ergebnissen beobachtet wurde186,87. Monoklonaler Antikörper wurde 2 Tage vor der Infektion intramuskulär in einer Menge von 5, 2,5 oder 1,25 mg/kg in 50 µL PBS verabreicht. Für das Koinfektionsmodell wurden 105 pfu jedes Virus in 100 µL 1 × DPBS gemischt, und 5 mg/kg jedes monoklonalen Antikörpers wurden in 50 µL 1 × DPBS gemischt. Nasenmuscheln und Lungen wurden zur Virustitration mittels Plaque-Assay 5 Tage nach der Infektion entnommen und durch Zentrifugation in DMEM geklärt. Konfluente Vero-Zellmonoschichten wurden in zweifacher Ausfertigung mit verdünnten Homogenaten in 24-Well-Platten beimpft. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Vertiefungen mit 0,8 % Methylzellulose überschichtet (hergestellt mit 1,2 % 0,05 % Trypsin für Proben von Tieren, die mit HMPV und HPIV1 infiziert waren). Nach 5 Tagen wurden die Plaques mit dem Typhoon-Imager gezählt, um die Titer in pfu pro Gramm Gewebe zu bestimmen. Aliquots von Nasenmuschel- und Lungenproben wurden außerdem für die Quantifizierung der Viruslast mittels Echtzeit-PCR aufbewahrt.

Die Serumkonzentrationen von MxR und 3 × 1 wurden mittels ELISA gemessen. Kurz gesagt, Nunc maxsorp 96-Well-Platten (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 442404) wurden 90 Minuten lang bei 4 °C mit 100 ng Ziegen-Anti-Human-Fab (Jackson ImmunoResearch, Kat.-Nr. 109-005-097) beschichtet. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 1 × DPBS gewaschen und dann mit 1 × DPBS, das 1 % Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. A2153) enthielt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Antigenbeschichtete Platten wurden 90 Minuten lang bei 4 °C mit Serum inkubiert. Eine Standardkurve wurde mit seriellen zweifachen Verdünnungen von Palivizumab erstellt. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 1×DPBS gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-Gesamt-Ig in einer Verdünnung von 1:6000 (Invitrogen, Kat.-Nr. 31412). Anschließend wurden die Vertiefungen viermal mit 1×DPBS gewaschen, gefolgt von einer 5–15-minütigen Inkubation mit TMB-Substrat (SeraCare, Kat.-Nr. 5120-0053). Die Absorption wurde bei 405 nm mit einem Softmax Pro-Plattenlesegerät (Molecular Devices) gemessen. Die Antikörperkonzentration in jeder Probe wurde anhand der Standardkurve und des Verdünnungsfaktors bestimmt.

Virale RNA wurde aus 140 μl Probenhomogenat mit dem QIAamp vRNA Mini Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 52904) extrahiert. Die RNA wurde mit 50 µL Wasser eluiert und 11 µL des Eluats wurden für die reverse Transkription verwendet. Benutzerdefinierte Reverse-Transkriptions-Primer für RSV (5'-TCCAGCAAATACACCATCCAAC-3') und HPIV3 (5'-CTAGAAGGTCAAGAAAAGGGAACTC-3') wurden entwickelt, um spezifisch an die Genomen von RSV bzw. HPIV3 zu binden. Ein Mikroliter jedes Primers mit 2 µM wurde in ein RT-Reaktionsgemisch mit 1 µL RNaseOut, 1 µL 0,1 M DTT, 4 µL SuperScript IV-Puffer und 1 µL SuperScript IV-Reverse-Transkriptase (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 18090200) gegeben ). Die reverse Transkription wurde mit dem folgenden Zyklus durchgeführt: 10 Minuten bei 42 °C, 10 Minuten bei 20 °C, 10 Minuten bei 50 °C und 10 Minuten bei 80 °C. Benutzerdefinierte TaqMan-Genexpressionsassays wurden für RSV (Vorwärtsprimer 5'-TGACTCTCCTGATTGTGGGATGATA-3', Rückwärtsprimer 5'-CGGCTGTAAGACCAGATCTGT-3' und Reporter 5'-CCCCTGCTGCTAATTT-3') und HPIV3 (Vorwärtsprimer, 5'-CGGTGACACAGTGGATCAGATT) entwickelt -3', Reverse-Primer 5'-TGTTTCAACCATAAGAGTTACCAAGCT-3' und Reporter 5'-ACCGCATGATTGACCC-3'). Die PCR-Reaktion bestand aus 2,5 µL dieser Primer, 10 µL der Reverse-Transkriptions-Reaktion, 25 µL TaqMan Universal Master Mix II mit UNG (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 4440038) und 12,5 µL Wasser. Die Echtzeit-PCR wurde mit dem Echtzeit-PCR-System QuantStudio 7 Flex mit den folgenden Parametern durchgeführt: 50 °C für 2 Minuten und 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 1 Minute. Um eine Standardkurve zu erstellen, wurde virale RNA aus mit Saccharose gereinigten RSV-Virusbeständen mit bekannten Titern in pfu/ml extrahiert. Die umgekehrte Transkription wurde wie oben durchgeführt. Die Reverse-Transkriptions-Reaktion wurde seriell achtmal im Verhältnis 1:4 in Wasser verdünnt. Die Echtzeit-PCR wurde wie oben durchgeführt und Standardkurven wurden erstellt, um die Viruslast mit der QuantStudio Real-time PCR Software v1.0 auf pfu/g zu interpolieren.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 7 durchgeführt. Paarweise statistische Vergleiche wurden mit dem zweiseitigen Mann-Whitney-Test durchgeführt. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Datenpunkte einzelner Proben werden angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzierungs- und Strukturdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden in der Protein Data Bank (PDB) und der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) hinterlegt und sind über die Zugangsnummern PDB 8DG8 (EMDB 27418) für 3×1/HPIV3 und PDB zugänglich 8DG9 (EMDB 27419) für MxR/RSV. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Giraud-Gatineau, A. et al. Vergleich der Mortalität im Zusammenhang mit respiratorischen Virusinfektionen zwischen Dezember 2019 und März 2020 mit der des Vorjahres im Südosten Frankreichs. Int. J. Infizieren. Dis. 96, 154–156 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruckwardt, TJ, Morabito, KM & Graham, BS Immunologische Lehren aus der Entwicklung von Impfstoffen gegen das Respiratory-Syncytial-Virus. Immunität 51, 429–442 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Drysdale, SB et al. Prioritäten für die Entwicklung von Impfstoffen gegen das Respiratory-Syncytial-Virus in verschiedenen Zielgruppen. Wissenschaft. Übers. Med. 12, eaax2466 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kennedy, LB, Li, Z., Savani, BN & Ljungman, P. Messung der Immunantwort auf häufig verwendete Impfungen bei erwachsenen Empfängern einer allogenen hämatopoetischen Zelltransplantation. Biol. Blutmarktranspl. 23, 1614–1621 (2017).

Artikel Google Scholar

Ambati, A. et al. Bewertung der Influenza-Impfung vor der Transplantation bei hämatopoetischer SCT: eine randomisierte prospektive Studie. Knochenmarktranspl. 50, 858–864 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Harris, AE et al. Impfungen vor der Transplantation bei allogenen Stammzelltransplantationsspendern und -empfängern: eine oft verpasste Chance für den Immunschutz? Knochenmarktranspl. 50, 899–903 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Boeckh, M. Die Herausforderung von Atemwegsvirusinfektionen bei Empfängern hämatopoetischer Zelltransplantate. Br. J. Hämatol. 143, 455–467 (2008).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Erard, V. et al. Rückgang des Luftstroms nach myeloablativer allogener hämatopoetischer Zelltransplantation: Die Rolle gemeinschaftlicher Atemwegsviren. J. Infizieren. Dis. 193, 1619–1625 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Agha, R. & Avner, JR Verzögerter saisonaler RSV-Anstieg während der COVID-19-Pandemie beobachtet. Pädiatrie 148, e2021052089 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Foley, DA et al. Das intersaisonale Wiederaufleben des Respiratory Syncytial Virus bei australischen Kindern nach der Reduzierung der Maßnahmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit im Zusammenhang mit der Coronavirus-Krankheit 2019. Klin. Infizieren. Dis. 73, e2829–e2830 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sieling, WD et al. Vergleichende Inzidenz und Belastung durch Atemwegsviren im Zusammenhang mit Krankenhausaufenthalten bei Erwachsenen in New York City. Influenza Andere Atemwege Viren 15, 670–677 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, N. et al. Belastung durch Nicht-Influenza-Virusinfektionen der Atemwege bei ins Krankenhaus eingelieferten Erwachsenen: Analyse einer mehrjährigen kanadischen Überwachungskohorte aus zwei Zentren. CMAJ 193, E439–E446 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker, RE et al. Die Auswirkungen nichtpharmazeutischer COVID-19-Interventionen auf die zukünftige Dynamik endemischer Infektionen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 30547–30553 (2020).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corti, D. et al. Kreuzneutralisierung von vier Paramyxoviren durch einen menschlichen monoklonalen Antikörper. Natur 501, 439–443 (2013).

Artikel CAS ADS PubMed Google Scholar

Schiffer, JT et al. Zeitpunkt und Schwere von ambulant erworbenen Atemwegsvirusinfektionen nach myeloablativer versus nicht-myeloablativer hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Haematologica 94, 1101–1108 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Crotty, MP et al. Epidemiologie, Koinfektionen und Folgen einer Viruspneumonie bei Erwachsenen: eine beobachtende Kohortenstudie. Medizin 94, e2332 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Saez-Llorens, X. et al. Sicherheit und Pharmakokinetik der Palivizumab-Therapie bei Kindern, die mit einer Infektion mit dem Respiratory-Syncytial-Virus ins Krankenhaus eingeliefert wurden. Pädiatr. Infizieren. Dis. J. 23, 707–712 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Meissner, HC Virale Bronchiolitis bei Kindern. N. engl. J. Med. 374, 62–72 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Polack, FP, Stein, RT & Custovic, A. Das Syndrom, auf das wir uns geeinigt haben, Bronchiolitis zu nennen. J. Infizieren. Dis. 220, 184–186 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

White, JM, Delos, SE, Brecher, M. & Schornberg, K. Strukturen und Mechanismen viraler Membranfusionsproteine: mehrere Variationen eines gemeinsamen Themas. Krit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 43, 189–219 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Connolly, SA, Leser, GP, Yin, HS, Jardetzky, TS & Lamb, RA Rückfaltung eines Paramyxovirus-F-Proteins von Präfusions- zu Postfusionskonformationen, beobachtet durch Liposomenbindung und Elektronenmikroskopie. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 103, 17903–17908 (2006).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ngwuta, JO et al. Präfusions-F-spezifische Antikörper bestimmen das Ausmaß der RSV-neutralisierenden Aktivität in menschlichen Seren. Wissenschaft. Übers. Med. 7, 309ra162 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilman, MS et al. Schnelle Profilierung des RSV-Antikörperrepertoires aus den Gedächtnis-B-Zellen natürlich infizierter erwachsener Spender. Wissenschaft. Immunol. 1, eaaj1879 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yin, HS, Paterson, RG, Wen, X., Lamb, RA & Jardetzky, TS Struktur der ungespaltenen Ektodomäne des Paramyxovirus (hPIV3)-Fusionsproteins. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 102, 9288–9293 (2005).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moscona, A. Interaktion des humanen Parainfluenzavirus Typ 3 mit der Wirtszelloberfläche. Pädiatr. Infizieren. Dis. J. 16, 917–924 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stewart-Jones, GBE et al. Strukturbasierter Entwurf eines quadrivalenten Fusions-Glykoprotein-Impfstoffs für das humane Parainfluenzavirus Typ 1–4. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 115, 12265–12270 (2018).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boonyaratanakornkit, J. et al. Schützende Antikörper gegen eine Infektion mit dem humanen Parainfluenzavirus Typ 3. MAbs 13, 1912884 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Battles, MB et al. Struktur und Immunogenität des vor der Fusion stabilisierten humanen Metapneumovirus-F-Glykoproteins. Nat. Komm. 8, 1528 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mas, V. et al. Technik, Struktur und Immunogenität des humanen Metapneumovirus-F-Proteins in der Postfusionskonformation. PLoS Pathog. 12, e1005859 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Henrickson, KJ Parainfluenzaviren. Klin. Microbiol Rev. 16, 242–264 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Graham, BS Impfstoffentwicklung für das Respiratory Syncytial Virus. Curr. Meinung. Virol. 23, 107–112 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Griffin, MP et al. Einzeldosis Nirsevimab zur RSV-Prävention bei Frühgeborenen. N. engl. J. Med. 383, 415–425 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hammitt, LL et al. Nirsevimab zur RSV-Prävention bei gesunden Spät- und Frühgeborenen. N. engl. J. Med. 386, 837–846 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wen, X. et al. Strukturelle Grundlage für die Antikörper-Kreuzneutralisierung des Respiratory Syncytial Virus und des humanen Metapneumovirus. Nat. Mikrobiol. 2, 16272 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, A. et al. Ein wirksamer, breit neutralisierender menschlicher RSV-Antikörper zielt auf die konservierte Stelle IV des Fusionsglykoproteins ab. Nat. Komm. 10, 4153 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilman, MSA et al. Vorübergehende Öffnung trimerer Präfusions-RSV-F-Proteine. Nat. Komm. 10, 2105 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mousa, JJ et al. Erkennung menschlicher Antikörper der Antigenstelle IV auf Pneumovirus-Fusionsproteinen. PLoS Pathog. 14, e1006837 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Harshbarger, W. et al. Konvergente Strukturmerkmale neutralisierender Antikörper des Respiratory Syncytial Virus und Plastizität des Site-V-Epitops bei Präfusion F. PLoS Pathog. 16, e1008943 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goodwin, E. et al. Säuglinge, die mit dem Respiratory-Syncytial-Virus infiziert sind, erzeugen starke neutralisierende Antikörper, denen eine somatische Hypermutation fehlt. Immunity 48, 339–349 e335 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ottolini, MG et al. Semipermissive Replikation und funktionelle Aspekte der Immunantwort in einem Baumwollrattenmodell einer Infektion mit dem humanen Parainfluenzavirus Typ 3. J. General Virol. 77, 1739–1743 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Boukhvalova, MS, Prince, GA & Blanco, JC Das Baumwollrattenmodell für respiratorische Virusinfektionen. Biologicals 37, 152–159 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y., Niewiesk, S. & Li, J. Kleintiermodelle für das menschliche Metapneumovirus: Baumwollratte ist freizügiger als Hamster und Maus. Pathogens 3, 633–655 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wyde, PR, Chetty, SN, Jewell, AM, Schoonover, SL & Piedra, PA Entwicklung eines Baumwollratten-Human-Metapneumovirus-Modells (hMPV) zur Identifizierung und Bewertung potenzieller hMPV-Virostatika und -Impfstoffe. Antivir. Res. 66, 57–66 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Skiadopoulos, MH et al. Bewertung der Replikation und Immunogenität rekombinanter humaner Parainfluenzavirus-Typ-3-Vektoren, die bis zu drei fremde Glykoproteine ​​exprimieren. Virology 297, 136–152 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Newman, JT et al. Erzeugung rekombinanter Impfstoffkandidaten gegen das humane Parainfluenzavirus Typ 1 durch Import temperaturempfindlicher und attenuierender Mutationen heterologer Paramyxoviren. J. Virol. 78, 2017–2028 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. et al. Das humane Parainfluenzavirus Typ 3, das das für die Virion-Verpackung modifizierte Pre-Fusion-F-Protein des Respiratory Syncytial Virus exprimiert, ergibt schützende intranasale Impfstoffkandidaten. PLoS ONE 15, e0228572 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herfst, S. et al. Erzeugung temperaturempfindlicher humaner Metapneumovirus-Stämme, die Hamstern eine schützende Immunität verleihen. J. General Virol. 89, 1553–1562 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wen, SC & Williams, JV Neue Ansätze zur Immunisierung und Therapie gegen das humane Metapneumovirus. Klin. Impfstoff. Immunol. 22, 858–866 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Bartlett, EJ et al. Humane Parainfluenzavirus-Typ-1-C-Proteine ​​sind nicht essentielle Proteine, die die Interferon- und apoptotischen Reaktionen des Wirts hemmen und für eine effiziente Replikation in nichtmenschlichen Primaten erforderlich sind. J. Virol. 82, 8965–8977 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herfst, S. et al. Die Immunisierung von Syrischen Goldhamstern mit dem F-Untereinheit-Impfstoff des humanen Metapneumovirus induziert einen Schutz vor einer Belastung mit homologen oder heterologen Stämmen. J. General Virol. 88, 2702–2709 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schickli, JH et al. Die Deletion des humanen Metapneumovirus M2-2 erhöht die Mutationshäufigkeit und schwächt das Wachstum bei Hamstern. Virol. J. 5, 69 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Skiadopoulos, MH et al. Die beiden wichtigsten genetischen Abstammungslinien des humanen Metapneumovirus sind antigenisch stark verwandt, und das Fusionsprotein (F) trägt maßgeblich zu dieser antigenen Verwandtschaft bei. J. Virol. 78, 6927–6937 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crowe, JE Jr. et al. Lebendimpfstoffe gegen das Respiratory-Syncytial-Virus der Untergruppe B, die bei Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten abgeschwächt, genetisch stabil und immunogen sind. J. Infizieren. Dis. 173, 829–839 (1996).

Artikel PubMed Google Scholar

Taylor, G. Tiermodelle der Respiratory-Syncytial-Virus-Infektion. Vaccine 35, 469–480 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchholz, UJ et al. Deletion der offenen Leserahmen 1 und 2 des M2-Gens des humanen Metapneumovirus: Auswirkungen auf die RNA-Synthese, -Abschwächung und Immunogenität. J. Virol. 79, 6588–6597 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

MacPhail, M. et al. Identifizierung von Kleintier- und Primatenmodellen zur Bewertung von Impfstoffkandidaten für das humane Metapneumovirus (hMPV) und Auswirkungen auf das hMPV-Impfstoffdesign. J. General Virol. 85, 1655–1663 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Murphy, BR & Collins, PL Lebendimpfstoffe gegen respiratorische Syncytial- und Parainfluenzaviren: Anwendungen der Reverse Genetik. J. Clin. Investig. 110, 21–27 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boukhvalova, MS, Yim, KC & Blanco, J. Baumwollrattenmodell zum Testen von Impfstoffen und Virostatika gegen das Respiratory-Syncytial-Virus. Antivir. Chem. Chemother. 26, 2040206618770518 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boukhvalova, M., Blanco, JC, Falsey, AR & Mond, J. Die Behandlung mit dem neuartigen RSV-Ig RI-002 kontrolliert die Virusreplikation und reduziert Lungenschäden bei immungeschwächtem Sigmodon hispidus. Knochenmarktranspl. 51, 119–126 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Johnson, S. et al. Entwicklung eines humanisierten monoklonalen Antikörpers (MEDI-493) mit starker In-vitro- und In-vivo-Aktivität gegen das Respiratory-Syncytial-Virus. J. Infizieren. Dis. 176, 1215–1224 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martin, ET, Kuypers, J., Wald, A. & Englund, JA Atemwegsinfektionen mit mehreren versus einzelnen Viren: Viruslast und klinische Schwere der Erkrankung bei hospitalisierten Kindern. Influenza Andere Atemwege Viren 6, 71–77 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Whaley, RE et al. Generierung einer kostengünstigen Zelllinie zur Unterstützung der Hochdurchsatzisolierung primärer menschlicher B-Zellen und monoklonaler neutralisierender Antikörper. J. Immunol. Methoden 488, 112901 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

McLellan, JS Neutralisierende Epitope auf dem Respiratory-Syncytial-Virus-Fusionsglykoprotein. Curr. Meinung. Virol. 11, 70–75 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas, NJ, Hollenbeak, CS, Ceneviva, GD, Geskey, JM & Young, MJ Palivizumab-Prophylaxe zur Verhinderung der Mortalität durch respiratorische Synzytialviren nach pädiatrischer Knochenmarktransplantation: ein Entscheidungsanalysemodell. J. Pädiatr. Hämatol. Oncol. 29, 227–232 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Joyce, MG et al. Kristallstruktur und Immunogenität des DS-Cav1-stabilisierten Fusionsglykoproteins aus dem Respiratory Syncytial Virus Subtyp B. Pathog. Immun. 4, 294–323 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Levin, MJ et al. Intramuskuläres AZD7442 (Tixagevimab-Cilgavimab) zur Prävention von Covid-19. N Engl J Med. 386, 2188–2200 (2022).

Biacchesi, S. et al. Gewinnung des humanen Metapneumovirus aus cDNA: Optimierung des Wachstums in vitro und Expression zusätzlicher Gene. Virology 321, 247–259 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bartlett, EJ et al. Durch Reverse Genetik entwickelte Impfstoffkandidaten gegen das humane Parainfluenzavirus Typ I (HPIV1) sind bei afrikanischen Grünen Meerkatzen abgeschwächt und wirksam. Vaccine 23, 4631–4646 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Munir, S. et al. Die nichtstrukturellen Proteine ​​1 und 2 des Respiratory Syncytial Virus unterdrücken die Reifung menschlicher dendritischer Zellen. J. Virol. 82, 8780–8796 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McLellan, JS et al. Strukturbasiertes Design eines Fusions-Glykoprotein-Impfstoffs gegen das Respiratory-Syncytial-Virus. Wissenschaft 342, 592–598 (2013).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wen, X. et al. Die Struktur des humanen Metapneumovirus-Fusionsproteins mit neutralisierendem Antikörper identifiziert eine Pneumovirus-Antigenstelle. Nat. Struktur. Mol. Biol. 19, 461–463 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, X. et al. Das rationale Design der Hülle identifiziert weitgehend neutralisierende humane monoklonale Antikörper gegen HIV-1. Wissenschaft 329, 856–861 (2010).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, J. et al. Isolierung menschlicher monoklonaler Antikörper aus peripheren Blut-B-Zellen. Nat. Protokoll. 8, 1907–1915 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGuire, AT et al. Spezifisch modifizierte Env-Immunogene aktivieren B-Zell-Vorläufer breit neutralisierender HIV-1-Antikörper in transgenen Mäusen. Nat. Komm. 7, 10618 (2016).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ & Brubaker, MA cryoSPARC: Algorithmen für die schnelle unbeaufsichtigte Kryo-EM-Strukturbestimmung. Nat. Methoden 14, 290–296 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cianfrocco, MA, Wong-Barnum, M., Youn, C., Wagner, R. & Leschziner, A. COSMIC2: ein wissenschaftliches Gateway für die Strukturbestimmung durch Kryo-Elektronenmikroskopie. In Proceedings of the Practice and Experience in Advanced Research Computing 2017 zu Nachhaltigkeit, Erfolg und Wirkung, (Hrsg. David, H.), Bd. 5, (Association for Computing Machinery, New York, NY, Vereinigte Staaten, 2017).

Sanchez-Garcia, R. et al. DeepEMhancer: eine Deep-Learning-Lösung für die Nachbearbeitung von Kryo-EM-Volumen. Komm. Biol. 4, 874 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liebschner, D. et al. Bestimmung der makromolekularen Struktur mithilfe von Röntgenstrahlen, Neutronen und Elektronen: jüngste Entwicklungen bei Phenix. Acta Crystallogr. Sekte. D-Struktur. Biol. 75, 861–877 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. Sekte. D Biol. Kristalllogr. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX: Strukturvisualisierung für Forscher, Pädagogen und Entwickler. Proteinwissenschaft. 30, 70–82 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Croll, TI ISOLDE: eine physikalisch realistische Umgebung für den Modellaufbau in niedrigaufgelösten Elektronendichtekarten. Acta Crystallogr. Sekte. D-Struktur. Biol. 74, 519–530 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Schrodinger, LLC Das PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.1.1 (Schrodinger, LLC, 2015) https://pymol.org/2/support.html?#citing.

Krissinel, E. & Henrick, K. Rückschluss auf makromolekulare Anordnungen aus dem kristallinen Zustand. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Johnson, RA, Prince, GA, Suffin, SC, Horswood, RL & Chanock, RM Respiratory-Syncytial-Virus-Infektion bei mit Cyclophosphamid behandelten Baumwollratten. Infizieren. Immun. 37, 369–373 (1982).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, H. et al. Entwicklung von Motavizumab, einem hochwirksamen Antikörper zur Vorbeugung von Respiratory-Syncytial-Virus-Infektionen in den oberen und unteren Atemwegen. J. Mol. Biol. 368, 652–665 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Y. et al. Schweregrad und Mortalität der Respiratory-Syncytial-Virus- vs. Influenza-A-Infektion bei hospitalisierten Erwachsenen in China. Influenza Andere Atemwege Viren 14, 483–490 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, N. et al. Hohe Morbidität und Mortalität bei Erwachsenen, die wegen Infektionen mit dem Respiratory-Syncytial-Virus ins Krankenhaus eingeliefert werden. Klin. Infizieren. Dis. 57, 1069–1077 (2013).

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Wir danken Julie McElrath für PBMCs aus der Seattle Area Control-Kohorte; Leo Stamatatos für die Nutzung von Laborräumen und -geräten; Andrew McGuire für die Bereitstellung von CD40L/IL2/IL21-exprimierenden 3T3-Zellen; Ramasamy Bakthavatsalam und LifeCenter Northwest für die Bereitstellung anonymisierter Milzreste; Ursula Buchholz, Shirin Munir und Peter Collins für die Bereitstellung der GFP-exprimierenden RSV, HMPV, HPIV3 und HPIV1; Peter Kwong, Guillaume Stewart-Jones und Aliaksandr Druz für die Expression von HPIV3 preF; Barney Graham für die Expression von RSV preF; Theodore Jardetzky und Xiaolin Wen für die Expression von HMPV preF; Steve Voght für das Korrekturlesen des Manuskripts; Paula Culver, Francesca Urselli und Laura Yates für administrative Unterstützung; die Fred Hutchinson Flow Cytometry Shared Resources für Unterstützung bei Instrumenten; die Fred Hutchinson Comparative Medicine Shared Resources zur Unterstützung bei der Unterbringung von Hamstern; und den Mitgliedern des Taylor Lab und des Boonyaratanakornkit Lab für hilfreiche Diskussionen. Experimentelle Schemata wurden mit BioRender.com erstellt. Diese Studie wurde von der Vaccine and Infectious Disease Division Faculty Initiative (JB und JJT) und dem Evergreen Beyond Pilot Award (JB und JJT) des Fred Hutchinson Cancer Center unterstützt, einer gesponserten Forschungsvereinbarung mit IgM Biosciences (JB und JJT), einem neuen Investigator Award der American Society for Transplantation and Cellular Therapy (JB) und der Amy Strelzer Manasevit Award des National Marrow Donor Program (JB). Ein Teil dieser Forschung wurde von U24 GM129547 vom NIH unterstützt und am PNCC der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, abgerufen. Weitere Elektronenmikroskopiedaten wurden mit der Fred Hutchinson Cancer Center Electron Microscopy Shared Resource generiert, die teilweise von P30 CA015704 unterstützt wird. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Madelyn Cabán, Justas V. Rodarte, Madeleine Bibby.

Abteilung für Impfstoffe und Infektionskrankheiten, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA

Madelyn Cabán, Justas V. Rodarte, Madeleine Bibby, Matthew D. Gray, Justin J. Taylor, Marie Pancera und Jim Boonyaratanakornkit

Abteilung für Immunologie und Abteilung für globale Gesundheit, University of Washington, Seattle, WA, USA

Madelyn Cabán und Justin J. Taylor

Medizinische Fakultät, University of Washington, Seattle, WA, USA

Jim Boonyaratanakornkit

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MC und MB konzipierten und führten die Experimente durch, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. MDG führte Experimente durch, analysierte Daten und redigierte das Manuskript. JVR und MP koordinierten und führten die Strukturanalyse durch und verfassten das Manuskript. JJT konzipierte die Studie, entwarf Experimente, analysierte die Daten und redigierte das Manuskript. JB konzipierte die Studie, konzipierte und führte die Experimente durch, analysierte die Daten und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Justin J. Taylor, Marie Pancera oder Jim Boonyaratanakornkit.

Die Autoren JB und JJT sind Erfinder von Patentanmeldungen, die vom Fred Hutchinson Cancer Center für die 3 × 1- und MxR-Antikörper eingereicht wurden. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Yaroslav Tsybovsky und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Cabán, M., Rodarte, JV, Bibby, M. et al. Kreuzschützende Antikörper gegen häufige endemische Atemwegsviren. Nat Commun 14, 798 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

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Eingegangen: 27. Juni 2022

Angenommen: 01. Februar 2023

Veröffentlicht: 13. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

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