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Oct 22, 2023

DNA-Sequenz- und Chromatin-Modifikatoren wirken zusammen, um den prägenden Kontrollregionen epigenetische Bistabilität zu verleihen

Nature Genetics Band 54,

Nature Genetics Band 54, Seiten 1702–1710 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Die genomische Prägung wird durch die elterliche DNA-Methylierung der Prägekontrollregionen (ICRs) reguliert. Trotz einer identischen DNA-Sequenz können ICRs in zwei unterschiedlichen epigenetischen Zuständen existieren, die über unbegrenzte Zellteilungen hinweg gespeichert und während der Keimbahnbildung zurückgesetzt werden. Hier untersuchen wir systematisch die genetischen und epigenetischen Determinanten dieser epigenetischen Bistabilität. Durch iterative Integration von ICRs und verwandten DNA-Sequenzen an einer ektopischen Stelle im Mausgenom identifizieren wir zunächst die DNA-Sequenzmerkmale, die für die Aufrechterhaltung epigenetischer Zustände in embryonalen Stammzellen erforderlich sind. Die autonomen regulatorischen Eigenschaften von ICRs ermöglichten es uns außerdem, DNA-methylierungsempfindliche Reporter zu entwickeln und nach Schlüsselkomponenten zu suchen, die an der Regulierung ihres epigenetischen Gedächtnisses beteiligt sind. Neben DNMT1, UHRF1 und ZFP57 identifizieren wir Faktoren, die den Übergang vom methylierten in den unmethylierten Zustand verhindern, und zeigen, dass zwei dieser Kandidaten, ATF7IP und ZMYM2, für die Stabilität der DNA- und H3K9-Methylierung an ICRs in embryonalen Stammzellen wichtig sind.

Die epigenetische Regulierung der Genaktivität hängt von mehreren Schichten von Chromatinmodifikationen ab, die während der DNA-Replikation erhalten bleiben1,2. Per Definition wirken diese epigenetischen Mechanismen unabhängig von der DNA-Sequenz an den Genomstellen, die sie besetzen. Mehrere Studien haben jedoch einen Beitrag der DNA-Sequenz zur Regulierung und Aufrechterhaltung von Chromatinmodifikationen hervorgehoben, wodurch eine klare Unterscheidung zwischen epigenetischer und genetischer Kontrolle der Genaktivität verhindert wird3,4,5,6,7,8. Genomische Prägung ist ein epigenetisches Phänomen, bei dem DNA-Methylierungsmarkierungen auf den mütterlichen oder väterlichen ICRs die elterspezifische Aktivität von Transkripten in cis9,10,11 bestimmen. ICRs erben elterliche DNA-Methylierungsmarkierungen entweder von der Eizelle oder dem Sperma, die dann in allen Körpergeweben der nächsten Generation vermehrt werden9. Die Vererbung unterschiedlicher epigenetischer Zustände auf den Elternchromosomen trotz identischer DNA-Sequenz, identischer Chromosomenposition und Exposition gegenüber denselben regulatorischen Faktoren im Zellkern machen ICRs zu einem hervorragenden Modell zur Untersuchung des individuellen Beitrags von DNA-Sequenz- und Chromatinmodifikationen zum epigenetischen Gedächtnis.

Es wurden mehrere Faktoren und Mechanismen identifiziert, die die Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung an ICRs regulieren. Sobald sich Methylierungsmarkierungen in der Keimbahn abgelagert haben12, sind die Erhaltungsmethyltransferase DNMT1 und ihr akzessorisches Protein UHRF1 für die Aufrechterhaltung der Methylierung während der DNA-Replikation verantwortlich13. Darüber hinaus wurden mehrere Faktoren identifiziert, die H3K9me3 an den DNA-methylierten ICRs regulieren, darunter SETDB1, KAP1 und G9A14,15,16. Wichtig. Der KRAB-Zinkfingerfaktor ZFP57 bindet die methylierte Hexanukleotid-DNA-Sequenz TGCmCGC und rekrutiert KAP1 und andere assoziierte Faktoren, um eine Rückkopplung zwischen DNA-Methylierung und H3K9me3 bei ICRs16,17 herzustellen. Tatsächlich sind die Bindung von ZFP57 und die Rekrutierung von KAP1 entscheidende Schritte bei der Regulierung von Abdrücken, da das Ausschalten (KO) von Zfp57 bei Mäusen zum Verlust fast aller Abdrücke und zur embryonalen Letalität führt18,19,20 und ZFP57 für die Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung erforderlich ist H3K9me3 bei ICRs in zellulären Systemen16,18,21.

Obwohl die Faktoren, die die DNA- und Histonmethylierung an ICRs steuern, umfassend untersucht wurden, wurden die DNA-Sequenzeigenschaften von ICRs nicht im Detail untersucht. Darüber hinaus ist auch nicht bekannt, ob weitere Schlüsselakteure zur epigenetischen Aufrechterhaltung an ICRs beitragen. Durch iterative Integration von ICR-DNA-Sequenzen an derselben Genomstelle in embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus zeigen wir, dass ICRs autonome genetische Elemente sind, die die an den endogenen Stellen beobachteten epigenetischen Zustände rekapitulieren können. Mit diesem Aufbau zeigen wir, dass wir durch die Voreinstellung der DNA-Methylierung zwei gegensätzliche epigenetische Zustände etablieren können, die durch den ektopischen ICR zuverlässig propagiert werden. Dieser von der DNA-Methylierung abhängige Schalter ist einzigartig bei ICRs. Durch die systematische Integration von Varianten- und synthetischen ICRs konnten wir die Sequenzanforderungen identifizieren, die für dieses schalterartige Verhalten notwendig und ausreichend sind. Darüber hinaus bestätigen wir durch die Verwendung der ektopischen ICRs als DNA-methylierungsempfindliche Reporter in genetischen Funktionsverlust-Screenings, dass DNMT1, UHRF1 und ZFP57 die zentralen epigenetischen Regulatoren der genomischen Prägung sind. Darüber hinaus identifizieren wir ATF7IP und ZMYM2 als Faktoren, die an der Regulierung der Aufrechterhaltung epigenetischer Zustände an ICRs beteiligt sind.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die DNA-Sequenz von ICRs ausreichende Informationen enthalten sollte, um die unterschiedlichen epigenetischen Zustände, die auf den Elternallelen beobachtet werden, zu etablieren und aufrechtzuerhalten (Erweiterte Daten, Abb. 1a). Wir haben vier ICRs aus den Prägeclustern Airn, Kcnq1ot1, Zrsr1 und H19 ausgewählt und mithilfe des Rekombinase-vermittelten Kassettenaustauschs (RMCE3) einzeln in das Genom von mESCs integriert (Abb. 1a). Um die unterschiedlichen DNA-Methylierungszustände der ICRs nachzuahmen, führten wir parallel RMCE für nicht methylierte ICRs und ICRs durch, die durch die bakterielle CpG-Methyltransferase M.SssI vormethyliert wurden (Abb. 1a und Extended Data Abb. 1b). Als Kontrollsequenz verwendeten wir den Igf2r-DMR (differentiell methylierte Region), einen Promotor, der nur während der Differenzierung eine differenzielle DNA-Methylierung erhält22. Darüber hinaus haben wir eine Reihe inaktiver Genpromotoren (Hes3, Tcl1 und Syt1) einbezogen, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie vor De-novo-DNA-Methylierung geschützt sind, wenn sie in dieselbe RMCE-Stelle integriert werden3 (Abb. 1b).

a, Experimenteller Überblick über die Erzeugung stabiler Zelllinien mit methylierten oder unmethylierten Spenderplasmiden unter Verwendung von RMCE. b, tabellarische Zusammenfassung der Methylierungsanalyse für alle integrierten ICRs, Kontroll-DMR und Promotorsequenzen. Endogene Methylierung (Endog. meth.) beschreibt den Methylierungszustand des endogenen Locus in mESCs. Mat., mütterliche Methylierung; Pat., väterliche Methylierung; n/a, keine Methylierung. Größe, CpG-Dichte (in 100 bp) und GC-Gehalt (%) werden angezeigt. Die gesamten Methylierungsprozentsätze der über RMCE integrierten DNA-Sequenzen, gemessen durch bsPCR, werden für Experimente mit unmethylierten (− M.SssI) und vormethylierten (+ M.SssI) Donorplasmiden gezeigt. n/d, nicht bestimmt. Sternchen kennzeichnen Messungen von Lienert et al.3. c, Detaillierte Methylierungsanalyse für den ektopischen Airn ICR. CpG-Positionen innerhalb der Airn-ICR-Sequenz werden durch schwarze vertikale Linien angezeigt. Amplifizierte Regionen für bsPCR werden dargestellt, und Einzelmolekülmessungen werden als schwarze Kreise angezeigt, die methylierten CpG-Dinukleotiden entsprechen, und weiße Kreise, die nicht methylierten CpG-Dinukleotiden entsprechen. Mit „x“ markierte CpG-Positionen entsprechen aufgrund von Sequenzierungsfehlern nicht ausgerichteten Nukleotiden. Aggregierte Methylierungswerte werden als farbcodierte vertikale Linien an der jeweiligen CpG-Position angezeigt. d, ChIP-qPCR-Messungen an ektopischen und endogenen ICRs im Vergleich zu einer intergenen Stelle. H3K9me3, blau; H3K4me2, orange. Datenpunkte zeigen einzelne technische Replikate an.

Nach erfolgreicher Integration haben wir die DNA-Methylierung an der RMCE-Stelle durch Bisulfit-Konvertierungs-PCR (bsPCR) gemessen. Alle vier ICRs behielten ihren zuvor festgelegten DNA-Methylierungsstatus an der ektopischen Stelle bei, obwohl in einigen Fällen eine geringfügige De-novo-Methylierung an den nicht methylierten ICRs beobachtet wurde (Abb. 1b, c und erweiterte Daten Abb. 1c – e). Im Gegensatz dazu wurde für das Igf2r-DMR und die Kontrollpromotorelemente keine Aufrechterhaltung der zuvor festgelegten DNA-Methylierung beobachtet (Abb. 1b und erweiterte Daten, Abb. 1f – i). Die unterschiedlichen DNA-Methylierungszustände am ektopischen Airn-ICR blieben nach längerer Kultivierung von mESCs über mehr als 20 Passagen oder nach Integration an eine andere RMCE-Position im Genom und auch nach In-vitro-Differenzierung von mESCs zu neuronalen Vorläufern stabil erhalten (Erweiterte Daten). Abb. 2a–c). Darüber hinaus blieb die DNA-Methylierung des ektopischen Airn-ICR nach 10-tägiger Kultivierung von mESCs in 2i-Medium trotz der globalen Verringerung von 5-Methylcytosin infolge des Erwerbs eines naiven Stammzellzustands immer noch auf hohem Niveau erhalten23,24,25,26 (Erweitert). Daten Abb. 2a,d).

Neben der DNA-Methylierung weisen endogene ICRs außerdem unterschiedliche Histonmodifikationen auf (Extended Data Abb. 1a), wobei der methylierte ICR durch H3K9me3 und der unmethylierte ICR durch H3K4me2 dekoriert wird (Ref. 14, 22, 27). Wir führten eine quantitative Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-PCR (qPCR) für H3K9me3 und H3K4me2 durch und verglichen die Anreicherung dieser Markierungen bei den RMCE-Integrationen der Airn- und Kcnq1ot1-ICRs mit ihren endogenen Gegenstücken (Abb. 1d). Die nicht methylierten ICRs an der RMCE-Stelle zeigten einen Mangel an H3K9me3 und einen Anstieg von H3K4me2, wohingegen die vormethylierten ICRs das entgegengesetzte Muster zeigten, mit einem Anstieg von H3K9me3 und einem Fehlen von H3K4me2 (Abb. 1d). Frühere Studien ergaben, dass das DNA-Methylierungs-spezifische KRAB-Znf-Protein ZFP57 für die Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung und von H3K9me3 bei endogenen ICRs erforderlich ist16,18,21. Diese Regulierung wird am ektopischen ICR wiederholt, da die Deletion von Zfp57 in mESCs durch CRISPR-Cas9 zu einem schnellen und vollständigen Verlust der DNA-Methylierung sowohl an ektopischen als auch an endogenen Stellen führt (Extended Data, Abb. 2e).

Wir wollten testen, ob die ICR-DNA-Sequenz für das epigenetische Gedächtnis erforderlich ist. Zunächst wollten wir herausfinden, ob kleinere ICR-Fragmente auch voreingestellte DNA-Methylierungsmuster effizient speichern würden, und wiederholten dieselben Experimente mit vier kleineren Fragmenten aus dem Airn-ICR (Abb. 2a und erweiterte Daten, Abb. 2f). Keines der getesteten Fragmente konnte die Aufrechterhaltung der unterschiedlichen Methylierung getreu wiedergeben. Das Gleiche wurde für den väterlich methylierten H19-ICR beobachtet (Extended Data Abb. 2g, h). Frühere Studien, die sich auf Nicht-ICR-Regulationsregionen (Promotoren, CpG-Inseln oder Enhancer) konzentrierten, haben gezeigt, dass die CpG-Dichte, der GC-Gehalt und/oder die Nukleotidsequenz die Etablierung von DNA-Methylierungsmustern beeinflussen können3,4,5,6. Basierend auf ihrer CpG-Dichte und ihrem GC-Gehalt liegen die hier getesteten ICRs im Bereich genomischer Elemente, die mit nichtmethylierten CpG-Inselpromotoren überlappen (Extended Data Abb. 3a). Um zu untersuchen, ob die CpG-Dichte und der GC-Gehalt der ICRs zur Aufrechterhaltung methylierter und unmethylierter Zustände beitragen, haben wir vier Genomregionen ausgewählt, die dem Airn-ICR in Bezug auf Größe, GC%, CpG-Anzahl und Verteilung sehr ähnlich sind (Extended Data Abb. 3b–d). Diese „Airn-ähnlichen“ Elemente konnten die unterschiedliche Methylierung nicht aufrechterhalten und nahmen einen hypomethylierten Zustand wie ihr endogenes Gegenstück an, was darauf hindeutet, dass die Länge der DNA-Sequenz, die CpG-Dichte und der GC-Gehalt nicht ausreichen, um zwei unterschiedliche epigenetische Zustände zu etablieren (Extended Data Abb. 3e, F).

a, Tabellarische Zusammenfassung der Methylierungsanalyse für alle Airn-ICR-Fragmente, schematisch dargestellt auf der linken Seite. Darüber hinaus werden für jedes Fragment die Fragmentlänge, die CpG-Dichten und der GC-Gehalt angezeigt. Gleiche Darstellung wie in Abb. 1b. b, Methylierungsanalyse für den gemischten Airn-ICR. Gleiche Darstellung wie in Abb. 1c. Mit „x“ markierte CpG-Positionen entsprechen aufgrund von Sequenzierungsfehlern nicht ausgerichteten Nukleotiden. c, ChIP-qPCR-Messungen am gemischten Airn-ICR an der ektopischen Stelle im Vergleich zum endogenen Airn-ICR. Datenpunkte zeigen einzelne technische Replikate. H3K9me3, blau; H3K4me2, orange. d, Methylierungsanalyse für den gemischten Airn-ICR mit wiederhergestellten ZFP57-Bindungsstellen. Gleiche Darstellung wie in Tafel b. e: Die Methylierungsanalyse für den gemischten Airn-ICR, der in murinen Erythroleukämiezellen (MEL) integriert ist, zeigt die Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung.

Um die direkte Anforderung der DNA-Sequenz vom CpG- und GC-Gehalt weiter zu unterscheiden, haben wir ein synthetisches DNA-Element basierend auf der Airn-ICR-Sequenz generiert, wobei wir die Inter-CpG-DNA-Sequenzen permutiert haben, bis eine Fehlpaarung von 78 % erreicht wurde (Extended Data Abb. 4a, B). Wichtig ist, dass durch die Permutation der ursprünglichen Sequenz der lokale GC-Gehalt sowie die Anzahl und Position der ursprünglichen CpGs erhalten blieben. Durch diesen Ersatz wurden alle Informationen zur DNA-Sequenz zwischen CpG entfernt, sodass wir den Beitrag der DNA-Sequenz von der CpG-Häufigkeit und -Verteilung unterscheiden konnten. Wir wiederholten die RMCE-Experimente mit diesem „gemischten“ Airn-ICR und stellten fest, dass der voreingestellte epigenetische Zustand nicht aufrechterhalten werden konnte (Abb. 2b). In beiden Fällen erreichte die DNA-Methylierung einen Zwischenwert von 40,3 % für die unmethylierte und 23,5 % für die vormethylierte Insertion, mit ungeordneten Methylierungsmustern (Abb. 2b). Die Sequenzänderungen führten weiterhin zu einer verringerten Etablierung von H3K9me3 und H3K4me2 an der RMCE-Stelle, unabhängig vom voreingestellten Methylierungszustand (Abb. 2c).

Das Mischen der Inter-CpG-DNA-Sequenz im Airn-ICR zerstörte alle ZFP57-Bindungsmotive, was den beobachteten Mangel an Aufrechterhaltung erklären könnte, in Übereinstimmung mit einer In-silico-Bewertung der ZFP57-Bindung an Wildtyp und gemischte Airn-ICR-Sequenz unter Verwendung von BPNet28 ( Erweiterte Daten Abb. 4c,d). Dementsprechend wollten wir untersuchen, ob ZFP57-Motive für die Aufrechterhaltung des epigenetischen Zustands ausreichend sind. Daher haben wir die ZFP57-Bindungsmotive im gemischten ICR wiederhergestellt (Extended Data Abb. 4e) und dieses methylierte und nicht methylierte DNA-Element in die RMCE-Stelle in mESCs eingeführt. Obwohl die unmethylierte Version den hypomethylierten Zustand nicht aufrechterhalten konnte, konnte der vormethylierte ICR einen vollständig hypermethylierten Zustand aufrechterhalten (Abb. 2d). Angesichts dieser Beobachtungen haben wir uns gefragt, ob der Bedarf an ZFP57-Bindungsstellen vom zellulären Kontext abhängt, insbesondere da die Genexpression von Zfp57 gewebespezifisch ist18,29. Daher führten wir den gemischten Airn-ICR in RMCE-kompetente Maus-Erythroleukämiezellen (MEL) ein und führten eine gezielte Bisulfitsequenzierung durch. Sowohl methylierte als auch nicht methylierte gemischte ICRs behielten die voreingestellten DNA-Methylierungsmuster bei (Abb. 2e), was darauf hinweist, dass in MEL-Zellen der CpG-Gehalt für die Erinnerung an DNA-Methylierungszustände ausreicht.

Endogene ICRs sind cis-regulierende Elemente, die die allelische Expression benachbarter Transkripte basierend auf ihrem DNA-Methylierungszustand bestimmen9. Wir wollten zunächst testen, ob ICR-Sequenzen drei verschiedene Reporterkonstrukte in Gegenwart einer DNA-Methylierung zum Schweigen bringen können, wenn sie zusammen in die RMCE-Stelle integriert werden (Abb. 3a und erweiterte Daten Abb. 5a). Wir haben drei häufig verwendete konstitutive Promotoren (pCAGGS, hEF1alpha und hPGK) ausgewählt und gezeigt, dass sie die Expression eines GFP-Reporters an der RMCE-Integrationsstelle in Abwesenheit von ICRs aufrechterhalten können (Extended Data, Abb. 5b). Als nächstes haben wir die Fähigkeit von drei methylierten ICRs (Airn, Kcnq1ot1 und Peg10) gemessen, diese Promotoren an derselben RMCE-Integrationsstelle stabil zu unterdrücken (Abb. 3b). Alle getesteten ICR-Sequenzen zeigten in Kombination mit den Ef1alpha- und hPGK-Promotoren eine stabile Repression. Im Gegensatz dazu konnten die methylierten Promotoren ohne ICRs oder in Kombination mit dem Dazl-Promotor, von dem bekannt ist, dass er DNA-methylierungsabhängig reguliert wird31, keinen unterdrückten Zustand aufrechterhalten (Abb. 3b). Der synthetische pCAGGS-Promotor lieferte je nach verwendetem ICR unterschiedliche Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass die Stärke dieses zusammengesetzten Promotors die durch einige ICRs induzierte epigenetische Repression überwinden kann (Abb. 3b). Die DNA-Methylierung-abhängige Repression blieb über längere Zeiträume erhalten, gemessen anhand der GFP-Aktivität in mehreren klonal abgeleiteten Populationen nach 16, 23 und 30 Tagen (Extended Data, Abb. 5c). Die gleiche methylierte ICR-abhängige Repression wurde für den väterlich methylierten H19-ICR beobachtet (Extended Data Abb. 5d).

a, Schematischer und experimenteller Überblick über die Generierung von Reporterzelllinien mit RMCE. b, Durchflusszytometrische Analyse der GFP-Expression 12 Tage nach der Transfektion mit verschiedenen vormethylierten ICR/Promotor-Kombinationen. Jeder Datenpunkt zeigt den Prozentsatz der GFP-positiven Zellenmessung aus einer klonal abgeleiteten Zellpopulation. c: Die durchflusszytometrische Analyse zeigt den Prozentsatz an GFP-positiven Zellen in unabhängigen Zelllinien an, die methylierte oder nicht methylierte RMCE-Donorplasmide erhalten, die den gemischten Wildtyp-Airn-ICR oder den gemischten Airn-ICR mit rekonstituierten ZFP57-Stellen in Kombination mit dem pEF1a-Promotor enthalten. Die GFP-Aktivität wurde zu zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (16 und 23 Tage) gemessen. d, Durchflusszytometrische Analyse von drei unabhängigen Klonen mit dem methylierten Airn-CAG-Reporter nach zweitägiger Behandlung mit dem DNA-Methylierungsinhibitor GSK-3484862 und unbehandelten und DMSO-Kontrollen. Die Messungen wurden 7 Tage nach dem Auswaschen des Arzneimittels wiederholt, um die Umkehrung der Reporter-Stummschaltung zu testen. Gleiche Darstellung wie in Tafel b.

Mit diesem Aufbau konnten wir den Beitrag der DNA-Methylierung und -Sequenz zum Stummschaltungspotenzial von ICRs testen. Hierzu verwendeten wir das Airn-pEF1a-GFP-Reporterkonstrukt, das bei unmethylierter Insertion eine stabile Aufrechterhaltung der GFP-Expression und bei methylierter Insertion eine stabile Stummschaltung zeigte (Abb. 3c). Als wir den Airn-ICR durch die gemischte Airn-Version ersetzten, beobachteten wir bei den meisten gemessenen Klonen bereits nach 16 Tagen einen Verlust der Stummschaltung und sogar noch mehr nach längerer Kultivierung, was darauf hindeutet, dass die methylierungsabhängige Stummschaltung in cis eine intakte ICR-Sequenz erfordert (Abb. 3c). Schließlich führten wir die gemischte Airn-Sequenz ein, die wiederhergestellte ZFP57-Bindungsstellen enthält. Obwohl die unmethylierte Version zu einem stochastischen Verlust der Transkriptionsaktivität führte, führte das methylierte Konstrukt zu einer stabilen Unterdrückung des nahegelegenen Promotors über mehrere Generationen, was darauf hindeutet, dass die ZFP57-Bindung nicht nur für die Aufrechterhaltung des epigenetischen Gedächtnisses bei ICRs erforderlich ist, sondern auch für die epigenetische Stummschaltung ausreicht in cis (Abb. 3c).

Um zu testen, ob die DNA-Methylierung von ICRs für die Unterdrückung des benachbarten Promotors erforderlich ist, haben wir die etablierten Reporterzelllinien herausgefordert, indem wir sie in 2i- und 2i + Vitamin C-Medien kultiviert haben. Beide Erkrankungen verringern die genomweiten DNA-Methylierungsniveaus23,24,25, wohingegen die Zugabe von Vitamin C zu einer weiteren Entfernung der DNA-Methylierung aus ICRs und repetitiven Elementen führt26,32. Die GFP-Repression wurde im 2i-Medium aufrechterhalten; Die Unterdrückung ging jedoch in Gegenwart von 2i + Vitamin C zunehmend verloren (Extended Data Abb. 5e – g). Um die Abhängigkeit von der DNA-Methylierung zur Aufrechterhaltung des unterdrückten Zustands bei den ICR-Reportern weiter zu testen, führten wir KO-Experimente der allgemeinen DNA-Methylierungs-Aufrechterhaltungsfaktoren Uhrf1 und Dnmt1 durch (Lit. 33). Wie erwartet führte die Entfernung der DNA-Methylierung in diesen KO-Zellen innerhalb von 7 Tagen zu einer Reaktivierung des ICR-Reporters (Extended Data Abb. 6a,b). Der geringe Prozentsatz an Zellen, die in diesen Tests eine GFP-Reaktivierung zeigen, ist auf die geringe KO-Effizienz im CRISPR-Zielzellpool zurückzuführen. Daher haben wir den Airn-ICR-Reporter 2 Tage lang in Gegenwart des DNMT1-Inhibitors GSK-3484862 (Ref. 34) kultiviert. Wir beobachteten eine vollständige Reaktivierung bei über 95 % der Zellen, die GFP exprimierten (Abb. 3d und erweiterte Daten, Abb. 6c). Durch die Verwendung dieses DNMT1-Inhibitors konnten wir außerdem testen, ob die Reaktivierung reversibel ist. Daher haben wir GSK-3484862 aus dem Medium entfernt und die Kultivierung nach dem Auswaschen noch 7 Tage lang fortgesetzt (Abb. 3d und erweiterte Daten Abb. 6c). Wir haben keine erneute Stummschaltung aktivierter Reporter beobachtet, was darauf hindeutet, dass der ICR nach dem Einschalten nicht in den Stummzustand zurückkehren kann.

Nachdem wir mehrere ICR-spezifische Reporterzelllinien etabliert hatten, wollten wir nach Proteinen suchen, die für die Aufrechterhaltung repressiver ICR-Zustände erforderlich sind. Wir haben den CRISPR-Screening-Workflow zunächst mithilfe einer gezielten Bibliothek für 1.051 Chromatin-bezogene Faktoren mit 6.204 Leit-RNAs (ChromMM-Bibliothek) und einer Kontrollbibliothek mit 500 nicht zielgerichteten Leitfäden in der pCAGGS-Airn-Reporterzelllinie etabliert (Abb. 4a und erweiterte Daten). Abb. 7a) und wir haben den Zeitpunkt für die Sammlung positiver Klone bestimmt (Extended Data Abb. 7b). Wir führten das Screening in drei methylierten ICR-Reporterlinien (Airn, Kcnq1ot1 und Peg10) durch, sammelten nach 8 Tagen GFP-positive Zellen und wiederholten das Screening auf Airn, Kcnq1ot1 unter sensibilisierten 2i-Mediumbedingungen (Extended Data Abb. 7c, d).

a, Experimenteller Überblick über gezielte CRISPR-Screens mit mehreren vormethylierten ICR-Reportern. Die Gating-Strategie wird in „Extended Data“ Abb. 7a und „Methoden“ beschrieben. b, Übersicht über Treffer aus CRISPR-Screenings in drei unter Serumbedingungen gezüchteten ICR-Reporterzelllinien. Blaue Punkte zeigen Gene mit einem P-Wert < 0,01 an, der mithilfe von MAGeCK RRA (robuste Rangaggregation) berechnet wurde. Gestrichelte Linien zeigen den P-Wert-Schwellenwert bei 0,05 an. c, Heatmap, die potenzielle Kandidaten aus allen CRISPR-Bildschirmen zeigt. Die Farbe zeigt die zusammengefasste logarithmische Faltungsänderung über alle Guides für ein bestimmtes Gen an, wie von MAGeCK bestimmt. Die Anreicherungen wurden berechnet, indem alle Replikate für einen Vergleich kombiniert wurden, wobei die GFP-angereicherte Fraktion mit dem unsortierten Zellpool verglichen wurde. Asterisk gibt P < 0,05 unter Verwendung der robusten Rangaggregation von MAGeCK an. Siehe entsprechendes Feld b und erweiterte Daten Abb. 8b,d. Genaue P-Werte finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Wie erwartet erzielten die drei Positivkontrollen Zfp57, Uhrf1 und Dnmt1 in allen Screens die höchsten Treffer (Abb. 4b, c, Erweiterte Daten Abb. 8a – c und Ergänzungstabelle 1). Darüber hinaus wurden andere Heterochromatin-assoziierte Faktoren wie Cbx1, Cbx5, Atrx, Daxx und Setdb1 in der GFP-positiven Fraktion angereichert. Die Liste der Treffer mit hoher Zuverlässigkeit, die in allen Screens wiederholt gefunden wurden, wurde um Zfp57, Uhrf1 und Dnmt1 erweitert, während andere Treffer in einzelnen ICR-Reporterzelllinien identifiziert wurden (Abb. 4c). Wir haben eine erweiterte CRISPR-Bibliothek (EpiTF) neu gestaltet, die aus 20.470 Guide-RNAs für 4.095 Gene besteht, die Kernfaktoren kodieren, um einen großen Teil der KRAB-Zinkfinger-Proteinfamilie abzudecken, und das Screening mit dem Airn ICR-Reporter wiederholt (Ergänzungstabelle 1). Trotz der erhöhten Komplexität der Bibliothek haben wir keine zusätzlichen Transkriptionsfaktoren identifiziert, die bei der Aufrechterhaltung der Airn-Reporter-Stummschaltung eine Rolle spielen (Abb. 4c und erweiterte Daten, Abb. 8d, e). Mehrere in mehr als einem Screen identifizierte Kandidaten wurden durch Single-KO-Validierung getestet. Zfp57, Uhrf1 und Dnmt1 zeigten eine konsistente Hochregulierung in allen drei Reporterlinien, wohingegen andere Kandidaten in einigen der getesteten Reporterlinien zu einer geringeren oder stochastischen Reaktivierung führten (Extended Data Abb. 8f).

Zwei Faktoren wurden in mindestens drei verschiedenen Screens identifiziert (Abb. 4c und Extended Data Abb. 8g): ATF7IP, verantwortlich für die SETDB1-vermittelte Stummschaltung transponierbarer Elemente 35, 36, 37, sowie ZMYM2, ein mit ATF7IP interagierender Faktor Wachstumsbeschränkung menschlicher pluripotenter Zellen38,39. Aufgrund ihrer Assoziation mit H3K9me3 und der berichteten Beteiligung an der Transkriptionsstummschaltung repetitiver Elemente haben wir ihren Beitrag zur Regulierung der epigenetischen Aufrechterhaltung an ICRs getestet. Darüber hinaus wurde kürzlich festgestellt, dass menschliches ATF7IP ein Repressor väterlich exprimierter geprägter Gene ist und für die Stummschaltung spermienspezifischer Gene erforderlich ist40. Wir wollten zunächst sehen, ob diese Faktoren tatsächlich auf die endogenen ICRs zurückzuführen sind, und analysierten vorhandene mESC-ChIP-seq-Datensätze, die für SETDB1 (Ref. 41), ZFP57 (Ref. 42), ATF7IP39 und ZMYM2 (Ref. 43) verfügbar sind. Wir beobachteten eine starke Kolokalisierung aller Faktoren an den endogenen ICRs, die in den CRISPR-Screenings verwendet wurden (Abb. 5a). Durch die weitere Ausweitung unserer Analyse auf alle annotierten ICRs stellen wir fest, dass fast alle ICRs durch ATF7IP, ZMYM2, ZFP57 und SETDB1 gemeinsam gebunden sind (Abb. 5b). Bemerkenswerte Ausnahmen sind MCTS2/H13, wo ATF7IP fehlt, und H19, das eine reduzierte Lokalisierung von ZMYM2 zeigt. Als allgemeiner Trend beobachten wir, dass ATF7IP und ZMYM2 immer in Gegenwart von SETDB1 und ZFP57 kolokalisieren, was darauf hindeutet, dass sie sich als Teil der H3K9me3-Maschinerie in ICRs lokalisieren. Interessanterweise zeigt die genomweite Analyse der ATF7IP-, ZMYM2-, ZFP57- und SETDB1-Peaks, dass diese Kolokalisierung außerhalb von ICRs nicht immer beobachtet wird. Obwohl die Mehrheit (85 %) der wenigen von uns entdeckten ATF7IP-Peaks mit ZFP57- und SETDB1-Stellen überlappen, kolokalisieren nur 30 % der ZMYM2-Peaks mit ZFP57 und SETDB1 (Extended Data Abb. 9a). ZMYM2-Peaks außerhalb der ZFP57/SETDB1-Stellen zeigen eine geringere H3K9me3- und DNA-Methylierung im Vergleich zu Peaks, die mit ZFP57/SETDB1 überlappen, was darauf hindeutet, dass ZMYM2 unabhängig von SETDB1 an mehreren Regulationswegen beteiligt ist (Extended Data Abb. 9b, c). Unabhängig von dieser Bindung sehen wir eine Verringerung der ATF7IP- und ZMYM2-Lokalisierung in den Airn-ICRs in Abwesenheit von ZFP57 (Extended Data Abb. 9d).

a, Genom-Browser-Snapshots für die ICRs Airn, Kcnq1ot1 und Peg10, die in den CRISPR-Bildschirmexperimenten verwendet wurden. ChIP-seq-Datensätze weisen auf eine Kolokalisierung von ZFP57, ATF7IP, ZMYM2 und SETDB1 an den interessierenden ICRs hin. b, Heatmaps, die die Bindung von ATF7IP, ZMYM2, ZFP57, SETDB1 und H3K9me3 10 kb (k) stromaufwärts und stromabwärts an allen annotierten ICRs im Mausgenom zusammenfassen. Dargestellt sind bibliotheksnormalisierte Lesevorgänge pro 20 bp. c, links: schematische Darstellung des Biotin-Proximity-Ligationsaufbaus zum Nachweis von Proteinen an ZFP57-gebundenen Stellen im Vergleich von ZFP57 fusioniert mit TurboID. LC MS/MS: Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie. Rechts: Vulkandiagramm mit angereicherten Proteinen und statistisch signifikanten Treffern aus einem direkten Vergleich zwischen ZFP57-TurboID und TurboID-NLS (nTurboID). Statistisch angereicherte Proteine ​​sind angegeben (FDR-korrigierter zweiseitiger t-Test mit falscher Entdeckungsrate: FDR = 0,05, künstliche Varianz innerhalb der Gruppen (s0) = 1, n = 4 technische Replikate). d: Die DNA-Methylierungsanalyse an ausgewählten ICRs zeigt einen Methylierungsverlust in Atf7ip-KO- und Zmym2-KO-Zellen (siehe erweiterte Daten, Abb. 10c für andere ICRs). Dargestellt sind Methylierungswerte für einzelne CpGs, die aus WGBS in Wildtyp-, Zmym2-KO- oder Atf7ip-KO-Zellen erhalten wurden. Die genomische Position der CpGs ist unten angegeben. e, H3K9me3 ChIP-seq zeigt den Verlust von H3K9me3 bei den ausgewählten ICRs an (Extended Data Abb. 10e für andere ICRs). Dargestellt sind Lesevorgänge pro 100-bp-Fenster. ICRs in den jeweiligen Prägeregionen werden angezeigt.

Um die Verbindung zwischen ATF7IP und ZMYM2 an ICRs weiter zu untersuchen, rekrutierten wir die Proximity-Biotin-Ligase TurboID44 für methylierte ICRs über ein ZFP57-TurboID-Fusionsprotein, das von der RMCE-Stelle exprimiert wurde, und führten BioID wie zuvor beschrieben durch (Abb. 5c). Als Hintergrundkontrolle generierten wir eine Zelllinie, die nur NLS-TurboID (nTurbo) exprimierte, und schlossen eine Zelllinie ein, die nur die KRAB-Domäne von ZFP57 exprimierte, fusioniert mit der TurboID-Ligase, um zwischen Proteinen zu unterscheiden, die mit ZFP57 interagieren, wenn sie nicht an Chromatin gebunden sind. Der massenspektrometrische Nachweis angereicherter Proteine ​​umfasste mehrere Faktoren, die zuvor mit ZFP57 assoziiert waren (KAP1, CBX3, CBX5 und MORC3). Unter ihnen haben wir ATF7IP entdeckt (Abb. 5c, erweiterte Daten, Abb. 9e und Ergänzungstabelle 1), was die Ergebnisse des CRISPR-Screenings und der genomweiten Analyse stützt. Im Fall von ZMYM2 konnten wir das Protein in der biotinylierten Fraktion oder der Hintergrundprobe nicht nachweisen, was darauf hindeutet, dass seine Anreicherung entweder unter der Nachweisgrenze lag oder nicht spezifisch mit ZFP57 interagierte.

Als nächstes wollten wir testen, ob das Fehlen dieser Faktoren, die während der frühen Mausentwicklung exprimiert werden, den epigenetischen Zustand bei endogenen ICRs beeinflusst, und wir haben mithilfe von CRISPR-Cas9 KO-mESCs für Atf7ip und Zmym2 generiert (Extended Data Abb. 9f, g). Die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms (WGBS) ergab eine Verringerung der DNA-Methylierung bei der Mehrzahl der analysierten ICRs, trotz eines begrenzten Verlusts der Methylierung im gesamten Genom (Abb. 5d und erweiterte Daten Abb. 10a – c). Peg13- und Meg3/Rian-ICRs behielten die DNA-Methylierung in beiden KO-Zelllinien bei, wohingegen H13/Mcts und Gnas/Nespas spezifisch die Methylierung in Abwesenheit von ZMYM2 und Zrsr1/Commd1 und H19 in Abwesenheit von ATF7IP beibehielten. Der Verlust der ICR-Methylierung wurde durch gezielte Bisulfitsequenzierung um die Bindungsstellen von ATF7IP und ZMYM2 an den Airn-, Kcnq1ot1- und Peg10-ICRs weiter bestätigt (Extended Data, Abb. 10d). Schließlich haben wir H3K9me3 in denselben KO-Zelllinien profiliert und einen Verlust von H3K9me3 bei allen ICRs beobachtet, mit Ausnahme von Peg13 und Meg3/Rian, die H3K9me3 in beiden KO-Linien behielten. Darüber hinaus behielten Zrsr1/Commd1 und H19 H3K9me3 in Atf7ip-KO-Zellen (Abb. 5e und Extended Data Abb. 10e). Die übereinstimmenden Veränderungen der DNA-Methylierung und von H3K9me3 an ICRs in Abwesenheit von ATF7IP oder ZMYM2 weisen darauf hin, dass diese Faktoren erforderlich sind, um den Wechsel von ICRs vom methylierten in den unmethylierten Zustand in mESCs zu verhindern.

Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, die genetischen und epigenetischen Determinanten zu untersuchen, die es ICRs ermöglichen, ihre unterschiedliche DNA-Methylierung aufrechtzuerhalten. Zu diesem Zweck haben wir ICRs aus ihrem endogenen chromosomalen Kontext isoliert und sie an einer heterologen Position im mESC-Genom eingefügt. Bei unmethylierter Integration behielten die getesteten ICRs einen DNA-methylierungsfreien und euchromatischen Zustand bei, was auf sequenzspezifische Mechanismen schließen lässt, die eine De-novo-Methylierung verhindern. Dieses Verhalten ähnelt CpG-Inselpromotoren, die durch eine erhöhte CpG-Dichte vor DNA-Methylierung geschützt sind4,5. Basierend auf ihrer CpG-Dichte und ihrem GC-Prozentsatz erfüllen die meisten ICRs tatsächlich die Definition von CpG-Inseln. Im Gegensatz dazu überschreibt die Integration von DNA-methylierten ICR-Sequenzen an derselben Stelle diesen Standardzustand und führt zu einer stabilen Ausbreitung der DNA-Methylierung mit anschließender Etablierung von Heterochromatin-Markierungen. Somit sind ICRs autonome DNA-Sequenzelemente, die die an ihrer endogenen Position beobachteten epigenetischen Regulationsmechanismen rekapitulieren können. Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Arbeiten, die darauf hinweisen, dass die DNA-Sequenz von ICRs ausreicht, um die Etablierung von Abdrücken während der Mausentwicklung zu rekapitulieren45,46,47,48,49. Wichtig ist, dass dieser auf DNA-Methylierung basierende Wechsel zwischen zwei gegensätzlichen Chromatinzuständen bei Nicht-ICR-Promotoren und anderen DNA-Sequenzen ähnlicher Größe, CpG-Dichte oder GC-Gehalt nicht beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass hierfür spezielle Eigenschaften des Volllängen-ICR erforderlich sind. epigenetische Bistabilität‘.

Die ektopischen ICRs ermöglichten die systematische Untersuchung der DNA-Sequenzen und Chromatin-Regulationsfaktoren, die für die Schaffung und Aufrechterhaltung des epigenetischen Gedächtnisses an ICRs in einer kontrollierten genomischen Umgebung erforderlich sind. Durch die Einführung synthetischer ICRs mit modifizierten DNA-Sequenzen stellen wir fest, dass der GC-Gehalt und die CpG-Dichte nicht ausreichen, um die Bistabilität in mESCs zu kodieren, sondern dass zusätzliche Sequenzen, wie z. B. ZFP57-Bindungsmotive, eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der DNA- und H3K9-Methylierung spielen. Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Arbeiten, bei denen Mutationen der methylierten CpGs des ZFP57-Erkennungsmotivs zum Verlust der Aufrechterhaltung der Methylierung über den gesamten Snrpn ICR21 führten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die ZFP57-Bindung nicht nur erforderlich, sondern auch ausreichend für das epigenetische Gedächtnis im methylierten Airn-ICR-Zustand in mESCs ist. Im Fall des nicht methylierten Allels führen dieselben Sequenzänderungen zu einem Verlust des Schutzes vor De-novo-Methylierung, was auf sequenzspezifische Mechanismen hindeutet, die vor De-novo-Methylierung schützen, möglicherweise ähnlich denen, die in regulatorischen Regionen nicht geprägter Gene beobachtet werden3,5. Da die Aufrechterhaltung der differentiellen Airn-ICR-Methylierung in MEL-Zellen jedoch unabhängig von DNA-Sequenzen außerhalb von CpGs war, schlagen wir eine zelltypspezifische Anforderung für sequenzspezifische Faktoren vor, die an der epigenetischen Aufrechterhaltung beteiligt sind. Im Fall von ZFP57 stünde dies im Einklang mit seiner auf Keimzellen und während der frühen Entwicklung beschränkten Transkriptionsaktivität18,29.

Nachdem wir die robuste Etablierung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin an methylierten ICRs identifiziert hatten, konnten wir Reporterzelllinien erzeugen, die auf DNA-Methylierung reagieren. Im Gegensatz zu früheren Strategien, bei denen der Snrpn-Promotor zur Meldung von Methylierungsänderungen an endogenen Genpromotoren verwendet wurde, berichten unsere Zelllinien direkt über regulatorische Änderungen an den eingeführten ICRs. Wir nutzten diese Reporter, um nach Faktoren zu suchen, die für die Aufrechterhaltung des unterdrückten Zustands erforderlich sind. Gezielte CRISPR-Screenings identifizieren Dnmt1, Uhrf1 und Zfp57 als die relevantesten Gene, die zur Aufrechterhaltung des DNA-Methylierungsstatus in allen getesteten ICRs erforderlich sind, was die Eignung unseres Aufbaus bestätigt. Darüber hinaus identifizierten und validierten unsere Funktionsscreenings zusätzliche Faktoren, von denen beschrieben wurde, dass sie H3K9me3 im gesamten Genom regulieren und mit ICRs assoziieren, einschließlich DAXX, ATRX, CBX1 und CBX5 (Ref. 14, 52, 53).

Unter den erhaltenen Treffern identifizierten wir ATF7IP und ZMYM2 als Faktoren, die an der Aufrechterhaltung der epigenetischen Repression bei ICR-Reportern beteiligt sind. ATF7IP und SETDB1 zeigen funktionelle Überschneidungen bei der Regulierung endogener retroviraler Elemente, wobei ATF7IP als Cofaktor von SETDB1 fungiert, indem es dessen enzymatische Aktivität stimuliert, es vor proteasomalem Abbau schützt und seine Kernlokalisierung erleichtert35,37,54,55. Obwohl der Verlust von SETDB1 in mESCs tödlich ist, verringert das Fehlen von ATF7IP den SETDB1-Spiegel, der für die Lebensfähigkeit ausreicht, aber nicht ausreicht, um alle unterdrückten Stellen im Genom aufrechtzuerhalten37,56. Es wurde gezeigt, dass die C-terminale Fibronektin-Typ-III-Domäne von ATF7IP mit ZMYM2 (auch ZFP198) interagiert, und es wurde vermutet, dass diese Interaktion für die Stummschaltung einiger keimbahnspezifischer Gene, einschließlich des geprägten FKBP6-Gens, wichtig ist39,57. Es wurde auch beschrieben, dass ZMYM2 mit H3K9me3-markiertem Chromatin interagiert58,59 und darüber hinaus für die Stummschaltung endogener retroviraler Elemente erforderlich ist, wodurch der Übergang zu zweizellähnlichen Zellen in der mESC-Kultur verhindert wird43,54. Die Rolle von ZMYM2 bei der Einschränkung der Potenz wird weiter durch die Tatsache gestützt, dass ZMYM2 für den Ausstieg aus der Pluripotenz erforderlich ist38,60. Wir zeigen, dass ATF7IP und ZMYM2 zusammen mit ZFP57 und SETDB1 bei den meisten endogenen ICRs in mESCs kolokalisieren und für die Erinnerung an den epigenetischen Zustand bei methylierten ICRs erforderlich sind. Dies steht im Einklang mit einer Veröffentlichung, die eine Rolle von ATF7IP bei der Regulierung spermienspezifischer Gene und väterlich exprimierter geprägter Gene, einschließlich Peg13 in humanen parthenogenetischen ESCs, zeigt40. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass ATF7IP in mESCs eine umfassendere Rolle bei der Regulierung aller methylierten ICRs spielen könnte, unabhängig von der elterlichen Herkunft.

Ob und wie diese beiden Faktoren zur Aufrechterhaltung der Abdrücke während der Zygotenbildung und der frühen Entwicklung beitragen, muss noch untersucht werden. Bei mESCs führte ihr Fehlen zu einer beeinträchtigten Erhaltungstreue und einem sporadischen Verlust von H3K9me3 an mehreren ICRs, unabhängig von ihrer elterlichen Herkunft. Wir vermuten, dass dies die repressive Rückkopplungsschleife zwischen DNA-Methylierung und H3K9me3 destabilisiert und das Umschalten des ICR in den standardmäßigen unmethylierten Zustand ermöglicht. Während wir bei einigen ICRs (z. B. Mcts2/H13, Zrsr1/Commd1 und H19) Unterschiede in den regulatorischen Aktivitäten von ATF7IP und ZMYM2 beobachten, muss noch geklärt werden, ob dies auf eine Spezifität dieser Faktoren gegenüber diesen ICRs zurückzuführen ist. Alternativ könnte dies auf die Stochastik beim ICR-Umschalten in einen unmethylierten Zustand ohne einen der beiden Faktoren zurückzuführen sein, der in klonal abgeleiteten Zellen gespeichert wird.

RMCE-kompetente mESCs (TC-1 (Ref. 3), erhalten von A. Dean, National Institutes of Health (NIH)) wurden auf mit 0,2 % Gelatine beschichteten Schalen in mESC-Medium mit DMEM (Invitrogen), 15 % fötales Kalb, kultiviert Serum (Invitrogen), 1× nicht-essentielle Aminosäuren (Invitrogen), 1× Glutamax (Invitrogen), 0,001 % 2-Mercaptoethanol (Invitrogen) und titrierter Leukämie-Hemmfaktor (hauseigene Herstellung) bei 37 °C in 7 % CO2 . Alternativ wurden mESCs in 2i-Medium kultiviert, das 50 % Neurobasalmedium (Invitrogen), DMEM/F12-Medium (Invitrogen), 1 × nicht-essentielle Aminosäuren (Invitrogen), 1 × Glutamax (Invitrogen) und 0,001 % 2-Mercaptoethanol (Invitrogen) enthielt ), 1× N2-Ergänzung (Invitrogen), 1× B27-Ergänzung (Invitrogen), titrierter Leukämie-Hemmfaktor, 3 µM CHIR99021 (Sigma-Aldrich) und 1 µM PD0325901 (Sigma-Aldrich). Wo angegeben, wurde L-Ascorbinsäure (Stemcell Technologies) in einer Konzentration von 100 µg ml−1 zugesetzt (Lit. 26). Die Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen wurde wie zuvor beschrieben ohne Feederzellen durchgeführt61. Zur DNMT1-Hemmung wurde GSK-3484862 (MedChemExpress) bis zu einer Endkonzentration von 10 µM hinzugefügt, wie zuvor bestimmt34. RMCE-kompetente MEL-Zellen30 (erhalten von D. Schübeler, FMI Basel) wurden in Suspension in DMEM (Invitrogen), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (Invitrogen) und 1× Glutamax (Invitrogen), kultiviert. Alle RMCE-kompetenten Zelllinien (TC-1 und MEL) wurden basierend auf Selektion und PCR auf der RMCE-Resistenzkassette authentifiziert.

Gezielte Zelllinienintegrationen in mESCs wurden durch RMCE erreicht, indem entweder Elektroporation von 2 × 10 Zellen mit dem Amaxa Nucleofector (Lonza) oder Lipofectamine 3000 (Invitrogen) Transfektionen von 2,5 × 10 Zellen verwendet wurden. Alle RMCE-Vektoren wurden mit einem CRE-exprimierenden Plasmid im Verhältnis 1:0,6 µg cotransfiziert, wobei entweder insgesamt 40 µg Plasmid für das Amaxa Nucleofector-Kit oder 1 µg für Lipofectamine 3000 verwendet wurden. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 3 selektiert µM Ganciclovir für mehr als 8 Tage. Die erhaltenen Zelllinien wurden als Pools aufbewahrt und bei Bedarf wurden klonale Zelllinien durch begrenzte Verdünnung erhalten. Pools oder klonale Zelllinien wurden mithilfe ortsspezifischer Integrations-PCRs genotypisiert. Die Elternzelllinie für alle Reporterzelllinien, die in den CRISPR-Screens verwendet werden, enthält ein stabil exprimiertes Cas9-Gen aus dem Rosa26-Locus, das durch TALEN-vermittelte Integration wie zuvor beschrieben erhalten wurde62. Einzelklon-KO-Zelllinien wurden durch CRISPR-Cas9 unter Verwendung des Plasmids px330-hSpCas9 (Addgene, 42230) zusammen mit einem pRR-Puro-Rekombinationsreporter62 erhalten. Insgesamt 1 µg Plasmid-DNA im Verhältnis 1:0,1 von px330 zu pRR-Puro wurde mit Lipofectamine 3000 transfiziert. Die Puromycin-Selektion wurde 36 Stunden nach der Transfektion für 36–48 Stunden bei einer Konzentration von 2 µg ml-1 begonnen. KO-Zelllinien wurden mithilfe der ortsspezifischen Targeting-PCR validiert. RMCE in MEL-Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Invitrogen) durchgeführt, wobei 5 × 105 Zellen in 6-Well-Platten für Suspensionszellen ausplattiert wurden. Insgesamt 2,5 µg Plasmid-DNA wurden unter Verwendung der gleichen Ration wie zuvor beschrieben gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen in T75-Flaschen überführt und Zellen, die einer Rekombination unterzogen wurden, wurden mit 5 µM Ganciclovir enthaltenden Medien für mehr als 8 Tage selektiert.

Ein Rückgrat mit zwei invertierten loxP-Stellen3 wurde verwendet, um mehrere leere Reportervektoren zu klonen, die eine 60-bp-Universaleintrittsstelle mit einer zentralen EcoRV-Restriktionsstelle enthalten, gefolgt von einem Promotor (pCAGGS, hPGK und Ef1alpha), der ein eGFP- oder mScarlet-Gen für steuert ChroMM- bzw. EpiTF-Screenings, gefolgt von einer nachgeschalteten BGH-Poly(A)- und einer WPRE-Sequenz. Einzelne ICR- oder Kontrollsequenzen wurden aus genomischer DNA amplifiziert (Ergänzungstabelle 1). Die Gibson-Montage erfolgte gemäß dem NEB Gibson Assembly Master Mix-Protokoll. Die In-vitro-Methylierung wurde mit bis zu 40 µg Plasmid-DNA unter Verwendung der NEB M.SssI-Methyltransferase in zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen von mindestens 4 Stunden mit 600 µM SAM (NEB, B9003S) und 1,5 U M.SssI (NEB, M0226L) pro Mikrogramm durchgeführt DNA. Die vollständige Methylierung von Plasmiden wurde durch Verwendung des CpG-methylierungsempfindlichen Restriktionsenzyms HpaII (NEB) und einer methylierungsunempfindlichen Kontrollreaktion mit MspI (NEB) bestätigt. Zelllinien wurden wie zuvor beschrieben generiert. Einzelne Klone wurden mittels PCR mit Primern, die die loxP-Stellen überspannten, genotypisiert. Die Methylierung des integrierten Reporterkonstrukts wurde an ausgewählten Klonen validiert.

Die Erfassung der Durchflusszytometriedaten wurde mit einem BD FACSCanto II- oder einem BD LSR Fortessa-Zellanalysator durchgeführt. FACS wurde mit einem BD FACSAria III Zellsortierer durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte mit FlowJo (Version 10.7) oder BD FACSDiva (9.1.2). Alle Proben wurden auf einzelne Zellen untersucht, wobei der Vorwärtsstreubereich (FSC-A) gegenüber dem Seitenstreubereich (SSC-A) und anschließend FSC-A gegenüber der Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) verwendet wurden. GFP-negative und positive Populationen wurden unter Verwendung von GFP-negativen Wildtyp-Zellen als Referenz quantifiziert. Für die Färbung mit Zelloberflächenmarkern wurde eine gleichmäßige Zellsuspension durch Trypsinisierung und Filterung durch ein 40-μm-Zellsieb (BD Bioscience) hergestellt. Die Zellen wurden mit einem Allophycocyanin (APC)-konjugierten CD90.1-Antikörper (Invitrogen, 17-0900-82) 30 Minuten lang bei 4 °C mit einer gesättigten Antikörperkonzentration (1 µl pro 15 Millionen Zellen) gefärbt.

BPnet28 (Version 0.0.23) wurde verwendet, um das Sequenzmotiv und den Kontext der ZPF57-Bindung in mESCs zu bestimmen. ZFP57 ChIP-seq-Daten und entsprechende Eingabedateien42 wurden mit Bowtie2 (Version 2.3.5.1) an das Mausgenom angepasst (NCBI Build 37 mm9, Juli 2007), nachdem Adapter mit Trimgalore (Version 0.6.6) entfernt wurden. Ausgerichtete Lesevorgänge wurden mit Picard (Version 2.23.9) nach PCR-Duplikaten gefiltert und nur Lesevorgänge mit einer Zuordnungsqualität (MAPQ) > 40 wurden für die weitere Analyse aufbewahrt. Alle Replikate wurden vor dem Peak-Calling mit MACS2 (Version 2.1.1.20160309) mit den folgenden Parametern zusammengeführt: callpeak -g mm–keep-dup all -q 0.05–call-summits. Lesevorgänge, die dem positiven und negativen Strang der zusammengeführten Datensätze zugeordnet waren, wurden in einzelne Dateien aufgeteilt und als Eingabespuren für BPnet auf die 5′-Basis gekürzt. Ein Modell wurde mit der Standard-bpnet9-Architektur (https://github.com/kundajelab/bpnet) trainiert, wobei die Chromosomen 1, 8 und 9 als Testsatz und Peaks auf den Chromosomen 2, 3 und 4 als Validierungssätze verwendet wurden. Peaks auf den Chromosomen X und Y wurden vom Modelltraining ausgeschlossen. Nach der Berechnung der Beitragswerte mit der DeepLIFT-Methode von BPnet wurden die Motive mit der TF-MoDISco-Methode von BPnet bestimmt. Um die Beitragswerte für die Airn- und gemischten Airn-Sequenzen zu bestimmen, wurde die eingegebene DNA One-Hot-codiert, bevor sie dem trainierten Modell unterzogen wurde, um ZFP57-Bindungsvorhersagen zu generieren. Für die Walking-Mutationen wurden 10 nt der gemischten Sequenz mit der ursprünglichen Airn-Sequenz ausgetauscht und pro Vorhersage um 1 bp verschoben.

Bis zu 2 µg genomische DNA oder die Gesamtmenge an eluiertem Material aus ChIP wurden für die Bisulfit-Umwandlung mit dem EpiTect Bisulfit Kit (Qiagen) verwendet. Die Bisulfit-PCR wurde unter Verwendung der PhusionU-Polymerase (Thermo Fisher Scientific) mit den in der Ergänzungstabelle 1 angegebenen Primern unter folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen von 1 Minute bei 95 °C, 1 Min. bei 50–60 °C (abhängig vom Primerpaar) und 1 Min. bei 72 °C, gefolgt von 5 Min. endgültiger Verlängerung bei 72 °C. Amplikons wurden in den CloneJET-Vektor (Thermo Fisher Scientific) kloniert, durch Sanger-Sequenzierung sequenziert und mit QUMA63 analysiert.

Gezielte Bisulfit-Sequenzierungsbibliotheken wurden aus äquimolaren gepoolten Bisulfit-PCR-Fragmenten hergestellt. Pro Ziel wurden zwei unabhängige PCR-Reaktionen mit Annealing-Temperaturen von 50 °C und 58 °C durchgeführt, um Amplifikationsverzerrungen abzuschwächen. Indizierte Bibliotheken wurden mit dem NEBNext Ultra II-Kit (NEB) ausgehend von 10 ng gepoolten Amplifikaten gemäß dem Protokoll des Herstellers erstellt. Die Sequenzierung wurde auf einem Illumina NovaSeq6000-Gerät mit 150-bp-Paired-End-Reads durchgeführt. Fastq-Dateien wurden mit trim_galore (Version 0.6.6) zugeschnitten und die Ausrichtung wurde mit Bismark (Version 0.23.0) mit dem Parameter non_directional durchgeführt. Die CpG-Methylierung wurde mit dem Bismark-Methylierungsextraktor extrahiert und die durchschnittliche CpG-Methylierung in R berechnet, wobei CpGs ausgeschlossen wurden, die weniger als 500 Mal abgedeckt wurden.

WGBS von Atf7ip- und Zmym2-KO-mESCs wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt64. Kurz gesagt, 10 µg genomische DNA wurden auf eine Länge von etwa 400–500 bp beschallt. Für jede Probe wurden 2 µg gescherte genomische DNA mit 10 ng äquimolarer, gepoolter, beschallter, methylierter Phagen-T7- und unmethylierter Phagen-Lambda-DNA gemischt. Die Adapterligatur wurde mit dem NEBNext Ultra II-Kit (NEB E7645L) unter Verwendung methylierter Adapter (NEB, E7535S) vor der Bisulfitkonvertierung mit dem Qiagen Epitect Bisulfit-Konvertierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach der Konvertierung wurden die Bibliotheken 10 Zyklen lang mit der Pfu TurboCx Hotstart DNA-Polymerase (Agilent) und den NEB-Dual-Index-Primern (NEB, E7600S) amplifiziert. PCR-Reaktionen wurden mit den folgenden Parametern durchgeführt: 95 °C für 2 Minuten, 98 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 10 Zyklen von 98 °C für 15 Sekunden, 65 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 3 Minuten mit 5 Min. bei 72 °C. Die PCR-Reaktionen wurden mit 1,2× AMPure XP-Beads (Beckman Coulter) gereinigt und in 20 µl EB-Puffer (Qiagen) eluiert. Die Qualität der Bibliothek wurde auf einer Agilent TapeStation überprüft und die Sequenzierung auf einem Illumina NovaSeq 6000-Gerät durchgeführt.

Ungefähr 15 × 106 Zellen wurden pro IP geerntet und 8 Minuten lang mit 1 % methanolfreiem Formaldehyd fixiert. Die Vernetzung wurde durch Zugabe von Glycin auf eine Endkonzentration von 0,125 nM gelöscht und 10 Minuten lang bei 4 °C auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 600 × g pelletiert, mit kaltem PBS gewaschen und 10 Minuten lang auf Eis in einem Puffer inkubiert, der 10 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8, 0,5 mM EGTA und 0,25 % Triton X-100 enthielt. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in 1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8, 0,5 mM EGTA und 200 mM NaCl 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Chromatin wurde in einem Puffer mit hohem Salzgehalt, der 50 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 % Triton mit einem Bioruptor Pico-Ultraschallgerät (Diagenode) geschert. Anschließend wurden 100 µg Chromatin pro IP-Reaktion mit 30 µl vorblockierten magnetischen Protein-A-Beads (Invitrogen) verwendet. Die Perlen wurden vor der Verwendung mit 1 mg BSA und 100 ng Hefe-tRNA (Sigma) in TE-Puffer, der eine Proteinase-Inhibitor-Mischung (Roche) enthielt, blockiert. Vor dem IP wurde Chromatin mit 20 µl blockierten Perlen 1 Stunde lang bei 4 °C vorgeklärt. Als nächstes wurden 5 % des Eingangsmaterials bei –20 °C gehalten und entlang des IP-Materials entvernetzt. Anschließend wurden 5 µg Antikörper pro IP für die Inkubation über Nacht bei 4 °C verwendet. Am nächsten Tag wurden 30 µl blockierte Perlen zum Chromatin gegeben und 4 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden auf einem Magneten getrennt und zweimal 8 Minuten lang mit Hochsalzpuffer gewaschen, einmal mit 50 mM LiCl, 0,5 % NP-40, 0,5 % Desoxycholat, 1 mM EDTA und 10 mM Tris, pH 8. Nach zwei weiteren Wäschen mit TE für 8 Minuten, Chromatin wurde nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C mit 60 µg RNaseA (Roche) in 1 % SDS und 100 mM NaHCO3 eluiert, gefolgt von einer 3-stündigen Inkubation unter Zugabe von 10 mM EDTA, 40 mM Tris, pH 8 und 60 µg Proteinase K (Roche). Die endgültige Entvernetzung erfolgte über Nacht bei 65 °C. Das eluierte Material wurde mittels Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt und mit einem Qubit 2.0-Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Die folgenden Antikörper wurden für ChIP verwendet: H3K9me3 (Abcam, ab8898, 5 µg pro IP), H3K4me2 (Diagenode, C15410035, 5 µg pro IP), H3K4me3 (Abcam, ab8580, 5 µg pro IP), ATF7IP (Bethyl, A300- 169A, 5 µg pro IP) und ZMYM2 (Bethyl, A301-711A, 10 µg pro IP).

qPCR-Reaktionen wurden als technische Duplikate auf einem Rotor Gene Q-Gerät (Roche) unter Verwendung des universellen qPCR-Kits KAPA SYBR Fast (Sigma) in 10-µl-Reaktionen mit 1 µl eluierter DNA für das IP-Material oder 1 µl einer 1:10-Verdünnung durchgeführt des Inputmaterials. Delta-Ct-Werte wurden über die Eingabe berechnet, gefolgt von Delta-Ct und Fold-Change über einer intergenen Region. Die Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Entsprechende Diagramme wurden mit Prism (5.0a) erstellt.

ChIP-seq-Bibliotheken wurden mit dem NEBNext ChIP-seq Library Prep Master Mix-Set für Illumina (NEB, E6240) oder dem NEBNext Ultra II Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers vorbereitet. Die endgültigen Bibliotheken wurden auf einem 2200 TapeStation System (Agilent) visualisiert und quantifiziert und mit gleichen Molverhältnissen gepoolt, bevor sie auf einem Illumina NovaSeq6000-Gerät mit 150-bp-Paired-End-Reads sequenziert wurden.

Veröffentlichte genomweite mESC-Datensätze wurden von GEO (WGBS65; H3K9me3, H3K4me3, H3K36me3 und H3K27me3 (Ref. 66), DNase-seq und RNA-seq67, SETDB1 (Ref. 41), ZFP57 (Ref. 42), ZMYM2 ( Ref. 43) und ATF7IP39. Sequenzierungs-Reads aus veröffentlichten Datensätzen und ChIP-seq-Reads, die in dieser Studie generiert wurden, wurden mit Trimgalore (Version 0.6.6) nach Reads geringer Qualität sowie Adaptersequenzen gefiltert und auf das Mausgenom abgebildet (NCBI Build 37 mm9, Juli 2007). Die Kartierung von H3K9me3, H3K4me3, H3K36me3, H3K27me3, DNase-seq und RNA-seq wurde mit QuasR (1.30.0) in R mit Standard-qAlign()-Einstellungen durchgeführt. Perückenspuren wurden mit QuasR qExportWig( )-Befehl und visualisiert mit dem UCSC-Genombrowser (https://genome.ucsc.edu). Die Zuordnung der WGBS-Daten erfolgte mit QuasR unter Verwendung von qAlign() mit den folgenden Einstellungen: genome = 'BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm9', Aligner = 'Rbowtie' und Bisulfit = 'dir'. CpG-Methylierungsaufrufe wurden mit qMeth() extrahiert und gefiltert, um nur CpGs zu enthalten, die mindestens 10x abgedeckt waren. ChIP-seq-Peakkoordinaten wurden mit MACS2 (Version 2.1.1.20160309) wie folgt erhalten Parameter: callpeak -g mm–keep-dup all -q 0.05–call-summits. Koordinaten wurden als GenomicRanges-Objekte in R importiert und Peaks, die größer als 1 kb waren, wurden aus der weiteren Analyse entfernt. Überlappungen zwischen Peaks wurden mit der Funktion findOverlaps() in R mit maxgap=1000 L berechnet. Heatmaps über ICRs und Peakregionen wurden mit genomation() in R unter Verwendung der Funktionen ScoreMatrixList() und multiHeatMatrix() generiert.

Die ChromMM- und EpiTFs-Bibliothek wurde wie zuvor beschrieben als Subpool der Wiener sgRNA-Bibliothek erstellt68. Lentivirus wurde in HEK293T-Zellen (erhalten von G. Schwank, Universität Zürich) wie beschrieben produziert69. Nicht konzentriertes Virus wurde mit unterschiedlichen Mengen nach dem gleichen Transduktionsverfahren titriert, das auch für die eigentlichen CRISPR-Screenings verwendet wurde. Die Transduktion wurde mit 1,25 × 106 Zellen durchgeführt, die in mit Gelatine beschichteten 6-Well-Platten in embryonalem Stammzellmedium mit 8 µg ml−1 Polybren (Merck) ausgesät wurden und 60 Minuten lang bei 500 × g und 37 °C zentrifugiert wurden. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf mehrere 15-cm-Platten übertragen und weitere 24 Stunden lang kultiviert wurden. Nach 36 Stunden wurden transduzierte Zellen mittels FACS selektiert. Für die ChromMM-Bibliothek wurden die Zellen mit einem APC-konjugierten Antikörper (Invitrogen, 17-0900-82, 1 µl pro 15 Millionen Zellen) gegen den Zelloberflächenmarker CD90.1 gefärbt, um APC-positive und GFP-negative Einzelzellen zu identifizieren. Für die EpiTF-Bibliothek wurden Zellen auf GFP-positive und mScarlet-negative Einzelzellen untersucht. Nach der Sortierung wurden die Zellen sparsam auf mehreren 15-cm-Schalen ausgesät und nach 4 Tagen nur einmal passagiert, um Engpässe bei der Bibliotheksdarstellung zu vermeiden. Am Tag 10 nach der Transduktion wurden GFP-positive Zellen sortiert und für die genomische DNA-Extraktion mit dem DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) weiterverarbeitet. Alle Screens wurden mit mindestens 30 Millionen Zellen und einer geringen Infektionsmultiplizität zwischen 0,1 und 0,2 durchgeführt, was eine Gesamtzellzahl von mindestens 3 Millionen Zellen und eine Leitdarstellung von mindestens 450x pro Leitlinie nach der ersten Sortierung ergab. Für die endgültige Sortierung wurde die gleiche Anzahl ursprünglich transduzierter Zellen für die Sortierung verwendet und als Referenzpool aufbewahrt. Das Screening mit der EpiTF-Bibliothek wurde wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch wurden 90 Millionen Zellen für die Transduktion bei einer Infektionsmultiplizität von 0,2 verwendet. Zunächst wurden alle Screens als technische Duplikate oder Triplikate mit einzelnen Reporterklonen durchgeführt und später noch einmal als unabhängige Experimente wiederholt. Um essentielle und wachstumsbeschränkende Gene zu bewerten, wurden die gepoolten Zellen an den angegebenen Tagen mit der ursprünglichen Plasmidbibliothek verglichen.

Die Bibliotheksvorbereitung erfolgte für die gesamte Menge der extrahierten genomischen DNA in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Amplifikationsschritten. In der ersten PCR wurden die integrierten Leitsequenzen unter Verwendung der Herculase II Fusion DNA-Polymerase (Agilent) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit maximal 500 ng DNA-Input pro 50 µl Reaktion unter Verwendung bibliotheksspezifischer Primer mit 3′-Adaptersequenzen für die Barcodierung amplifiziert ( Ergänzungstabelle 1). Der PCR-Mix enthielt 1,5 % DMSO und hatte eine Endkonzentration von 3 nM MgCl2. Amplifizierte Produkte wurden zunächst mit dem MinElute Gel-Extraktionskit (Qiagen) gereinigt und potenzielle Primerdimere wurden mit AmpureXP-Perlen (Beckmann) in einem Verhältnis von 0,7-fachem Volumen entfernt. Probenspezifische Barcodes wurden in einer zweiten PCR unter Verwendung von NEBNext Multiplex Oligos (NEB) und dem NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix (NEB) gemäß dem Handbuch des Herstellers mit 10 % des eluierten Produkts aus der ersten PCR und 7 Amplifikationszyklen durchgeführt. Für die EpiTF-Bibliothek wurde die Barcode-Kennzeichnung mit den i5-Primern aus dem NEBNext Multiplex Oligo Kit (NEB) und einem benutzerdefinierten Primer durchgeführt, der die P7-Sequenz trägt (Ergänzungstabelle 1). Die Sequenzierung wurde auf einem Illumina NovaSeq6000 oder einem MiSeq-Gerät durchgeführt, wobei ein 10-bp-Index-Read 1 für die EpiTF-Bibliothek angegeben wurde.

Das Demultiplexen wurde mit der Standardpipeline von Illumina durchgeführt. Für die EpiTF-Bibliothek wurde das Demultiplexen nur für den i5-Index durchgeführt, da der i7-Index den UMI68 enthält. Fastq-Dateien wurden mit Cutadapt (Version 3.10) so gekürzt, dass sie nur die Guide-RNA-Sequenz enthalten, wobei -g 5′-TAGCTCTTAAAC...GGTGTTTCGTC-3′ für die verknüpften Adaptersequenzen im Lentivirus-Backbone für die ChromMM-Bibliothek oder -g aaacaccg…gtttaaga angegeben wurde für die EpiTF-Bibliothek. Das Alignment wurde mit Bowtie2 (Version 2.3.5.1) gegen ein Referenzgenom durchgeführt, das aus den sgRNA-Sequenzen erstellt wurde, wobei die folgenden Alignment-Parameter angegeben wurden: -k 1–sehr empfindlich. BAM-Dateien wurden mit der Bamtobed-Funktion von bedtools (Version 2.27.1) in Bettdateien konvertiert. Bettdateien wurden in R importiert, um eine Zählmatrix für MAGeCK (Version 0.5.9.2) zu erstellen. Für die abschließende Analyse wurden die Zählungen aus technischen Replikaten sowie verschiedene GFP-Hoch- und GFP-Niedrig-Bins aggregiert. MAGeCK wurde mit der Einstellung „total-norm-method“ und dem unsortierten Pool als Kontrollprobe ausgeführt, wobei die unabhängigen Replikate angegeben wurden.

Die Single-Guide-Validierung erfolgte mit einer Guide-RNA, die in der Bibliothek enthalten war, und einem unabhängig entworfenen Guide mit hoher On-Target- und niedriger Off-Target-Aktivität, wie in Lit. beschrieben. 70 (Ergänzungstabelle 1). Die Leitfäden wurden in das px459-Rückgrat (Addgene, 62988) kloniert, was die Selektion von Puromycin ermöglicht. Hierzu wurden 1.000 Zellen einen Tag vor der Transfektion in mit Gelatine beschichtete Vertiefungen einer 96-Well-Platte ausgesät. Als nächstes wurden 100 ng Plasmid-DNA pro Vertiefung als technische Replikate unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Invitrogen) transfiziert. Nach 36 Stunden wurden transfizierte Zellen für 36–48 Stunden mit 2 µg ml-1 Puromycin selektiert, wobei nicht transfizierte Zellen als Kontrolle dienten. Die Reaktivierung des Reporters wurde 12 Tage nach der Transfektion mittels Durchflusszytometrie bewertet und die GFP-Reaktivierung wurde über Zellen quantifiziert, die mit nicht zielgerichteten Kontrollleitfäden transfiziert wurden.

Für das Western Blot wurden 20–35 μg Protein auf 6 % oder 10 % Polyacrylamidgelen aufgetrennt und mit dem TransBlot Turbo-System (Bio-Rad) auf Polyvinylidenfluoridmembranen übertragen. Zur Antikörper-basierten Färbung wurde die Membran einmal mit TBS-T (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl und 0,1 % Tween-20) gewaschen, mit 5 % fettfreier Trockenmilch in TBS-T blockiert und mit gefärbt Primärantikörper gegen ATF7IP (Bethyl, A300-169A), ZMYM2 (Bethyl, A301-711A-M) oder LAMIN B1 (Santa Cruz Biotechnology, 374015) bei 4 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Membranen dreimal 10 Minuten lang mit TBS-T gewaschen, bevor sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit artspezifischen Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert wurden. Nach weiteren drei Wäschen mit TBS-T für jeweils 10 Minuten wurde das Signal mit dem Amersham ECL Western Blot-Nachweisreagenz (GE Healthcare Life Sciences; RPN2109) und der Belichtung auf Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences; 28906836) in einer Dunkelkammer nachgewiesen.

Zelllinien wurden wie in Villasenor et al.45 beschrieben generiert. Die kodierende Sequenz des BioID2-Enzyms des ursprünglichen Eintrittsvektors wurde gegen die kodierende Sequenz des TurboID-Enzyms44 ausgetauscht. Die Zellen wurden entweder mit dem Eintrittsvektor transfiziert, der nur die TurboID mit einer Kernlokalisierungssequenz, der stromaufwärts der TurboID klonierten ZFP57-cDNA-Sequenz der Maus in voller Länge oder der KRAB-Domäne von ZFP57, wie auf UniProt kommentiert, enthielt. Alle Zellen wurden mithilfe eines Western-Blots von Zellen validiert, die wie zuvor beschrieben 12 Stunden lang mit 50 µM Biotin (Sigma-Aldrich) inkubiert wurden, mit geringfügigen Anpassungen, um den Biotin-Nachweis zu ermöglichen. Kurz gesagt, die Membranen wurden 1 Stunde lang in 5 % BSA in TBS mit 0,1 % Triton X-100 blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (1:20.000) in TBS mit 0,1 % Triton Die Membran wurde zweimal mit TBS mit 0,3 % Triton X-100, zweimal mit TBS mit 0,3 % Triton jede.

TurboID-Proben wurden wie in Villaseñor et al.45 beschrieben vorbereitet. Kurz gesagt, die Zellen wurden vierfach auf 15-cm-Platten gezüchtet, 12 Stunden lang mit 50 μM Biotin (Sigma-Aldrich) bei 70 % Konfluenz inkubiert und mit Trypsin geerntet. Im Folgenden wurden die Proben bei 4 °C oder auf Eis gehandhabt. Zellpellets wurden in 5× Volumen Kernextraktionspuffer 1 (NEB1; 10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1× EDTA-freier vollständiger Proteaseinhibitor) gequollen Cocktail (PIC; Roche) für 10 Minuten, vor dem Spinnen bei 2.000 × g für 10 Minuten. Die Zellen wurden unter Verwendung eines losen Dounce-Stempels in 2 × Volumina NEB1 homogenisiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 10 Minuten gesammelt und in resuspendiert 1× Volumen Kernextraktionspuffer 2 mit 450 mM NaCl (NEB2; 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 20 % Glycerin, 1 mM DTT und 1× PIC) und 10 weitere Male mit einem engen Dounce homogenisiert Stempel, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde mit Überkopfrotation. Trümmer wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 2.000 × g entfernt, bevor die Salzkonzentration des Überstands mit 2 × Volumina NEB2 auf 150 mM NaCl eingestellt und die endgültige NP40-Konzentration auf eingestellt wurde 0,3 %. Proteinextrakte wurden mit dem Qubit Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Q33211) quantifiziert und pro IP wurden gleiche Mengen an Proteinextrakten verwendet. Für jedes IP 40 µl Streptavidin M-280 Dynabeads (Thermo Fisher Scientific), vorblockiert in IP-Puffer (IPB; NEB2, 150 mM NaCl, 0,3 % NP40, 1 mM DTT, 1 × PIC), enthaltend 1 % kalten Fisch Gelatine wurde zu den Extrakten gegeben und über Nacht bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Als nächstes wurden die Perlen zweimal mit 2 % SDS in TE, das 1 mM DTT und 1 × PIC enthielt, 10 Minuten lang unter Rotation bei RT gewaschen, gefolgt von einem 10-minütigen Waschen mit einem Hochsalzpuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EDTA). 1 % Triton % Desoxycholat, 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 1× PIC) und zweimal mit TE-Puffer mit 1 mM DTT, 1× PIC. Nach dem Waschen wurden die Perlen mit 5 µg ml−1 Trypsin (Promega; V5111) in 40 µl Aufschlusspuffer (1 M Harnstoff in 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin) vorverdaut. für 2,5 h bei 26 °C und Schütteln bei 600 U/min. Der Überstand wurde mit 2 mM Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin 45 Minuten lang bei Raumtemperatur weiter reduziert, mit 10 mM Chloracetamid 30 Minuten lang bei Raumtemperatur alkyliert und vor Licht geschützt. Für den Endverdau wurde die Proteinlösung mit zusätzlichen 0,5 µg Trypsin über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die aufgeschlossenen Proben durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % und Acetonitril (ACN) bis zu einer Endkonzentration von 3 % für das Laden auf C18 StageTips vorbereitet. Eigengefertigte C18-StageTips (Functional Genomics Center Zürich) wurden mit 100 % Methanol befeuchtet, zweimal mit der Elutionslösung (60 % ACN, 0,1 % TFA) gereinigt und durch zweimaliges Waschen mit 3 % ACN und 0,1 % TFA für die Beladung vorbereitet . Nach dem Auftragen der Peptidlösung wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand noch einmal aufgetragen, bevor zweimal mit 3 % ACN und 0,1 % TFA gewaschen wurde. Abschließend wurden die Peptide zweimal mit der Elutionslösung eluiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, im Schnellvakuum getrocknet, zentrifugiert und in 3 % ACN, 0,1 % Ameisensäure, enthaltend Standardpeptide mit interner Retentionszeit (iRTs, Biognosys), rekonstituiert. Die Proben wurden auf einem Easy-nLC 1000 HPLC-System, das an ein Orbitrap Fusion-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war, mit blockrandomisierten Proben analysiert

MaxQuant (Version 1.5.3.30) wurde zur Proteinidentifizierung und markierungsfreien Quantifizierung71 basierend auf dem Maus-Referenzproteom (UniProtKB/Swiss-Prot und UniProtKB/TrEMBL), Version 2018_12, kombiniert mit manuell annotierten kontaminierenden Proteinen, mit Protein- und Peptid-FDR-Werten verwendet auf 1 % eingestellt. Perseus wurde für die statistische Analyse wie zuvor beschrieben72 verwendet. Dabei wurden nur Proteine ​​aufbewahrt, die in drei von vier Proben pro Gruppe identifiziert wurden. Fehlende Werte wurden aus einer um 1,8 Standardabweichungen nach links verschobenen Gaußschen Verteilung mit einer Breite von 0,3 errechnet. Ein t-Test wurde verwendet, um potenzielle Interaktoren mit einem FDR-Schwellenwert von < 0,05 und einem S0-Wert von 1 zu identifizieren. Die Daten wurden mit R (Version 4.0.3) visualisiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten wurden bei NCBI GEO unter der folgenden Zugangsnummer GSE176461 hinterlegt; Die proteomischen Massenspektrometriedaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD034918 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle Analysen wurden mit zuvor veröffentlichten oder entwickelten Tools durchgeführt. Es wurde kein benutzerdefinierter Code entwickelt oder verwendet.

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Referenzen herunterladen

Wir danken A. Dean (NIH/NIDDK) für die freundliche Bereitstellung der TC-1-mESC-Linie und M. Buehler (FMI Basel) und C. Földy (Universität Zürich) für die Bereitstellung von Plasmiden. Darüber hinaus danken wir G. Schwank und seiner Gruppe (Universität Zürich) für ihre Hilfe bei der Etablierung des CRISPR-Screen-Protokolls, dem Functional Genomics Center Zurich (FGCZ), S3IT Zürich und der Cytometry Facility der Universität Zürich für ihre Unterstützung. Wir danken P.-A. Defossez (Universität Paris Diderot) und Mitgliedern der Baubec-Gruppe für ihren Beitrag und ihre konstruktive Kritik. TB dankt der Universität Zürich und der Universität Utrecht, dem Schweizerischen Nationalfonds (183722, 180354 und 190378), dem Europäischen Forschungsrat (865094 – ChromatinLEGO – ERC-2019-COG) und dem EMBO Young Investigator-Programm für Unterstützung. NS wurde durch Postdoktorandenstipendien der EMBO und der Universität Zürich unterstützt und ist SNF-Ambizione-Stipendiat (186012). RV dankt der Universität Zürich für die Unterstützung (UZH-Postdoc-Stipendium FK-21-060). DS dankt der Novartis Research Foundation, dem Europäischen Forschungsrat im Rahmen der Fördervereinbarung für das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union (EU) (667951-ReadMe und 884664-DNAccess) und dem Schweizerischen Nationalfonds (310030B_176394) für die Unterstützung. ARK dankt dem European Molecular Biology Laboratory, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KR 5247/1-1) und dem Schweizerischen Nationalfonds Ambizione (Zuschuss PZOOP3_161493).

Nina Schmolka

Derzeitige Adresse: Institut für Experimentelle Immunologie, Universität Zürich, Zürich, Schweiz

Rodrigo Villasenor

Aktuelle Adresse: Abteilung für Molekularbiologie, Biomedizinisches Zentrum München, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland

Silvia Domcke

Derzeitige Adresse: Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle, WA, USA

Arnaud R. Krebs

Derzeitige Adresse: European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Genombiologie-Abteilung, Heidelberg, Deutschland

Abteilung für molekulare Krankheitsmechanismen, Universität Zürich, Zürich, Schweiz

Stefan Butz, Nina Schmolka, Ino D. Karemaker, Rodrigo Villaseñor, Isabel Schwarz & Tuncay Baubec

Molecular Life Science PhD-Programm der Life Science Zurich Graduate School, Universität Zürich und ETH Zürich, Zürich, Schweiz

Stefan Butz

Friedrich-Miescher-Institut für biomedizinische Forschung, Basel, Schweiz

Silvia Domcke, Florian Lienert, Arnaud R. Krebs & Dirk Schübeler

Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Basel, Basel, Schweiz

Silvia Domcke, Florian Lienert & Dirk Schübeler

Institut für Molekulare Biotechnologie Austria (IMBA), Vienna BioCenter (VBC), Wien, Österreich

Esther CH Uijttewaal & Ulrich Elling

Forschungsinstitut für Molekulare Pathologie (IMP), Vienna BioCenter (VBC), Wien, Österreich

Julian Jude & Johannes Zuber

Abteilung für Genombiologie und Epigenetik, Institut für Biodynamik und Biokomplexität, Abteilung für Biologie, Naturwissenschaftliche Fakultät, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande

Nathalie P. de Wagenaar, Xue Bao und Tuncay Baubec

Medizinische Universität Wien, Vienna BioCenter (VBC), Wien, Österreich

Johannes Zuber

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SB und TB haben die Studie entworfen. SB, NS, IK, RV, IS, SD, FL, NdW, XB und TB führten Experimente durch. JJ, UE, JZ und UE haben gezielte CRISPR-Bibliotheken entworfen und generiert. AK und DS stellten Zelllinien und Datensätze zur Verfügung, die in dieser Studie verwendet wurden. SB und TB haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Tuncay Baubec.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Genetics dankt Maxim Greenberg und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a) Genom-Browser-Snapshot für den Airn-ICR-Locus in embryonalen Stammzellen der Maus. Gezeigt werden ChIP-seq-Tracks für Chromatin-Modifikationen, RNA-seq-Daten für die Transkriptionsaktivität, DHS-seq für die Chromatin-Zugänglichkeit, WGBS-Daten für DNA-Methylierung und lokale GC-Dichte in Prozent. Die für Experimente verwendete ICR-Sequenz ist hervorgehoben. b) Repräsentatives Agarosegel für den Restriktionsverdau von in vitro methylierten und unmethylierten Plasmiden vor der Transfektion. HpaII und MspI teilen sich die gleiche Erkennungsstelle, HpaII wird jedoch durch CpG-Methylierung blockiert. Das Experiment wurde vor der RMCE-Integration mindestens zweimal wiederholt. Molekulare Größenmarker sind angegeben. c) Schematischer Überblick über das ektopisch integrierte DNA-Fragment für H19 mit vertikalen Linien, die einzelne CpG-Stellen veranschaulichen (oben) und Einzelmolekülmessungen der DNA-Methylierung der vormethylierten und unmethylierten Sequenzen mittels Bisulfit-PCR (unten). de) wie in (c): für Zrsr1 (d) und Kcnq1ot1 (e). f) Schematischer Überblick über das ektopisch integrierte DNA-Fragment für das Igf2r-gametische DMR mit vertikalen Linien, die einzelne CpG-Stellen veranschaulichen (oben) und Einzelmolekülmessungen der DNA-Methylierung der vormethylierten und unmethylierten Sequenzen mittels Bisulfit-PCR (unten). gi) wie in f: Hes3 (g), Syt1 (h) und Tcl1 (i). Daten zu unmethyliertem (- M.SssI) Bisulfit für gi wurden von Lienert et al.3 erhalten und zum Vergleich gezeigt.

Quelldaten

a) Übersichtstabelle für die Methylierungsanalyse des Airn ICR nach Langzeitkultur (über 20 aufeinanderfolgende Passagen), zufälliger Integration an eine andere genomische Stelle, während der Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) oder nach 10-tägiger Kultivierung in 2i. bd) Einzelmolekülmessungen aus der Bisulfit-PCR entsprechend den in a zusammengefassten Daten. e) Methylierungsanalyse für den ektopischen und endogenen Airn-ICR nach CRISPR-vermitteltem Zfp57-KO. Dreiecke zeigen CpGs innerhalb von ZFP57-Motiven an. Die durch bsPCR analysierte Region ist angegeben. f) Schematische Übersicht über die in der Studie getesteten Airn-ICR-Fragmente (oben) und Einzelmolekül-Bisulfit-PCR-Ergebnisse der einzelnen Fragmente (unten). g) Übersichtstabelle für die Methylierungsanalyse der H19-ICR-Fragmente, einschließlich Größe, CpG-Dichte und GC Inhaltsinformationen. h) Einzelmolekülmessungen aus der Bisulfit-PCR entsprechend den in g zusammengefassten Daten.

a) Analyse der Sequenzmerkmale für genomweite 1-kb-Fenster. Gelbe Punkte zeigen die in dieser Studie verwendeten ICR-Sequenzen an. Rote Punkte weisen auf Airn-ähnliche Fragmente hin. b) Genom-Browser-Schnappschüsse für alle vier Airn-ähnlichen Sequenzen. Hervorgehobene Kästchen geben die in den RMCE-Experimenten verwendeten DNA-Sequenzen an. c) Sequenzeigenschaften ausgewählter Airn-ähnlicher Sequenzen im Vergleich zum Airn ICR. Vertikale Linien entsprechen einzelnen CpG-Stellen innerhalb der Sequenz. d) GC-Prozentsatz ausgewählter Airn-ähnlicher Sequenzen. e) Einzelmoleküldarstellung der in f zusammengefassten Daten. f) Tabellarische Zusammenfassung der Methylierungsanalyse für alle Airn-ähnlichen Sequenzen, einschließlich des Airn-ICR zum Vergleich.

a) Workflow, der das In-silico-Sequenz-Shuffling für den Airn ICR angibt. b) Sequenzcharakteristik der am stärksten abweichenden gemischten Sequenz (Airn-shuffled) im Vergleich zur ursprünglichen Airn-Sequenz. c) BPNet-Bewertung der ZFP57-Bindung am Wildtyp-Airn-ICR und vorhergesagte Bindung im gemischten Airn-ICR. d) Vorhergesagte ZFP57-Bindung in Wildtyp-Airn mit einem scannenden 10-bp-Ersatz aus der gemischten Airn-Sequenz. Jede Zeile stellt die Vorhersage aus einem Ersatzexperiment dar. e) Vorhersage der ZFP57-Bindung in gemischten Airn + rekonstituierten ZFP57-Bindungsmotiven.

a) Design von GFP-Reporterkonstrukten mit unterschiedlichen Promotoren unter Verwendung identischer Überhangsequenzen für die Gibson-Assemblierung und b) durchflusszytometrische Analyse der GFP-Expression von Zellen, die die unmethylierten, leeren Reporterkonstrukte ohne ICRs tragen. c) Durchflusszytometrie-Analyse, die den Prozentsatz GFP-positiver Zellen pro Population (abgeleitet von einzelnen Klonen) angibt und die Stabilität der Repression für methylierte ICR-Reporter in Kombination mit entweder EF1a- (oben) oder PGK-Promotoren (unten) zeigt, gemessen nach 16, 23 und 30 Tagen nach der Transfektion. Darüber hinaus wird der GFP-Prozentsatz für Zellen angezeigt, die Reporter nur mit methylierten Promotoren (keine ICRs) oder in Kombination mit dem Dazl-Promotor als Kontrollen erhalten. Jeder Punkt kennzeichnet unabhängig abgeleitete Klone. d) Durchflusszytometrie-Analyse von Zellen, die einen H19-EF1a-Reporter enthalten. e) Durchflusszytometrie-Analyse für einen repräsentativen mESC-Klon mit dem Airn-pCAGGS-Reporter, der 12 Tage lang in Serum, 2i oder 2i + Vitamin C kultiviert wurde. f) Durchflusszytometrische Analyse von drei unabhängigen Klonen mit dem methylierten Airn-CAG-Reporter nach 8 Tagen in verschiedenen Medienbedingungen. g) Zeitverlauf für die Reaktivierung verschiedener ICR-Promotor-Kombinationen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Datenpunkte zeigen den Mittelwert von 3 unabhängigen Klonen. Der Fehlerbalken gibt den Standardfehler des Mittelwerts an.

a) Durchflusszytometrische Analyse der GFP-Reaktivierung 8 Tage nach der Transfektion mit Guide-RNAs, die auf die Gene Uhrf1 und Dnmt1 abzielen, im Vergleich zu Zellen, die mit nicht-targeting Guide-RNAs transfiziert wurden. Es werden Daten der gesamten Population der Zielzellen ohne Vorauswahl für KO-Zellen angezeigt. b) Zusammengefasste Ergebnisse aus a. Jeder Punkt gibt den Prozentsatz GFP-positiver Zellen in der gesamten Population der Zielzellen an. c) Durchflusszytometrische Analyse von vormethyliertem Airn-EF1a-GFP, behandelt mit dem DNA-Methylierungsinhibitor GSK-3484862 für 2 Tage (oben) und anschließendem Auswaschen für 7 Tage, was darauf hinweist, dass der Reporter nach der Reaktivierung nicht wieder verstummt.

a) FACS-Gating-Strategie für CRISPR-Screenings unter Verwendung der ChromMM-Bibliotheken. Transduzierte mESCs werden basierend auf dem CD90.1-Zelloberflächenmarker ausgewählt, der vom sgRNA-haltigen Transgen coexprimiert wird. Reaktivierte Zellen werden nach GFP-Expression sortiert (z. B. 8 Tage). b) Zeitverlaufsexperiment für ein CRISPR-Screening unter Verwendung der ChromMM- oder Kontrollbibliothek, durchgeführt mit drei unabhängigen Klonen. Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an. cd) Durchflusszytometrische Analyse von Zelllinien, die mit der Chromatin-Targeting-Bibliothek im Vergleich zur Nicht-Targeting-Kontrollbibliothek in Serum bzw. 2i transduziert wurden. Die Achse gibt den Prozentsatz GFP-positiver Zellen in der CRISPR-Screening-Population an.

a) Rangdiagramm für Screenings unter Serumbedingungen. Die gestrichelte horizontale Linie zeigt den p-Wert-Schwellenwert von 0,05 an. P-Werte wurden mithilfe von MAGeCK RRA (robuste Rangaggregation) ermittelt. Rote Punkte zeigen bekannte Heterochromatin-Faktoren an, die mit der ICR-Regulation assoziiert sind, blaue Punkte zeigen Gene an, die in mehreren Screens gefunden wurden, und grüne Punkte zeigen die Positivkontrollen an. b) Übersicht über CRISPR-Treffer für die unter 2i-Bedingungen gezüchteten Airn- und Kcnq1ot1-Reporterzelllinien. Die gestrichelte horizontale Linie zeigt den p-Wert-Schwellenwert von 0,05 an, der mit MAGeCK RRA (robuste Rangaggregation) ermittelt wurde. c) Rangdiagramm für Bildschirme unter 2i-Bedingungen. Die gestrichelte horizontale Linie zeigt den p-Wert-Schwellenwert von 0,05 an, der mit MAGeCK RRA (robuste Rangaggregation) ermittelt wurde. d) Übersicht über CRISPR-Treffer unter Verwendung der EpiTF-Bibliothek in der im Serum gezüchteten Airn-Reporterzelllinie. Die gestrichelte horizontale Linie zeigt den p-Wert-Schwellenwert von 0,05 an, der mit MAGeCK RRA (robuste Rangaggregation) ermittelt wurde. e) Rangdiagramm für das Screening unter Verwendung des Airn pEF1a-Reporters im Serum unter Verwendung der EpiTF-Bibliothek. Die gestrichelte horizontale Linie zeigt den p-Wert-Schwellenwert von 0,05 an, der mit MAGeCK RRA (robuste Rangaggregation) ermittelt wurde. f) Validierung potenzieller Kandidaten durch einzelne Transfektionen von Guide-RNAs gegen das angegebene Gen. Die GFP-Expression wurde 12 Tage nach der Transfektion gemessen. Transfektionen wurden in technischen Replikaten durchgeführt. Potenzielle Kandidaten wurden mit einem unabhängigen Leitfaden und einem Leitfaden aus der ChromMM-Bibliothek angesprochen. Die Daten zeigen den Prozentsatz positiver Zellen in Pools nach CRISPR-Targeting. g) Netzwerkdarstellung für alle potenziellen Kandidaten unter Verwendung der STRING-Datenbank. Der rosa Rand weist auf experimentell bestimmte Wechselwirkungen hin; Der cyanfarbene Rand weist auf bekannte Interaktionen aus kuratierten Datenbanken hin. Grüne, rote und blaue Ränder zeigen vorhergesagte Interaktionen basierend auf der Gennachbarschaft, der Genfusion bzw. dem gleichzeitigen Vorkommen von Genen an. Gelbe und schwarze Kanten sind vorhergesagte Interaktionen, die auf Textmining bzw. Co-Expression basieren.

a) Peak-Überlappungsanalyse, die den Prozentsatz der ZMYM2- oder ATF7IP-Peaks zeigt, die mit SETDB1, ZFP57 oder durch ZFP57 und SETDB1 gemeinsam gebundenen genomischen Stellen übereinstimmen. b) Heatmap, die die ZMYM2-Bindung an ZMYM2-Peaks anzeigt und durch Peaks getrennt ist, die SETB1- und SETB1-unabhängige Peaks überlappen. Das H3K9me3 ChIP-seq-Signal wird für die gleichen Peak-Sets angezeigt. c) WGBS-Methylierungsanalyse bei unabhängigen ZMYM2- und ATF7IP-Peaks (N = 159). ZMYM2-Peaks werden durch Stellen getrennt, die sich mit SETDB1 überlappen (N = 4201) und nicht überlappen (N = 10292). Boxplots bezeichnen den Interquartilbereich als Box (IQR) und die niedrigsten und höchsten Werte im Bereich von 1,5 x IQR um die Box als Whiskers. d) ChIP-qPCR für die Bindung von ATF7IP und ZMYM2 am endogenen Airn ICR in Wildtyp- und Zfp57-KO-Zellen. Die ChIP-Anreicherung wird auf 5 % Eingabe normalisiert und auf eine genomische Hintergrundstelle (intergen) kalibriert. Dargestellt sind unabhängige technische Nachbildungen. e) Vulkandiagramme, die Proteine ​​anzeigen, die im ZFP57_dZNF-TurboID (nur KRAB-Domäne) angereichert sind, über einer Hintergrund-TurboID-Zelllinie (nTurbo). Statistisch angereicherte Proteine ​​sind angegeben (FDR-korrigierter zweiseitiger t-Test: FDR = 0,05, s0 = 1, n = 4 technische Replikate). f) Expressionsniveaus für ZFP57, ATF7IP und ZMYM2, gemessen zu verschiedenen Zeitpunkten während der frühen Embryonalentwicklung. Dargestellt sind RPKM-normalisierte Lesevorgänge aus Referenz. 73. g) Immunoblot-Nachweis von ATF7IP und ZMYM2 in Wildtyp- und KO-Zellen unter Verwendung spezifischer Antikörper. Als Beladungskontrolle dient Lamin B1. Das Sternchen bezeichnet den Zmym2-KO-Klon, der für die WGBS-Analyse verwendet wird. Der Versuch wurde mindestens dreimal wiederholt. Molekulargewichtsmarker sind angegeben.

Quelldaten

a) Boxplots, die die durchschnittliche DNA-Methylierung über alle CpGs anzeigen, die mindestens 10x im Mausgenom abgedeckt sind. Der Interquartilbereich wird als Kästchen (IQR) und die niedrigsten und höchsten Werte im Bereich von 1,5 x IQR um das Kästchen als Whiskers angezeigt. Die Anzahl der analysierten unabhängigen CpGs ist angegeben. b) Bisulfit-Umwandlungskontrollen aus zugegebener Lambda- und methylierter T7-Phagen-DNA zeigen eine vollständige Umwandlung von DNA-Molekülen. Der Interquartilbereich wird als Kästchen (IQR) und die niedrigsten und höchsten Werte im Bereich von 1,5 x IQR um das Kästchen als Whiskers angezeigt. Die Anzahl der analysierten unabhängigen CpGs ist angegeben. c) WGBS-Datenanalyse aller annotierten ICRs in Wildtyp-, Atf7ip-KO- und Zmym2-KO-mESCs. d) Individuelle Methylierungsprofile aus gezielten Bisulfit-Sequenzierungsexperimenten für Airn-, Kcnqot1- und Peg10-ICRs in Wildtyp-, Atf7ip-KO- und Zmym2-KO-mESCs. Zur besseren Visualisierung wurden 1000 Amplicons pro Probe zufällig ausgewählt. e) Heatmap, die H3K9me3 bei allen ICRs in Wildtyp-, Atf7ip-KO- und Zmym2-KO-mESCs zeigt. Dargestellt sind bibliotheksnormalisierte Lesevorgänge pro 20 bp.

Ergänzungstabelle mit zusätzlichen Informationen und numerischen Werten im Zusammenhang mit CRISPR-Screenings, bioID-MS-Experimenten und DNA-Sequenzinformationen.

Unbeschnittenes DNA-Gel.

Unbeschnittene Western Blots.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Butz, S., Schmolka, N., Karemaker, ID et al. DNA-Sequenz- und Chromatin-Modifikatoren wirken zusammen, um den prägenden Kontrollregionen epigenetische Bistabilität zu verleihen. Nat Genet 54, 1702–1710 (2022). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01210-z

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Eingegangen: 10. Juni 2021

Angenommen: 19. September 2022

Veröffentlicht: 04. November 2022

Ausgabedatum: November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01210-z

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Epigenetik & Chromatin (2023)