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Oct 12, 2023

Herbeiführung einer Erstarrung

Naturstoffwechsel Band 5,

Nature Metabolism Band 5, Seiten 789–803 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Torpor ist ein energiesparender Zustand, in dem Tiere ihre Stoffwechselrate und Körpertemperatur drastisch senken, um raue Umweltbedingungen zu überstehen. Hier berichten wir über die nichtinvasive, präzise und sichere Induktion eines erstarrenden hypothermischen und hypometabolischen Zustands bei Nagetieren durch transkranielle Fernultraschallstimulation im präoptischen Bereich des Hypothalamus (POA). Wir erreichen bei Mäusen einen lang anhaltenden (>24 Stunden) erstarrenden Zustand durch eine geschlossene Rückkopplungssteuerung der Ultraschallstimulation mit automatischer Erkennung der Körpertemperatur. Ultraschallinduzierte Hypothermie und Hypometabolismus (UIH) werden durch die Aktivierung von POA-Neuronen ausgelöst, betreffen den dorsomedialen Hypothalamus als nachgeschaltete Hirnregion und die anschließende Hemmung des thermogenen braunen Fettgewebes. Die Einzelkern-RNA-Sequenzierung von POA-Neuronen zeigt, dass TRPM2 ein ultraschallempfindlicher Ionenkanal ist, dessen Unterdrückung UIH unterdrückt. Wir zeigen auch, dass UIH bei einem nicht trägen Tier, der Ratte, möglich ist. Unsere Ergebnisse belegen, dass UIH eine vielversprechende Technologie für die nichtinvasive und sichere Herbeiführung eines erstarrenden Zustands ist.

Erstarrung ist wie der Winterschlaf ein physiologischer Zustand, in dem Säugetiere aktiv den Stoffwechsel unterdrücken, die Körpertemperatur senken und andere Lebensprozesse verlangsamen, um Energie zu sparen und tödliche Bedingungen und kalte Umgebungstemperaturen zu überleben1. Das Konzept, mit künstlichen Mitteln eine schläfrige Hypothermie und einen Hypometabolismus hervorzurufen, wurde ursprünglich 1960 als biomedizinische Lösung zur Reduzierung des Energieverbrauchs bei langfristigen bemannten Raumflügen vorgeschlagen2,3. Erstarrungsähnliche Hypothermie und Hypometabolismus könnten auch die Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten unter lebensbedrohlichen Bedingungen (z. B. Herzinfarkt oder Schlaganfall) erhöhen, indem sie den Stoffwechsel und das Fortschreiten der Krankheit verlangsamen4.

Die nichtinvasive und sichere Herbeiführung eines schläfrigen Zustands gilt als Science-Fiction und beschränkt sich auf Filme und Romane5,6. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist es immer noch nicht gelungen. Das ursprüngliche Konzept ging davon aus, dass der Winterschlaf durch endogene Blutsubstanzen reguliert wird7 und umfangreiche Anstrengungen wurden der Suche nach endogenen Substanzen gewidmet, die durch systemische Unterdrückung des Stoffwechsels einen schläfrigen Zustand auslösen8,9. Man geht heute davon aus, dass Erstarrung durch das Zentralnervensystem (ZNS) gesteuert wird, um zahlreiche Funktionen präzise zu koordinieren10,11,12. Es wurde berichtet, dass die direkte intrakranielle Injektion von Arzneimitteln, die auf die ZNS-Signalwege abzielen, einen tiefen Unterkühlungszustand hervorrief, der einer natürlichen Erstarrung ähnelte13,14. Jüngste bahnbrechende Studien identifizierten mehrere neuronale Populationen im hypothalamischen POA, die Erstarrung und Winterschlaf bei Nagetieren regulieren11,12,15. Die Gentechnik dieser neuronalen Populationen zur optogenetischen und chemogenetischen Manipulation führte zu entscheidenden Verhaltens- und physiologischen Merkmalen von Erstarrung/Winterschlaf bei Mäusen11,12,15. Obwohl diese technologischen Fortschritte bei der Herbeiführung eines schläfrigen Zustands vielversprechend sind, erfordern diese Ansätze einen chirurgischen Eingriff oder Gentechnik, was die breite Anwendung dieser Ansätze und ihre Übertragung auf den Menschen einschränkt.

Ultraschall ist die einzige verfügbare Energieform, die nichtinvasiv den Schädel durchdringen und sich millimetergenau und ohne ionisierende Strahlung auf jede beliebige Stelle im Gehirn konzentrieren kann16,17. Diese Fähigkeiten, zusammen mit seiner Sicherheit, Portabilität und niedrigen Kosten, haben Ultraschall zu einer vielversprechenden Technologie für die Neuromodulation bei Kleintieren18,19, nichtmenschlichen Primaten20,21 und Menschen16,22 gemacht, obwohl sein Mechanismus noch unklar ist. Hier berichten wir über die nichtinvasive, präzise und sichere Induktion eines erstarrenden Zustands bei Mäusen durch Ultraschall-Fernstimulation am POA (Abb. 1a). Wir entdeckten, dass dieser UIH mit der Ultraschallaktivierung des TRPM2-Ionenkanals zusammenhängt, der in Torpor-assoziierten POA-Neuronen exprimiert wird. Wir haben die mögliche Beteiligung des dorsomedialen Hypothalamus als nachgelagerte Hirnregion und des braunen Fettgewebes als Effektorgewebe bei der Regulierung von UIH aufgedeckt. Wir haben auch gezeigt, dass die Ultraschallstimulation am POA bei Ratten, einem nicht trägen Tier, erfolgreich Hypothermie auslöste.

a, Darstellung eines durch Ultraschall (US) induzierten, erstarrenden Zustands. b, Abbildung der tragbaren US-Sonde (oben). Die Sonde wurde an eine Grundplatte angeschlossen, die auf den Kopf der Maus geklebt wurde. Die MRT des Mauskopfes mit der tragbaren US-Sonde zeigt, dass der Ultraschall nichtinvasiv auf den POA (Einsatz) gerichtet war. Unten ist ein Foto einer sich frei bewegenden Maus mit angeschlossener tragbarer US-Sonde zu sehen. c, Illustration der in dieser Studie verwendeten US-Stimulationswellenform. ISI, Inter-Stimulus-Intervall; PD, Pulsdauer; PRF, Pulswiederholungsfrequenz. d, Kalibrierung des Temperaturanstiegs (T) an der Oberfläche (oben) und im Inneren (unten) der US-Sonde. Die Temperatur im Inneren der Sonde wurde zwischen dem piezoelektrischen Material und dem Kopf der Maus gemessen, wenn US-Sonden auf die POA oder den Kortex gerichtet waren. Cortex wurde als Off-Target-Kontrolle ausgewählt. Die US-Beschallung wird durch die rosa Balken angezeigt. n = 6 Mäuse (oben) und n = 4 Mäuse (unten). Durchgezogene Linien und Schatten geben den Mittelwert ± Standardabweichung an

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Natürliche Erstarrung ist durch die Hauptmerkmale Hypothermie, Hypometabolismus und Hypoaktivität gekennzeichnet11,23. Wir haben einen tragbaren „Plug-and-Play“-Ultraschallwandler entwickelt (Abb. 1b und Extended Data Abb. 1), um Ultraschall aus der Ferne an die POA-Region frei beweglicher Mäuse zu liefern, die nach Belieben Zugang zu Nahrung und Wasser hatten. Wir zeichneten zunächst die Änderung der Körpertemperatur von Mäusen mit einer Wärmeinfrarotkamera auf und stellten während und nach der Ultraschallstimulation einen starken Abfall der Hauttemperatur im interskapularen Bereich fest, in dem sich braunes Fettgewebe (BAT) befindet (TBAT) (Abb. 2a und Zusatzvideo 1). (1,6 MPa Schalldruck, 3,2 MHz Frequenz, 50 ms Impulsdauer, 10 Hz Impulswiederholungsfrequenz, 10 s Reizdauer, 30 s Interstimulusintervall und 6 Gesamtzahl der Reize; Abb. 1c). Diese Beobachtung eines Temperaturabfalls der BAT war mit einem Anstieg der Schwanztemperatur synchronisiert (Abb. 2a, b). Zwei Hauptmechanismen, die der Thermoregulation bei Nagetieren zugrunde liegen, sind die BAT-Thermogenese (die eine zitterfreie Wärmeerzeugung ermöglicht) und die Schwanzvasodilatation (die die Wärmeableitung ermöglicht). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ultraschallstimulation von POA bei Mäusen die Wärmeproduktion unterdrückte und einen Wärmeverlust auslöste, der zu Unterkühlung führte. Videoaufzeichnungen des Tierverhaltens zeigten, dass die Ultraschallstimulation des POA auch mit einer Verringerung der Bewegungsaktivität korrelierte (Abb. 2b).

a, Infrarot-Wärmebilder (oben) und Fotos (unten) einer Maus, die am POA eine US-Stimulation erhält. Die US-Transducer-Sonde ist durch gepunktete Kreise markiert. b, BAT-Temperatur (TBAT), Schwanztemperatur (Ttail) und körperliche Aktivität von Mäusen mit US-Stimulation bei POA (US+, n = 12 Mäuse) im Vergleich zu zwei Kontrollgruppen: Mäuse ohne US-Beschallung (US–, n = 12 Mäuse) und Mäuse mit US-Stimulation am Kortex als Off-Target-Kontrolle (Off-Target, n = 6 Mäuse). Die US-Beschallung wird durch die rosa Balken angezeigt. c, Kernkörpertemperatur (Tcore), Stoffwechselrate (VO2) und RQ (VCO2/VO2) für US+ (n = 13 Mäuse für Tcore und n = 17 Mäuse für VO2 und RQ), US– (n = 14 Mäuse für Tcore und n = 18 Mäuse für VO2 und RQ) und Off-Target-Gruppen (n = 4 Mäuse für Tcore, VO2 und RQ) (oben, von links nach rechts). Maximaler ΔTcore (niedrigster Tcore – mittlerer Tcore vor US), maximaler ΔVO2 (niedrigster VO2 – mittlerer VO2 vor US) und maximaler ΔRQ (niedrigster RQ – mittlerer RQ vor US) (unten, von links nach rechts). Männliche und weibliche Mäuse werden als blaue bzw. rosa Punkte dargestellt. d, Repräsentative EKG-Kurven bei Mäusen vor (oben) und nach US-Stimulation (unten). e, Herzfrequenz vor und nach der US-Stimulation für die Gruppen US+ (n = 9 Mäuse), US– (n = 5 Mäuse) und Off-Target (n = 5 Mäuse, gezielt auf den Hippocampus) (links). Während der gesamten Aufnahmezeit wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Off-Target- und der US-Gruppe festgestellt. Vergleich der Herzfrequenz vor der US-Stimulation und der niedrigsten Herzfrequenz, die durch die US-Stimulation bei POA innerhalb von 10 Minuten nach der US-Stimulation erreicht wurde (rechts). BPM, Schläge pro Minute. Durchgezogene Linien und Schatten geben den Mittelwert ± SEM an. Fehlerbalken geben SEM an. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus. Die P-Werte wurden unter Verwendung einer einseitigen Varianzanalyse, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test in c und e (links), wobei die US+- und Off-Target-Gruppen jeweils mit der US–-Gruppe verglichen wurden, und einem zweiseitigen gepaarten t-Test in berechnet e (rechts).

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Anschließend platzierten wir Mäuse in Stoffwechselkäfigen, die es uns ermöglichten, ihren Stoffwechsel vor, während und nach der Ultraschallstimulation der POA zu beurteilen, indem wir die Sauerstoffverbrauchsraten (VO2) und den Atmungsquotienten (RQ = VCO2 / VO2) analysierten12. Diesen Mäusen wurden drahtlose Temperatursensoren in ihre Bauchhöhle implantiert, um gleichzeitig die Körperkerntemperatur (Tcore) zu messen. Die Ultraschallstimulation führte zu einer deutlichen Abnahme der Körperkerntemperatur (max. ∆Tcore = −3,26 ± 0,19 °C) (Abb. 2c) und des VO2 (um 36,61 ± 1,74 %) (Abb. 2c). Diese Effektgrößen ähnelten der zuvor berichteten nüchterninduzierten Erstarrung bei Mäusen11,24. Ultraschall unterdrückte den Sauerstoffverbrauch vor dem Absinken der Körpertemperatur (Extended Data Abb. 2b,c), was eher auf eine aktive Hemmung des Stoffwechsels als auf einen sekundären Effekt der Unterkühlung schließen lässt. Die Dauer der Tcore-Reduktion unter die Körpertemperatur betrug laut UIH 51,98 ± 5,52 Minuten (Extended Data Abb. 2d), was mit natürlicher Erstarrung vergleichbar war24,25. Ultraschall verringerte auch den RQ auf 0,72 ± 0,01 (Abb. 2c). Ein RQ nahe 0,7 weist darauf hin, dass die UIH die Nutzung des Energiesubstrats von einer Mischung aus Kohlenhydraten und Fett auf die Fettoxidation umgestellt hat, was sich als gemeinsames Merkmal träger Tiere erwiesen hat26. Mäuse, die sich einer UIH unterzogen, wechselten spontan vom hypothermischen und hypometabolischen Zustand in einen normalen Zustand, was auch ein entscheidendes Merkmal der natürlichen Erstarrung ist5,11,12. Elektrokardiogramm (EKG)-Aufzeichnungen zeigten, dass UIH die Herzfrequenz um 47,3 % senkte, was deutlich niedriger war als vor der Ultraschallstimulation und in der Gruppe ohne Ultraschallstimulation (Abb. 2d, e). Diese physiologischen Zustände wurden bei Mäusen ohne Ultraschallstimulation oder mit Ultraschallstimulation an Stellen außerhalb des Ziels (Kortex und ventraler Hippocampus) nicht beobachtet (Abb. 2b – e und erweiterte Daten Abb. 3), was bestätigt, dass es sich um einen ultraschallinduzierten, erstarrenden Zustand handelt wurde durch POA-spezifische Stimulation hervorgerufen, anstelle von unspezifischen Effekten, wie z. B. Wärme, die durch piezoelektrisches Ultraschallmaterial erzeugt wird (Abb. 1d). Die immunhistologische Untersuchung des Gehirns von Mäusen nach der Ultraschallbehandlung ergab keine sichtbaren Schäden oder Entzündungen im Gehirn (Extended Data Abb. 4). Alle oben genannten Experimente wurden bei Raumtemperatur (~22 °C) durchgeführt. Wir wiederholten das Experiment bei kalter (6 °C) und thermoneutraler (30 °C) Umgebungstemperatur und stellten fest, dass Hypothermie und Hypometabolismus erfolgreich hervorgerufen wurden (Extended Data Abb. 5). Die Effektgröße von UIH nahm mit abnehmender Umgebungstemperatur zu (Extended Data Abb. 5), was darauf hindeutet, dass die Wirkung von UIH durch die Umgebungstemperatur moduliert werden könnte.

Als nächstes untersuchten wir die Fähigkeit von Ultraschall, die Tiefe und Dauer der Unterkühlung präzise zu kontrollieren. Diese Fähigkeit, den induzierten Zustand präzise zu steuern, ist der Schlüssel zur erfolgreichen Herstellung des schläfrigen Zustands. Die Wirkung von Ultraschall auf das Gehirn hängt von vielen Parametern ab, darunter dem Schalldruck und der Reizdauer. Wir beobachteten, dass ein höherer Schalldruck und eine höhere Reizdauer die UIH-Tiefe erhöhten, gemessen am maximalen ∆TBAT (Abb. 3a, b). Ein Schalldruck von mehr als 0,8 MPa war erforderlich, um eine signifikante Änderung von ∆TBAT unter dem in dieser Studie getesteten Parameterraum zu bewirken. Wir haben einen automatischen Rückkopplungsregler mit geschlossenem Regelkreis entwickelt, um durch binäre Steuerung der Ultraschallausgabe eine lang anhaltende und stabile UIH zu erreichen. Als Machbarkeitsnachweis stellte der geschlossene Rückkopplungsregler die gewünschte Körpertemperatur (Tset) auf weniger als 34 °C ein, was zuvor als Kriterium für natürliche Erstarrung bei Mäusen angegeben wurde27 (Abb. 3c). Der Controller empfing kontinuierlich Eingangssignale vom Körperkerntemperatursensor und schaltete dann die Ultraschallstimulation ein, wenn Tcore > Tset, oder aus, wenn Tcore ≤ Tset. Die Körperkerntemperatur wurde insgesamt 30 Stunden lang aufgezeichnet und das Feedback-gesteuerte Ultraschallverfahren 24 Stunden lang fortgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die rückkopplungsgesteuerte UIH die Körpertemperatur der Maus etwa 24 Stunden lang (24,90 ± 0,63 Stunden) auf 32,95 ± 0,45 °C hielt (Abb. 3d, e). Mäuse zeigten bei rückkopplungsgesteuerter UIH im Vergleich zu Kontrollen eine verringerte Nahrungsaufnahme und einen geringeren Gewichtsverlust (Abb. 3f). Die Körpertemperatur der Maus erholte sich 54,18 ± 35,56 Minuten nach Ende der rückkopplungsgesteuerten UIH allmählich auf ein normales Niveau (> 34 ° C) (Erweiterte Daten, Abb. 2e). Das geschlossene Rückkopplungskontrollsystem zeigt das große Potenzial der Ultraschall-Gehirn-Schnittstellentechnologie für die nichtinvasive, präzise Induktion von UIH.

a, TBAT gemessen mit US-Stimulation bei unterschiedlichem Schalldruck (links) und Reizdauer (rechts). Durchgezogene Linien und Schatten in den Kurven geben den Mittelwert ± Standardabweichung b an. Korrelationen zwischen maximalem ΔTBAT (niedrigster TBAT – mittlerer TBAT vor US) und akustischem Druck (links) oder Reizdauer (rechts). n = 4 Mäuse für die 0,4-MPa-, 1,2-MPa-, 2-s-, 4-s- und 6-s-Gruppen; n = 7 für die 0-MPa- und 0-s-Gruppen; n = 3 für die 0,8 MPa- und 8-s-Gruppen und n = 6 für die 1,6 MPa- und 10-s-Gruppen. Fehlerbalken kennzeichnen sem c, Schematische Darstellung des geschlossenen Feedback-Kontrollsystems zur Erzielung einer Langzeit-UIH (erstellt mit BioRender.com). d, Repräsentativer Tcore, gemessen an einer Maus mit dem Feedback-gesteuerten UIH mit geschlossenem Regelkreis. Jeder US-Konjunkturimpuls wird durch einen rosa Punkt dargestellt. e, Quantifizierung des mittleren Tcore (links) und der Dauer, wenn Tcore < 34 °C (rechts) durch das geschlossene Rückkopplungskontrollsystem erreicht wird. f, Nahrungsaufnahme (links) und Körpergewichtsveränderung (rechts) der Mäuse, die einer Feedback-kontrollierten UIH mit geschlossenem Regelkreis unterzogen wurden (US+, n = 4 Mäuse), im Vergleich zu den Kontrollmäusen (US−, n = 4 Mäuse). Bei den Boxplots zeigen die Mittellinie und die Boxgrenzen an, dass die mittleren ± SEM-P-Werte mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests berechnet wurden.

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Um den neuronalen Mechanismus von UIH zu verstehen, begannen wir mit der Ex-vivo-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und der Immunfluoreszenzfärbung des neuronalen Aktivitätsmarkers Fos in der durch Ultraschall gezielten POA-Region (Abb. 4a und erweiterte Daten, Abb. 6). Die Fos-Expression war im medialen präoptischen Bereich (MPA; 10,17 ± 1,30 % gegenüber 1,85 ± 0,69 %), im medialen präoptischen Kern (MPO; 7,58 ± 0,51 % gegenüber 1,38 ± 0,57 %) und im periventrikulären Kern (Pe; 6,68 ± 1,39 %) hoch. gegenüber 1,43 ± 0,82 %) (Abb. 4b). Anschließend untersuchten wir die Dynamik der neuronalen Aktivität im POA als Reaktion auf Ultraschall. Wir exprimierten den Calcium (Ca2+)-Reporter GCaMP6s in POA-Neuronen, installierten eine optische Faser in derselben Region und zeichneten kontinuierlich die Dynamik der Ca2+-Aktivität vor, während und nach der Ultraschallstimulation mittels Faserphotometrie auf (Abb. 4c). Wir beobachteten einen konsistenten, robusten und wiederholten Anstieg der neuronalen Aktivität als Reaktion auf jeden Ultraschallimpuls (Abb. 4d). Die während der Ultraschallstimulation aufgezeichnete neuronale Aktivität war durch einen Anstieg der Spitzenamplitude (von 0,17 ± 0,30 auf 2,03 ± 0,42), des mittleren Z-Scores (von 0,09 ± 0,28 auf 1,69 ± 0,40) und der Spitzenfrequenz (von 0 auf 5,7 ± 1,08) gekennzeichnet min−1) im Vergleich zur neuronalen Aktivität, die vor der Ultraschallstimulation gemessen wurde (Abb. 4e). Der Trend der Ca2+-Aktivitätsänderungen stimmte mit dem Trend der Körpertemperaturänderungen überein (Abb. 4d). Diese Ergebnisse zeigten, dass UIH durch Ultraschallaktivierung von POA-Neuronen hervorgerufen wurde. Unsere Feststellung, dass die transkranielle Stimulation des POA ausreichte, um UIH auszulösen, zeigte die entscheidende Rolle des POA bei der Herbeiführung eines erstarrenden Zustands bei Mäusen.

a, Oben: In-situ-Hybridisierungsanalyse des Fos-Markers in der POA-Region in Mäusen mit (US+) und ohne (US–) US-Stimulation. Die Einfügung zeigt die Gehirnregion, in der diese Bilder aufgenommen wurden. Räumliche Verteilung des Fos-Signals, registriert mit dem Gehirnatlas der Maus (unten). LPO, lateraler präoptischer Bereich; VLPO, ventrolateraler präoptischer Kern; VMPO, ventromedialer präoptischer Kern. b, Anteil der Fos+-Zellen in verschiedenen POA-Gehirnregionen in den US+- und US–-Gruppen. n = 6 Mäuse für die US+-Gruppe und n = 4 Mäuse für die US-Gruppe, mit Ausnahme der VLPO-Quantifizierung in der US+-Gruppe, wo n = 5 Mäuse verwendet wurden. Fehlerbalken kennzeichnen Sem c, schematische Darstellung der faserphotometrischen Aufzeichnung der neuronalen Ca2+-Aktivität im von den USA angestrebten POA (erstellt mit BioRender.com) (links). Das MRT einer Maus zeigt die konfokale Ausrichtung von Glasfaser (grüne gepunktete Linie) und US-Wandler (braun) in der POA-Region (rechts). d, Repräsentative Ca2+-Aktivitäten (oben) von POA-Neuronen, die US-Stimulation erhalten, und die entsprechende TBAT-Kurve (unten). Die US-Stimulation besteht aus sechs Einzelreizen. e, Ca2+-Signal als Reaktion auf jeden US-Impuls von n = 7 Mäusen. Basierend auf diesem Ca2+-Signal wurden die Spitzenamplitude, der mittlere Z-Score und die Frequenz in drei Fenstern vor (5 s), während (10 s) und nach (15 s) US-Stimulation (n = 7 Mäuse) quantifiziert. Bei den Boxplots zeigen die Mittellinie und die Boxgrenzen an, dass die mittleren ± SEM-P-Werte durch den ungepaarten zweiseitigen T-Test (b) und den gepaarten zweiseitigen T-Test (e) berechnet wurden.

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Um das ultraschallempfindliche Molekül zu identifizieren, das die Aktivierung von POA-Neuronen ermöglicht, die mit der Induktion von UIH (POAUIH-Neuronen) verbunden sind, führten wir eine Hochdurchsatz-Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) der auf Ultraschall gerichteten POA-Region durch. Wir sezierten die POA-Regionen (n = 4 Mäuse für die US+-Gruppe und n = 4 Mäuse für die US−-Scheingruppe), dissoziierten sie, um einzelne Kerne zu sammeln und Kerne aus Neuronen mithilfe des NeuN-Markers vorzuselektieren. Insgesamt 35 verschiedene neuronale Cluster mit 21.886 Neuronen (Abb. 5a) wurden mithilfe unbeaufsichtigter, graphbasierter Clusterbildung identifiziert28. Davon sind 11 Cluster erregend (darunter 2 Hybridcluster) und 24 hemmend (darunter 3 Hybridcluster) (Abb. 5b), was mit der hohen Vielfalt der Zelltypen in der POA übereinstimmt11,29. Jüngste Studien ergaben, dass Torpor-assoziierte Neuronen durch spezifische genetische Marker gekennzeichnet sind, darunter Adcyap1 (kodierend für Adenylatcyclase aktivierendes Polypeptid-1)11, Qrfp (pyroglutamyliertes RFamid-Peptid)12 und Esr1 (Östrogenrezeptor-1)15. Darüber hinaus wurde ein Großteil dieser Neuronen entweder als erregend oder hybrid klassifiziert. Wir verwendeten diese drei Marker, um Torpor-assoziierte Neuronen durch k-Means-Clustering zu identifizieren30 und fanden sieben Torpor-assoziierte Cluster, bei denen es sich um erregende oder hybride Neuronen handelte (Abb. 5b).

a, UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) von 21.886 neuronalen Kernen. Unterschiedliche Farben repräsentieren unterschiedliche neuronale Populationen. Die Expressionsniveaus der drei wichtigsten repräsentativen klassenspezifischen Markergene sind auf UMAP farblich gekennzeichnet (blau): Gad1 für inhibitorische Cluster, Slc17a6 für erregende Cluster und Adcyap1+ für Torpor-assoziierte Cluster. b, Expression von exzitatorischen und inhibitorischen Markergenen über verschiedene neuronale Zelltypen hinweg (organisiert durch k-means-Clustering) (oben). Expression von Torpor-assoziierten Markergenen (Adcyap1, Esr1 und Qrfp) in erregenden und hybriden neuronalen Populationen (geclustert basierend auf diesen Torpor-assoziierten Genen) (Mitte). Expression aller Gene, die für TRP- und PIEZO-Kanalfamilien kodieren, in allen Torpor-assoziierten Clustern, geordnet nach dem Expressionsniveau der IEGs (unten). Der rosa Balken zeigt den Cluster an, der von den USA aktiviert wurde. c: Die Expressionsebene von Trpm2 ist auf UMP farblich gekennzeichnet (blau). Der US-aktivierte Torpor-assoziierte h0-Cluster ist im Diagramm markiert. d, Repräsentatives FISH-Bild von Adcyap1 und Trpm2 im POA-Bereich von zwei koronalen Abschnitten aus verschiedenen Ebenen. FISH-Analysen wurden bei fünf Mäusen wiederholt. Die anterior-posterioren Koordinaten relativ zum Bregma werden basierend auf dem Allen Mouse Brain Atlas62 angegeben.

Die allgemein akzeptierte Hypothese für die Ultraschall-Neuromodulation ist die Aktivierung endogener ultraschallempfindlicher Ionenkanäle. Obwohl frühere Studien über die Aktivierung mehrerer Ionenkanäle aus PIEZO- und TRP-Familien berichteten (einschließlich PIEZO1/2 (Ref. 31,32), TRPA1 (Ref. 33), TRPV1 (Ref. 34), TRPP1/2 und TRPC1 (Ref. 35)) wurden diese Studien hauptsächlich in vitro mit kultivierten Zellen durchgeführt. Es wurde keine In-vivo-Studie durchgeführt, um mögliche Ionenkanäle zu untersuchen und so die ultraschallempfindlichen Ionenkanäle auf Neuronen im Gehirn aufzudecken. Hier untersuchten wir alle Gene von TRP (TRPV, TRPM, TRPC, TRPP, TRPA und TRPML) und PIEZO-Kanalfamilien in den torporassoziierten erregenden Neuronen und fanden eine breite Expression von Genen, die für TRP-Kanalfamilien kodieren, einschließlich TRPV, TRPM, TRPC , TRPA- und PIEZO-Ionenkanäle (Abb. 5b). Unter allen sieben Torpor-assoziierten neuronalen Populationen identifizierten wir dann eine spezifische Population, die durch eine hohe Expression von fünf neuronalen Aktivierungsmarkern gekennzeichnet war, darunter Fos, Fosb, Nr4a1, Egr1 und Dusp1, auch als Immediate-Early-Gene (IEGs) bekannt dass diese neuronale Population durch Ultraschall aktiviert wurde. Wir beziehen uns auf die durch Ultraschall aktivierte Torpor-assoziierte neuronale Population POAUIH-Neuronen. Durch die Untersuchung aller TRP- und PIEZO-Kanalgene stellten wir fest, dass das Expressionsniveau von TRPM2 in den POAUIH-Neuronen hoch war (Abb. 5b, c).

Um zu überprüfen, ob der TRPM2-Ionenkanal ultraschallempfindlich ist, führten wir eine Ex-vivo-FISH-Analyse durch und stellten fest, dass Trpm2 mit Fos mit einem Koexpressionsprozentsatz von 27,53 ± 9,75 % koexprimiert wurde (Abb. 6a, b). Anschließend haben wir die Ultraschallempfindlichkeit von TRPM2 weiter bewertet, indem wir es in HEK293T-Zellen überexprimiert haben. Wir fanden heraus, dass Ultraschall erfolgreich den Ca2+-Einstrom in Zellen induzierte, die TRPM2 überexprimierten, was in den Wildtyp-Zellen nicht beobachtet wurde (Abb. 6c, d). Die durch Ultraschall hervorgerufene Ca2+-Reaktion in TRPM2+-Zellen wurde durch den TRPM2-Blocker 2-APB signifikant unterdrückt (Abb. 6c,d). Diese Ergebnisse stützen stark, dass TRPM2 ein ultraschallempfindlicher Ionenkanal ist.

a, Repräsentative FISH-Bilder von Fos und Trpm2. Zellen, die Fos und Trpm2 koexprimieren, sind eingekreist. b, Der Prozentsatz der Fos+-Zellen in Populationen, die Trpm2 exprimieren (Trpm2+), im Vergleich zur Population ohne Trpm2-Expression (Trpm2−). n = 4 Mäuse. c, Fluoreszenz-Ca2+-Bilder von in vitro HEK293T-Zellen ohne TRPM2-Überexpression (links), mit TRPM2-Überexpression (Mitte) und mit TRPM2-Überexpression und 2-APB-Blocker (rechts). Vor US-Stimulation (oben); nach US-Stimulation (unten). n = 5 unabhängige Tests. WT, Wildtyp. d, Wärmekarte des normalisierten Ca2+-Signals (ΔF/F) von 100 zufällig ausgewählten Zellen aus fünf unabhängigen Tests in diesen drei Gruppen. Gepunktete Linien zeigen die Ein- und Ausschaltzeit der US-Stimulation an. e, ΔTBAT (Änderung des TBAT relativ zur Grundlinie) von Mäusen, denen shRNA injiziert wurde, um TRPM2 (TRPM2-KD) auszuschalten (links). Der maximale ΔTBAT (rechts) wurde anhand des linken Diagramms als der niedrigste ΔTBAT während des 7–12-minütigen Intervalls nach Beginn der US-Stimulation bestimmt. Die Scheingruppe erhielt eine Injektion mit durcheinandergemischter shRNA. n = 5 Mäuse für die Scheingruppe und n = 7 Mäuse für die TRPM2-KD-Gruppe. f, Ca2+-Signal als Reaktion auf US-Ultraschall (rosa Balken) bei TRPM2-KD-Mäusen im Vergleich zur Scheingruppe. Die Spitzenamplitude der Ca2+-Kurve wurde für die TRPM2-KD-Gruppe und die Scheingruppe quantifiziert. n = 8 Mäuse für die Scheingruppe und n = 10 Mäuse für die TRPM2-KD-Gruppe. Durchgezogene Linien und Schatten in Kurven geben den Mittelwert ± SEM an. Fehlerbalken geben SEM an. Die US-Stimulation ist durch rosa Balken gekennzeichnet. Die P-Werte wurden mithilfe des ungepaarten zweiseitigen t-Tests in b und e berechnet. Beim Vergleich der Spitzenamplitude vor und während der US-Stimulation wurde in f ein gepaarter zweiseitiger t-Test verwendet.

Quelldaten

Um zu überprüfen, ob der TRPM2-Ionenkanal an der UIH beteiligt ist, führten wir eine In-situ-Hybridisierungsanalyse durch und stellten fest, dass Trpm2 mit dem molekularen Marker von Torpor-assoziierten Neuronen Adcyap1 mit einem Koexpressionsprozentsatz von 35,7 ± 5,3 % kolokalisiert war (Abb. 5d). Wir haben die Rolle von TRPM2 bei UIH weiter untersucht, indem wir Lentivirus-shRNA verwendet haben, um die TRPM2-Expressionsniveaus (TRPM2-KD) in der POA-Region gezielt zu senken. Die Western-Blot-Analyse bestätigte den erfolgreichen Abbau von TRPM2 (Extended Data Abb. 7). TRPM2-KD-Mäuse verringerten die UIH signifikant. Die TBAT-Temperatursenkung war bei TRPM2-KD-Mäusen im Vergleich zur Kontrolle um 41,2 % verringert (Abb. 6e). Die Amplitude des durch Ultraschall hervorgerufenen Ca2+-Signals in POA sank bei TRPM2-KD-Mäusen nahezu auf den Ausgangswert (Abb. 6f). Diese Ergebnisse zeigten, dass TRPM2 an der Induktion von UIH beteiligt war.

Anschließend untersuchten wir die potenziellen nachgeschalteten Hirnregionen, die mit der Aktivierung von POA-Neuronen während der UIH verbunden sind. Es wurde zuvor berichtet, dass metabolische und thermische Regulierungen durch POA-Projektionen auf den dorsomedialen Hypothalamus (DMH)36,37, den Arcuatuskern (ARC)36 und den ventromedialen Hypothalamus (VMH)36 koordiniert werden, die sich in der Hypothalamusregion hinter dem POA befinden. Wir führten die FISH-Analyse des Fos-Markers in diesen hypothalamischen Regionen nach Ultraschallstimulation am POA durch. Wir stellten eine erhöhte Fos-Expression in mehreren hypothalamischen Bereichen fest, einschließlich DMH, ARC und dem lateralen Hypothalamus (LH) (Abb. 7a, b). Die höchste Fos-Expression wurde in DMH beobachtet (6,00 ± 0,91 % in US+) (Abb. 7b). Wir zeichneten das Ca2+-Signal in der DMH-Region mittels Faserphotometrie auf und richteten gleichzeitig Ultraschall auf den POA, um die neuronale Aktivität von DMH während UIH zu untersuchen ( Abb. 7c). Wir beobachteten, dass die mittlere Spitzenamplitude des Ca2+-Signals von DMH-Neuronen während der Ultraschallstimulation an der POA anstieg (von 0,04 ± 0,20 auf 0,41 ± 0,15; Abb. 7d, e), was zeigt, dass die Aktivierung von DMH-Neuronen mit der UIH zusammenhängt . Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DMH möglicherweise am neuronalen Schaltkreis beteiligt ist, der die UIH reguliert, während andere Gehirnregionen (z. B. ARC und VMH) möglicherweise auch als Knoten im neuronalen Torpor-Netzwerk fungieren.

a, FISH-Färbung des Fos-Markers in hypothalamischen Regionen um DMH bei Mäusen mit (US+) und ohne (US–) US-Stimulation (links). Die Orte dieser Bilder sind im Gehirnatlas angegeben (Einfügung). Räumliche Verteilung des Fos-Signals, registriert im Gehirnatlas der Maus (rechts). TU, Riechtuberkel. b, Anteil der Fos+-Zellen in DMH, ARC, LH, VMH und TU für US+- und US–-Mäuse. n = 5 Mäuse für die US+-Gruppe und n = 4 Mäuse für die US−-Gruppe. Fehlerbalken kennzeichnen sem c, Setup für die photometrische Aufzeichnung der neuronalen Ca2+-Aktivität im DMH gleichzeitig mit US-Targeting auf den POA. d, Ca2+-Aktivität von DMH-Neuronen während der US-Stimulierung von POA-Neuronen. n = 5 Mäuse. Durchgezogene Linien und Schatten in den Kurven geben den Mittelwert ± Standardabweichung, die Spitzenamplitude (links), den mittleren Z-Score (Mitte) und die Häufigkeit (rechts) der neuronalen DMH-Aktivität vor, während und nach der US-Stimulation in der POA-Region an. n = 5 Mäuse. f, illustrativ für die Hypothese, dass UIH durch UCP1-abhängige BAT-Thermogenese und Energieaufwand vermittelt wird. g, Tcore während der US-Stimulation im Vergleich von WT- und UCP1-Knockout-Mäusen (UCP1-KO) (links). Max. ΔTcore (niedrigster Tcore – mittlerer Tcore vor US) (rechts). h, VO2 während der US-Stimulation bei WT- und UCP1-KO-Mäusen (links). Max. ΔVO2 (niedrigste VO2 – mittlere VO2 vor Ultraschallstimulation) (rechts). In g und h bezeichnen durchgezogene Linien und Schatten in Kurven den Mittelwert ± Standardabweichung; Fehlerbalken bezeichnen sem; n = 6 Mäuse für die WT-Gruppe und n = 5 Mäuse für die UCP1-KO-Gruppe. Der P-Wert wurde mithilfe des ungepaarten zweiseitigen T-Tests (b, g, h) und des gepaarten zweiseitigen T-Tests (e) berechnet. c und f wurden mit BioRender.com erstellt.

Quelldaten

Es ist bekannt, dass der Hypothalamus mit dem sympathischen Nervensystem verbunden ist, das die Thermogenese und den Energieverbrauch peripherer Effektorgewebe verändert38. Wir beobachteten den Abfall der BAT-Temperatur während der UIH (Abb. 2a, b), was darauf hindeutet, dass BAT ein stromabwärts gelegenes Effektorgewebe der neuronalen Schaltkreise der UIH ist (Abb. 7f). Da UCP1 das entscheidende mitochondriale Protein ist, das für die BAT-Thermogenese39 verantwortlich ist, verwendeten wir UCP1-KO-Mäuse für UIH und verglichen die Veränderungen von Tcore und VO2 mit denen der Wildtyp-Kontrolle. Wir fanden heraus, dass die Tiefe der ultraschallinduzierten Hypothermie (gemessen durch max. ΔTcore) bei UCP1-KO-Mäusen etwa 2,2-fach geringer war als bei Wildtyp-Mäusen (Abb. 7g). Das Ausmaß des Hypometabolismus (gemessen am maximalen ΔVO2) war bei UCP1-KO-Mäusen 1,7-fach niedriger als bei Wildtyp-Mäusen (Abb. 7h); Dieser hypothermische und hypometabolische Zustand wurde bei UCP1-KO-Mäusen jedoch nicht vollständig beseitigt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass BAT ein Effektorgewebe ist, das die Veränderungen der Körpertemperatur und der Stoffwechselrate während der UIH vermittelt.

Mäuse sind gut darauf vorbereitet, unter Kalorienrestriktion in einen Zustand der Erstarrung zu geraten. Um zu beurteilen, ob UIH bei nicht trägen Tieren hervorgerufen werden kann, führten wir eine Ultraschallstimulation bei Ratten durch, einer Art, die weder Winterschlaf noch tägliche Erstarrung zeigt12,14. Mithilfe eines tragbaren Ultraschallwandlers mit einem ähnlichen Design wie bei Mäusen wurde Ultraschall aus der Ferne in die POA-Region frei beweglicher Ratten abgegeben (Abb. 1b). Wir fanden eine Abnahme der Hauttemperatur, insbesondere im BAT-Bereich (TBAT), nach der Ultraschallstimulation (Abb. 8a, b). Die Ultraschallstimulation führte bei Ratten auch zu einer signifikanten Abnahme der Körperkerntemperatur (max. ∆Tcore = –1,33 ± 0,22 °C) (Abb. 8c). Obwohl der Grad der Senkung der Körpertemperatur bei Ratten geringer war als bei Mäusen, belegen diese Daten die Durchführbarkeit von UIH bei einem nicht trägen Tier.

a: Infrarot-Wärmebilder einer Ratte, die am POA US-Stimulation erhält. b, TBAT von Ratten, die Ultraschall am POA erhielten (US+, n = 12) im Vergleich zu Kontrollratten ohne US-Stimulation (US–, n = 4). c, Tcore-Kurven in den Gruppen US+ (n = 6) und US– (n = 6) (links). Vergleich des maximalen ΔTcore zwischen den US+- und US–-Gruppen (rechts). Durchgezogene Linien und Schatten in Kurven geben den Mittelwert ± Standardabweichung an. Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung. Der P-Wert wurde mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests berechnet.

Quelldaten

In dieser Studie haben wir die UIH-Technik entwickelt, die bei Mäusen nichtinvasiv, präzise und sicher einen erstarrenden Zustand hervorruft. Wir haben gezeigt, dass UIH durch Ultraschallaktivierung von POA-Neuronen hervorgerufen wurde. POAUIH-Neuronen wiesen eine hohe Expression des TRPM2-Ionenkanals auf, der sich als ultraschallempfindlich erwies und zur Induktion von UIH beitrug. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse auf eine mögliche Beteiligung des dorsomedialen Hypothalamus als nachgelagerte Hirnregion und des braunen Fettgewebes als Effektorgewebe bei UIH hin. Wir haben gezeigt, dass die Ultraschallstimulation am POA bei einem nicht trägen Tier (Ratte) einen Unterkühlungszustand hervorrief.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Ultraschallstimulation des POA physiologische Prozesse insgesamt auf eine Weise unterdrückte, die einer natürlichen Erstarrung ähnelte. Die Ultraschallstimulation unterdrückte systematisch den Stoffwechsel und die Thermogenese, verlagerte die Nutzung des Energiesubstrats auf Fett und verringerte die Herzfrequenz, was zusammengenommen Schlüsselmerkmale der natürlichen Erstarrung sind11,23. Es wurde festgestellt, dass eine einzelne Ultraschallstimulation einen hypothermischen und hypometabolischen Zustand hervorruft, der bis zu etwa einer Stunde anhält, was mit natürlicher Erstarrung übereinstimmt24,25. Diese verlängerte Dauer stimmte auch mit einem früheren Bericht überein, der feststellte, dass die optogenetische Aktivierung von QRFP-Neuronen im POA nach einer 1-sekündigen Lichtbeleuchtung zu einem Unterkühlungszustand führte, der länger als 30 Minuten anhielt12. Die relativ lange Dauer dieses Zustands wird teilweise auf den langsamen Prozess der Thermogenese während der Wiedererwärmung zurückgeführt40. Es könnte auch möglich sein, dass neuronale Schaltkreise, die an der Aufrechterhaltung dieses hypothermischen und hypometabolischen Zustands beteiligt sind, direkt oder indirekt durch Ultraschallstimulation aktiviert werden. Trotz der Ähnlichkeit zwischen UIH und natürlicher Erstarrung gibt es immer noch Unterschiede zwischen diesen beiden Zuständen hinsichtlich der nachgeschalteten Effektorgewebe. Wir fanden heraus, dass BAT am durch UCP1 vermittelten UIH-Prozess beteiligt ist, der sowohl die Tiefe der Hypothermie und des Hypometabolismus als auch die Erregung durch UIH reguliert (Extended Data, Abb. 8). Bei natürlicher Erstarrung wurde jedoch berichtet, dass UCP1 hauptsächlich zur Erregung aus der Erstarrung beiträgt, nicht jedoch zur Tiefe der Unterkühlung und des Hypometabolismus40. Darüber hinaus stieg die Schwanztemperatur der Maus während der UIH an, möglicherweise um die Wärmeableitung durch Vasodilatation zu verbessern. Dieses Phänomen wurde bei nüchternbedingter täglicher Erstarrung nicht berichtet41. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen dem UIH-Zustand und der natürlichen Erstarrung im Hinblick auf physiologische Merkmale, neuronale Schaltkreise und Effektorgewebe zu charakterisieren und zu verstehen.

Die global koordinierte Regulierung von Torpor-assoziiertem Verhalten lässt darauf schließen, dass Ultraschall die Torpor-assoziierten neuronalen Populationen bei POA moduliert. Tatsächlich ergab die Einzelkern-RNA-Sequenzierung, dass Ultraschall die zuvor berichteten Torpor-assoziierten neuronalen Populationen bei POA aktivierte, die durch die Markergene Adcyap1, Qrfp und Esr1 gekennzeichnet sind (Ref. 11, 12, 15). Wir haben entdeckt, dass TRPM2 ein ultraschallempfindlicher Ionenkanal in POAUIH-Neuronen ist. Unsere Studie liefert In-vivo-Beweise, die zeigen, dass Ultraschall neuronale Aktivitäten im Gehirn durch die Aktivierung endogener Ionenkanäle moduliert. TRPM2 wurde zuvor in wärmeempfindlichen POA-Neuronen entdeckt, die die Körpertemperatur regulieren42. Wir haben herausgefunden, dass TRPM2 für die Auslösung von UIH notwendig ist. Diese Studie konzentrierte sich auf TRPM2, den am stärksten exprimierten Ionenkanal in POAUIH-Neuronen unter den in unsere Analyse einbezogenen Ionenkanälen. Zusätzlich zu TRPM2 beobachteten wir auch eine breite Expression anderer TRP- und PIEZO-Kanalfamilien in torporassoziierten neuronalen Populationen. TRPM2-Knockdown unterdrückte teilweise die Tiefe von UIH, hob den UIH-Effekt jedoch nicht vollständig auf, was darauf hindeutet, dass auch andere ultraschallempfindliche Ionenkanäle oder Moleküle an der Ultraschallaktivierung von POA-Neuronen beteiligt sind, um Hypothermie und Hypometabolismus auszulösen.

Die biophysikalischen Mechanismen für die Ultraschallaktivierung von POA-Neuronen und dem TRPM2-Ionenkanal müssen noch entdeckt werden. TRPM2 ist ein Ca2+-durchlässiger, nicht selektiver Kationenkanal und empfindlich gegenüber Temperaturänderungen43,44. Wir haben die POA-Temperatur während der Ultraschallbeschallung mithilfe der In-vivo-Magnetresonanztomographie (MRT)-Thermometrie gemessen. Der Temperaturanstieg bei POA betrug 2,58 ± 0,26 °C (Extended Data Abb. 9), was darauf hindeutet, dass der durch Ultraschall induzierte thermische Effekt zur Aktivierung von POA-Neuronen beitrug. Durch die Analyse der Korrelation zwischen neuronaler Aktivierung und POA-Temperaturanstieg haben wir herausgefunden, dass der mittlere Beginn der neuronalen Aktivierung bei 1,17 s lag. Der mittlere Temperaturanstieg zum Zeitpunkt des Einsetzens der neuronalen Aktivierung betrug 0,06 °C (Extended Data Abb. 9). Ein solch geringer Temperaturanstieg legt nahe, dass der durch Ultraschall induzierte mechanische (nicht-thermische) Effekt auch zur Aktivierung der POA-Neuronen beitrug. Ebenso beobachteten wir einen Temperaturanstieg in der Zellkulturkammer während der Ultraschallstimulation von TRPM2+ HEK293-Zellen. Wir fanden heraus, dass der mittlere Temperaturanstieg, der dem Beginn der Ca2+-Aktivität von TRPM2+-Zellen entspricht, 0,34 °C betrug (Extended Data Abb. 10). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die POA-Neuronen und der TRPM2-Ionenkanal wahrscheinlich durch die mechanischen und thermischen Effekte von Ultraschall aktiviert werden.

POA-Neuronen koordinieren die Aktivierung mehrerer nachgelagerter Gehirnbereiche, um Erstarrung zu orchestrieren; Allerdings ist dieser hirnweite komplexe Schaltkreis noch weitgehend unbekannt. Wir fanden heraus, dass die Induktion von UIH mit der Aktivierung von DMH-Neuronen während der Ultraschallstimulation am POA korreliert. Dieser Befund steht im Einklang mit den zuvor berichteten neuronalen Schaltkreisen, dass sowohl die Qrfp- als auch die Adcyap1-Torpor-assoziierten POA-Neuronen auf DMH projizieren, um Hypothermie und Hypometabolismus während genetisch induzierter oder durch Fasten verursachter Torpor zu induzieren 11,12. Unsere Studie legt auch nahe, dass andere nachgelagerte Gehirnregionen, wie etwa das ARC, ebenfalls an der Koordination von UIH beteiligt sein könnten. Es wurde vermutet, dass das ARC, ein Bereich im Hypothalamus, der für die Regulierung der Energiehomöostase von entscheidender Bedeutung ist, die entscheidende stromabwärts gelegene Region ist, die die Projektion von Torpor-induzierenden Esr1+-Neuronen in POA15 empfängt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Ultraschallstimulation durch Modulation der neuronalen Schaltkreise, die an der natürlichen Erstarrung beteiligt sind, eine schläfrige Hypothermie und einen Hypometabolismus auslöst. Diese Studie ergab auch, dass das nachgeschaltete Effektorgewebe, BAT, an der UIH-Regulierung beteiligt war. BAT wurde zuvor im Zusammenhang mit der Thermogenese untersucht39,45, wohingegen seine Rolle bei der Erstarrungsregulierung noch nicht vollständig erforscht war40,46,47. Wir fanden heraus, dass BAT eines der wichtigsten Effektorgewebe ist, das die Änderungen der Körpertemperatur und der Stoffwechselrate während der UIH vermittelt, und dass diese Effekte UCP1-abhängig sind.

UIH hat das Potenzial, das seit langem angestrebte Ziel einer nichtinvasiven und sicheren Herbeiführung des erstarrenden Zustands zu erreichen, das von der wissenschaftlichen Gemeinschaft mindestens seit den 1960er Jahren verfolgt wird. In der Vergangenheit wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren, die den Stoffwechsel systemisch unterdrücken und einen schläfrigen Zustand hervorrufen. Diesen Wirkstoffen wie Schwefelwasserstoff9, Adenosinmonophosphat48, Delta-Opioiden49, N6-Cyclohexyladenosin14,50 und den Cocktails chemischer Verbindungen51 fehlt es an anatomischer und funktioneller Spezifität und sie verursachen systemische Nebenwirkungen außerhalb des Ziels52, die alle ihre Verwendung einschränken. Jüngste Studien schlagen Ansätze vor, um Erstarrung herbeizuführen, indem sie auf das ZNS durch chirurgische Injektion von Arzneimitteln in das Gehirn oder gentechnische Manipulation von mit Erstarrung verbundenen neuronalen Schaltkreisen abzielen. Diese Ansätze sind von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung des zentralnervösen Weges der Erstarrung, aber die Notwendigkeit chirurgischer Eingriffe im Gehirn und der Gentechnik schränkt ihre Übertragung auf den Menschen ein. Im Vergleich zu anderen nicht-pharmakologischen und nicht-genetischen Neuromodulationstechniken (z. B. Tiefenhirnstimulation, transkranielle Magnetstimulation und transkranielle Gleichstromstimulation) verfügt die Ultraschallstimulation über die einzigartige Fähigkeit, tiefe Hirnregionen nichtinvasiv mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision bei Tieren zu erreichen und menschliche Gehirne. UIH nutzt transkranielle Ultraschallstimulation, um Hypothermie und Hypometabolismus zu induzieren, indem es den Hauptregulator der Erstarrung, den POA, nichtinvasiv stimuliert. Es handelt sich um eine nichtinvasive und sichere Technik, die durch gezielte Behandlung des ZNS eine schlaffe Hypothermie und einen Hypometabolismus induziert.

Da sich die Ultraschall-Neuromodulation bereits beim Menschen als machbar erwiesen hat, ist die Übertragung von UIH auf den Menschen sehr vielversprechend. Eine berechtigte Frage ist, ob UIH von Mäusen auf den Menschen übertragen werden kann. Wir haben gezeigt, dass die Ultraschallstimulation bei Ratten, die von Natur aus nicht in Erstarrung geraten, eine Unterkühlung hervorruft, was auf die Möglichkeit schließen lässt, dass ähnliche Effekte auch beim Menschen hervorgerufen werden könnten. Eine präzise Ultraschallregulierung von POA-Neuronen kann beim Menschen zu schlaffer Unterkühlung und Hypometabolismus führen, obwohl noch viel Arbeit erforderlich ist. Die UIH könnte Anwendungen erschließen, die von neuen medizinischen Behandlungen bis hin zur langfristigen bemannten Raumfahrt reichen.

Für die anfängliche Charakterisierung des US-induzierten Effekts der schläfrigen Hypothermie und des Hypometabolismus verwendeten wir erwachsene (6–9 Wochen alte) männliche und weibliche C57BL/6NCrl-Mäuse (Charles River Laboratories), die zufällig Versuchsgruppen zugeordnet wurden. UCP1-Knockout-Mäuse (weiblich, 2–4 Monate alt) wurden vom Labor von J. Brestoff bereitgestellt. In dieser Studie wurden weibliche und männliche Wistar Han IGS-Ratten (Charles River Laboratories, Stammcode 273) im Alter von 4–6 Wochen verwendet. Alle Mäuse und Ratten wurden in einer Tierhaltung an der Washington University School of Medicine gehalten. Die Tiere wurden in einer temperaturkontrollierten (23–26 °C) und feuchtigkeitskontrollierten (35–65 %) Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und mit einer Standard-Chow-Diät versorgt. Alle Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Washington University in St. Louis gemäß den National Institutes of Health (NIH) Guidelines for Animal Research (Tierprotokoll Nr. 21-0187) geprüft und genehmigt.

Wir haben miniaturisierte tragbare US-Wandler entwickelt, um US-Stimulationen bei sich frei bewegenden Mäusen abzugeben. Der Wandler wurde unter Verwendung eines Bleizirkonat-Titanat-Keramikresonators (DL-43, DeL Piezo Specialties) mit einer Mittenfrequenz von 3,2 MHz, einer Apertur von 13 mm und einer geometrischen Fokustiefe von 10 mm hergestellt. Jeder Wandler wurde mit einem Hydrophon (HGL-200, Onda) in entgastem und entionisiertem Wasser mit und ohne Ex-vivo-Mausschädel kalibriert. Die Halbwertsbreite des US-Wandlers betrug 0,8 mm bzw. 3,8 mm in lateraler und axialer Richtung.

Der tragbare US-Wandler wurde im „Plug-in“-Design auf einer Grundplatte am Kopf der Maus befestigt, die vor dem Experiment auf den Schädel der Maus geklebt wurde (Extended Data Abb. 1). Um die Grundplatte zu verkleben, wurde die Maus betäubt und der Kopf mithilfe eines stereotaktischen Rahmens fixiert. Ein Markierungsstift wurde am stereotaktischen Rahmen befestigt und dazu verwendet, einen Punkt auf den Schädel zu zeichnen, um die POA-Region anhand seiner Koordinaten in Bezug auf das Bregma anzuzeigen (AP = 0,2 mm und ML = 0,2 mm relativ zum Bregma). Die Grundplatte wurde mit Hilfe eines Einsatzes auf der Schädeldecke der Maus implantiert. Der Einsatz hatte in der Mitte ein Loch, das mit dem Punkt auf dem Schädel ausgerichtet war, um auf die gewünschte Gehirnregion zu zielen. Nach diesem Zielvorgang wurde der Einsatz entfernt und die Grundplatte mit Klebezement auf den Schädel geklebt. Für das Off-Target-Kontrollexperiment wurde die Grundplatte implantiert, um auf den Kortex (AP = 3,0 mm und ML = 0 mm, relativ zu Bregma) oder den ventralen Hippocampus zu zielen, der sich in der gleichen Tiefe wie POA befindet (AP = −2,7). mm, ML = 2,7 mm und DV = −5,0 mm). Nach der Implantation der Grundplatte durften sich die Tiere mindestens 3 Tage lang von der Operation erholen und an die Grundplatte gewöhnen. Vor jedem US-Stimulationsexperiment wurde der tragbare US-Wandler mit entgastem US-Gel (Aquasonics) gefüllt und dann unter leichter Anästhesie mit Isofluran (1–1,5 % Isofluran) in die Grundplatte am Kopf der Maus eingesteckt. Die Gesamtdauer dieser Vorbereitung betrug höchstens 15 Minuten, um die Wirkung der Anästhesie zu minimieren. Die US-Zieltiefe (DV-Richtung) wurde durch individuelle Anpassung der Höhe des kegelförmigen Gehäuses gesteuert. Die Brennweite des konkav geformten Wandlers betrug ~8 mm. Die Höhe des Wandlergehäuses wurde auf etwa 3 mm ausgelegt, um auf den POA und den ventralen Hippocampus (als Off-Target-Kontrolle) zu zielen, die sich in einer Tiefe von 5 mm befinden. Die Höhe des Wandlergehäuses wurde auf 7 mm ausgelegt, um auf die Kortikalis zu zielen, die sich in einer Tiefe von 1 mm befindet. Die Fokustiefe (relevant für den Schädel) des tragbaren US wurde durch die Hydrophonkalibrierung mit dem Ex-vivo-Mausschädel validiert (Extended Data Abb. 1). Anschließend durften sich die Mäuse vor der ersten Stimulation etwa 90 Minuten lang von der Narkose erholen und sich an die Verhaltenstestplattform gewöhnen. Die Installation der Grundplatte und das Design des tragbaren US-Wandlers waren in den Rattenexperimenten ähnlich, mit Ausnahme der Mittenfrequenz (1,5 MHz in Rattenexperimenten) und der Zielkoordinaten (AP = 0 mm, ML = 0 mm und DV = ~8,5 mm).

Die US-Stimulation wurde unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: Grundfrequenz von 3,2 MHz für Mäuse und 1,5 MHz für Ratten, maximaler negativer Schalldruck (In-situ-Druck unter Berücksichtigung der Schädeldämpfung) von 1,6 MPa für Mäuse und 1,4 MPa für Ratten, Arbeitszyklus von 50 %, Pulswiederholungsfrequenz 10 Hz, Reizdauer 10 s, Intervall zwischen den Reizen 30 s, Reizzahl 6 (Mäuse) bzw. 20 (Ratten). In der Parameterstudie wurden die Reizdauer (2–10 s) und der Schalldruck (0,4, 0,8, 1,2 und 1,6 MPa) variiert, während andere Parameter gleich blieben. Um eine Aktivierung der Hörbahn durch US-Stimulation zu vermeiden, haben wir am Anfang und Ende jeder US-Wellenform eine geglättete Hüllkurve angewendet, indem wir eine zuvor beschriebene Methode53 verwendet haben. Die Wellenform wurde in MATLAB (R2021a, Mathworks) generiert, indem am Anfang und Ende der Wellenform eine Gaußsche Funktionshüllkurve angewendet wurde, um die Erzeugung breitbandiger Frequenzkomponenten zu reduzieren. Die Pulswiederholungsfrequenz betrug 10 Hz, was außerhalb des Hörbereichs der Maus liegt54,55. Die programmierte Wellenform wurde dann in einen Funktionsgenerator (33500B, Agilent) eingegeben, über einen Leistungsverstärker (1020L, ENI) verstärkt und an den US-Wandler übertragen. Es war keine Anpassung der elektrischen Impedanz erforderlich, da der reale Teil der Wandlerimpedanz bei der Resonanzfrequenz, gemessen mit einem Netzwerkanalysator E5061A ENA mit dem 85070E Dielectric Probe Kit (Agilent Technologies), im Bereich von 31 bis 59 Ohm lag ausreichend nahe an den 50 Ohm liegen, die für eine perfekte Impedanzanpassung erforderlich sind.

Die Körperoberflächentemperatur vor, während und nach der US-Stimulation wurde mit einer Wärmebildkamera aufgezeichnet. Mäuse mit angeschlossenem tragbaren US-Wandler wurden in eine Freifeld-Testplattform gesetzt, bei der es sich um eine Box mit den Maßen 20 cm (Höhe) × 10 cm (Breite) × 10 cm (Länge) handelte. Eine Infrarot-Wärmebildkamera (FLIR E54-Kamera, FLIR Systems) wurde 60 cm über der Box positioniert, um die Körpertemperatur der Maus mit der FLIR ResearchIR (v.4)-Software zu erfassen. Um genaue Messungen der Oberflächentemperatur zu gewährleisten, wurde das Fell auf dem Rücken des Tieres vor Beginn des Experiments mit einer Haarschneidemaschine entfernt. Dieses Haarentfernungsverfahren wurde in allen Experimenten durchgeführt, einschließlich der US+- und US–-Kontrollgruppen. Neben der Wärmebildkamera wurde eine Webcam (C920, Logitech) platziert, um das Mausverhalten mithilfe der Software Bonsai (v.2.7) synchron mit der Wärmekamera zu erfassen. Die Umgebungstemperatur wurde bei allen Experimenten konstant bei ~22 °C gehalten. Der TBAT wurde mithilfe der Kombination aus FLIR Tool (v.6.4), Bonsai und MATLAB-Software automatisch mit den folgenden Schritten berechnet: (1) Verfolgung des BAT-Standorts in Bonsai durch Schätzung der Mitte des BAT auf 25 % der Körperlänge vor dem Schwerpunkt des Körpers; und (2) Berechnen der mittleren Temperatur innerhalb des interessierenden Bereichs, der durch einen Kreis mit einem Radius von 3 mm definiert ist, der am identifizierten BAT-Standort zentriert ist, unter Verwendung von MATLAB. Die Schwanztemperatur wurde manuell berechnet, indem ein kreisförmiger Interessenbereich mit 2 mm Durchmesser ausgewählt wurde, der auf dem proximalen 1 cm des Schwanzes zentriert war. Die maximale Änderung der BAT-Temperatur (max. ∆TBAT) wurde berechnet, indem die Differenz zwischen der minimalen BAT-Temperatur, die innerhalb des 7–12-minütigen Intervalls nach Beginn der US ermittelt wurde, und der Basiskörpertemperatur berechnet wurde, die als mittlere Körpertemperatur definiert wurde gemessen 15 Minuten vor der US-Stimulation. Diese Berechnung wurde durchgeführt, nachdem ein Tiefpassfilter auf das Rohsignal angewendet wurde, um durch Hochfrequenzkameras verursachte Schwankungen zu eliminieren und so ein genaueres Ergebnis zu erzielen.

Für die Messungen der Körperkerntemperatur (Tcore), der Sauerstoffverbrauchsrate (VO2) und der RQ-Aufzeichnungen wurde jede Maus in einem Stoffwechselkäfig im temperaturgesteuerten Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS) (Columbus Instruments) gehalten. Der US-Schallkopf wurde mit einem Drehgelenkadapter an der Oberseite des Stoffwechselkäfigs befestigt, um sicherzustellen, dass sich die Maus mit dem tragbaren US-Schallkopf ohne Kabelgewirr frei im Käfig bewegen konnte. Die Mäuse wurden vor jedem Experiment zunächst 1 Tag lang an das CLAMS angepasst. Die Raten des Sauerstoffverbrauchs (VO2) und der Kohlendioxidproduktion (VCO2) wurden mit einem OxyMax-Schnellsensor (Columbus Instruments) alle ca. 3 Minuten gemessen, wobei acht Käfige jeweils 20 Sekunden lang in Reihe gemessen wurden (18 Sekunden Luftentlüftung; 2 Sekunden Messung). und mit der CLAX Statistical Software aufgezeichnet. Mäusen in den Stoffwechselkäfigen wurden außerdem telemetrische Temperatursensoren (TA-XS, Stellar Telemetry, TSE Systems) implantiert, um die Körperkerntemperatur synchron mit den Stoffwechselaufzeichnungen aufzuzeichnen. Mäuse hatten während des gesamten Experiments nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser. Die maximale Änderung der Körperkerntemperatur (max. ∆Tcore) wurde berechnet, indem die Differenz zwischen der minimalen Körpertemperatur, die innerhalb der 30 Minuten nach Beginn der Ultraschalluntersuchung erreicht wurde, und der Basiskörpertemperatur (definiert als die mittlere Körpertemperatur der 5 -min-Fenster, das 1 Minute vor der US-Stimulation auftritt). Die maximale Änderung der Sauerstoffverbrauchsrate (max. ΔVO2) wurde mit der gleichen Methode berechnet. Der maximale ΔRQ wurde berechnet, indem die Differenz zwischen dem niedrigsten RQ, der innerhalb des 45–55-Minuten-Fensters nach Beginn der US beobachtet wurde, und der Grundstoffwechselrate bestimmt wurde, die als der gemittelte RQ definiert wurde, der innerhalb eines 28-Minuten-Fensters gemessen wurde und 2 Minuten zuvor auftrat die US-Stimulation. Eine Maus wurde aus der Tcore-Kurve in Abb. 2c ausgeschlossen, da die Aufzeichnung aufgrund eines Ausfalls des Telemetriesensors unvollständig war. Der Beginn war der Zeitpunkt, an dem entweder Tcore oder VO2 unter dem Schwellenwert lagen, der als Mittelwert des Ausgangswerts – 2 × Standardabweichung des Ausgangswerts – definiert ist. Der Endzeitpunkt des UIH war der Zeitpunkt, als Tcore wieder auf 34 °C zurückkehrte. Die Gesamtdauer der UIH wurde dann als der Zeitraum vom Beginn bis zum Ende der UIH definiert. Bei wachen Mäusen wurde ein EKG mit dem ECGenie-System (Mouse Specifics) aufgezeichnet. Die Herzfrequenz wurde mit der EzCG Signal Analysis Software (v.7.0, Mouse Specifics) analysiert. Um den UIH-Effekt bei verschiedenen Umgebungstemperaturen zu testen, haben wir die Temperatur im CLAMS-System so eingestellt, dass sie entweder auf ~6 °C, ~22 °C oder ~30 °C gehalten wird. Die Mäuse wurden vor dem Experiment zunächst 1 Tag lang bei der voreingestellten Umgebungstemperatur an das CLAMS angepasst. Nach der Anpassung wurde den Mäusen eine US-Stimulation unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls verabreicht, wenn sich die Mäuse in der spezifischen Umgebungstemperatur (6 °C, 22 °C oder 30 °C) befanden.

Der US-induzierte Anstieg der Gehirntemperatur wurde durch MR-Thermometrie in vivo unter Verwendung eines 4,7-T-MR-Scanners (Agilent/Varian DirectDrive Console) unter Verwendung der ähnlichen Methode gemessen, die im vorherigen Artikel beschrieben wurde34. Phasenbilder wurden unter Verwendung einer kontinuierlich angewendeten Gradientenecho-Bildgebungssequenz mit einem Flipwinkel von 20°, TR von 10 ms und TE von 4 ms, einer Schichtdicke von 1,5 mm und einer Matrixgröße von 128 × 128 für ein Feld von 60 × 60 mm aufgenommen der Ansicht. Phasenbilder wurden in Echtzeit mit der ThermoGuide-Software (Version 1.3.4, Image Guided Therapy) verarbeitet, um die Temperaturbilder auf der Grundlage der Protonenresonanzfrequenzverschiebungsmethode zu erstellen. Der Temperaturanstieg im Inneren der US-Transducer-Sonde wurde mit einem faseroptischen Thermometer (Luxtron, jetzt LumaSense Technologies) gemessen. Das faseroptische Thermometer wurde in den US-Wandlerkegel eingeführt und auf dem Kopf der Maus und unter dem piezoelektrischen Material platziert, um den Temperaturanstieg der Wandlersonde zu messen.

Das Feedback-Steuerungssystem wurde unter Verwendung eines Feedback-Controllers (MATLAB und eines Open-Source-Arduino UNO R3-Mikrocontrollers), eines Sensorelements (dem Telemetrie-Kernkörpertemperatursensor) und eines Betätigungsgeräts (US) entwickelt. Das Konzept des Rückkopplungskontrollsystems mit geschlossenem Regelkreis ist in Abb. 3 dargestellt. Das Rückkopplungskontrollsystem empfing kontinuierlich Tcore-Messungen in 1-Minuten-Intervallen. Wenn der erkannte Tcore > Tset (Tset = 34 °C) war, schaltete das System den US ein (höchster negativer Schalldruck von 1,6 MPa; Arbeitszyklus von 50 %; Impulswiederholungsfrequenz von 10 Hz; Stimulusdauer von 10 s; inter- Reizintervall von 20 s; Reizzahl von 6). Wenn Tcore ≤ Tset, waren die USA ausgeschaltet. Da Mäuse den US-Wandler über einen längeren Zeitraum tragen mussten, haben wir einen speziellen Drehgelenk-Kabelstecker entwickelt, der von einem um 360° drehbaren Schleifring (Adafruit) modifiziert wurde, damit sich das US-Wandlerkabel frei drehen kann, wenn sich die Maus bewegt. Die gesamte Aufzeichnungszeit betrug 30 Stunden und die Mäuse erhielten 24 Stunden lang eine Feedback-kontrollierte US-Stimulation. Wasser und Futter waren für die Mäuse frei zugänglich. Um die zusätzliche akustische Dämpfung zu kompensieren, die durch die Blasenbildung im US-Gel nach mehreren Stimulationen entsteht, wurde der akustische Druck um 10 % und die Reizzahl nach 12-stündiger Stimulation auf 8 erhöht. Das Gewicht der Mäuse und des Futters im Käfig wurde vor und nach dem Experiment gemessen.

US-induzierte neuronale Aktivitäten in POA- und DMH-Regionen wurden durch faserphotometrische Aufzeichnung von GCaMP-Signalen untersucht. Einen Monat vor der Aufzeichnung wurden AAV5-Syn-GCaMP6s durch stereotaktische Injektion in die POA- oder DMH-Region injiziert, wobei die Koordinaten gemäß dem Maushirnatlas verwendet wurden: DV = –5,0 mm, AP = 0,2 mm und ML = 0,2 mm für die POA ; DV = −5,2 mm, AP = −1,8 mm und ML = 0,2 mm für den DMH. Für die Aufzeichnung am POA wurde die Grundplatte des US-Wandlers am Schädel der Maus befestigt, wobei ihr mittleres Loch mit dem während der Virusinjektion gebohrten Loch ausgerichtet war. Eine faseroptische Kanüle (MFC_200/245-0.37_6mm_ZF1.25_FLT, Doric Lenses) wurde etwa 200 µm über der Injektionsstelle durch das Loch der Grundplatte implantiert und das Loch wurde während der Virusinjektion gebohrt. Dieses Design ermöglichte die Ausrichtung der US-Fokusregion und der Kanülenspitze innerhalb des POA. Für die Aufnahme am DMH wurde eine Grundplatte mit einem 2 mm außermittigen Loch implantiert und die Kanüle durch dieses Loch in das Gehirn eingeführt. Dieses Plattendesign ermöglichte eine US-Stimulation durch die Mitte der Platte, die auf die POA ausgerichtet war, während die Photometrieaufzeichnung im DMH-Bereich erfolgte. Anschließend wurden Kanüle und Grundplatte mit Klebezement fixiert und stabilisiert. Anschließend durften sich die Mäuse eine Woche lang von der Operation erholen.

Tragbare US-Wandler für die gleichzeitige US-Stimulation und Faserphotometrieaufzeichnung wurden durch Bohren eines Lochs mit 2 mm Durchmesser zum Einführen der optischen Faser gebaut. Das Loch befand sich in der Mitte des Wandlers für die Ausrichtung auf POA und 2 mm außermittig für die Ausrichtung auf DMH. Der Wandler wurde in die Grundplatte eingesteckt. Eine passende Hülse wurde durch das Loch des Wandlers geführt und verband die Edelstahlhülse mit der implantierten Kanüle. Die Faser übertrug anregendes blaues Licht (Wellenlänge 470 nm, Leistung 4 %) und sammelte von GCaMP6s emittierte Photonen. GCaMP6s-Signale wurden mit einem Photometriesystem (FP3002, Neurophotometrics) synchron zur US-Stimulation gesammelt, digitalisiert und gemessen. Zur Erfassung der Photometriedaten und des Synchronisationssignals von einer LED wurde die Open-Source-Software Bonsai (v.2.7) verwendet.

Photometriedaten wurden vor, während und nach der US-Stimulation erfasst. Die erfassten Daten wurden mit einer Methode verarbeitet, die an eine zuvor beschriebene Methode angepasst wurde56. Die Daten wurden zunächst mithilfe eines Hochpassfilters entbleichet und mithilfe der MATLAB-Funktion „zscore“ in einen Az-Score umgewandelt. Peaks wurden mithilfe der MATLAB-Funktion „findpeaks“ identifiziert. Die Spitzenamplitude, der Mittelwert des Z-Scores und die Spitzenfrequenz wurden vor dem US (der 5-s-Zeitraum direkt vor der US-Stimulation), während des US (10 s während der US-Stimulation) und nach dem US (der 15-s-Zeitraum direkt nach Ende der US-Stimulation) berechnet ). Der Beginn der neuronalen Aktivierung wurde als die Zeit vom Einsetzen des US bis zum Beginn einer erfolgreich hervorgerufenen Ca2+-Aktivität bestimmt, die als Z-Score > (Mittelwert + 3 × Standardabweichung) des Wertes vor dem US definiert wurde.

Um die Positionen des US-Wandlers und der optischen Faser zu überprüfen, wurde zusätzlich eine MRT der Mäuse mit einem 9,4-T-Kleintier-MRT-Scanner (BioSpec 94/20 USR; Bruker BioSpin MRI, Ettlingen) durchgeführt. Die Mäuse wurden unter 2 % Isofluran anästhesiert und in eine RF-Volumenspule (Bruker BioSpin MRI) gelegt. T2-gewichtete Fast-Spine-Echo-Bilder wurden mit den folgenden Einstellungen aufgenommen: TR/TE von 2.200/43,53 ms; Scheibendicke von 0,25 mm; Auflösung in der Ebene von 0,125 × 0,125 mm2; Matrixgröße von 256 × 256; Flipwinkel von 180°; Durchschnittswerte von 8.

Ungefähr 1,5 Stunden nach der US-Stimulation wurden Mäuse durch transkardiale Perfusion mit PBS, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA), getötet. Die Gehirne wurden gesammelt und über Nacht in 4 % PFA fixiert und zum Kryoschneiden in 30 % Saccharose (in 1 × PBS) äquilibriert. Die fixierten Gehirne wurden zur immunhistochemischen Färbung und In-situ-Hybridisierungsanalyse in 15-µm-Scheiben geschnitten.

Die immunhistochemische Färbung wurde unter Verwendung der folgenden Primärantikörper durchgeführt: Anti-NeuN (Abcam, Kat.-Nr. 104225, 1:1.000-Verdünnung), Anti-GFAP (Abcam, Kat.-Nr. 207165, 1:1.000-Verdünnung), Anti-Iba1 ( Abcam, Kat.-Nr. 178846, 1:1.000-Verdünnung) und Anti-c-Fos-Antikörper (Cell Signaling Technology, Kat.-Nr. 2250, 1:500-Verdünnung). Die FISH-Färbung mit dem RNA-Scope-Assay wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers für das RNA-Scope-Multiplex-Fluoreszenz-v2-Kit (Advanced Cell Diagnostics (ACD), 323110) durchgeführt. Die verwendeten RNA-Scope-Sonden waren Mm-FOS (ACD, 316921), Mm-Adcyap1-C2 (ACD, 405911-C2) und Mm-Trpm2-C3 (ACD, 316831-C3).

Die gefärbten Hirnschnitte wurden mit dem Mehrkanal-Keyence BZ-X800-Mikroskop mit einem ×20-Objektiv und der BZ-X800-Analysesoftware (Keyence Corp) abgebildet. Um den Prozentsatz positiver Zellen in verschiedenen Gehirnregionen zu quantifizieren, wurden die Gehirnschnitte mit dem Allen Brain Atlas registriert, basierend auf einer halbautomatischen Registrierungsmethode in MATLAB, über die zuvor berichtet wurde57. Die gemittelte Fluoreszenzintensität von Protein- oder RNA-Markern wurde innerhalb der geschätzten Zellfläche berechnet und als positiv eingestuft, wenn sie höher als der Mittelwert + 3 × Standardabweichung des gesamten Gehirnhintergrunds war.

Ungefähr 1 Stunde nach der US-Stimulation wurden Mäuse transkardial mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1 × PBS) perfundiert. Die POA-Region sowohl der US-behandelten Mäuse (US+, n = 4) als auch der Scheinmäuse (US−, n = 4) wurde aus jedem Gehirn extrahiert und in einem Dounce Homogenizer (Kimble) homogenisiert, der 0,4 ml frisch zubereiteten Kernextraktionspuffer enthielt (250 mM Saccharose, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % Triton gefolgt von acht Schlägen mit dem B-Pistill. Das Homogenat von vier Mäusen aus der Kontrollgruppe und vier Mäusen aus der US-Gruppe wurde zur Zellkernisolierung gepoolt. Die Proben wurden durch ein 30-µm-Zellsiebröhrchen (Corning Falcon) filtriert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 500 g zentrifugiert, um Kerne auszufällen. Die dissoziierten Kerne wurden einmal gewaschen und vorsichtig mit Kernspeicherpuffer (PBS mit 1 % BSA und 0,2 U μl-1 rekombinantem Ribonuklease-Inhibitor) resuspendiert. Um Neuronenkerne für die Einzelkern-RNA-Sequenz zu reinigen, wurde die Kernsuspension mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Maus-Anti-NeuN-Antikörper (Millipore Sigma, MAB377X, 1:200-Verdünnung) 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kerne einmal gewaschen und mit Kernspeicherpuffer mit 1 μg ml−1 DAPI resuspendiert. Die Proben wurden durch ein 30-µm-Zellsiebrohr gefiltert und kurz mit FACS (MoFlo, Beckman Coulter) unter Verwendung der FlowJo-Software (v.10.8) mit einer spezifischen Gating-Strategie sortiert (ergänzende Abbildung 1). Die Neuronenkerne wurden nach DAPI+/NeuN+-Kernen sortiert und in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Ungefähr 25.000 Neuronenkerne wurden von jeder Kontroll- und US-Gruppe gesammelt und zur Einzelzell-RNA-Seq (10x Genomics) an GTAC@MGI geschickt. Unter Verwendung eines Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ GEM-, Library- und Gel Bead-Kits v.3.1 (10x Genomics) wurden Neuronenkerne sofort auf einen Chromium Single Cell Processor (10x Genomics) geladen, um RNA-Barcoding aus einzelnen Kernen zu erstellen. Sequenzierungsbibliotheken wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt und die resultierenden cDNA-Proben wurden auf einem Agilent Bioanalyzer unter Verwendung des High Sensitivity DNA Chip laufen gelassen, um die cDNA-Konzentrationen zu bestimmen. Die Proben wurden kombiniert und auf einem Illumina Nova Seq 6000 laufen gelassen.

Die Rohsequenzierungsdaten wurden mithilfe der 10x Genomics CellRanger-Pipeline (v.6.1.1) basierend auf dem Referenzmausgenom (mm10-2020-A) mit Standardparametern verarbeitet. Die Daten wurden auf die Probe mit der niedrigsten Sättigung normalisiert, was zu 83.113 Lesevorgängen (Mittelwert), 3.207 Genen (Median) und 7.353 UMI-Zählungen (Unique Molecular Identifier) ​​(Median) pro Zelle in der Kontrollgruppe (n = 4 Mäuse) führte. Die UIH-Gruppe (n = 4 Mäuse) enthielt 77.898 Reads, 2.998 Gene und 6.498 UMI-Zählungen pro Zelle.

Das Seurat-Paket (v.4.0) in R Studio (R v.4.2) wurde zur Verarbeitung der Einzelkern-RNA-seq-Daten verwendet. Die Daten wurden zunächst mit den folgenden Kriterien gefiltert. Bei den Zellen mit einer Mitochondrienzahl von >5 % wurde davon ausgegangen, dass sie eine starke mitochondriale Kontamination aufwiesen, und sie wurden gefiltert. Zellen mit eindeutigen Merkmalszahlen > 7.500 wurden als Dubletts oder Vielfache betrachtet und gefiltert. Zellen mit einer eindeutigen Merkmalsanzahl <200 wurden ebenfalls gefiltert. Nach dem Filtern wurden alle Seurat-Objekte zusammengeführt. Zur Normalisierung wurde die Methode „LogNormalize“ mit einem Skalierungsfaktor von 10.000 verwendet. Die Funktion „FindVariableFeatures“ wurde verwendet, um die 4.000 wichtigsten variablen Features zu extrahieren. Die Daten wurden mithilfe der ScaleData-Funktion nach dem Mitochondrienprozentsatz skaliert. Die IEGs könnten sich möglicherweise auf die Clusterbildung auswirken. Daher haben wir vor der folgenden Datenverarbeitungspipeline alle 139 IEGs58 aus der Liste der Merkmalsgene entfernt. Als nächstes wurde die Hauptkomponentenanalyse mit der Funktion „RunPCA“ durchgeführt. Mithilfe der 40 wichtigsten Hauptkomponenten wurden die Funktion „FindNeighbors“ und „FindClusters“ verwendet, um die ersten 34 Cluster zu identifizieren. Die Clustering-Ergebnisse wurden mithilfe von UMAP-Diagrammen visualisiert.

Als neuronale Zellen identifizierte Cluster wurden zur weiteren Analyse verwendet, indem das durchschnittliche Expressionsniveau von Kif5c und Camk2a58 überprüft wurde. Insgesamt wurden 21.886 von 22.612 als neuronale Zellen identifiziert. Die Funktion „FindAllMarkers“ wurde verwendet, um signifikante Gene in jedem Cluster zu finden. Die neuronale Population wurde zusätzlich verarbeitet, um neuronale Subtypen zu identifizieren, indem die oben genannten Methoden wiederholt wurden. Durch Clustering wurden 11 erregende und 24 hemmende neuronale Zelltypen identifiziert. Die hierarchische Baumkonstruktion der erregenden Neuronen wurde verwendet, um die Torpor-assoziierten Neuronen auf der Grundlage der zuvor gemeldeten Merkmale zu identifizieren, einschließlich Adcyap1, Qrfp und Esr1 (Ref. 11, 12, 15), basierend auf k-Means-Clustering. Die durchschnittlichen Expressionsniveaus von TRP- und PIEZO-Ionenkanälen, die aus der vorherigen Literatur59,60,61 zusammengefasst wurden, wurden für alle Torpor-assoziierten Cluster untersucht.

Lentivirale Partikel, die Trpm2-shRNA (m) enthielten (Kat.-Nr. sc-42675-V, Santa Cruz Biotechnology), wurden verwendet, um die Expression von TRPM2-Ionenkanälen zu unterdrücken, und lentivirale Partikel, die durcheinandergemischte shRNA (m) enthielten (Kat.-Nr. sc-42675-V, Santa Cruz Biotechnology) 108080, Santa Cruz Biotechnology) wurden als Kontrolle verwendet. Anschließend wurden 1,5 µl shRNA-Lösung (106 infektiöse Viruseinheiten) bilateral in die POA-Region mikroinjiziert (3 µl Gesamtvolumen). Die Injektion wurde dreimal alle 3 Tage durchgeführt, um eine ausreichende Anzahl lentiviraler Partikel in der POA sicherzustellen. Drei Wochen nach der ersten Injektion erhielten die Mäuse wie zuvor beschrieben eine US-Stimulation in der POA-Region. Ein Western Blot wurde durchgeführt, um das Expressionsniveau von TRPM2 in der POA-Region in der Knockdown-Gruppe zu bewerten und mit dem der Kontrollgruppe zu vergleichen, der Scramble-shRNA injiziert wurde.

Um die US-Empfindlichkeit des TRPM2-Ionenkanals zu untersuchen, verwendeten wir unsere zuvor beschriebene In-vitro-Kalziumbildgebungsmethode34. HEK293T-Zellen (CRL-3216, ATCC) wurden in DMEM (4,5 g l-1 Glucose) gezüchtet, ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM l-Glutamin, 100 μg ml-1 Natriumpyruvat, 1 % nicht-essentieller Aminosäuren und 1 % Pen-Strep. Der TRPM2-Ionenkanal wurde in den Zellen unter Verwendung von Lipofectamine 2000 überexprimiert. Einen Tag vor der Transfektion wurden Zellen mit 0,5–1 × 105 in 500 μl Wachstumsmedium ohne Antibiotika in jeder zweiten Vertiefung einer 48-Well-Platte ausgesät. Anschließend wurden zunächst 2 μl Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) mit 0,8 μg Trpm2-DNA-Plasmid (Plasmid 53920, Addgene) in 50 μl Opt-MEM gemischt. Dann wurden 50 μl des Komplexes zu den Zellen gegeben, um eine zweitägige Transfektion vor der Anwendung der US-Stimulation zu ermöglichen. Fluo-4 AM (Thermo Fisher Scientific), ein Ca2+-Indikator, wurde verwendet, um die räumliche Dynamik der Ca2+-Reaktion auf US-Stimulation mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops bei einer Bildrate von 2,4 Bildern s−1 mit dem Q-Capture (Pro 7) abzubilden. Software. Die funktionelle Expression von TRPM2 wurde durch Beobachtung des Ca2+-Signals als Reaktion auf den Agonisten ADPR (100 μM Endkonzentration, Adenosin-5′-diphosphoribose-Natriumsalz, A0752-25MG, Sigma-Aldrich) validiert. 30 s nach Beginn der Aufzeichnung wurde eine US-Stimulation (Frequenz 1,7 MHz, Schalldruck 1,0 MPa, Arbeitszyklus 40 %, PRF 10 Hz, Dauer 60 s) unter Verwendung des maßgeschneiderten US-Stimulationsaufbaus auf die Zellen angewendet wie in unserer vorherigen Studie34 beschrieben. Aufgrund der Unterschiede bei den US-Wandlern haben wir nicht denselben US-Parameter wie beim In-vivo-US-Stimulationsprotokoll verwendet. Der Beginn der Aktivierung von TRPM2+-Zellen wurde als die Zeit vom Beginn der US bis zum Beginn einer erfolgreich hervorgerufenen Ca2+-Aktivität definiert, die als ΔF/F > (Mittelwert + 3 × Standardabweichung) des Signals vor der US-Stimulation definiert wurde . Die Temperatur der Zellkulturkammer wurde mit einem faseroptischen Thermometer überwacht. Die Spitze des faseroptischen Thermometers wurde an einer Stelle etwa 1 mm nahe dem Fokus des Wandlers eingeführt, um Störungen durch die Ausbreitung von US-Wellen zu vermeiden. Für die Blockerstudie wurden 1 Minute vor der US-Stimulation 5 µl Antagonist 2-APB (TOCRIS) zu 500 µl Zellkulturlösung bis zu einer Endkonzentration von 30 µM zugegeben.

Die statistische Analyse wurde in GraphPad (Prism) durchgeführt und die statistischen Analysemethoden sind in jeder Bildunterschrift angegeben. Statistische Unterschiede wurden immer dann als signifikant angesehen, wenn P < 0,05 war.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie präsentierten Daten sind in den Quelldaten verfügbar. Auf die Originaldatensätze, die in der Einzelkern-RNA-Sequenzierungsanalyse verwendet wurden, kann bei NCBI zugegriffen werden, archiviert unter dem Gene Expression Omnibus-Zugangscode GSE228180. Der in dieser Studie verwendete Mäusehirnatlas ist im Allen Brain Atlas verfügbar. Zusätzliche Informationen und Anfragen nach Ressourcen und Reagenzien, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Allen Institute for Brain Science. Allen-Gehirnatlas; http://mouse.brain-map.org/

Referenzen herunterladen

Wir danken JD Quirk für seine Hilfe bei dem technischen Problem des MRT-Scanners. Wir danken L. Li von der University of Washington, C.-K. Mo und X. Liu für ihre wertvollen Vorschläge zur Einzelkern-RNA-seq-Datenanalyse. Wir danken auch A. Norris und A. Cone für ihre Unterstützung bei der Einrichtung der Körpertemperatur-Bildgebung mithilfe einer Wärmekamera. Wir danken M. Rhodes für seine Hilfe bei der Bildgebung der FISH-gefärbten Schnitte. Einige der Cartoons wurden mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde von den NIH R01MH116981 (HC), UG3MH126861 (HC), R01EB027223 (HC) und R01EB030102 (HC) unterstützt. JRB wird von NIH DP5 OD028125 und Burroughs Wellcome Fund CAMS Nr. unterstützt. 1019648.

Abteilung für Biomedizintechnik, Washington University in St. Louis, Saint Louis, MO, USA

Yaoheng Yang, Jinyun Yuan, Dezhuang Ye, Zhongtao Hu, Kevin Xu, Lu Xu, Yan Gong, Yimei Yue, Jianmin Cui und Hong Chen

Abteilung für Pathologie und Immunologie, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO, USA

Rachael L. Field und Jonathan R. Brestoff

Abteilung für Psychiatrie, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO, USA

Alexxai V. Kravitz

Abteilungen für Anästhesiologie und Schmerzmedizin, Pharmakologie und Bioingenieurwesen, Zentrum für Neurobiologie von Sucht, Schmerz und Emotionen, University of Washington, Seattle, WA, USA

Michael R. Bruchas

Abteilung für Radioonkologie, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO, USA

Hong Chen

Abteilung für Neurochirurgie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Hong Chen

Abteilung für Neurotechnologie, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO, USA

Hong Chen

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Die Konzeption lag in der Verantwortung von HC und Y. Yang. Das Design des Experiments lag in der Verantwortung von HC, Y. Yang, JRB und MRB. Die Durchführung des Experiments lag in der Verantwortung von Y. Yang, JY, RLF, DY, ZH, LX, KX, Y. Yue und YG. Die Untersuchung der Ergebnisse lag in der Verantwortung von HC. Y. Yang, JY, AVK, MRB und JRB Die Visualisierung wurde von HC und Y. Yang durchgeführt. Die Beschaffung der Mittel lag in der Verantwortung von HC. Die Projektverwaltung wurde von HC durchgeführt. Die Aufsicht wurde von HC, JRB, MRB und JC durchgeführt. Das Verfassen des ursprünglichen Entwurfs wurde von HC und Y. Yang durchgeführt. Die Überprüfung und Bearbeitung erfolgte durch HC, Y. Yang, JC, JY, RLF, DY, ZH, YG, KX, AVK, MRB und JRB

Korrespondenz mit Hong Chen.

Bei JRB sind Patentanträge anhängig, die nichts mit der aktuellen Studie zu tun haben. Konkret geht es um den Mitochondrientransfer zur Behandlung von Krankheiten, die mit mitochondrialer Dysfunktion einhergehen, einen Therapieansatz für allergische Erkrankungen und eine Methode zur Überwindung von Hook-Effekten in Immunoassays. JRB war in den letzten 12 Monaten als Berater für DeciBio und Flagship Pioneering tätig und ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von LUCA Science. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Metabolism dankt Gerhard Heldmaier, Martin Jastroch, Takeshi Sakurai und Elsa Fouragnan für ihren Beitrag zum Peer Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handling: Christoph Schmitt, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(A) Abbildung des tragbaren Ultraschallwandlers. Der Wandler war an einer Grundplatte befestigt, die auf den Kopf der Maus geklebt wurde. Fotos der Ultraschallsonde (US-Sonde) und der Grundplatte. Ein Foto des Grundplatteneinsatzes ist ebenfalls vorhanden. Der Grundplatteneinsatz mit einem Loch in der Mitte wurde während der Grundplatteninstallation verwendet, um die Positionierung der Grundplatte zu steuern. Der Einsatz wurde nach der Montage der Grundplatte entfernt. (B) Der Versuchsaufbau zur Messung der von der Ultraschallsonde erzeugten akustischen Druckfelder mithilfe eines Hydrophons in einem entgasten Wassertank. Der Ex-vivo-Mausschädel mit der Grundplatte wurde vor der Ultraschallsonde platziert. (C) Die gemessenen akustischen Druckfelder in der axialen Brennebene und der seitlichen Brennebene in Gegenwart des Mausschädels. Die anhand der Halbwertsbreite gemessene Größe des Fokusbereichs betrug 3,8 mm in axialer Richtung und 0,8 mm in lateraler Richtung.

(A) UIH-induzierte Änderung der Körperkerntemperatur (max. ΔTcore) und Änderung der Stoffwechselrate (max. ΔVO2) bei weiblichen (rosa) und männlichen (blau) Mäusen. Im linken Diagramm sind n = 6 männliche Mäuse in den Gruppen US+ und US− und n = 7 weibliche Mäuse in der Gruppe US+ und 8 weibliche Mäuse in der Gruppe US−. Im rechten Diagramm sind n = 5 Mäuse in allen Gruppen. (B) Zeitliche Korrelation von VO2 und Tcore, induziert durch Ultraschallstimulation. Die US-Beschallung wird durch den rosa Balken angezeigt. (C) Vergleich von VO2 und Tcore-Beginnzeit. N = 7 Mäuse. (D) Quantifizierung der Dauer des unterkühlten Zustands. N = 7 Mäuse. (E) Quantifizierung der Wiedererwärmungszeit (vom niedrigsten Tcore bis 34 °C) in Gruppen, die eine einzelne US-Stimulation und eine Feedback-gesteuerte Langzeit-Ultraschallstimulation erhalten. N = 7 Mäuse für die einzelne US-Stimulationsgruppe und 4 Mäuse für die rückkopplungsgesteuerte Ultraschallstimulationsgruppe. Fehlerbalken bezeichnen sem. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus. Die P-Werte wurden unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests in (A und E) und eines gepaarten zweiseitigen t-Tests in C berechnet.

Quelldaten

Änderung der Körperkerntemperatur relativ zum Ausgangswert (ΔTcore) und dem berechneten maximalen ΔTcore für die vier Gruppen, einschließlich der Gruppe ohne Ultraschallstimulation (US−), der Gruppe, die Ultraschallstimulation am POA erhält (POA), der Off-Target-Gruppe Die Kontrollgruppe erhielt Ultraschall am Kortex (Cortex) und die Kontrollgruppe außerhalb des Ziels erhielt Ultraschall am ventralen Hippocampus (Hippocampus). In der rechten Abbildung wurde der maximale ΔTcore als niedrigster Tcore berechnet – mittlerer Tcore vor US. Die US-Beschallung wird durch den rosa Balken angezeigt. Durchgezogene Linien und Schatten geben den Mittelwert ± SEM an. Fehlerbalken geben SEM an. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus. N = 8 Mäuse in der US-Gruppe, 7 Mäuse in der POA-Gruppe, 4 Mäuse in der Cortex-Gruppe und 6 Mäuse in der Hippocampus-Gruppe. Die P-Werte wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA berechnet, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test, bei dem jede Gruppe mit US− verglichen wurde.

Quelldaten

Bewertung der Morphologie und Anzahl von Neuronen, Astrozyten und Mikroglia nach Ultraschallstimulation am POA. Fehlerbalken bezeichnen sem. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus. N = 5 Mäuse. Die P-Werte wurden mithilfe des ungepaarten zweiseitigen t-Tests berechnet.

Quelldaten

(A) Kernkörpertemperatur (Tcore) und (B) Stoffwechselrate (VO2) für Mäuse, die Ultraschallstimulation bei verschiedenen Umgebungstemperaturen (6 °C, 22 °C und 30 °C) erhalten. Die US-Beschallung wird durch die rosa Balken angezeigt. Durchgezogene Linien und Schatten geben den Mittelwert ± SEM an. Fehlerbalken geben SEM an. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus. Max ΔTcore und max VO2 wurden berechnet, indem die Differenz zwischen dem Minimalwert, der innerhalb des 70-Minuten-Zeitraums nach Beginn der Ultraschalluntersuchung erhalten wurde, und dem Basiswert berechnet wurde, der als mittlere Körpertemperatur des 5-Minuten-Fensters definiert wurde, das 1 Minute vor dem Ultraschall auftrat Ultraschallstimulation. N = 4 Mäuse für alle Gruppen. Die P-Werte wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test im Vergleich zur Gruppe mit einer Umgebungstemperatur von 22 °C berechnet.

Quelldaten

Links: Immunfluoreszenzfärbung des c-Fos-Proteins im ultraschallstimulierten Gehirn (US+) und nicht beschallten Gehirn (US−). Rechts: Prozentsatz der c-Fos+-Zellen unter allen Zellen in der Ziel-POA-Region beim Vergleich der US+- und US−-Gruppen. N = 5 Mäuse für die US+-Gruppe und 4 Mäuse für die US−-Gruppe. Fehlerbalken kennzeichnen SEM-P-Werte, die mithilfe ungepaarter zweiseitiger t-Tests berechnet wurden.

Quelldaten

Western-Blot-Bewertung des TRPM2-Expressionsniveaus bei Scheinmäusen, denen eine Injektion des Kontrollvirus (Sham) verabreicht wurde, und Mäusen, denen eine Lentivirus-Sh-RNA-Injektion zur Unterdrückung der TRPM2-Expression (TRPM2-KD) verabreicht wurde. Fehlerbalken bezeichnen SEM N = 4 Mäuse für die TRPM2-KD-Gruppe und 5 Mäuse für die Sham-Gruppe. P-Werte wurden mithilfe ungepaarter zweiseitiger t-Tests berechnet.

Quelldaten

Quantifizierung der Änderungsrate der Körpertemperatur (Spitzen-ΔTcore-Rate) und der VO2-Änderungsrate (Spitzen-ΔVO2-Rate) während des Eintritts (A) und der Erregung von UIH (B) für WT- und UCP1-KO-Gruppen. Fehlerbalken bezeichnen sem. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus (weiblich). N = 6 Mäuse für die WT-Gruppe und 5 Mäuse für die UCP1-KO-Gruppe. P-Werte wurden mithilfe ungepaarter zweiseitiger t-Tests berechnet.

Quelldaten

(A) (Links) Koronales MR-Thermometriebild der ultraschallinduzierten Erwärmung im Gehirn der Maus in vivo. Die durchgezogene weiße Linie umreißt das Gehirn der Maus und die gepunkteten Linien veranschaulichen den Ultraschallstrahl. (Rechts) Temperaturänderungen innerhalb der ultraschallgesteuerten POA-Region (ΔTTarget) als Funktion der Zeit. (B) (Links) Der Zeitpunkt des Einsetzens der neuronalen Aktivierung wurde aus der faserphotometrischen Aufzeichnung der Ca2+-Aktivität am POA während der US-Stimulation berechnet (Abb. 4). (Rechts) Das entsprechende ΔTTarget zum Zeitpunkt des Beginns der neuronalen Aktivierung. Durchgezogene Linien und Schatten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. Jeder Punkt stellt eine 10-sekündige Ultraschallstimulation dar.

Quelldaten

(A) Temperaturänderungen in der Zellkulturkammer (ΔTchamber) als Funktion der Zeit. (B) (Links) Die Aktivierungszeit von TRPM2+-Zellen wurde aus den Fluoreszenz-Ca2+-Bildern von in vitro HEK293-Zellen mit TRPM2-Überexpression berechnet (Abb. 6). (Rechts) Die entsprechende ΔTchamber zum Zeitpunkt des Beginns der TRPM2-Aktivierung. Durchgezogene Linien und Schatten geben den Mittelwert ± Standardabweichung an. Jeder Punkt repräsentiert eine Zelle.

Quelldaten

Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie.

Repräsentatives Infrarot-Wärmebildvideo einer Maus, die am POA eine nichtinvasive Ultraschallstimulation erhält.

Statistische Quelldaten.

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Unverarbeitete Western Blots.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, Y., Yuan, J., Field, RL et al. Herbeiführung eines erstarrenden, hypothermischen und hypometabolischen Zustands bei Nagetieren durch Ultraschall. Nat Metab 5, 789–803 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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Eingegangen: 29. Oktober 2022

Angenommen: 11. April 2023

Veröffentlicht: 25. Mai 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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