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May 28, 2023

Für die Tröpfchenfixierung ist die Methanolfixierung die Methode der Wahl

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 522 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Der wichtigste kritische Schritt bei der Einzelzell-Transkriptomik ist die Probenvorbereitung. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Zellen nach der Dissoziation zu konservieren und die Probenhandhabung von der Bibliotheksvorbereitung zu entkoppeln. Die Eignung dieser Methoden hängt jedoch von den zu verarbeitenden Zelltypen ab. In diesem Projekt führen wir einen systematischen Vergleich von Konservierungsmethoden für tröpfchenbasierte Einzelzell-RNA-Seq auf Nerven- und Gliazellen durch, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen stammen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass DMSO zwar die höchste Zellqualität in Bezug auf die pro Zelle nachgewiesenen RNA-Moleküle und Gene bietet, jedoch die Zellzusammensetzung stark beeinflusst und die Expression von Stress- und Apoptosegenen induziert. Im Gegensatz dazu weisen mit Methanol fixierte Proben eine ähnliche Zellzusammensetzung wie frische Proben auf und bieten eine gute Zellqualität und geringe Expressionsverzerrungen. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass die Methanolfixierung die Methode der Wahl für die Durchführung tröpfchenbasierter Einzelzell-Transkriptomik-Experimente an neuronalen Zellpopulationen ist.

Methoden der Einzelzelltranskriptomik (scRNA-seq) haben die Art und Weise, wie wir die Expression von Genen über Individuen, Gewebe und sogar bei Krankheiten hinweg im Hochdurchsatz untersuchen, revolutioniert1,2,3. Bisher beschränkten sich Studien darauf, Veränderungen im Expressionsniveau von Genen in großen Mengen zu identifizieren, d. h. in der Zellpopulation, aus der eine bestimmte Probe bestand. Somit vermischten diese Ansätze zwei unterschiedliche Effekte: Veränderungen in der Zellzusammensetzung der interessierenden Probe und Veränderungen in der Expression von Genen innerhalb einzelner Zellen. Nun ermöglicht scRNA-seq die unabhängige Bewertung dieser beiden Effekte und kann sowohl Veränderungen in der Zellzusammensetzung4,5 als auch die Expression von Genen in bestimmten Zelltypen6,7 erkennen.

Trotz der Beliebtheit von scRNA-seq-Methoden sind noch einige technische Herausforderungen ungelöst. Beispielsweise ist die Dissoziation der Zellen aus einem Gewebe und die Gewinnung einer guten Zellsuspension, die für die scRNA-Sequenz erforderlich ist, sehr gewebespezifisch und kann den Einsatz verschiedener Strategien erfordern, einschließlich enzymatischer Verdauung, mechanischer Disgregation und fluoreszenzaktivierter Zelle Sortieren und andere Technologien8,9,10,11,12. Daher kann die Vorbereitung der Proben für scRNA-seq mehrere Stunden dauern, was eine spätere Verarbeitung bequemer macht. Abgesehen von technischen Schwierigkeiten ist die Zellkonservierung auch dann wichtig, wenn wir die Probendissoziation und -verarbeitung aus anderen Gründen entkoppeln müssen, beispielsweise für den Versand von Proben an eine externe Einrichtung oder wenn wir mehrere Proben sammeln und zu einem späteren Zeitpunkt gemeinsam verarbeiten möchten um Zeit oder Geld zu sparen. In all diesen Fällen möchten Forscher diese Proben so konservieren, dass die Unterschiede in der Zellzusammensetzung und Genexpression einzelner Zellen im Vergleich zur Originalprobe minimiert werden. Das heißt, die beste Konservierungsmethode ist diejenige, die den geringsten Einfluss auf die Zellzusammensetzung der Probe und das transkriptomische Profil der einzelnen Zellen hat.

Es wurden bereits mehrere Methoden zur Zellkonservierung entwickelt, um dieses Problem zu lösen und die Probenhandhabung von der Bibliotheksvorbereitung zu entkoppeln. Darunter finden wir sowohl hausgemachte als auch kommerzielle Lösungen, einschließlich Methanolfixierung13,14, Dithiobissuccinimidylpropionat15, Dimethylsulfoxid (DMSO)-Kryokonservierung16,17, Essigsäure-Methanol (ACME)10, Paraformaldehyd18, CellCover17 und vivoPHIX19. Diese Methoden zielen darauf ab, die Probenzusammensetzung und die RNA-Qualität der Zellen aufrechtzuerhalten. Da die Probenvorbereitung jedoch gewebespezifisch ist, gehen wir davon aus, dass unterschiedliche Konservierungsmethoden für verschiedene Proben optimal sein könnten. Viele dieser Protokolle wurden nur in Zelllinien oder leicht zu gewinnenden Zellen wie peripheren Blutzellen getestet und daher ist nicht klar, wie ihre Leistung in Zellen ist, die schwer zu dissoziieren sind oder die während der Dissoziation möglicherweise beschädigt werden. Insbesondere wurde keine der bisherigen Methoden an reifen Neuronen oder an Neuronen getestet, die aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) stammen, die die Hauptquelle neuronaler Zellen für die Untersuchung der molekularen Mechanismen sind, die neurologische Erkrankungen auslösen20.

In dieser Arbeit haben wir die Leistung von fünf gängigen Fixierungs- oder Konservierungsmethoden in von hiPSCs abgeleiteten Nerven- und Gliazellen verglichen. Die Ergebnisse unserer Arbeit zeigen, dass die verschiedenen Konservierungs-/Fixierungsmethoden die Proben auf unterschiedliche Weise beeinflussen, einschließlich Verzerrungen im transkriptomischen Profil, der Zellzusammensetzung und der Komplexität der Bibliothek. Die Kryokonservierung mit DMSO bietet die höchste Zellqualität im Hinblick auf die Komplexität der Bibliothek. Allerdings sind die gewonnenen Datensätze stark an Neuronen verarmt und weisen eine stärkere Stresssignatur auf. Im Gegensatz dazu beeinflussen ACME und vivoPHIX die Zellzusammensetzung der Einzelzellsuspensionen nicht wesentlich, schädigen jedoch die RNA, was die Komplexität der Bibliothek und damit die Anzahl der in einzelnen Zellen nachgewiesenen Gene und RNA-Moleküle verringert. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Methanolfixierung die Methode der Wahl für die Durchführung tröpfchenbasierter Einzelzell-Transkriptomik-Experimente an neuronalen Zellpopulationen ist, da sie im Vergleich zu frischen Proben eine hohe Bibliothekskomplexität bietet, ohne die Zellzusammensetzung oder Genexpression zu beeinträchtigen.

Einzelne oder gepoolte hiPSC-Zelllinien wurden unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls21 mit geringfügigen Modifikationen zu kortikalen Neuronen differenziert. Kurz gesagt, hiPSC-Kolonien wurden in mit Matrigel beschichteten 12-Well-Platten ausgesät, und nach Erreichen der Konfluenz wurde die neuronale Differenzierung unter Verwendung einer Kombination von BMP-Inhibitoren (Noggin, Dorsomorphin und SB431542) induziert (Abb. 1a). Nach 29–50 Tagen Differenzierung wurden die Zellen mit Papain-Accutase-Lösung dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten (Ergänzungsdaten 1). Zu diesem Zeitpunkt wurden einige der Proben direkt mit dem automatischen Drop-seq-Setup NADIA (frisch) von Dolomite Bio eingekapselt, mit DMSO17 kryokonserviert oder mit Methanol14,22, ACME10 oder chemischen Komponenten, die RNA-Moleküle stabilisieren, wie vivoPHIX19 und CellCover17, konserviert. die zuvor in der Einzelzell-Transkriptomik verwendet wurden (Abb. 1b).

a Schematische Darstellung des Differenzierungsprotokolls von hiPSCs zu neuralen Vorläuferzellen. b Systematischer Vergleich von Konservierungsmethoden. Nach der Differenzierung der hiPSCs wurden alle Zellen mit Papain-Accutase dissoziiert und entweder direkt eingekapselt oder mit einem der verschiedenen getesteten Reagenzien konserviert. Nach der Konservierung wurden die Zellen aufgetaut oder rehydriert und unter Verwendung eines kommerziellen Drop-seq-Aufbaus unter Verwendung derselben Protokolle eingekapselt.

Vor der Durchführung einer Einzelzell-Transkriptomanalyse untersuchten wir, ob die Konservierung von Einzelzellsuspensionen die Qualität der gewonnenen RNA beeinflusst. Zu diesem Zweck extrahierten wir Gesamt-RNA aus frischen und konservierten neuralen Vorläuferzellen (NPCs), die bis zu 15 Tage bei –80 °C oder 4 °C gelagert wurden. Für jede Probe haben wir die Gesamtmenge an RNA quantifiziert und ihre Qualität mit dem Agilent TapeStation-System bewertet. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Qualität der extrahierten RNA von der verwendeten Konservierungsmethode abhängt. DMSO-, Methanol- und ACME-Proben wiesen sehr hohe RIN-Werte (RNA Integrity Number) (~9) auf, ähnlich denen frischer Proben. Im Gegensatz dazu wies die vivoPHIX-Probe einen gewissen RNA-Abbau auf (RIN ~7) und die mit CellCover verarbeiteten Proben wiesen stärkere Abbaugrade auf, mit RIN-Werten ~2 bei 4 °C und ~6 bei –80 °C (ergänzende Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass CellCover nicht für die Langzeitlagerung von Zellen für die Einzelzell-Transkriptomik geeignet ist. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache haben wir beschlossen, CellCover für den systematischen Vergleich von Konservierungsmethoden zu verwerfen.

Um die Auswirkungen verschiedener Konservierungsmethoden zu vergleichen, wurden hiPSCs zu NPCs differenziert und entweder mit einer der verschiedenen Konservierungs-/Fixierungsmethoden konserviert oder direkt mit der NADIA-Ausrüstung, einem kommerziellen Drop-seq-Setup, eingekapselt (Abb. 1b). Die Zellverkapselung und die Bibliotheksvorbereitung erfolgten für alle Proben nach dem gleichen Protokoll. Die gewonnenen Datensätze wurden anschließend anhand verschiedener Metriken ausgewertet, um ihre Qualität zu beurteilen.

Die Untersuchung der cDNA-Profile ergab, dass ACME- und vivoPHIX-Proben weniger cDNA und kleinere Fragmente aufwiesen als die übrigen Bibliotheken (Abb. 2a), was mit dem RNA-Abbau übereinstimmt. Dies wurde bei den vivoPHIX-Proben erwartet, die bereits nach zweiwöchiger Aufbewahrung eine geringere RNA-Qualität aufwiesen, nicht jedoch bei ACME-Proben, deren RIN-Werte denen frischer Proben ähnelten (ergänzende Abbildung 1). Als nächstes bewerteten wir die Auswirkungen der Aufbewahrungsmethoden auf die Komplexität der Bibliothek. Wir haben samtools23 verwendet, um jede der nicht ausgerichteten BAM-Dateien herunterzurechnen, um Dateien zu erstellen, die 10 %, 20 %, 30 % usw. des Originaldatensatzes enthalten. Jede dieser Teilproben wurde dann mit derselben Rechenpipeline verarbeitet, um heruntergesampelte digitale Genexpressionsmatrizen (DGE) zu generieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass kryokonservierte DMSO-Zellen und methanolfixierte Zellen bei gleicher Sequenzierungstiefe eine vergleichbare oder höhere Anzahl an Genen und eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) pro Zelle liefern als frische Zellen. Im Vergleich dazu enthalten ACME- und vivoPHIX-Proben bei 7500 Lesevorgängen pro Zelle etwa 40 % der Gene und UMIs, die in frischen Zellen erhalten wurden (Abb. 2b) (Ergänzende Daten 2). Die höhere Anzahl an Genen und UMIs in den DMSO-Proben D1 und D2 und den Methanol-fixierten Proben M3 und M4 ist auf Unterschiede in der Einfangeffizienz der für die Einkapselung verwendeten Perlen zurückzuführen und nicht auf eine intrinsisch höhere Einfangeffizienz unter diesen Versuchsbedingungen (Ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Daten 1).

eine Spur der nach der Einkapselung erhaltenen Bibliotheken, einschließlich frischem (F1 und F2), Methanol (M1, M2, M3 und M4), DMSO (D1, D2 und D3), ACME (A1 und A2) und vivoPHIX (V1). und V2) Proben. Die Bibliotheken der mit vivoPHIX und ACME fixierten Proben weisen kleinere Fragmentgrößen und weniger RNA auf, was mit dem RNA-Abbau vereinbar ist. b Downsampling-Diagramme, die die Anzahl der Gene und UMIs als Funktion der Sequenzierungstiefe (mittlere Lesevorgänge pro Zelle) zeigen. In beiden Fällen weisen DMSO- (blau) und Methanol-Bibliotheken (grün) eine Tiefe auf, die der von frischen Proben (rot) entspricht oder höher ist. c Violindiagramme, die die Anzahl der Gene, UMIs, den Prozentsatz des Mitochondriengehalts (% MT) und den Ribosomengehalt (% Ribo) der Zellen für jede Probe nach Verwerfen von Zellen und Dubletts geringer Qualität zeigen. Die in den Geigendiagrammen enthaltenen Boxplots fassen die Datenverteilung zusammen. Die Ober- und Unterseite der Box stellen das 1. und 3. Quartil dar. Die mittlere Linie entspricht dem Median. Die Linien reichen nicht weiter als 1,5 des Interquartilbereichs. d Balkendiagramme, die den Prozentsatz der den Zellen zugewiesenen intronischen und exonischen UMIs für jede der Bibliotheken zeigen. Die Anzahl der intronischen Lesevorgänge reicht von ~10 % in DMSO-Probe D1 bis ~30 % in Methanolprobe M4. Hohe intronische UMI-Fraktionen weisen auf einen zellulären RNA-Austritt oder eine nukleare RNA-Anreicherung hin.

Die geringere Komplexität der vivoPHIX- und ACME-Bibliotheken spiegelt sich auch im Anteil minderwertiger Zellen in den Proben wider, bei denen pro Zelle nur wenige UMIs und Gene nachgewiesen wurden (Abb. 2c und Tabelle 1) und die möglicherweise leeren Tröpfchen oder enthaltenden Tröpfchen entsprechen kaputte Zellen24. Während die Anzahl der verworfenen Zellen minderer Qualität etwa 10 % der Zellen in frischen, DMSO- und Methanol-fixierten Zellen beträgt, steigt diese Zahl in ACME- und vivoPHIX-Proben auf bis zu 29 % bzw. 49 % (Tabelle 1 und ergänzende Daten 3). ).

Nach dem Verwerfen von Zellen geringer Qualität weisen die verbleibenden vivoPHIX- und ACME-Zellen immer noch deutliche Qualitätsunterschiede auf (Abb. 2c und Tabelle 1). Interessanterweise war der Prozentsatz der auf mitochondriale Gene abgebildeten UMIs in allen Proben ähnlich niedrig, was darauf hindeutet, dass die geringere Anzahl eingefangener RNAs in diesen Proben möglicherweise nicht auf RNA-Leckage oder Zellschäden zurückzuführen ist24, sondern eher mit der RNA-Einfangeffizienz oder dem RNA-Abbau zusammenhängt. Darüber hinaus zeigten ACME-Proben einen viel höheren Anteil an UMIs, die auf ribosomale Proteine ​​abgebildet waren, als alle anderen Proben (Abb. 2c), was zuvor auch mit minderwertigen Zellen oder technischen Artefakten in Verbindung gebracht wurde25.

Einer der Gründe, warum vivoPHIX- und ACME-fixierte Zellen weniger RNAs pro Zelle aufweisen, könnte darin liegen, dass die Fixierungsmethode den Zellbruch erleichtert. In diesem Fall würden wir eine geringere Bibliothekskomplexität und einen höheren Anteil an Lesevorgängen erwarten, die aus intronischen Regionen stammen, die hauptsächlich aus Prä-mRNAs stammen und an Kernen angereichert sind26,27. In unseren Proben war der Anteil der intronischen Messwerte aus jeder Probe je nach Konservierungsmethode unterschiedlich und reichte von 10 % in DMSO-Proben bis zu ~30 % in Methanol- und vivoPHIX-Proben (Abb. 2d). Der höhere Anteil intronischer Lesevorgänge in vivoPHIX- und Methanolproben weist auf eine nukleare RNA-Anreicherung26,27 hin. Wenn man jedoch bedenkt, dass die Anzahl der in Methanol nachgewiesenen Gene und UMIs im Durchschnitt etwa dreimal höher ist als in vivoPHIX-Proben (Supplementary Data 2), ist ein RNA-Leckage wahrscheinlich nicht die Ursache für diese Verzerrung. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Konservierungsmethoden vivoPHIX und ACME die Qualität der aus menschlichen NPC-Populationen gewonnenen Einzelzelltranskriptome erheblich beeinflussen, obwohl dies nicht durch einen erhöhten RNA-Austritt oder Zellbruch erklärt werden kann.

Nachdem wir die Gesamtqualitätsmetriken der Proben bewertet hatten, untersuchten wir, ob Konservierungsmethoden die Zellzusammensetzung der Proben beeinflussen. Zu diesem Zweck haben wir alle Proben gepoolt und gemeinsam analysiert. Erste Analysen zeigten einen starken Chargeneffekt, der hauptsächlich auf die verwendete Konservierungsmethode zurückzuführen war. Wie in der ergänzenden Abbildung 3 zu sehen ist, belegen die Zellen aus verschiedenen Experimenten vor der Integration unterschiedliche Bereiche des UMAP-Diagramms (Uniform Manifold Approximation and Projection) (ergänzende Abbildung 3). Daher verwendeten wir Harmony28, um die Datensätze zu integrieren und die aus der hiPSC-Differenzierung erhaltenen Zellpopulationen zu identifizieren (Abb. 3). Nach der Chargenkorrektur identifizierten wir 12 Zellpopulationen, die proliferierenden Vorläufern, NPCs, astroglialen Vorläufern, Zwischenvorläufern und verschiedenen Arten von Neuronen entsprechen, die durch die Expression spezifischer Markergene gekennzeichnet sind (Abb. 3, ergänzende Abbildungen 4 und 5 sowie ergänzende Daten 4). und 5). Alle identifizierten Cluster waren in allen Einzelproben vorhanden. Die relative Häufigkeit der einzelnen Zellpopulationen änderte sich jedoch je nach verwendeter Konservierungsmethode (Abb. 4a und ergänzende Abb. 6). Um zu untersuchen, ob diese Änderungen auf experimentelle Verzerrungen zurückzuführen waren oder ob es sich um systematische Verzerrungen aufgrund der Fixierungsmethode handelte, führten wir eine Analyse der Zusammensetzung der Proben mit scCODA durch, einem kürzlich entwickelten Tool, das Änderungen in Einzelzelldatensätzen selbst bei einem niedrigen Wert zuverlässig identifizieren kann Anzahl der Wiederholungen5. Im Gegensatz zu anderen Methoden modelliert scCODA die Zusammensetzungsverzerrung der Stichprobe als Ganzes und nicht für jeden Cluster einzeln. Dadurch wird verhindert, dass Änderungen des Zellanteils aufgrund der Verarmung einer einzelnen Zellpopulation fälschlicherweise erkannt werden, was zu einer künstlichen Zunahme aller anderen Zellpopulationen in der Probe führen würde. Um Veränderungen in der Zusammensetzung zu identifizieren, haben wir frische Proben als Referenzgruppe ausgewählt, sodass die Ergebnisse anzeigen, ob wir im Vergleich zu dieser Gruppe Veränderungen in der Zusammensetzung feststellen. Die Ergebnisse dieser Analyse verdeutlichen eine signifikante Erschöpfung erregender Neuronen in kryokonservierten DMSO-Proben im Vergleich zu frischen Proben, während wir in den mit einer der anderen Methoden konservierten Proben keine signifikanten Zusammensetzungsverzerrungen feststellen (Abb. 4b).

ein UMAP-Diagramm, das die in den NPC-Proben identifizierten Zellpopulationen zeigt, zu denen verschiedene Arten von NPC-Populationen, astrogliale Vorläufer, intermediäre Vorläufer sowie erregende und hemmende unreife Neuronen gehören. b Merkmalsdiagramme bekannter Markergene, die zur Identifizierung der Zellpopulationen in (a) verwendet wurden, einschließlich NPC-Markern (SOX2), Proliferationsmarkern (TOP2A und PCNA), kortikalen Schicksalsmarkern (FOXG1), dorsalen Schicksalsmarkern (PAX3) und Dach Plattenmarker (PTN), Astroglia-Marker (ADGRV1 und GJA1), unreife neuronale Marker (DCX), intermediäre Vorläufermarker (HES6), inhibitorische (GAD2) und erregende (SLC17A6) neuronale Marker.

a UMAP-Diagramme, die die Verteilung der Zellen über Cluster für jede der Fixierungsmethoden zeigen. Die Cluster sind wie in Abb. 3a gefärbt. DMSO-konservierte Proben zeigen im Vergleich zu allen anderen Proben eine starke Zellverarmung in neuronalen Clustern. b Balkendiagramm, das den durchschnittlichen Anteil der Zellen zeigt, die jedem Cluster für jede Methode zugewiesen sind. Die Höhe der Balken stellt den Durchschnitt aller mit derselben Methode konservierten Proben dar. Schwarze Punkte stellen den Zellanteil in einzelnen Proben dar. * Zeigt Proben mit einem signifikanten Unterschied im Zellanteil in einer bestimmten Probe im Vergleich zu frischen Proben an, wie von scCODA vorhergesagt. Dies bedeutet, dass der durchschnittliche Wert der Probe gemäß dem scCODA-Modell unter Null liegt, wenn man eine Falscherkennungsrate von <0,05 berücksichtigt.

Schließlich untersuchten wir, ob Konservierungsmethoden Veränderungen in der Genexpression hervorriefen, die den Vergleich zwischen Proben beeinflussen könnten. Ein Vergleich der Genexpression zwischen den Proben zeigt eine hohe Korrelation zwischen allen Proben (Pearson-Korrelationskoeffizient R > = 0,8), obwohl ACME- und vivoPHIX-Proben etwas geringere Korrelationen mit allen anderen Proben aufweisen (ergänzende Abbildung 7). Diese geringere Korrelation kann durch globale oder zelltypspezifische Veränderungen der Genexpression, aber auch durch kompositorische Verzerrungen erklärt werden. Um dies weiter zu untersuchen, haben wir für jeden Cluster und jede Probe separat Pseudobulk-Zählungen erstellt und eine Korrelationsanalyse auf Clusterebene durchgeführt. Unsere Analysen zeigen, dass die Fixierungsmethode zu Verzerrungen bei der Clusterbildung von Zellpopulationen über mehrere Proben hinweg führt (ergänzende Abbildung 8). Allerdings führt die hohe Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Clustern, d. h. NPC-Populationen, dazu, dass Zellcluster, die mit einer bestimmten Methode konserviert wurden, zusammenclustern. Um dieses Problem zu beheben, haben wir die Clusterung von Proben für jeden Zellcluster unabhängig voneinander mithilfe von sigclust229 ausgewertet, einer statistischen Methode zum Testen der statistischen Signifikanz der hierarchischen Clusterung. Wie in Abb. 5 zu sehen ist, häuften sich in allen Fällen Methanolproben mit frischen Proben. Im Gegensatz dazu häufen sich in 8 der 12 identifizierten Zellpopulationen mehrere vivoPHIX- und ACME-Proben getrennt von frischen Proben. Diese Analyse bestätigt somit, dass das Gesamtexpressionsprofil der Methanol-fixierten Zellen in jedem Cluster dem von frischen Zellen ähnlicher ist als dem von Zellen, die mit anderen Methoden konserviert wurden.

Dendrogramm, das die Ähnlichkeit der Genexpressionsprofile der Zellen aus verschiedenen Proben zeigt, die zum selben Zellcluster gehören. Die Proben sind wie folgt gekennzeichnet: frisch (F1 und F2, rote Farbe), Methanol (M1, M2, M3 und M4, grüne Farbe), DMSO (D1, D2 und D3, blaue Farbe), ACME (A1 und A2). , violette Farbe) und vivoPHIX (V1 und V2, magentafarbene Farbe). Die Signifikanz im hierarchischen Clustering wird mit dem in sigclust2 implementierten shc-Test bewertet. Signifikante Zweige im Dendrogramm werden rosa hervorgehoben. *, ** und *** markieren die Zweige mit einem P-Wert kleiner als 0,05, 0,01 bzw. 0,001. Nicht signifikante Zweige werden in Gelb und nicht getestete Zweige in Blau und Grün hervorgehoben.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Dissoziations- und Konservierungsmethoden zellulären Stress auslösen können, der sich auf der transkriptomischen Ebene widerspiegelt9,30. Dementsprechend haben wir die Expression von Immediate Early-Genen (IEGs) und Apoptosemarkern in unseren Datensätzen überprüft. Die Apoptose-Gensignatur war in ACME-, vivoPHIX- und DMSO-Proben im Vergleich zu frischen Proben höher und in DMSO höher als in Methanol-fixierten Proben, obwohl diese Unterschiede minimal waren (Abb. 6a). Alle fixierten Proben zeigten eine höhere IEG-Expression als frische Proben, obwohl kryokonservierte DMSO-Zellen eine höhere IEG-Expression aufwiesen als alle anderen Proben (Abb. 6b). Dieses Ergebnis zeigt, dass das Einfrieren und Auftauen die Zellen in einer Weise belastet, die sich insgesamt auf das transkriptomische Profil der Zellen auswirkt. Um zu untersuchen, ob die Zellkonservierung zusätzliche Expressionsverzerrungen auf der Ebene einzelner Cluster hervorruft, haben wir Muscat31 verwendet, um zelltypspezifische differentiell exprimierte Gene (DEGs) in festen Proben im Vergleich zu frischen Proben zu identifizieren (Supplementary Data 6). Unsere Analyse zeigt, dass die Anzahl der differentiell exprimierten Gene (DEGs) je nach Fixierungsmethode sehr unterschiedlich ist. Während vivoPHIX-Proben in allen Clustern viele DEGs aufweisen, liegt die Menge an signifikanten DEGs in DMSO-Proben nahe bei Null (Abb. 6c und ergänzende Daten 6). Mithilfe der Analyse der Anreicherung von Genontologie-Termen untersuchten wir, ob unterschiedliche Fixierungsmethoden zu Verzerrungen in der Genexpression in Bezug auf bestimmte Funktionen führen würden. Unsere Ergebnisse fanden keine signifikanten Begriffe, die in Genen überrepräsentiert waren, die über mehrere Zellcluster hinweg konsistent hoch- oder runterreguliert wurden, was darauf hindeutet, dass der Effekt, den die Fixierungsmethoden auf die Genexpression über Cluster hinweg haben, nicht mit bestimmten Zellfunktionen oder -orten zusammenhängt.

a, b Violindiagramme, die die Verteilung der Anreicherungswerte der Apoptose- (a) und Stress-Signaturen (b) über die Probenvorbereitungsmethoden hinweg zeigen. Die in den Geigendiagrammen enthaltenen Boxplots fassen die Datenverteilung zusammen. Ober- und Unterseite der Box stellen das 1. und 3. Quartil dar. Die mittlere Linie entspricht dem Median. Die Linien reichen nicht weiter als 1,5 des Interquartilbereichs. a Der Apoptose-Anreicherungs-Score ist bei DMSO-, ACME- und vivoPHIX-Proben höher als bei frischen Proben (schwarze Sternchen) und bei DMSO höher im Vergleich zu Methanol (blaue Sternchen). b Die Spannungssignatur ist bei allen Fixierungs-/Konservierungsmethoden höher als bei frischen Proben (schwarze Sternchen) und bei DMSO auch höher im Vergleich zu allen anderen Fixierungsmethoden (blaue Sternchen). In allen Fällen wurde die statistische Signifikanz mithilfe eines einseitigen Wilcoxon-Rangsummentests getestet. Vergleiche mit frischen Produkten sind mit schwarzem * markiert und Vergleiche von DMSO mit anderen Fixierungsmethoden sind blau. ** zeigt einen P-Wert <0,01 an; *** zeigt einen P-Wert <0,001 an. c Balkendiagramm, das die Anzahl der signifikant hoch- und herunterregulierten Gene für jede Fixierungsmethode in jedem Zellcluster mit einem log2fc > = |0,58| zeigt und ein angepasster Wald-Test-P-Wert <0,05. vivoPHIX- und Methanolproben weisen über Cluster hinweg mehr DEGs auf, während die Anzahl der DEGs in DMSO nahe Null liegt.

Methoden der Einzelzell-Transkriptomik werden zum neuen Standard für die Untersuchung transkriptomischer Veränderungen über Proben und Bedingungen hinweg. Diese Technologien sind im Vergleich zu Bulk-Transkriptomik-Methoden wie RNA-seq oder 3'-seq relativ neu. Daher gibt es in vielen Fällen noch keine einheitlichen Vorbereitungsprotokolle für die verschiedenen verwendeten Proben. In diesem Projekt haben wir verglichen, wie häufig verwendete Konservierungs- und Fixierungsmethoden die Zellzusammensetzung und Expression von neuralen und glialen Zellpopulationen beeinflussen, die von hiPSCs abgeleitet sind. Diese Arbeit erweitert somit frühere Studien, die die Auswirkungen nur einer Konservierungsmethode auf die Qualität von Einzelzell-Transkriptomen verglichen haben oder sich auf deren Auswirkungen auf verschiedene Zelltypen konzentriert haben und daher möglicherweise nicht auf neuronale Zellen anwendbar sind13,14,15,16 ,17,18,19. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Konservierungs-/Fixierungsmethoden die Qualität der Einzelzell-Transkriptomik-Datensätze auf unterschiedliche Weise beeinflussen, einschließlich einer verringerten Bibliothekskomplexität, Änderungen in der Zellzusammensetzung und Änderungen im Expressionsprofil einzelner Zellen (Tabelle 2).

In Bezug auf die Komplexität der Bibliothek zeigen ACME- und vivoPHIX-Proben einen starken Rückgang der Menge an cDNA, die nach der Einzelzellverkapselung erhalten wird (Abb. 2a), was sich auch in einem geringeren Nachweis von Genen und UMIs widerspiegelt (Abb. 2b). Im Fall der vivoPHIX-Proben könnte dies mit einer anfänglich geringeren Qualität der RNA-Probe zusammenhängen, die niedrigere RIN-Werte aufwies (ergänzende Abbildung 1). Im Fall von ACME-Proben, deren RNA-Qualität der frischer Proben entsprach, steht dieser Rückgang im Einklang mit früheren Berichten, die zeigen, dass die RNA-Integrität in ACME-fixierten Proben mit der Zeit abnimmt10. Die geringere Bibliothekskomplexität dieser Proben aufgrund einer höheren Abbruchrate ist wahrscheinlich die Ursache für die Verzerrungen in der Zellpopulationsclusteranalyse (Abb. 5) und könnte zur Anzahl der in jedem Cluster identifizierten DEGs beitragen (Abb. 6c und Ergänzung). Daten 6).

Bei der Betrachtung der Zellzusammensetzung zeigen unsere Ergebnisse deutlich eine starke Erschöpfung neuronaler Zellen in den kryokonservierten DMSO-Proben (Abb. 4). Für dieses Projekt wurden verschiedene Zelllinien und Experimente verwendet, was einen verwirrenden Effekt auf die Zelltypzusammensetzung haben könnte. Der Vergleich von DMSO- und Methanolproben, die aus genau derselben Differenzierung (M3, M4, D1 und D2) stammen (Ergänzungsdaten 1), zeigt jedoch einen deutlichen Unterschied in der relativen Häufigkeit erregender Neuronenpopulationen zwischen Methanol- und DMSO-Proben Zusätzlicher Beweis dafür, dass die kompositorischen Verzerrungen auf das Fixierungs-/Konservierungsverfahren zurückzuführen sind (ergänzende Abbildung 6). Während DMSO zuvor als hervorragende Methode zur Zellkonservierung für die Einzelzell-Transkriptomik beschrieben wurde16,17, untersuchte keine dieser Studien die Wirkung von DMSO auf reife neuronale Zellen. Die Verringerung der Anzahl wiederhergestellter Neuronen könnte auf DMSO-Toxizität32,33 oder DMSO-induzierte reaktive Gliose zurückzuführen sein, über die bereits berichtet wurde und die Zellen nach einer sehr kurzen Exposition beeinträchtigen kann32, oder einfach auf die höhere Fragilität von Neuronen zurückzuführen sein, bei denen dies nicht der Fall ist Überstehen Sie Auftau-/Gefrierzyklen. Letzteres könnte die höhere Expression von Stressgenen in DMSO-Proben im Vergleich zu frischen und allen anderen fixierten Proben erklären. Die erhaltenen Neuronen weisen jedoch keine starken Expressionsverzerrungen auf, da sie häufig mit frischen und methanolfixierten Proben zusammentreffen und kaum signifikante DEGs aufweisen (Abb. 6 und ergänzende Daten 6). Während unsere Ergebnisse zeigen, dass DMSO keine gute Wahl für die Durchführung einer Zusammensetzungsanalyse von hiPSC-abgeleiteten Zellen ist, könnte es zur Profilierung reiner neuronaler Proben verwendet werden, wenn die Zellverfügbarkeit kein Problem darstellt.

Unsere Analysen zeigen auch, dass die verschiedenen Fixierungs-/Konservierungsmethoden die Genexpression auf unterschiedliche Weise verändern. Durch Fixierung verursachte Expressionsverzerrungen können sich auf das gesamte Expressionsprofil von Zellclustern auswirken, wie dies bei vivoPHIX- und ACME-Proben der Fall ist (Abb. 5 und ergänzende Abb. 7 und 8), oder zelltypspezifische Veränderungen in der Genexpression hervorrufen (Abb . 6c und ergänzende Daten 6). Darüber hinaus haben wir in allen Proben eine höhere Expression von IEGs im Vergleich zu frischen und eine höhere Expression von Apoptosemarkern in vivo PHIX-, ACME- und DMSO-Zellen im Vergleich zu frischen Proben festgestellt (Abb. 6a, b). Diese Ergebnisse bestätigen frühere Beobachtungen, die eine höhere IEG-Expression mit Dissoziations- und Kryokonservierungsverzerrungen in Verbindung brachten9,30 und unterstreichen die Notwendigkeit genauer Kontrollen und Validierungsexperimente, um die in Einzelzelldaten beobachteten Genexpressionsänderungen zu bestätigen.

Schließlich muss berücksichtigt werden, dass Fixierungsmethoden die Erkennung unterschiedlich exprimierter Gene beeinflussen könnten, da sie die Komplexität der Bibliothek sowie die Anzahl der Gene und UMI beeinflussen. Da die Fähigkeit, differenziell exprimierte Gene zu erkennen, in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der einem Gen zugewiesenen Reads oder UMIs steht, ist es möglich, dass subtile differenzielle Expressionsänderungen aufgrund biologischer oder experimenteller Bedingungen übersehen werden. Wir gehen davon aus, dass diese Effekte in ACME- und vivoPHIX-Proben stärker ausfallen, da dort weniger Gene und UMIs pro Zelle nachgewiesen werden (Abb. 2c). Dies kann jedoch ausgeglichen werden, wenn mehr Zellen sequenziert werden. Methanolfixierte Zellen wurden bereits erfolgreich eingesetzt, um Veränderungen in der Genexpression in Einzelzelldaten unter verschiedenen biologischen Bedingungen zu entdecken34,35, was darauf hindeutet, dass diese Fixierungsmethode nicht nur zur Identifizierung der homöostatischen Genexpression, sondern auch zur Identifizierung subtilerer biologischer Unterschiede geeignet ist.

Unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile der verschiedenen Methoden (Tabelle 2) und der Einschränkungen dieser Studie zeigt unsere vergleichende Analyse, dass die Methanolfixierung die beste Konservierungsmethode für die Durchführung von Einzelzell-Transkriptomanalysen an Nervenzellen ist. Bibliotheken aus Methanol-fixierten Zellen haben eine ähnliche Komplexität wie frische Zellen (Abb. 2) und weisen keine starken Verzerrungen in der Genexpression auf, die sich auf das gesamte transkriptomische Profil der Zellen auswirken (Abb. 5 und 6 sowie ergänzende Daten 4 und 5). Zellzusammensetzung (Abb. 4 und ergänzende Abb. 6), wodurch die Probe das Profil erhält, das dem von frischen Zellen am ähnlichsten ist.

In dieser Arbeit haben wir die Auswirkungen von Fixierungs- und Konservierungsmethoden in von hiPSC abgeleiteten Neuronen- und Gliazellen anhand einiger Replikate (2–4) pro Bedingung getestet. Diese Anzahl an Replikaten ist angesichts der Kosten einzelner Einzelzellexperimente und aktueller experimenteller Standards akzeptabel. Dennoch schränkt es unsere Fähigkeit ein, den Einfluss aller möglichen Variablen auf die Qualität der Stichprobe vollständig zu beurteilen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die Konservierungsmethode die Probenzusammensetzung und Genexpression beeinflusst. Andere Parameter wie die Aufbewahrungstage, die verwendete Zelllinie, das Differenzierungsexperiment und die Perlencharge haben Einfluss auf die endgültigen Einzelzelltranskriptome. Diese Arbeit bietet jedoch keinen ausführlichen Vergleich aller dieser Aspekte, was den Rahmen dieses Projekts sprengen würde. Daher können die in dieser Arbeit bereitgestellten Ergebnisse unterschiedlich sein, wenn mit unterschiedlichen Zelltypen, Proben und Einzelzelltechnologien gearbeitet wird oder andere experimentelle Bedingungen als die hier verwendeten verwendet werden. Forscher sollten all diese Faktoren berücksichtigen und einzelne Experimente optimieren, da unsere Ergebnisse zeigen, dass die Probenverarbeitung die Ergebnisse von Einzelzell-Transkriptomik-Experimenten erheblich beeinflussen kann.

hiPSCs wurden auf 1:40 mit Matrigel (Corning, Nr. 354277) beschichteten Schalen in ergänztem mTeSR-1-Medium (StemCell Technologies, Nr. 85850) mit 500 U ml–1 Penicillin und 500 mg ml–1 Streptomycin (Gibco, Nr. 15140122) gehalten. Für die Differenzierung kortikaler Neuronen wurde das zuvor beschriebene Protokoll21 mit geringfügigen Modifikationen befolgt. Kurz gesagt, hiPSC-Kolonien wurden in 12-Well-Platten ausgesät, die mit 1:40 Matrigel beschichtet waren, und zwar mit einer Zelldichte, die ausreichte, um einen Tag nach dem Ausplattieren eine 100 %ige Konfluenz sicherzustellen. Am Tag 1 wurde das Medium auf neurales Induktionsmedium (neurales Erhaltungsmedium (1:1 Verhältnis von DMEM/F-12 GlutaMAX (Gibco, Nr. 10565018) und Neurobasal (Gibco, Nr. 21103049)) Medium mit 1× N-2 ( Gibco, #17502048), 1× B-27 (Gibco, #17504044), 5 μg ml−1 Insulin (Sigma, #I9278), 1 mM L-Glutamin (Gibco, #35050061), 100 μM nicht-essentielle Aminosäuren (Lonza, #BE13-114E), 100 μM 2-Mercaptoethanol (Gibco, #31350010), 50 U ml−1 Penicillin und 50 mg ml−1 Streptomycin), ergänzt mit 500 ng ml−1 Noggin (R&D Systems, #3344- NG-050), 1 μM Dorsomorphin (StemCell Technologies, Nr. 72102) und 10 μM SB431542 (Calbiochem, Nr. 616461)). Das neuronale Induktionsmedium wurde 9–12 Tage lang täglich ausgetauscht, bis sich die Neuroepithelschicht gebildet hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Neuroepithelzellen in Aggregaten unter Verwendung von Dispase (StemCell Technologies, #07923) gesammelt und auf einer mit 20 μg ml-1 Laminin beschichteten (Sigma, #L2020) Platte mit sechs Vertiefungen, die 2 ml neuronales Erhaltungsmedium enthielt, ausgesät. Die Zellen wurden in neuronalem Erhaltungsmedium inkubiert und alle zwei Tage ausgetauscht, bis neuronale Rosettenstrukturen erkennbar waren (Tage 12–15 nach neuronaler Induktion). Anschließend wurden dem Medium 2–4 Tage lang 20 ng ml bFGF (Peprotech, Nr. 100-18B) zugesetzt, um die Expansion der Neurostammzellen zu fördern. Am Tag 18 nach der neuronalen Induktion wurden die Zellen zur Vorläuferamplifikation mit Dispase gespalten. Am 24. Tag, als sich Neuronen an der Außenseite der Rosetten anzusammeln begannen, wurden die Zellen 1:3 mit Accutase (Merck Millipore, #SCR005) in einer Einzelzellsuspension passagiert und mit 50.000 Zellen pro cm² auf 20 μg ml ausgesät 1 Laminin-beschichtete Sechs-Well-Platte. Nach einer Woche wurden die Zellen erneut geteilt (Verhältnis 1:4) und auf mit 20 μg ml-1 Laminin beschichteten Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und die Kultur bis zu 50 Tage (zwischen 29 und 50) nach der neuronalen Induktion mit Mediumwechseln fortgesetzt jeden zweiten Tag. Zur Gewinnung von NPCs wurden mehrere hiPSCs-Zelllinien und Differenzierungsexperimente verwendet (Supplementary Data 1). Weitere Informationen zu den in der Zellkultur verwendeten Medien und Reagenzien finden Sie in den Zusatzdaten 7. Alle in dieser Arbeit verwendeten hiPSC-Zelllinien wurden mit Einverständniserklärung menschlicher Spender generiert. Die Verwendung von hiPSCs in dieser Arbeit wurde von der spanischen Nationalen Garantiekommission für die Spende und Verwendung menschlicher Zellen und Gewebe des Carlos III National Institute of Health genehmigt.

Die Zellen wurden nach einem zuvor beschriebenen, für scRNA-seq-Techniken optimierten Protokoll in eine Einzelzellsuspension dissoziiert36. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zellen 35 Minuten lang bei 37 °C unter Verwendung von Papain-Accutase-Dissoziationspuffer (1:1) (PDS Kit, Papain, Worthington Biochemical Corporation, Nr. LK003176) enzymatisch dissoziiert und mit DMEM/F-12 GlutaMAX, ergänzt mit, gequencht wurden 10 µM ROCK-Inhibitor (Y-27632, StemCell Technologies, #72304) und 0,033 mg ml−1 DNase (DNase (D2), Worthington Biochemical Corporation, #LK003170). Weitere Informationen zu den in der Zellkultur verwendeten Medien und Reagenzien finden Sie in den ergänzenden Daten 7. Die Zellsuspension wurde durch ein 40-µm-Sieb (Pluriselect Life Science, Nr. 43-10040-60) filtriert und dann 3 Minuten lang bei 150 g zentrifugiert RT. Nach drei Wäschen mit 0,4 mg ml-1 BSA in DPBS wurden die Zellen gezählt und die Lebensfähigkeit mittels Trypanblau-Methode aufgezeichnet. In die Studie wurden nur Proben mit einer Zelllebensfähigkeit von mehr als 75 % einbezogen.

Etwa 2,5 × 106 Zellen wurden nach der Dissoziation in Kryoröhrchen in 1 ml Gefriermedium, neuronalem Erhaltungsmedium, ergänzt mit 10 % v/v DMSO (Sigma-Aldrich, #D2438) und 20 ng ml-1 bFGF, kryokonserviert. Die Kryoröhrchen wurden in einen zuvor mit Isopropylalkohol gefüllten Mr. Frosty-Gefrierbehälter (Nalgene, Nr. 5100-001) gegeben und über Nacht bei –80 °C (ON) gelagert und dann zur Langzeitlagerung in einen Dampfphasen-Stickstoff-Gefrierschrank überführt. Kryokonservierte DMSO-Proben wurden in einem Wasserbad bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren aufgetaut, dann wurde 1 ml Erhaltungsmedium in das Fläschchen gegeben und in ein Falcon-Röhrchen mit 10 ml Erhaltungsmedium überführt. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei RT mit 160 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und das Zellpellet mit 1 ml DPBS und 0,01 % BSA gewaschen und dann in ein 1,5-ml-DNA-LoBind-Röhrchen (Eppendorf, Nr. 022431021) überführt. Die Zellen wurden erneut pelletiert und in DPBS und 0,01 % BSA resuspendiert. Abschließend wurden die Zellen durch ein 40-µm-Sieb filtriert und in einer Neubauer-Kammer unter Verwendung der Standard-Trypanblau-Methode gezählt.

Gemäß dem Methanol-Fixierungsprotokoll für Einzelzell-RNA-Seq in 10X Genomics (CG000136) wurden 200 µl eiskaltes DPBS hinzugefügt, um ein 2,5 × 106 Zellpellet zu resuspendieren. 800 µl vorgekühltes 100 %iges Methanol wurden tropfenweise zugegeben, bis die endgültige Methanolkonzentration 80 % erreichte. Proben in DNA-LoBind-Röhrchen wurden 30 Minuten lang auf Eis gelegt, dann bei –20 °C eingeschaltet und schließlich zur langen Lagerung auf –80 °C überführt. Mit Methanol fixierte Zellen wurden auf Eis aufgetaut und zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Das Zellpellet wurde gewaschen und in 1 ml DPBS mit 0,01 % BSA und 0,2 U µl−1 RNase-Inhibitor (Takara Bio, Nr. 2313 A) und 1 mM DTT (Sigma-Aldrich, Nr. D0632) rehydriert, um einen RNA-Abbau zu vermeiden . Die Zellen wurden erneut mit einem 40-µm-Sieb filtriert und in einer Neubauer-Kammer gezählt.

Ein Pellet aus 1 × 106 bis 5 × 106 Zellen wurde vorsichtig mit 100 µl Waschpuffer (DPBS mit 0,01 % BSA und 0,2 U µl−1 RNase-Inhibitor und 1 mM DTT) resuspendiert. Dann wurde ACME-Lösung (Waschpuffer: Methanol: Essigsäure: Glycerin; in einem Endverhältnis von 13:3:2:2) tropfenweise zugegeben, während das Röhrchen auf ein Endvolumen von 1 ml gemischt wurde, und 30 Minuten bei RT inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1000 g und 4 °C und Verwerfen des Überstands wurde das fixierte Zellpellet zweimal in 1 ml Waschpuffer gewaschen und in 1 ml Waschpuffer, ergänzt mit 10 % v/v DMSO, zur Lagerung bei – resuspendiert 80 °C. ACME-fixierte Proben wurden nach dem gleichen Protokoll wie methanolfixierte Proben aufgetaut und rehydriert.

Ein Zellpellet mit 1 × 106 bis 5 × 106 Zellen wurde vorsichtig mit 25 µl DPBS mit 0,01 % BSA resuspendiert. Zur Probenfixierung wurden 75 µl vivoPHIX-Reagenz (Rapid Labs, #RD-VIVO-5) (Verhältnis 3:1) zugegeben und durch zehnmaliges Umdrehen des Röhrchens während der ersten 5 Minuten der Fixierung gemischt. Anschließend wurde das Röhrchen bei RT auf ein Radgerät gestellt und weitere 30 Minuten inkubiert. Die Proben wurden bei 4 °C EIN gelagert und dann zur Langzeitlagerung auf –80 °C überführt.

Mit vivoPHIX fixierte Proben wurden durch Zugabe eines Volumens (100 µl) 100 % Ethanol und mehrmaliges Mischen des Röhrchens durch Umdrehen rehydriert. Anschließend wurden die Zellen 5 Minuten lang bei RT mit 1000 g pelletiert und der Überstand verworfen. 0,5 ml vivoPHIX-SCAA (1 Volumen vivoPHIX mit drei Volumen Eisessig) wurden sehr langsam zum Zellpellet gegeben, ohne es zu stören, und genau 3 Minuten lang bei RT inkubiert. Das vivoPHIX-SCAA aus dem Pellet wurde entfernt und die Zellen wurden erneut 5 Minuten lang bei RT mit 100 g pelletiert, um mit einer P20-Pipettenspitze jegliche verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Das Zellpellet wurde dreimal mit DPBS mit 0,01 % BSA und 0,2 U µl−1 RNase-Inhibitor und 1 mM DTT gewaschen und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden mit einem 40-µm-Sieb filtriert und in einer Neubauer-Kammer gezählt.

Ein Zellpellet mit 1 × 106 bis 5 × 106 Zellen wurde nach enzymatischer Dissoziation mit Accutase-Papain-Lösung vorsichtig durch Schwenken des Röhrchens mit dem restlichen Waschpuffer (25 µl) resuspendiert. Dann wurden 10 Volumina CellCover (250 µl) (Anacyte Laboratories) hinzugefügt und die Zellsuspension bis zur Verwendung bei 4 °C oder –80 °C gelagert. Das dem Unternehmen zur Verfügung gestellte empfohlene Protokoll empfiehlt nicht, die Proben einzufrieren oder für einen längeren Zeitraum von 2–7 Tagen aufzubewahren. Wir wollten jedoch die Effizienz dieses Reagenzes in unserem Arbeitsablauf testen, da das Protokoll recht einfach ist. Mit CellCover fixierte Proben wurden nach dem gleichen Verfahren wie bei Methanol-fixierten Proben gewonnen.

Für eine Einzelzellverkapselung in einem NADIA-Gerät (Dolomite Bio, Nr. 3200590) folgten wir dem vom Unternehmen bereitgestellten Protokoll. Wir haben 75.000 Zellen in einem Volumen von 250 µl (300.000 Zellen ml-1) und 150.000 Macosko oligodT-Beads (ChemGenes Corporation, #Macosko-2011-10 (V + )) in 250 µl (600 Beads µl-1) geladen, die zuvor gewaschen und gereinigt wurden resuspendiert in Lysepuffer (6 % w/v Ficoll PM-400, 0,2 % v/v Sarkosyl, 0,02 M EDTA, 0,2 M Tris pH 7,5 und 0,05 M DTT in nukleasefreiem Wasser). Zellen und Kügelchen flossen im Mikrofluidikchip des Geräts mit einer Einfangeffizienz von 5–7 % zusammen.

Unmittelbar nach dem Aufbrechen der Tröpfchenemulsion werden die vom OligodT eingefangenen RNAs revers transkribiert (maxima H RT Master Mix, Thermo, #EP0751) (Supplementary Data 8). Anschließend wurden die überschüssigen Perlenprimer, die kein RNA-Molekül einfingen, durch 45-minütige Inkubation der Perlen mit Exonuklease I (New England Biolabs, #174M0293L) bei 37 °C entfernt. Gesammelte Einzelzelltranskriptome, die an Mikropartikel (STAMPS) gebunden waren, wurden gezählt und in nukleasefreiem Wasser bei 400 Kügelchen µl-1 resuspendiert und in Pools von 4000 Kügelchen pro PCR-Röhrchen aufgeteilt und je nach verwendeter Kügelchencharge für 9 oder 11 PCR-Zyklen amplifiziert für die Verkapselung (9 Zyklen für Charge 01, 11 für die anderen). Nach der cDNA-Reinigung mit 0,6:1 AMPure XP Beads (Agencourt, #A63881) zur Probe wurde eine Quantifizierung mit dem Qubit dsDNA HS Assay (Thermo, #Q32851) und eine Überprüfung der Fragmentgröße mit einem 4200 TapeStation System (Agilent, #G2991BA) durchgeführt . Das Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina, #FC-131-1096) wurde für die Tagmentierung von 600 pg cDNA, die Markierung des Illumina-Adapters und die Amplifikation verwendet (Supplementary Data 8). Die Größe der Nextera-Bibliotheken nach der Reinigung mit 0,6:1 AMPure XP Beads pro Probe wurde mit einem 4200 TapeStation-System bestimmt und mit dem Qubit dsDNA HS Assay quantifiziert. 1,8 pM der gepoolten Bibliotheken wurden auf dem Illumina NextSeq 550-Sequenzer mit Nextseq 550 High Output v2 sequenziert Kit (75 Zyklen) (Illumina, #20024906) im Paired-End-Modus; 20 bp für Read 1 unter Verwendung des benutzerdefinierten Primers Read1CustSeqB37 (Zellenbarcode und UMI) und 64 bp für Read 2 und 8 bp für den i7-Index.

scRNA-seq-Bibliotheken wurden mit der Drop-seq_tools 2.3-Pipeline38 verarbeitet, um DGE-Matrizen (Digital Gene Expression) zu generieren. Zunächst wurden Drop-seq-Tools verwendet, um den Index und die Annotationsdateien für die hg38-Assembly-Version des menschlichen Genoms zu generieren, wobei Ensembl Version 100 Annotation39 als Referenz diente. Als Nächstes wurden Fastq-Dateien mit Paired-End-Lesevorgängen mithilfe von Picard Tools v2.18.1440 zu einer einzigen nicht ausgerichteten BAM-Datei zusammengeführt. Unter Verwendung des Drop-seq-Toolkits mit Standardparametern wurden die Lesevorgänge dann mit der Zelle und den molekularen Barcodes markiert, am 5'-Ende gekürzt, um Adaptersequenzen zu entfernen, und am 3'-Ende, um PolyA-Schwänze zu entfernen. Als nächstes wurden die Lesevorgänge mit der STAR-Version 2.7.0.a41 auf das menschliche Genom (Version hg38) abgebildet. Die resultierenden BAM-Dateien wurden mit den Annotationsmetadatendateien getaggt, um Lesevorgänge zu identifizieren, die Gene überlappen. Abschließend wurde die Zell-Barcode-Korrektur mit den Programmen DetectBeadSubstitutionError und DetectBeadSynthesisErrors ebenfalls mit Standardparametern durchgeführt. Um die Anzahl der während der Einzelzellenkapselung erhaltenen Zellen abzuschätzen, haben wir ein Kniediagramm verwendet und als Eingabe die Anzahl der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge verwendet, die den oberen N Barcodes zugewiesen sind, wobei N mindestens das Fünffache der Anzahl der erwarteten Zellen ist. Die mit diesem Verfahren erhaltene geschätzte Zellzahl wurde dann zur Generierung einer DGE verwendet. Für jeden Datensatz wurden zwei DGE-Matrizen generiert, eine mit allen UMIs überlappenden Genen unter Verwendung der Parameter LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC LOCUS_FUNCTION_LIST = INTERGENIC und eine andere mit allen UMIs überlappenden Introns unter Verwendung der Parameter LOCUS_FUNCTION_LIST = null LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC.

DGE-Expressionsmatrizen wurden mit Seurat v 4.2.142 analysiert. Zuerst haben wir für jeden Datensatz Seurat-Objekte generiert und diese Objekte zusammengeführt, bevor wir die Filterung von Zellen mit geringer Qualität durchgeführt haben. Nach der manuellen Inspektion wurden alle Zellen mit einer UMI-Zahl unter 200 oder über 17.000, einer Genzahl unter 200 oder über 5.500, einem Prozentsatz an mitochondrialen Transkripten von mehr als 7,5 % und einem Ribosomengehalt von mehr als 40 % verworfen. Die Anzahl der bei jedem Schritt verworfenen Zellen ist in den Zusatzdaten 3 angegeben. Anschließend haben wir DoubletFinder43 für jedes Beispielobjekt separat verwendet, um Dubletts zu entfernen. Die in jedem Datensatz identifizierten Parameter und Dubletts sind in den Zusatzdaten 9 detailliert beschrieben. Nach der Dublettentfernung haben wir einzelne Objekte zusammengeführt, um eine gemeinsame Analyse durchzuführen. Zunächst wurden alle Gene entfernt, die in weniger als drei Zellen exprimiert wurden. Darüber hinaus haben wir ein lineares Modell angepasst, um die Beziehung zwischen der logarithmischen Anzahl der UMIs und der logarithmischen Anzahl der pro Zelle erkannten Gene zu beschreiben. Alle Zellen mit einem Rest von weniger als –0,5 (3 Zellen) wurden verworfen. Das endgültig erhaltene Seurat-Objekt enthielt 16.870 Zellen und 24.468 Gene.

Wir haben die Seurat-Funktion verwendet, um den Prozentsatz der mitochondrialen Transkripte, die Anzahl der Gene, die Anzahl der UMIs und die Konservierungsmethode zu ermitteln. Um die Daten zu normalisieren, haben wir die LogNormalize-Methode verwendet und mit einem Skalierungsfaktor von 10.000 multipliziert. Anschließend haben wir die 2000 variabelsten Gene ausgewählt, um 100 Hauptkomponenten (PCs) zu berechnen. Wir haben die ElbowPlot-Funktion verwendet, um das Ausmaß der von jedem PC erklärten Variabilität manuell zu überprüfen und die ersten 20 PCs auszuwählen, die zum Erstellen des kNN-Diagramms und zum Berechnen des UMAP-Diagramms mithilfe von 500 Trainingsepochen (Iterationen) verwendet wurden. Um die Batch-Effekte zu eliminieren, die sich auf die Identifizierung gemeinsamer Zellpopulationen in allen Datensätzen auswirken, haben wir das Harmony-Paket28 verwendet. Die Funktion RunHarmony wurde auf das gefilterte und verarbeitete Objekt angewendet und stellte die Beispiele als zu integrierende Variable bereit. Durch die Untersuchung des aktualisierten Elbow-Diagramms haben wir die ersten 19 korrigierten PCs ausgewählt, um das Clustering durchzuführen. Wir haben das Paket clustree44 verwendet, um die Clustering-Ergebnisse bei verschiedenen Auflösungen von 0,1 bis 1 zu überprüfen, und haben eine endgültige Auflösung von 0,7 gewählt, bei der wir 12-Zellen-Populationen erhalten haben. Um die Top-Marker für jeden Cluster zu berechnen, haben wir die FindAllMarkers-Funktion von Seurat mit nur positiven Markern und den restlichen Standardparametern verwendet. Statistisch signifikante Marker mit einem angepassten P-Wert des Wilcoxon-Rangsummentests von weniger als 0,05 wurden ausgewählt.

Wir haben die Funktion AddModuleScore mit Standardparametern aus dem Seurat-Paket42 verwendet, um zu beurteilen, ob die verschiedenen Fixierungsmethoden Stress induzierten oder Apoptose in den Zellen begünstigten. Diese Funktion vergleicht die Expression eines Satzes bestimmter Gene mit zufälligen Sätzen von Genen mit ähnlicher Expression im Datensatz, um eine Anreicherung zu berechnen. Für die Apoptose-Signatur haben wir eine Gensignatur erstellt, die die Gene BCL2, TNF, TP53, CASP3, BAX, CASP8, FAS45 umfasst. Für die Stresssignatur verwendeten wir die folgenden unmittelbar frühen Gene FOS, JUN, EGR1, UBC, HSPA1B, BTG2, IER2, ID330. Statistisch signifikante Unterschiede im Signaturwert zwischen den verschiedenen Fixierungsmethoden und frischen Proben wurden mithilfe eines einseitigen Wilcoxon-Rangsummentests berechnet.

Um Veränderungen in der Zellzusammensetzung zu beurteilen, verwendeten wir scCODA5. Um scCODA auszuführen, haben wir frische Proben als Referenzbedingung definiert. Um den Vergleich festzulegen, musste ein Cluster mit geringer Variabilität zwischen den Stichproben als Referenz ausgewählt werden. In diesem Fall verwendeten wir als Referenz den NPC-Cluster, der eine gute Anzahl von Zellen und eine sehr geringe Streuung (ausgedrückt als Unterschiede zwischen Gruppen) aufwies. Um sicherzustellen, dass die Ergebnisse konsistent und reproduzierbar sind, haben wir scCODA5 zehnmal mit der Hamilton-Monte-Carlo-Stichprobenmethode mit Standardparametern ausgeführt und die Ergebnisse gemittelt. Zelltypen mit durchschnittlichen Werten unter (oder über) Null weisen laut scCODA-Modell eine signifikante Abnahme (oder Zunahme) der Häufigkeit auf (Falscherkennungsrate <0,05).

Wir haben die Funktion „aggregatData“ aus dem R-Paket Muscat31 verwendet, um Pseudobulk-Ausdruckswerte für jeden Cluster in jeder der Stichproben zu erhalten. Anschließend verwendeten wir die Funktion pbDS, um eine differenzielle Genexpressionsanalyse mit DESeq246 für jeden Cluster durchzuführen und DEGs für jede Methode im Vergleich zu frischen Proben zu identifizieren. DEGs mit einem angepassten Wald-Test-P-Wert <0,05 und einer absoluten log2-fachen Änderung >0,58 sind in den Zusatzdaten 6 und in Abb. 6c verfügbar. Um zu beurteilen, ob die verschiedenen Fixierungs-/Konservierungsmethoden zu Verzerrungen bei der Expression bestimmter Gensätze führten, untersuchten wir die biologischen Prozesse, die mit hoch- und herunterregulierten Genen verbunden sind, mithilfe der Enrichr-Funktion des GSEApy-Pakets47. Für diese Analyse haben wir alle Gene verwendet, die für jede Fixierungs-/Konservierungsmethode über mindestens vier Zelltypen hinweg konsistent hoch- oder herunterreguliert wurden. Es wurden nur Gensätze mit mindestens zehn Genen analysiert. Als Hintergrundsatz für die Anreicherungsanalyse haben wir alle im Datensatz exprimierten Gene bereitgestellt, die mindestens 445 UMIs aufwiesen, was die minimale Expression unter den identifizierten DEGs darstellt. Bei allen Vergleichen haben wir keinen signifikant überrepräsentierten Begriff der Genontologie identifiziert (hypergeometrischer testbereinigter P-Wert <0,001).

Um die Korrelation zwischen Datensätzen zu bewerten, haben wir die Expressionsprofile aller Zellen aus jedem Datensatz global und auf Clusterebene verglichen. Zu diesem Zweck haben wir Pseudobulk-Expressionswerte für alle Gene innerhalb eines bestimmten Clusters/Datensatzes berechnet. Anschließend haben wir die Zählwerte c mithilfe eines Pseudocounts logtransformiert, sodass der normalisierte Ausdruck n n = log (c + 1) war. Wir haben diese normalisierten Ausdruckswerte verwendet, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten pro Zelltyp/Probe mithilfe der Funktion cor in R zu berechnen. Wir haben die Funktion pheatmap48 verwendet, um ein hierarchisches Clustering unter Verwendung einer vollständigen Clustering-Methode durchzuführen und die Korrelationskoeffizienten zur Berechnung der euklidischen Abstände zwischen Clustern zu verwenden. Da viele Zellcluster sehr ähnlich sind, haben wir das gleiche Verfahren für jeden Zelltyp separat wiederholt und die statistische Signifikanz der Stichprobencluster mithilfe der shc-Funktion aus dem sigclust2 R-Paket29 in der entsprechenden Korrelationstabelle ermittelt. Die shc-Methode verwendet ein auf Monte-Carlo-Simulation basierendes Signifikanztestverfahren, um die Signifikanz der hierarchischen Clustering-Ergebnisse des Datensatzes zu bewerten. Die statistische Signifikanz wird an jedem Knoten entlang des hierarchischen Baums (Dendrogramm) ausgehend von der Wurzel mithilfe eines Gaußschen Nullhypothesetests bewertet und ein entsprechender P-Wert mithilfe des 2-Mittelwert-Clusterindex berechnet, einer Statistik, die empfindlich auf Null- und Alternativhypothesen reagiert. Zur Korrektur mehrerer Tests wird eine familienweise Fehlerrate angewendet, die das Verfahren steuert. Wir haben für jeden Zelltyp Dendrogrammdiagramme erstellt, um die Ähnlichkeit zwischen Clustern für verschiedene Proben zu veranschaulichen und die statistisch signifikanten Unterschiede hervorzuheben.

Unterschiedliche Perlenchargen können unterschiedliche mRNA-Einfangeffizienzen aufweisen. Um die Auswirkungen der Verwendung verschiedener Chargen bei scRNA-seq-Verkapselungen zu bewerten, haben wir die Einfangeffizienz der Bead-Chargen 01 und 02 gemessen. Wir haben dieselbe Probe zweimal mit beiden im Artikel verwendeten Bead-Chargen eingekapselt. Nach der RT-PCR amplifizierten wir 4000 STAMPS durch PCR mit 9, 10, 11 oder 12 Zyklen unabhängig voneinander. Nach der Reinigung der AMPure XP Beads wurde die cDNA jeder PCR mit dem Qubit dsDNA HS Assay quantifiziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass wir die Anzahl der PCR-Zyklen bei Verwendung von Charge 02 um das Zweifache erhöhen mussten, um mit den beiden Perlenchargen eine ähnliche cDNA-Konzentration zu erhalten (ergänzende Abbildung 2).

Alle Einzelzell-Transkriptomik-Experimente wurden mit mindestens zwei verschiedenen Zelllinien und zwei unabhängigen Differenzierungsexperimenten durchgeführt. Die Proben D1, D2, M3 und M4 stammen aus denselben Differenzierungsexperimenten, wurden jedoch mit unterschiedlichen Protokollen und an unterschiedlichen Tagen fixiert (DMSO-Kryokonservierung für D1 und D2, Methanolfixierung für M3 und M4). Die Proben F1, F2, M1, M2, D3, A1, A2, V1 und V2 stammen alle aus unabhängigen Differenzierungsexperimenten. Alle Details zu Differenzierungstagen, verwendeten Zelllinien und anderen Details aus der Probenkonservierung finden Sie in den Zusatzdaten 1. Die anfängliche Anzahl der Zellen jeder Probe und die endgültige Anzahl nach der Qualitätsfilterung sind in Tabelle 1 angegeben. Diese Zellen werden in allen im Artikel bereitgestellten Analysen verwendet.

Die meisten rechnerischen Analysen wurden mit R49 und bestimmten in R 4.2.1 implementierten Paketen wie Seurat50, Harmony28, clustree44, muscat31, sigclust229 und DoubletFinder43 durchgeführt. Wir haben auch das in Python implementierte Programm scCODA5 verwendet, um Änderungen in der Zelltyphäufigkeit zu bewerten, und das Programm GSEApy47, um eine GO-Term-Anreicherungsanalyse durchzuführen. Alle Details finden Sie im Abschnitt Methoden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle für diese Studie generierten rohen und verarbeiteten scRNA-seq-Daten sind in der GEO-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE209947 zu finden. Quelldaten, die den Abbildungen zugrunde liegen. 2c, d, 4b und 6 sind in den Zusatzdatendateien 10–14 verfügbar.

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Wir danken allen Mitgliedern des Plass Lab für nützliche Kommentare und kritische Diskussionen. Wir danken außerdem Yvonne Richaud-Patin vom Regenerative Medicine Program bei IDIBELL und Dr. Zomeño von der Advanced Cell and Tissue Culture-Plattform von IDIBELL für ihre Hilfe bei der iPSC-Zellkultur. Wir danken Dr. Iglesias für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir danken außerdem Dr. Iglesias, Dr. Kim und Dr. Sebé-Pedrós für ihre Unterstützung bei der Einrichtung der ACME- und vivoPHIX-Protokolle zur Zellkonservierung. Diese Forschung wurde durch ein Forschungsprojekt des staatlichen Forschungs- und Entwicklungsprogramms Research Challenges des spanischen Ministeriums für Wissenschaft, Innovation und Universitäten finanziert (Fördernummer: PID2019-108580RA-I00/AEI/10.13039/501100011033). Die MP-Arbeit wird durch einen Ramón y Cajal-Vertrag des spanischen Ministeriums für Wissenschaft und Innovation (RYC2018-024564-I) unterstützt. Wir danken dem CERCA-Programm/Generalitat de Catalunya für die institutionelle Unterstützung von IDIBELL.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake.

Genregulation der Zellidentität, Programm für Regenerative Medizin, Bellvitge Institute for Biomedical Research (IDIBELL), L'Hospitalet del Llobregat, Barcelona, ​​Spanien

Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake, Mohamed N. Hassan, Natalie Chaves Cayuela und Mireya Plass

Programm zur Förderung der klinischen Übersetzung der Regenerativen Medizin in Katalonien, P-CMR[C], L'Hospitalet del Llobregat, Barcelona, ​​Spanien

Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake, Mohamed N. Hassan, Natalie Chaves Cayuela, Loris Mularoni und Mireya Plass

Programm für Regenerative Medizin, Bellvitge Institute for Biomedical Research (IDIBELL), L'Hospitalet del Llobregat, Barcelona, ​​​​Spanien

Loris Mularoni

Zentrum für vernetzte biomedizinische Forschung zu Biotechnik, Biomaterialien und Nanomedizin (CIBER-BBN), Madrid, Spanien

Mireya-Platz

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AGF und MP haben das Projekt entworfen und Experimente geplant. AGF und NC führten experimentelle Arbeiten durch. FA, MH und MP führten rechnerische Datenanalysen durch. LM führte die Zusammensetzungsanalyse der Proben durch. MP akquirierte Fördermittel, überwachte und koordinierte die Arbeit. AGF, FA und MP interpretierten die Ergebnisse. MP hat das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Mireya Plass.

MP ist Mitglied des Redaktionsausschusses für Kommunikationsbiologie, war jedoch weder an der redaktionellen Überprüfung noch an der Entscheidung zur Veröffentlichung dieses Artikels beteiligt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt Timothy (J) Petros und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: George Inglis. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gutiérrez-Franco, A., Ake, F., Hassan, MN et al. Die Methanolfixierung ist die Methode der Wahl für die tröpfchenbasierte Einzelzelltranskriptomik neuronaler Zellen. Commun Biol 6, 522 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

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Eingegangen: 05. August 2022

Angenommen: 12. April 2023

Veröffentlicht: 15. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

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