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Jun 09, 2023

Parallele Sequenzierung extrachromosomaler zirkulärer DNAs und Transkriptome in einzelnen Krebszellen

Nature Genetics Band 55,

Nature Genetics Band 55, Seiten 880–890 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Extrachromosomale DNAs (ecDNAs) kommen bei Krebs häufig vor, aber viele Fragen zu ihrem Ursprung, ihrer strukturellen Dynamik und ihrem Einfluss auf die intratumorale Heterogenität sind noch ungeklärt. Hier beschreiben wir die extrachromosomale zirkuläre DNA und Transkriptomsequenzierung einzelner Zellen (scEC&T-seq), eine Methode zur parallelen Sequenzierung zirkulärer DNAs und mRNA voller Länge aus einzelnen Zellen. Durch die Anwendung von scEC&T-seq auf Krebszellen beschreiben wir interzelluläre Unterschiede im ecDNA-Gehalt und untersuchen gleichzeitig deren strukturelle Heterogenität und transkriptionelle Auswirkung. Onkogenhaltige ecDNAs waren klonal in Krebszellen vorhanden und führten zu interzellulären Onkogenexpressionsunterschieden. Im Gegensatz dazu kamen andere kleine zirkuläre DNAs nur in einzelnen Zellen vor, was auf Unterschiede in ihrer Selektion und Vermehrung hinweist. Interzelluläre Unterschiede in der ecDNA-Struktur deuteten auf eine zirkuläre Rekombination als Mechanismus der ecDNA-Evolution hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass scEC&T-seq ein Ansatz zur systematischen Charakterisierung sowohl kleiner als auch großer zirkulärer DNA in Krebszellen ist, was die Analyse dieser DNA-Elemente bei Krebs und darüber hinaus erleichtern wird.

Die Messung mehrerer Parameter in denselben Zellen ist der Schlüssel zum genauen Verständnis biologischer Systeme und ihrer Veränderungen bei Krankheiten1. Im Fall zirkulärer DNAs ist es wichtig, DNA-Sequenzinformationen mit Messungen der Transkriptionsleistung zu integrieren, um deren funktionellen Einfluss auf Zellen zu beurteilen. In menschlichen Zellen können mindestens drei Arten zirkulärer DNAs unterschieden werden2,3,4,5: (1) kleine zirkuläre DNAs (<100 kb)6, die unter verschiedenen Namen beschrieben wurden, darunter eccDNAs6, microDNAs4, apoptotische zirkuläre DNAs6, klein polydisperse zirkuläre DNAs7 und telomere zirkuläre DNAs oder C-Kreise8; (2) T-Zell-Rezeptor-Exzisionskreise (TRECs)9; und (3) große (>100 kb), onkogene, kopiezahlamplifizierte zirkuläre extrachromosomale DNAs10,11 (als ecDNA bezeichnet und während der Metaphase als doppelte winzige Chromosomen sichtbar12). Trotz unserer zunehmenden Fähigkeit, mehrere Merkmale in einzelnen Zellen zu charakterisieren13, bleibt eine eingehende Charakterisierung des zirkulären DNA-Gehalts, der Struktur und der Sequenz in einzelnen Zellen mit aktuellen Ansätzen schwierig.

Bei Krebs sind Onkogenamplifikationen auf ecDNA von besonderem Interesse, da sie durch ihre einzigartige Fähigkeit, während der Mitose repliziert und ungleichmäßig getrennt zu werden, die Heterogenität der interzellulären Kopienzahl wirksam vorantreiben14,15,16,17,18,19. Diese Heterogenität ermöglicht es Tumoren, sich an Therapien anzupassen und ihnen auszuweichen2,20,21,22. Tatsächlich haben Patienten mit ecDNA-tragenden Krebserkrankungen negative klinische Ergebnisse11. Jüngste Untersuchungen deuten darauf hin, dass Enhancer-haltige ecDNAs in Kernzentren miteinander interagieren17,23 und entfernte chromosomale Positionen in trans beeinflussen können23,24. Dies legt nahe, dass sogar ecDNAs, die keine Onkogene enthalten, funktionsfähig sein könnten23,24. Darüber hinaus haben wir kürzlich herausgefunden, dass Tumore ein unerwartetes Repertoire kleinerer, kopienzahlneutraler zirkulärer DNAs mit bisher unbekannter funktioneller Relevanz beherbergen3.

In dieser Studie berichten wir über die extrachromosomale zirkuläre DNA- und Transkriptomsequenzierung einzelner Zellen (scEC&T-seq), eine Methode, die die parallele Sequenzierung aller zirkulären DNA-Typen unabhängig von ihrer Größe, ihres Inhalts und ihrer Kopienzahl sowie der mRNA voller Länge in Einzelzellen ermöglicht Zellen. Wir demonstrieren seinen Nutzen für die Profilierung einzelner Krebszellen, die sowohl strukturell komplexe multifragmentierte ecDNAs als auch kleine zirkuläre DNAs enthalten.

Derzeitige hochmoderne Reinigungsansätze für zirkuläre DNA umfassen drei aufeinanderfolgende Schritte, nämlich die Isolierung der DNA, gefolgt von der Entfernung der linearen DNA durch Exonuklease-Verdau und die Anreicherung der zirkulären DNA durch Rolling-Circle-Amplifikation3,6,25. Wir kamen zu dem Schluss, dass dieser Ansatz auf einzelne Zellen reduziert werden kann und in Kombination mit Smart-seq2 (Lit. 26) die parallele Sequenzierung von zirkulärer DNA und mRNA ermöglichen könnte. Um unsere Methode in einzelnen Zellen zu vergleichen, verwendeten wir Neuroblastom-Krebszelllinien, die wir zuvor in großen Populationen charakterisiert hatten3. Wir verwendeten FACS, um Zellen in 96-Well-Platten zu trennen (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1a, b und ergänzende Tabelle 1). DNA wurde von polyadenylierter RNA getrennt, die auf Magnetkügelchen eingefangen wurde, die an einzelsträngige Sequenzen von Desoxythymidin-Primern (Oligo dT) gekoppelt waren, ähnlich wie bei früheren Ansätzen27. Die DNA wurde einem Exonukleaseverdau unterzogen, wie er in der Vergangenheit erfolgreich in großen Zellpopulationen durchgeführt wurde, um zirkuläre DNA anzureichern3,6,25 (Abb. 1b). DNA, die vor dem Exonukleaseverdau einer PmeI-Endonuklease ausgesetzt wurde, diente als Negativkontrolle3. In einer Untergruppe von Fällen blieb die DNA als zusätzliche Kontrolle unverdaut (Abb. 1b). Die nach den verschiedenen Verdauungsschemata verbleibende DNA wurde amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde einer Illumina-Paired-End-Sequenzierung und in einigen Fällen einer Long-Read-Nanopore-Sequenzierung unterzogen (Abb. 1a). Die Sequenzzusammensetzung zirkulärer DNAs wurde analysiert und der genomische Ursprung in zirkularisierten Regionen mithilfe zuvor etablierter Rechenalgorithmen für die zirkuläre DNA-Analyse abgeleitet3.

a, Schema der scEC&T-seq-Methode. b, Schematische Darstellung der Versuchsbedingungen und erwarteten Ergebnisse. c, Genom verfolgt den Vergleich der Lesedichten auf mtDNA (chrM) in drei beispielhaften CHP-212-Zellen für jede getestete Versuchsbedingung. Von oben nach unten: Keine Verdauung (lila), 1-tägiger Exonuklease-Verdau (hellgrün), 5-tägiger Exonuklease-Verdau (dunkelgrün) und Endonuklease-Verdau mit PmeI vor 5-tägigem Exonuklease-Verdau (grau). d, Anteil der Sequenzierungsablesungen, die in jeder Versuchsbedingung in CHP-212- (rot) und TR14-Zellen (blau) auf mtDNA abgebildet werden. e, Anteil der Sequenzierungsablesungen, die in jeder experimentellen Bedingung in CHP-212- und TR14-Zellen auf zirkuläre DNA-Regionen abgebildet werden, die durch scEC&T-seq identifiziert wurden. f, Sequenzierungsanteil liest die Zuordnung zu zirkulären DNA-Regionen mit der Endonuklease PmeI, die auf die durch scEC&T-seq identifizierte Sequenz in jeder experimentellen Bedingung in CHP-212- und TR14-Zellen abzielt. d–f, die Probengröße ist unter allen Bedingungen identisch: keine Verdauung (n = 16 TR14-Zellen, n = 28 CHP-212-Zellen); 1-tägiger Exonukleaseverdau (n = 37 TR14-Zellen, n = 31 CHP-212-Zellen); 5-tägiger Exonukleaseverdau (n = 25 TR14-Zellen, n = 150 CHP-212-Zellen); und Endonuklease-Verdau mit PmeI vor dem 5-tägigen Exonuklease-Verdau (n = 6 TR14-Zellen, n = 12 CHP-212-Zellen). Alle statistischen Analysen entsprechen einem zweiseitigen Welch-t-Test. P-Werte werden angezeigt. In allen Boxplots stellen die Boxen das 25. und 75. Perzentil dar, wobei der Mittelbalken den Medianwert darstellt und die Whiskers den weitesten Ausreißer ≤ 1,5× des Interquartilbereichs (IQR) von der Box darstellen.

Quelldaten

Um die Leistung unserer scEC&T-seq-Methode zu bewerten, haben wir zunächst den Nachweis und die Anreicherung mitochondrialer DNA (mtDNA) bewertet, da mtDNA in allen Zellen vorhanden ist, durch PmeI verdaut wird und aufgrund ihrer Zirkularität und extrachromosomalen Natur als Positivkontrolle dient. Ein signifikant höherer Prozentsatz der auf mtDNA abgebildeten Lesevorgänge wurde nach längerer Exposition der DNA einzelner Zellen gegenüber Exonuklease festgestellt (P <2, 2 × 10−16, zweiseitiger Welch-t-Test; Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 1c, D). Dies war auch bei allen anderen zirkulären DNA-Elementen der Fall (P <2,2 × 10−16, zweiseitiger Welch-t-Test; Abb. 1e), was auf eine signifikante Anreicherung zirkulärer DNA hinweist. Nach einem Tag Exonuklease-Verdau wurde eine signifikante Anreicherung von ecDNA-Regionen, d. . Diese Anreicherung war nach einem längeren 5-tägigen Exonukleaseverdau nicht so ausgeprägt wie die kleinerer zirkulärer DNAs, was darauf hindeutet, dass ecDNA in Gegenwart von Exonuklease im Vergleich zu kleineren zirkulären DNAs möglicherweise weniger stabil ist oder dass kleine zirkuläre DNAs durch φ29-Polymerase effizienter amplifiziert werden (Ergänzende Abbildung 1e, f). Die PmeI-Endonuklease-Inkubation vor der 5-tägigen Exonuklease-Verdauung reduzierte die Lesekartierung auf mtDNA signifikant um das 404,8-fache (P < 2,2 × 10−16, zweiseitiger Welch-t-Test; Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 1c). Eine ähnliche Erschöpfung wurde bei der Lesekartierung auf zirkulärer DNA mit PmeI-Erkennungsstellen beobachtet, was die spezifische Anreicherung zirkulärer DNA durch unser scEC&T-seq-Protokoll bestätigt (P < 2,2 × 10−16, zweiseitiger Welch-t-Test; Abb. 1f und ergänzende Abb . 1g,h). Eine signifikante Übereinstimmung zwischen dem Illumina- und Nanoporen-basierten Nachweis zirkulärer DNAs deutete auf einen reproduzierbaren Nachweis unabhängig von der Sequenzierungstechnologie hin (zweiseitige Pearson-Korrelation, R = 0,95, P <2,2 × 10−16; ergänzende Abbildung 2a – d). Somit ermöglicht scEC&T-seq die Isolierung und Sequenzierung zirkulärer DNAs aus einzelnen Zellen.

Die abgetrennte mRNA aus denselben Zellen wurde mit Smart-seq2 (Ref. 26,27) verarbeitet (Abb. 1a und Ergänzende Anmerkung 1). Wir haben durchschnittlich 9.058 ± 1.163 (Mittelwert ± Standardabweichung) vollständige mRNA-Transkripte aus verschiedenen Genen pro Zelle nachgewiesen (Ergänzungsabbildung 3a – c und Ergänzungstabelle 2). Durch unbeaufsichtigtes Clustering wurden beide Zelllinienpopulationen getrennt (ergänzende Abbildung 3d, e). Um zu testen, ob scEC & T-seq qualitativ hochwertige mRNA-Sequenzierungsdaten lieferte, bewerteten wir die Genexpression der Zellzyklussignatur und klassifizierten einzelne Zellen in drei Zellzyklusphasen (G1, S, G2 / M; ergänzende Abbildung 3f). Die aus scEC & T-seq abgeleiteten Zellzyklusverteilungen stimmten mit denen überein, die mithilfe der FACS-basierten Zellzyklusanalyse gemessen wurden, und bestätigten deren Genauigkeit (ergänzende Abbildung 3g). Somit ermöglicht scEC&T-seq nicht nur die Anreicherung und den Nachweis zirkulärer DNAs, sondern ermöglicht auch die parallele Messung hochwertiger, vollständiger Transkript-mRNA in einzelnen Krebszellen.

Es wird erwartet, dass in einer Krebszellpopulation nur zirkuläre DNAs klonal vorhanden sind, die einen Fitnessvorteil verleihen22. Wir haben kürzlich herausgefunden, dass Tumore im Durchschnitt mehr als 1.000 einzelne zirkuläre DNAs enthalten, von denen die meisten klein sind (<100 kb), keine Onkogene enthalten und nicht zur Onkogenamplifikation beitragen3. Ihre interzellulären Unterschiede sind jedoch noch unerforscht und es ist immer noch unklar, ob kleine zirkuläre DNAs einen Fitnessvorteil verleihen können und in Krebszellen klonal vermehrt werden10. In Übereinstimmung mit unseren früheren Berichten in Massenpopulationen3 variierte die durchschnittliche Anzahl einzelner zirkulärer DNA-Regionen, die mithilfe von scEC&T-seq identifiziert wurden, zwischen 97 und 1.939 (Median = 702) pro Einzelzelle in Neuroblastom-Zelllinien (Abb. 2a). Die zirkuläre DNA-Größenverteilung und der genomische Ursprung waren zwischen einzelnen Zellen ähnlich und spiegelten die bei der Massensequenzierung beobachtete Verteilung wider (Minimum = 30 bp, Maximum = 1, 2 Mb, Median = 21.483 kb; Abb. 2a und ergänzende Abb. 4a, b). Alle analysierten Zellen waren zum Zeitpunkt der Sortierung am Leben (ergänzende Abbildung 1a, b) und die meisten (> 95 %) zirkulären DNAs, die in einzelnen Zellen nachgewiesen wurden, waren größer als apoptotische zirkuläre DNAs, was darauf hindeutet, dass die meisten zirkulären DNAs nicht auf Apoptose zurückzuführen waren. wie in anderen Berichten vorgeschlagen6 (Abb. 2a und ergänzende Abb. 4a). Somit enthält jede Krebszelle ein breites Spektrum einzelner zirkulärer DNAs aus unterschiedlichen genomischen Kontexten.

a, Heatmap mit der Anzahl und Länge einzelner zirkulärer DNA-Regionen (<100 kb), die durch scEC&T-seq in CHP-212- und TR14-Neuroblastom-Einzelzellen identifiziert wurden (n = 150 CHP-212-Zellen, n = 25 TR14-Zellen; Behältergröße = 500 bp) mit Dichteverteilung für zirkuläre DNA-Größen (oben) und Gesamtzahl zirkulärer DNA (rechts). b, Heatmap der genomweiten zirkulären DNA-Dichte in CHP-212- und TR14-Neuroblastom-Einzelzellen (oben: n = 150 CHP-212-Zellen, Behältergröße = 3 MB; unten: n = 25 TR14-Zellen, Behältergröße = 3 MB) und Genomspuren, die die genomweite Lesedichte von WGS in großen Zellpopulationen anzeigen. Die Position des MYCN-Gens in Chromosom 2 wird angezeigt. c, d, Wiederholungsanalyse in CHP-212-Zellen (n = 150) (c) und TR14-Zellen (n = 25) (d), angezeigt als Anteil der Zellen, die eine nachgewiesene zirkuläre DNA von jedem zirkulären DNA-Typ enthalten. ecDNA wurde als zirkuläre DNA definiert, die mit durch die Massensequenzierung identifizierten kopiezahlamplifizierten Regionen (grün) und mtDNA oder chrM (rot) überlappt. „Andere“ sind alle anderen kleinen zirkulären DNAs (blau). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Wie erwartet enthielten die meisten kleinen zirkulären DNAs keine Onkogene10. Der Gesamtanteil der in Zellen immer wieder nachgewiesenen kleinen zirkulären DNAs war gering (Abb. 2b – d und ergänzende Abb. 4c). Dies weist darauf hin, dass nur eine kleine Untergruppe kleiner zirkulärer DNAs in Krebszellen klonal vermehrt wird. Im Einklang mit ihrer bekannten onkogenen Rolle bei Krebs und den positiven selektiven Vorteilen wurden amplifizierte, onkogenhaltige ecDNAs wiederholt in Zellen nachgewiesen (Abb. 2b – d), was durch FISH validiert wurde (Abb. 2b und ergänzende Abb. 5a – c). ). Auch wenn die funktionelle Relevanz kleiner zirkulärer DNAs nicht ausgeschlossen werden kann, lässt die beobachtete hohe Subklonalität darauf schließen, dass sie nicht im gleichen Maße zur Fitness von Krebszellen beitragen wie klonale onkogenverstärkende ecDNA.

Wir und andere haben kürzlich gezeigt, dass ecDNAs komplexe Strukturen sind, die manchmal neu angeordnete Fragmente aus verschiedenen Chromosomen enthalten23,28,29,30. In Anbetracht der Tatsache, dass scEC&T-seq wiederholt ecDNAs in Megabase-Größe nachweisen konnte, die die Onkogene MYCN, CDK4 oder MDM2 enthalten (Abb. 2b), fragten wir, ob scEC&T-seq Einblicke in ecDNA-Strukturen liefern könnte. Tatsächlich erfasste scEC&T-seq Multifragment-ecDNAs in fast allen Einzelzellen und rekapitulierte die zuvor beschriebenen Elementstrukturen, die in Massenpopulationen gefunden wurden (Abb. 3a, b). In etwa 30 % der Einzelzellen war mindestens ein Varianten-unterstützender Read pro ecDNA-Breakpoint nachweisbar (Ergänzungstabelle 3). Die weitere Quantifizierung von ecDNA-Verbindungs-übergreifenden Lesevorgängen und die rechnerische Erkennung von Strukturvarianten (SV) sowohl aus der Sequenzierung mit kurzen als auch mit langen Lesevorgängen bestätigten die Vernetzung der Segmente (ergänzende Abbildungen 6a – p und ergänzende Tabellen 4 und 5). Solche SVs können zur Expression von Fusionstranskripten auf ecDNA3 führen. Tatsächlich konnten Fusionstranskripte in einzelnen Zellen mithilfe von scEC & T-seq identifiziert werden (Abb. 3c und ergänzende Abb. 7). Somit ist scEC&T-seq ausreichend empfindlich, um ecDNA-assoziierte SVs und die daraus resultierende Fusionsgenexpression in einzelnen Zellen zu erkennen.

a, b: Long- und Short-Read-basierte ecDNA-Rekonstruktionen, abgeleitet aus WGS-Daten in großen Zellpopulationen und Read-Abdeckung über die ecDNA-Fragmente über einzelne Zellen in CHP-212 (n = 150) (a) und TR14 (n = 25). ) Zellen (b), wie durch scEC&T-seq nachgewiesen. Von oben nach unten: Rekonstruktion des ecDNA-Amplikons, Profil der Kopienanzahl, Genanmerkungen, Lesedichte über der ecDNA-Region in fusionierten Einzelzellen und Abdeckung über der ecDNA-Region in einzelnen Zellen (Zeilen). c, Beispielhaftes Fusionstranskript, das durch scEC&T-seq erkannt wurde und aus der Neuanordnung chromosomaler Segmente in der CDK4-ecDNA in TR14 resultiert. Von oben nach unten: scCircle-seq-Leseabdeckung über die Bruchpunktregion in fusionierten TR14-Einzelzellen (logarithmisch skaliert), Transkriptanmerkungen, scRNA-seq-Leseabdeckung über die fusionierten Transkripte in fusionierten TR14-Einzelzellen, native Transkriptdarstellungen und Fusionstranskriptdarstellung. Die miteinander verbundenen Genomsegmente in der CDK4-ecDNA, die zum Fusionsgen führen, werden durch eine rote gestrichelte Linie angezeigt.

Die ungleiche mitotische Segregation der ecDNA impliziert, dass die Anzahl der ecDNA-Kopien zwischen einzelnen Zellen stark variieren kann17,22. In den meisten Einzelzellen unterschieden sich Multifragment-ecDNAs nicht in Struktur und Zusammensetzung (Abb. 3a, b), was darauf hindeutet, dass ecDNA in kultivierten Zelllinien strukturell stabil ist. Wie durch ihre binomiale mitotische Segregation und den damit verbundenen starken Fitnessvorteil vorhergesagt, enthielten die meisten einzelnen TR14-Zellen alle drei unabhängigen Onkogen-tragenden ecDNAs, die auch in Massenpopulationen nachgewiesen wurden (Abb. 3b und Abb. 4a). Eine kleine Anzahl von Zellen enthielt jedoch nur eine Teilmenge unabhängiger ecDNAs (Abb. 4a – c). Dies legt nahe, dass die Variation des ecDNA-Gehalts als Quelle für die Heterogenität der Population dient. Interessanterweise wurden MDM2-beherbergende ecDNAs in allen Einzelzellen nachgewiesen, wohingegen CDK4- und MYCN-beherbergende ecDNAs in einigen Zellen fehlten (Abb. 4b, c), was darauf hindeutet, dass möglicherweise noch undefinierte biologische Prinzipien der ecDNA-Segregation existieren. Als nächstes fragten wir, ob die Heterogenität der ecDNA-Kopienzahl die Expression von Genen beeinflusst, die auf ecDNA kodiert sind. Wir haben bestätigt, dass die Verteilung der relativen ecDNA-Kopienzahl mit den mit FISH gemessenen Kopiezahlverteilungen übereinstimmt (ergänzende Abbildung 8a – h). Die Phaseneinteilung der SNPs deutete darauf hin, dass ecDNAs in jeder einzelnen Krebszelle monoallelischen Ursprungs sind (ergänzende Abbildung 9a, b), was frühere Beobachtungen in Massenzellpopulationen bestätigt . In Übereinstimmung mit den durch die Kopienzahl bedingten Unterschieden in der Genexpression korrelierte die relative ecDNA-Kopienzahl positiv mit den mRNA-Lesezahlen der Gene, die auf ecDNAs in denselben einzelnen Zellen enthalten waren (Abb. 4d – h). Auch wenn Enhancer-Wechselwirkungen in geclusterter ecDNA ebenfalls zur Variabilität der interzellulären ecDNA-Expression beitragen können, liefern wir Belege dafür, dass die Heterogenität der ecDNA-Kopienzahl ein wesentlicher Faktor für interzelluläre Unterschiede in der Onkogenexpression ist.

a, Schematische Darstellung der drei unabhängigen ecDNAs, die in TR14 identifiziert wurden: MYCN-ecDNA (gelb); CDK4-ecDNA (blau); und MDM2-ecDNA (rot). b, UpSet-Diagramm, das das gleichzeitige Vorkommen der drei in TR14 identifizierten ecDNAs (MDM2, CDK4, MYCN) in einzelnen Zellen (n = 25 TR14-Zellen) zeigt. c: Genomspuren mit Lesedichten (logarithmisch skaliert) über rekonstruierten ecDNA-Regionen in drei beispielhaften TR14-Zellen, die unterschiedliche erkannte ecDNAs zeigen. d, Violindiagramme der mRNA-Expressionsniveaus in TR14- und CHP-212-Einzelzellen (zweiseitiger Welch-t-Test; P = 0,0038 (MYCN), P < 2,2 × 10−16 (LPIN1, TRIB2, CDK4, MDM2, MYT1L) ); n = 171 CHP-212-Zellen, n = 42 TR14-Zellen. e, f, Paarweiser Vergleich zwischen ecDNA- und mRNA-Lesezahlen von scEC&T-seq über die rekonstruierte MYCN-ecDNA-Region in CHP-212-Einzelzellen (zweiseitige Pearson-Korrelation, P < 2,2 × 10−16, R = 0,86, n = 150 Zellen) (e) und in TR14-Einzelzellen (zweiseitige Pearson-Korrelation, P = 0,0056, R = 0,54, n = 25 Zellen) (f). g, h, Paarweiser Vergleich zwischen ecDNA- und mRNA-Lesezahlen aus scEC&T-seq über die rekonstruierten CDK4- (g) und MDM2-ecDNAs (h) in TR14-Einzelzellen (zweiseitige Pearson-Korrelation, P = 0,0046, R = 0,55 für CDK4 und P = 0,0019, R = 0,59 für MDM2, n = 25 TR14-Zellen).

Quelldaten

Einzelnukleotidvarianten (SNVs) sind wichtige Treiber der interzellulären Heterogenität und Tumorentwicklung31. Darüber hinaus können SNVs in Zellen verfolgt werden, was ihre Verwendung für Anwendungen zur Abstammungsverfolgung ermöglicht32. Um zu testen, ob scEC&T-seq zum Nachweis von SNVs verwendet werden kann, haben wir SNV-Erkennungsalgorithmen auf zusammengeführte Einzelzell-scEC&T-seq-Daten angewendet und die erkannten SNVs mit denen verglichen, die in den Gesamtgenomsequenzen von Massenpopulationen identifiziert wurden. Die meisten mit scEC&T nachgewiesenen SNVs wurden auch im gesamten Genom nachgewiesen (>69,5 %). Da scEC & T-seq auch mtDNA erkennt (Abb. 2c, d), stellten wir die Hypothese auf, dass heteroplasmatische mitochondriale Mutationen die Abstammungsverfolgung ermöglichen könnten, wie in anderen Einzelzelltests in der Vergangenheit gezeigt wurde (Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 1c). Tatsächlich genotypisierte die unbeaufsichtigte hierarchische Clusterbildung durch homoplasmatische mtDNA-Varianten Zellen genau (ergänzende Abbildung 10a). Heteroplasmatische SNVs auf mtDNA zeigten eine hohe interzelluläre Heterogenität und wurden durch unbeaufsichtigte hierarchische Clusterbildung auf einzelnen Einzelzellen gruppiert, was auf Subklonalität hinweist und möglicherweise eine Abstammungsverfolgung ermöglicht (ergänzende Abbildung 10b und ergänzende Abbildung 11a, b). Somit kann scEC&T-seq heteroplasmatische Varianten in mtDNA und ecDNA erkennen und ermöglicht so eine breite Palette von SNV-basierten Anwendungen und Analysen, einschließlich Abstammungsinferenz.

Während der Ursprung und die funktionellen Konsequenzen großer onkogenhaltiger ecDNA-Elemente in der Vergangenheit ausführlich untersucht wurden33,34, ist weitgehend unklar, wie kleine zirkuläre DNAs gebildet werden und wie sie das Verhalten von Zellen beeinflussen. Neuere Arbeiten legen nahe, dass während der Apoptose einige kleine kreisförmige Elemente gebildet werden6. Andere Berichte liefern Hinweise auf die Beteiligung einer fehlerhaften Reparatur von DNA-Schäden an ihrer Entstehung35. Im Einklang mit früheren Berichten 36 haben wir das Vorhandensein von Mikrohomologie an zirkulären Bruchstellen kleiner zirkulärer DNAs identifiziert, was darauf hindeutet, dass eine durch Mikrohomologie vermittelte Reparatur an ihrer Entstehung beteiligt sein könnte (ergänzende Abbildung 12). Die in einzelnen Zellen identifizierte bimodale Größenverteilung (Abb. 2a) lässt darauf schließen, dass in Zellen mindestens zwei Arten kleiner zirkulärer DNAs existieren. In allen analysierten Einzelzellen wurden sehr kleine zirkuläre DNAs (<3 kb) gefunden (Abb. 2a und Abb. 5a). Es wurde kein Unterschied im Anteil sehr kleiner zirkulärer DNAs zwischen Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen beobachtet (Abb. 5b), was die Frage aufwirft, ob solche kleinen zirkulären DNAs repliziert werden können. Um die Wege zu identifizieren, die mit dem hohen Gehalt dieser sehr kleinen zirkulären DNAs verbunden sind, verglichen wir die RNA-Expression von Zellen mit einer hohen relativen Menge solcher kleinen zirkulären DNAs mit der von Zellen mit einem niedrigen relativen Gehalt (Abb. 5a). Zwanzig Signalwege wurden in Zelltranskriptomen mit einem hohen, sehr kleinen zirkulären DNA-Gehalt signifikant positiv angereichert (Abb. 5c – e und Ergänzungstabelle 6). In Übereinstimmung mit früheren Studien waren DNA-Schäden und Reparaturwege35,37,38, Apoptose6 und Telomererhaltung39 in Zellen mit einem hohen relativen Gehalt dieses kleineren Subtyps zirkulärer DNA signifikant angereichert (Abb. 5c – e). Dies zeigt, dass scEC&T-seq dazu beitragen kann, seit langem bestehende Fragen zum Ursprung und den funktionellen Konsequenzen kleiner zirkulärer DNAs zu beantworten.

a, Dichtediagramm des relativen Gehalts an kleiner zirkulärer DNA (<3 kb) in CHP-212-Einzelzellen (n = 129). Für differenzielle Expressionsanalysen wurden die Zellen in zwei Kategorien eingeteilt: „niedrig“ (orangefarbener Bereich, untere 40 %) und „hoch“ (violetter Bereich, obere 40 %). b, Violindiagramm zum Vergleich der relativen Anzahl kleiner zirkulärer DNAs (<3 kb) in verschiedenen Zellzyklusphasen in CHP-212- (rot, n = 129) und TR14-Einzelzellen (blau, n = 20). Unter den angegebenen Bedingungen wurde ein zweiseitiger Welch-T-Test verwendet. P-Werte werden angezeigt. c, Zellprozesse deutlich angereichert in CHP-212-Zellen mit hohem relativ sehr kleinem zirkulären DNA-Gehalt. Angepasste P-Werte und Genzahlen werden angezeigt. d, Gene-Set-Enrichment-Analyse (GSEA)-Diagramm der Gene, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind (angepasstes P = 0,0415). e, GSEA-Diagramm der Gene, die an der zellulären Reaktion auf den DNA-Schadensreiz beteiligt sind (angepasstes P = 0,0008). Die P-Werte wurden mit der Bejamini-Hochberg-Methode angepasst.

Die Konformation und Zugänglichkeit des Chromatins kann die Anfälligkeit für DNA-Schäden beeinflussen40. Wir stellten die Hypothese auf, dass kleine zirkuläre DNAs ein Produkt von DNA-Schäden an Stellen mit unterschiedlicher Zugänglichkeit oder Konformation des Chromatins sein könnten. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die relative Anreicherung der Chromatin-Immunpräzipitation des CCCTC-Bindungsfaktors (CTCF) gemessen, gefolgt von einer Sequenzierung (ChIP-seq) und einem Assay auf Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierungs-Peaks (ATAC-seq) in Regionen mit verglichenen kleinen kreisförmigen DNAs zu anderen Stellen im Genom. Für diese Analyse wurden kleine zirkuläre DNAs verwendet, die mit scEC & T-seq in einzelnen CHP-212-Zellen nachgewiesen wurden, und solche, die mit Circle-seq in den Massenzellpopulationen nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildung 13a – d). Interessanterweise wurden zirkuläre DNA-Bruchpunkte an CTCF-Bindungsstellen sowohl in einzelnen Zellen als auch in großen Zellpopulationen signifikant angereichert. Diese Anreicherung war umso auffälliger, wenn man bedenkt, dass Regionen, aus denen kleine zirkuläre DNAs stammten, an Stellen mit hohen ATAC-seq-Signalen deutlich abgereichert waren (ergänzende Abbildung 13e). Dies legt nahe, dass CTCF-Bindungsstellen und nicht zugängliches Chromatin, das an CTCF-Bindungsstellen reichlich vorhanden ist41, anfällig für Brüche und zirkuläre DNA-Bildung sein könnten. Um die ChIP-seq-Hintergrundsignale zu kontrollieren, haben wir die Anreicherung der ChIP-seq-Peaks H3K4me1, H3K27ac und H3K27me3 an Stellen mit kleiner zirkulärer DNA-Bildung gemessen. In allen Fällen wurden kleine zirkuläre DNAs an diesen Stellen mit deutlich geringerer Häufigkeit gefunden als für zufällig verteilte Regionen erwartet (ergänzende Abbildung 13f – h), was die Spezifität der CTCF-Anreicherung bestätigt und darauf hinweist, dass möglicherweise durch H3K4me1, H3K27ac und H3K27me3 markierte Stellen vorhanden sind vor Bruch und Zirkularisierung geschützt. In Anbetracht der Rolle von CTCF bei der Regulierung der dreidimensionalen Struktur von Chromatin durch Vermittlung der Bildung von Chromatinschleifen41 lassen unsere Daten die Möglichkeit vermuten, dass DNA-Brüche während der CTCF-vermittelten Schleifenextrusion einen Mechanismus für die Bildung kleiner zirkulärer DNA darstellen könnten.

Als nächstes wendeten wir scEC&T-seq auf einzelne Kerne von zwei Neuroblastomen und lebende T-Zellen an, die aus den Blutproben von zwei Patienten isoliert wurden (Abb. 6a, ergänzende Abbildungen 14a, b und 15a – t und ergänzende Anmerkung 1). Die Anzahl der in Krebszellen identifizierten einzelnen zirkulären DNA-Elemente war im Vergleich zu normalen T-Zellen und Zelllinienzellen deutlich höher, was darauf hindeutet, dass die DNA-Zirkularisierung in Tumoren häufiger vorkommt als in nicht transformierten Zellen oder Zellen in Kultur (Abb. 6b). Die Größenverteilungen der zirkulären DNA und der relative Genomgehalt waren vergleichbar mit denen, die in Zelllinien beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass scEC & T-seq unabhängig vom Eingabematerial reproduzierbar zirkuläre DNA einfängt (Abb. 6b und ergänzende Abb. 4a und 16a). In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen in Zelllinien war der Anteil wiederkehrend identifizierter kleiner zirkulärer DNAs gering (ergänzende Abbildung 16b – d). Große, onkogenhaltige ecDNAs hingegen wurden in Übereinstimmung mit ihrer onkogenen Rolle wiederholt in Tumorkernen, jedoch nicht in T-Zellen identifiziert (Abb. 6c und ergänzende Abb. 16b – d). MYCN-haltige ecDNAs waren in fast allen Krebskernen beider Patienten nachweisbar, was mit FISH bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 16e – g). Wie in Zelllinien beobachtet, korrelierten interzelluläre Unterschiede in der MYCN-Transkription positiv mit dem relativen ecDNA-Gehalt (ergänzende Abbildung 16h, i). Somit kann scEC&T-seq erfolgreich auf menschliche Tumore angewendet werden.

a, Schematische Darstellung, die die Verarbeitung von Tumor- und Blutproben beschreibt. b, Anzahl einzelner zirkulärer DNA-Regionen, normalisiert durch die Bibliotheksgröße, die in primären Tumorkernen (n = 93 Kerne Patient Nr. 1, n = 86 Kerne Patient Nr. 2), Neuroblastom-Zelllinien-Einzelzellen (n = 25 TR14-Zellen, n = 150 CHP-212-Zellen) und nichtmaligne einzelne T-Zellen (n = 38 Patient Nr. 3, n = 41 Patient Nr. 4). Die P-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen Welch-T-Tests berechnet und werden angezeigt. Die Kästchen in den Boxplots stellen das 25. und 75. Perzentil dar, wobei der mittlere Balken den Medianwert darstellt und die Whiskers den am weitesten entfernten Ausreißer ≤ 1,5× des IQR vom Kästchen darstellen. c, Heatmap der genomweiten zirkulären DNA-Dichte in Neuroblastom-Primärtumoren und normalen T-Zellen (n = 93 Patient Nr. 1, grün; n = 86 Patient Nr. 2, lila; n = 38 Patient Nr. 3, gelb; n = 41 Patient Nr. 4, orange; Behältergrößen = 3 MB). Die Position des MYCN-Gens in chr2 wird angezeigt.

Jüngste Studien zu Krebsgenomen haben strukturell komplexe ecDNAs beschrieben3,11,18,19,28,29,42; Aufgrund der Analyse großer Zellpopulationen waren sie jedoch nur begrenzt in der Lage, Rückschlüsse auf die strukturelle ecDNA-Heterogenität zu ziehen. Beide analysierten Neuroblastome enthielten große und strukturell komplexe MYCN-haltige ecDNAs, was durch Long-Read-Nanoporensequenzierung derselben einzelnen Kerne und durch Gesamtgenomsequenzierung (WGS) von Massenzellpopulationen bestätigt wurde (Abb. 7a und ergänzende Abb. 17a). Während die ecDNA-Struktur bei Patient Nr. Während die MYCN-haltige ecDNA des anderen Patienten (Patient Nr. 1) so komplex war, dass sie nicht vollständig rechnerisch rekonstruiert werden konnte (ergänzende Abbildung 17b), bestand sie strukturell aus fünf einzelnen genomischen Fragmenten, die alle von Chromosom 2 stammten durch vier SVs (Nr. 1–4) auf eine Weise verbunden, die einfach genug war, um zuverlässig in einzelnen Zellen rekonstruiert zu werden (Abb. 7a). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Beurteilung der strukturellen Heterogenität der interzellulären ecDNA bei diesem Patienten den Rückschluss auf die Strukturdynamik der ecDNA erleichtern könnte. Tatsächlich unterschied sich die ecDNA strukturell erheblich zwischen einer Untergruppe einzelner Zellen (Abb. 7a, b). SV-Nr. 1 war in allen Einzelzellen vorhanden, was darauf hindeutet, dass es vor den anderen SVs auftrat und möglicherweise die ursprüngliche Variante darstellt, die zur Zirkularisierung führte (Abb. 7b – d). SVs Nr. 2–4 hingegen wurden in einer Untergruppe von Zellen nicht nachgewiesen. Außerdem SV-Nr. 2 und SV-Nr. 3 zeigte das Vorhandensein einer 6-kb-Deletion und SV-Nr. 4 stützte das Vorhandensein einer größeren Deletion (ungefähr 180 kb) auf der ecDNA, die beide in den meisten, aber nicht allen einzelnen Zellen vorhanden waren (94,2 %; Abb. 7c, d). Analyse der Split-Reads an den Haltepunkten der SV-Nr. 2 und 3, das heißt die Kanten der 6-kb-Deletion, und die Abdeckung dieser Deletion in einzelnen Zellen deuteten auf das Vorhandensein von drei verschiedenen subklonalen Zellpopulationen hin, die wir Subklon Nr. nannten. 1–3. Klon Nr. 1 enthielt eine intakte ecDNA ohne Deletionen. Klon Nr. 2 enthielt eine gemischte Population von ecDNAs mit und ohne Deletionen (Abb. 7b – e). Im Klon Nr. Wie in 3 gezeigt, deuteten die erkannten SVs und die Sequenzierungsabdeckung auf das Vorhandensein einer reinen Population von ecDNAs hin, die sowohl Deletionen als auch alle SVs enthielten (Abb. 7c – e). Die einfachste Abfolge von Mutationsereignissen, die zu der beobachteten interzellulären strukturellen ecDNA-Heterogenität führen würden, beginnt mit einem einfachen Ausschneiden einer ecDNA, die MYCN und benachbarte chromosomale Regionen enthält, d. h. SV Nr. 1, die die ecDNA-Variante Nr. erzeugt. 1 gefunden in Klon Nr. 1 (Abb. 7e,f). Anschließend erfolgt die Fusion zweier einfacher ecDNA Nr. 1 Varianten, die eine komplexere neu angeordnete ecDNA-Variante Nr. erzeugen. 2, die die kleine 6-kb-Deletion und SV-Nr. enthält. 2 und 3 zusätzlich zu SV-Nr. 1 (Abb. 7e,f). Eine solche zirkuläre Rekombination steht im Einklang mit neueren Modellen, die auf WGS43 basieren. Eine zusätzliche große Deletion auf dieser ecDNA würde die ecDNA-Variante 3 mit allen SV-Nummern erzeugen. 1–4 und beide Löschungen (Abb. 7e, f). Das Vorherrschen der ecDNA-Variante 3 in diesen Neuroblastomzellen lässt darauf schließen, dass sie einen positiven Selektionsvorteil mit sich bringen könnte. Unsere Proof-of-Principle-Demonstration, dass scEC&T-seq dabei helfen kann, auf die strukturelle Dynamik von ecDNA zu schließen, zeigt, dass scEC&T-seq zukünftige Studien erleichtern kann, die wichtige offene Fragen zum Ursprung und zur Entwicklung von ecDNA beantworten.

a, Long-Read-basierte ecDNA-Rekonstruktionen, abgeleitet aus WGS-Daten in Massenpopulationen und Read-Abdeckung über die ecDNA-Fragmente über einzelne Kerne hinweg bei Patient Nr. 2 (n = 86 Kerne), nachgewiesen durch Long-Read- oder Short-Read-scEC&T-seq. Von oben nach unten: Rekonstruktion des ecDNA-Amplikons (die SVs auf ecDNAs sind gefärbt; SV-Nr. 1–4), Genanmerkung, Lesedichte über der ecDNA-Region in großen, lang gelesenen Nanoporen-WGS-Daten, Lesedichte über der ecDNA-Region in zusammengeführten Einzeldaten Kerne und Abdeckung über die ecDNA-Region in einzelnen Kernen (Zeilen), wie durch Long-Read- oder Short-Read-scEC&T-seq nachgewiesen. Die 6-kb-Löschung wird rot hervorgehoben. Das einzelne Sternchen gibt die nicht kartierbare Region des Referenzgenoms (hg19) an. b, Heatmap der Gesamtzahl der Lesevorgänge (logarithmisch skaliert) in einem 500-bp-Fenster über die identifizierte 6-kb-Deletion auf ecDNA über einzelne Kerne hinweg bei Patient Nr. 2 (n = 86 Kerne). c, Beispielhafte Genomspuren der drei identifizierten Klonvarianten bei Patient Nr. 2 basierend auf der Abwesenheit oder Anwesenheit der 6-kb-Deletion auf dem ecDNA-Element. Die logarithmisch skalierte Gesamtlesedichte wird in Blau und die Kreiskanten-unterstützende Lesedichte in Grau dargestellt. d, Nachweis von SV-Nr. 1–4, die das multifragmentierte ecDNA-Element in acht beispielhaften Einzelzellen unterstützen, die die drei identifizierten Klonvariantengruppen darstellen (≥1 Lesevorgang, der den SV unterstützt, grau; 0 Lesevorgang, der den SV unterstützt, weiß). e, Schematische Darstellung der in d nachgewiesenen ecDNA-Varianten 1–3. f, Schematische Interpretation der Entwicklung der ecDNA-Struktur bei Patient Nr. 2 basierend auf den identifizierten ecDNA-Varianten in den scEC&T-seq-Daten. Die Position des MYCN-Onkogens und seiner lokalen Enhancer-Elemente (e1–e5), angezeigt durch die einzelnen Sternchen, in jeder ecDNA-Variante wird angezeigt.

Regulatorische Elemente werden üblicherweise auf ecDNA amplifiziert, spielen eine wesentliche Rolle bei der Transkriptionsregulation von Onkogenen auf ecDNA und unterliegen vermutlich einer starken positiven Selektion28,29. Tatsächlich wurde mindestens eines der kürzlich beschriebenen MYCN-spezifischen Enhancer-Elemente28,29 wiederholt auf ecDNAs nachgewiesen, die MYCN in über 82,7 % der Neuroblastom-Einzelzellen enthielten (Abb. 7f und ergänzende Abb. 18a). Interessanterweise wurde die bei Patient Nr. festgestellte Löschung festgestellt. 2, also ecDNA-Variante 3, wird voraussichtlich zum Verlust einer von zwei MYCN-Genkopien führen, einschließlich der regulatorischen Elemente e2 und e3, die auf ecDNA-Variante 2 vorhanden sind (Abb. 7f). Dies erhöht die Möglichkeit, dass die Änderung der Enhancer:Onkogen-Stöchiometrie (6:1 in Variante 3 gegenüber 8:2 in Variante 2), d. h. das Vorhandensein von einer statt zwei Onkogenkopien auf einer ecDNA, für die Onkogenexpression von Vorteil sein könnte weil es möglicherweise eine effizientere Nutzung von Enhancern auf der ecDNA ermöglicht. Solche Mechanismen könnten das beobachtete Vorherrschen der ecDNA-Variante Nr. erklären. 3 in der Tumorzellpopulation.

Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass ecDNAs, die keine Onkogene enthalten, aber Enhancer-Elemente enthalten, existieren und die Transkriptionsleistung auf linearen Chromosomen oder auf anderen ecDNAs in trans als Teil von ecDNA-Hubs verbessern können17,23. Um solche ecDNA-Elemente zu identifizieren, analysierten wir H3K4me1-, H3K27ac-, H3K27me3-ChIP-seq- und ATAC-seq-Daten von Neuroblastomzellen und suchten nach ecDNAs, die diese Regionen enthalten, aber keine Onkogene enthalten. In einzelnen Neuroblastomzellen wurde wiederholt keine ecDNA identifiziert, die nur Enhancer-Elemente enthielt. Alle wiederkehrend nachgewiesenen ecDNAs enthielten mindestens ein Onkogen. Es wurde jedoch eine große Menge nicht wiederkehrender kleiner zirkulärer DNAs identifiziert, die nur Genomregionen mit regulatorischen Elementen enthielten (ergänzende Abbildung 18b). Das Fehlen eines Wiederauftretens dieser zirkulären DNA-Elemente lässt jedoch darauf schließen, dass sie in diesen Krebszellen nicht erhalten bleiben oder keine positiven Selektionsvorteile mit sich bringen. Somit ermöglicht scEC&T-seq den Nachweis nichtkodierender zirkulärer DNAs und ermöglicht zukünftige Untersuchungen ihrer Rolle bei der Transkriptionsregulation bei Krebs.

Wir haben gezeigt, dass scEC&T-seq durch parallele Sequenzierung von zirkulärer DNA und mRNA aus einzelnen Krebszellen nicht nur leicht die transkriptionellen Konsequenzen der ecDNA-gesteuerten Heterogenität der interzellulären Onkogen-Kopienzahl unterscheidet, sondern auch das Potenzial hat, Prinzipien der strukturellen Evolution von ecDNA aufzudecken. Wir glauben, dass die integrierte Analyse des zirkulären DNA-Gehalts und des Transkriptoms einer Zelle durch scEC&T-seq ein umfassenderes Verständnis des Ausmaßes, der Funktion, der Heterogenität und der Entwicklung zirkulärer DNAs bei Krebs und darüber hinaus ermöglichen wird.

scEC&T-seq ergänzt kürzlich veröffentlichte Methoden zur Einzelzell-DNA- und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)23,27, die lineare intra- von extrachromosomalen zirkulären Amplifikaten nicht ohne weiteres unterscheiden können. Obwohl scEC&T-seq mit der Automatisierung kompatibel ist, ermöglichen die aufwändigen Verfahren zur zirkulären DNA-Anreicherung nur einen geringen Durchsatz, was die Kosten pro Zelle in die Höhe treibt und derzeit eine Einschränkung dieser Methode darstellt. Im Vergleich zu tröpfchenbasierten mikrofluidischen Einzelzelltechnologien generiert die plattenbasierte scEC&T-seq jedoch eine einheitliche Anzahl von Lesevorgängen pro Zelle und erzeugt unabhängige Sequenzierungsbibliotheken, die für die Auswahl und Neusequenzierung verfügbar sind, was von Vorteil ist, wenn eine hohe Sequenzierungsabdeckung erforderlich ist. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass scEC&T mit verschiedenen Sequenzierungstechnologien kombiniert werden kann. Der Detaillierungsgrad von scEC&T-seq geht weit über den von Hochdurchsatzmethoden hinaus. Die Kombination unserer Methode mit anderen Einzelzelltechnologien, zum Beispiel Strand-seq44, und Verarbeitungsansätzen, zum Beispiel der Einzelzell-Tri-Channel-Verarbeitung45, kann das Spektrum der von scEC&T-seq erkannten somatischen Variationen erhöhen.

Durch die Durchführung von scEC&T-seq in einzelnen Krebszellen konnten wir deren zirkulären DNA-Gehalt unabhängig von der Kopienzahl und der zirkulären DNA-Größe profilieren. In lebenden Einzelzellen wurden kleine zirkuläre DNAs identifiziert, was darauf hindeutet, dass Apoptose nicht der einzige Mechanismus ihrer Entstehung ist. Während onkogenhaltige ecDNAs klonal in einzelnen Zellen vorhanden waren, waren kleine zirkuläre DNAs ausschließlich in einzelnen Zellen vorhanden. Dies weist nicht nur darauf hin, dass kleine zirkuläre DNAs Krebszellen wahrscheinlich keinen Selektionsvorteil verschaffen, sondern legt auch die Existenz noch unbekannter Voraussetzungen für die Selektion, Vermehrung und Aufrechterhaltung dieser zirkulären DNAs nahe.

Der überzeugende Nachweis der Integration zirkulärer DNA- und mRNA-Sequenzierung in einzelnen Krebszellen zeigt, dass der gleiche Ansatz auf eine Vielzahl biologischer Systeme angewendet werden kann, um die Diversität und Invarianz zirkulärer DNA in einzelnen Zellen weiter zu untersuchen. Daher gehen wir davon aus, dass unsere Methode eine Ressource für zukünftige Forschungen in vielen Bereichen über die Krebsbiologie hinaus sein wird, und gehen davon aus, dass sie das Potenzial hat, viele derzeit ungelöste biologische Fragen zur zirkulären DNA zu beantworten.

Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll von scEC&T-seq ist auf Nature Protocol Exchange46 verfügbar und wird unten beschrieben. Die Dauer des Protokolls beträgt etwa 8 Tage pro 96-Well-Platte.

Menschliche Tumorzelllinien wurden von ATCC (CHP-212) erhalten oder von JJ Molenaar (TR14; Princess Máxima Center for Pediatric Oncology) bereitgestellt. Die Identität aller Zelllinien wurde durch Short-Tandem-Repeat-Genotypisierung (Genetica DNA Laboratories und IDEXX BioResearch) verifiziert; Fehlen von Mycoplasma spp. Die Kontamination wurde mit einem Lonza MycoAlert Detection System bestimmt. Zelllinien wurden in Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 1 % Penicillin, Streptomycin und 10 % FCS, kultiviert. Um die Anzahl lebensfähiger Zellen zu bestimmen, wurden die Zellen trypsiniert (Gibco), in Medium resuspendiert und 5 Minuten lang bei 500 g sedimentiert. Anschließend wurden die Zellen im Medium resuspendiert, im Verhältnis 1:1 mit 0,02 % Trypanblau (Thermo Fisher Scientific) gemischt und mit einem TC20-Zellzähler (Bio-Rad Laboratories) gezählt.

Die Zellen wurden in einer 15-cm-Schale bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet und durch Zugabe von KaryoMAX Colcemid (10 µl ml−1, Gibco) für 1–2 Stunden in der Metaphase arretiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, trypsiniert (Gibco) und 10 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Wir fügten 10 ml 0,075 M KCl hinzu, vorgewärmt auf 37 °C, jeweils 1 ml, und rührten dazwischen mit maximaler Geschwindigkeit. Anschließend wurden die Zellen 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 5 ml eiskalte 3:1 MeOH:Essigsäure (aufbewahrt bei –20 °C) zugegeben, jeweils 1 ml, gefolgt von einer Resuspension der Zellen durch Schwenken des Röhrchens. Die Probe wurde 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Die Zugabe des Fixiermittels und die anschließende Zentrifugation wurden viermal wiederholt. Zwei Tropfen Zellen in 200 µl MeOH:Essigsäure wurden aus einer Höhe von 15 cm auf vorgewärmte Objektträger getropft. Die Objektträger wurden über Nacht inkubiert.

Die Objektträger wurden 10 Minuten lang bei –20 °C in MeOH:Essigsäure fixiert und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden in Pepsinlösung (0,001 N HCl) unter Zusatz von 10 µl Pepsin (1 g 50 ml−1) 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Objektträger wurden 5 Minuten lang in 0,5-fachem Kochsalzlösung-Natriumcitrat-Puffer (SSC) gewaschen und durch 3-minütiges Waschen in 70 %, 90 % und 100 % kaltem Ethanol (bei –20 °C gelagert) dehydriert. Getrocknete Objektträger wurden mit 10 µl Vysis LSI N-MYC SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probes (Abbott), ZytoLight SPEC CDK4/CEN 12 Dual Color Probe (ZytoVision) oder ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12 Dual Color Probe (ZytoVision) gefärbt und mit bedeckt auf ein Deckglas gelegt und mit Gummizement versiegelt. Die Denaturierung erfolgte in einem ThermoBrite-System (Abbott) für 5 Minuten bei 72 °C, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 37 °C. Die Objektträger wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC/0,1 % IGEPAL gewaschen, gefolgt von 3 Minuten bei 60 °C in 0,4 × SSC/0,3 % IGEPAL (Sigma-Aldrich) und einem zusätzlichen Waschgang in 2 × SSC/0,1 % IGEPAL für 3 Min. bei Raumtemperatur. Getrocknete Objektträger wurden 10 Minuten lang mit 12 µl Hoechst 33342 (10 µM, Thermo Fisher Scientific) gefärbt und 5 Minuten lang mit PBS gewaschen. Nach dem Trocknen wurde ein Deckglas auf den Objektträger montiert und mit Nagellack versiegelt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Leica SP5-Mikroskop (Leica Microsystems) aufgenommen.

CHP-212- und TR14-Zellen für die Interphase-FISH wurden in 8-Kammer-Objektträgern (Nunc Lab-Tek, Thermo Scientific Scientific) bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet. Die Vertiefungen wurden 20 Minuten lang bei –20 °C in MeOH:Essigsäure fixiert und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS gewaschen. Die Vertiefungen wurden entfernt und die Objektträger wurden in Pepsinlösung (0,001 N HCl) unter Zugabe von 10 µl Pepsin (1 g 50 ml−1) bei 37 °C 10 Minuten lang verdaut. Nach einem 5-minütigen Waschen in 0,5 × SSC wurden die Objektträger durch Waschen in 70 %, 90 % und 100 % kaltem Ethanol, gelagert bei –20 °C, dehydriert (3 Minuten in jeder Lösung). Getrocknete Objektträger wurden entweder mit 5 µl Vysis LSI N-MYC SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probes, ZytoLight SPEC CDK4/CEN 12 Dual Color Probe oder ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12 Dual Color Probe gefärbt, mit einem Deckglas abgedeckt und mit Gummizement versiegelt . Die Denaturierung erfolgte in einem ThermoBrite-System für 5 Minuten bei 72 °C, gefolgt von 37 °C über Nacht. Die Objektträger wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC/0,1 % IGEPAL gewaschen, gefolgt von 3 Minuten bei 60 °C in 0,4 × SSC/0,3 % IGEPAL und weiteren 3 Minuten in 2 × SSC/0,1 % IGEPAL bei Raumtemperatur . Getrocknete Objektträger wurden 10 Minuten lang mit 12 µl Hoechst 33342 (10 µM) gefärbt und 5 Minuten lang mit PBS gewaschen. Nach dem Trocknen wurde ein Deckglas auf den Objektträger montiert und mit Nagellack versiegelt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Leica SP5-Mikroskop aufgenommen. Zur Schätzung der Anzahl der ecDNA-Kopien haben wir die Herde mithilfe von FIJI v.2.1.0 mit der Funktion „Maxima finden“ gezählt. Nukleare Grenzen wurden als interessierende Regionen markiert. Der Schwellenwert für die Signalerkennung innerhalb der interessierenden Regionen wurde manuell bestimmt und für alle analysierten Bilder innerhalb einer Gruppe verwendet.

Diese Studie umfasst Tumor- und Blutproben von Patienten, bei denen zwischen 1991 und 2022 ein Neuroblastom diagnostiziert wurde. Die Patienten wurden gemäß den Studienprotokollen der Deutschen Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie (GPOH) registriert und behandelt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration des Weltärztebundes von Helsinki (Version 2013) und der guten klinischen Praxis durchgeführt; Die Einverständniserklärung aller Patienten oder ihrer Erziehungsberechtigten wurde eingeholt. Die Entnahme und Verwendung von Patientenproben wurde von den Fachkollegien der Charité-Universitätsmedizin Berlin und der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln genehmigt. Proben und klinische Daten wurden von der Charité-Universitätsmedizin Berlin oder der Nationalen Neuroblastom-Biobank und dem Neuroblastom-Studienregister (Universitäts-Kinderklinik Köln) des GPOH archiviert und zur Verfügung gestellt. Die MYCN-Kopienzahl wurde mittels FISH bestimmt. Tumorproben wiesen nach Beurteilung durch einen Pathologen einen Tumorzellgehalt von mindestens 60 % auf.

Gewebeproben wurden unter Verwendung eines vorgekühlten Glas-Dounce-Gewebehomogenisators (Katalog-Nr. 357538, Wheaton) in 1 ml eiskaltem EZ PREP-Puffer (Sigma-Aldrich) homogenisiert. Zur Gewebehomogenisierung wurden zehn Hübe mit einem losen Stößel gefolgt von fünf weiteren Hüben mit einem festen Stößel verwendet. Um die durch Reibung entstehende Hitze zu reduzieren, wurde der Doouncer während der Homogenisierung stets auf Eis gehalten. Das Homogenat wurde durch ein Falcon-Röhrchen (Becton Dickinson) mit einer 35-µm-Zellsiebkappe filtriert. Die Anzahl der intakten Kerne wurde durch Färben und Zählen mit 0,02 % Trypanblau (Thermo Fisher Scientific), gemischt im Verhältnis 1:1, geschätzt.

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Plaque PLUS (Cytiva) isoliert. Vollblutproben wurden 1:1 in kalziumfreiem PBS resuspendiert und langsam zu 12 ml Ficoll-Plaque PLUS gegeben. Die Probe wurde 30 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, ohne zu zerbrechen. Die obere Schicht der PBMCs wurde isoliert und in 40 ml PBS gewaschen. PBMCs wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 g gesammelt und in 10 % Dimethylsulfoxid in FCS resuspendiert. Die PBMC-Suspensionen wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Zur Einzelzellsortierung wurden 1–10 Millionen Neuroblastomzellen oder PBMCs mit Propidiumiodid (PI) (Thermo Fisher Scientific) in 1 × PBS gefärbt; Lebensfähige Zellen wurden basierend auf Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften und PI-Färbung ausgewählt. PBMC-Suspensionen wurden zusätzlich mit einer 1:400-Verdünnung von Anti-Human-CD3 (Ax700, BioLegend) angefärbt. Kernsuspensionen wurden mit DAPI (Endkonzentration 2 μM, Thermo Fisher Scientific) gefärbt. Lebensfähige Zellen, CD3+-PBMCS- oder DAPI+-Kerne wurden mit einem FACSAria Fusion Flow Cytometer (BD Biosciences) in 2,5 μl RLT Plus-Puffer (QIAGEN) in 96-Well-Platten mit geringer Bindung (4titude) sortiert, mit Folie versiegelt (4titude) und bei gelagert −80 °C bis zur Verarbeitung.

Die physikalische Trennung von genomischer DNA (gDNA) und mRNA wurde wie zuvor im G&T-seq-Protokoll von Macaulay et al.27 beschrieben durchgeführt. Alle Proben wurden mit einer Biomek FXP Laboratory Automation Workstation (Beckman Coulter) verarbeitet. Kurz gesagt, polyadenylierte mRNA wurde unter Verwendung eines modifizierten Oligo-dT-Primers (Ergänzungstabelle 7) eingefangen, der an Streptavidin-gekoppelte Magnetkügelchen (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Katalog-Nr. 65001, Invitrogen) konjugiert war. Die konjugierten Perlen wurden direkt zum Zelllysat gegeben (10 μl) und 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen bei 800 U/min (MixMate, Eppendorf) inkubiert. Mithilfe eines Magneten (Alpaqua) wurde die eingefangene mRNA vom Überstand mit der gDNA getrennt. Der gDNA-haltige Überstand wurde auf eine neue 96-Well-Platte (4titude) übertragen; Die mit mRNA eingefangenen Perlen wurden dreimal bei Raumtemperatur in 200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,05 % Tween 20 und 0,2 × RNase-Inhibitor gewaschen (SUPERase•In, Thermo Fisher Scientific). Für jeden Waschschritt wurden die Perlen 5 Minuten lang bei 2.000 U/min in einem MixTape (Eppendorf) gemischt. Der Überstand wurde nach jedem Waschen gesammelt und mit den gleichen Spitzen mit dem ursprünglichen Überstand gepoolt, um den DNA-Verlust zu minimieren.

Die auf den Perlen eingefangene mRNA wurde in 10 μl eines Reverse-Transkriptions-Mastermixes eluiert, der 10 U μl-1 SuperScript II Reverse Transkriptase (Thermo Fisher Scientific), 1 U μl-1 RNase-Inhibitor und 1 × Superscript II-Erststrangpuffer enthielt (Thermo Fisher Scientific), 2,5 mM DTT (Thermo Fisher Scientific), 1 M Betain (Sigma-Aldrich), 6 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific), 1 μM Template-Switching-Oligo (Ergänzungstabelle 7), Desoxynukleosidtriphosphat-Mischung (1 jeweils mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) (Thermo Fisher Scientific) und nukleasefreies Wasser (Thermo Fisher Scientific) bis zum Endvolumen (10 μl). Die reverse Transkription wurde auf einem Thermocycler 60 Minuten lang bei 42 °C durchgeführt, gefolgt von 10 Zyklen von 2 Minuten bei 50 °C und 2 Minuten bei 42 °C und endete mit einer 10-minütigen Inkubation bei 60 °C. Die Amplifikation komplementärer DNA (cDNA) durch PCR wurde unmittelbar nach der reversen Transkription durchgeführt, indem 12 μl PCR-Mastermix, einschließlich 1 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix mit 0,1 μM ISPCR-Primer (10 mM; Ergänzungstabelle 7), direkt zu den 10 μl hinzugefügt wurden Reverse-Transkriptions-Reaktionsmischung. Die Reaktion wurde auf einem Thermocycler für sieben Zyklen wie folgt durchgeführt: 3 Minuten bei 98 °C, dann 18 Zyklen mit 15 Sekunden bei 98 °C, 20 Sekunden bei 67 °C, 6 Minuten bei 72 °C und schließlich 72 °C 5 Minuten. Die amplifizierte cDNA wurde unter Verwendung eines Volumenverhältnisses von Ampure Beads (Beckman Coulter) von 1:0,9 gereinigt und in 20 μl Elutionspuffer (Buffer EB, QIAGEN) eluiert.

Die isolierte DNA wurde unter Verwendung eines Volumenverhältnisses von Ampure Beads von 1:0,8 gereinigt. Die Probe wurde mit den Perlen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Mischen bei 800 U/min (MixMate) inkubiert. Die Isolierung zirkulärer DNA wurde wie zuvor beschrieben in Massenpopulationen durchgeführt3,25. Kurz gesagt, die DNA wurde von den Perlen direkt in einen Exonuklease-Verdau-Mastermix (20 Einheiten plasmidsicherer ATP-abhängiger DNase (Epizentrum), 1 mM ATP (Epizentrum), 1 × plasmidsicherer Reaktionspuffer (Epizentrum)) eluiert eine 96-Well-Platte. Einer Untergruppe von Proben wurde 1 μl der Endonuklease MssI/PmeI (20 U μl, New England Biolabs) zugesetzt. Der Verdau linearer DNA wurde 1 oder 5 Tage lang bei 37 °C mit 10 U Plasmid-Safe DNase und 4 μl ATP (25 mM) durchgeführt, das alle 24 Stunden erneut zugegeben wurde, um den enzymatischen Verdau fortzusetzen. Nach 1 oder 5 Tagen enzymatischer Verdauung wurde die Exonuklease durch 30-minütige Inkubation bei 70 °C hitzeinaktiviert. Die Exonuklease-resistente DNA wurde mit dem REPLIg Single-Cell Kit (QIAGEN) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und amplifiziert. Für diesen Reinigungsschritt wurden 32 μl Polyethylenglykolpuffer (18 % (w/v) (Sigma-Aldrich), 25 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,05 % Tween 20) hinzugefügt. gemischt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Perlen zweimal mit 80 %igem Ethanol gewaschen und die Exonuklease-resistente DNA wurde direkt in die Reaktionsmischung eluiert und durch Mehrfachverdrängungsamplifikation mit einem REPLIg Single-Cell Kit (QIAGEN) durchgeführt. Amplifizierte zirkuläre DNA wurde unter Verwendung eines Volumenverhältnisses von Ampure Beads von 1:0,8 gereinigt und in 100 μl Elutionspuffer (Buffer EB, QIAGEN) eluiert.

Insgesamt 20 ng amplifizierte cDNA oder zirkuläre DNA wurden für die Bibliotheksvorbereitung unter Verwendung des NEBNext Ultra II FS (New England Biolabs) gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Die Proben wurden unter Verwendung einzigartiger Dual-Index-Primerpaare (New England Biolabs) mit einem Barcode versehen und die Bibliotheken wurden gepoolt und auf einem HiSeq 4000-Instrument (Illumina) oder einem NovaSeq 6000-Instrument mit 2 × 150-bp-Paired-End-Reads für zirkuläre DNA-Bibliotheken und 2 sequenziert × 75-bp-Paired-End-Reads für cDNA-Bibliotheken.

Sequenzierte Reads aus den gDNA-Bibliotheken wurden mit TrimGalore (v.0.6.4)47 gekürzt und dem menschlichen Genom Build 19 (GRCh37/hg19) zugeordnet. Die Ausrichtung wurde mit dem Burrows-Wheeler Aligner (BWA)-MEM (v.0.7.17)48 durchgeführt. Gemäß der Empfehlung des Human Cell Atlas-Projekts49 (v.2.2.1)50 wurden die von Smart-seq2 (Ref. 26) erhaltenen RNA-seq-Daten mit einer Transkriptomreferenz abgeglichen, die aus der hg19- und ENCODE-Annotation v.19 erstellt wurde (Lit. 51). Anschließend wurden Gene und Isoformen zuvor mit rsem (v.1.3.1)52 mit einer einzelnen Zelle quantifiziert.

Vor der Nanopore-Sequenzierung wurde die amplifizierte zirkuläre DNA aus einzelnen Zellen einem T7-Endonuklease-Verdau unterzogen, um die DNA-Verzweigung zu reduzieren. Anschließend wurden 1,5 µg amplifizierte zirkuläre DNA 30 Minuten lang bei 37 °C mit 1,5 µl T7-Endonuklease I (10 U µl−1, New England Biolabs) in 3 µl NEBuffer 2 und nukleasefreiem Wasser bis zum Endvolumen inkubiert von 30 µl. Die mit Endonuklease verdaute DNA wurde unter Verwendung eines Volumenverhältnisses von Ampure Beads von 1:0,7 gereinigt und in 25 µl nukleasefreiem Wasser eluiert. Bibliotheken wurden mit dem ONT Rapid Barcoding Kit (Katalog-Nr. SQK-RBK004, Oxford Nanopore Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und auf einer R9.4.1 MinION-Durchflusszelle (FLO-MIN106, Oxford Nanopore Technologies) sequenziert. Pro Lauf wurden maximal vier Proben gemultiplext.

Die scCircle-seq Nanopore-Daten wurden mit Guppy (v.5.0.14; Ausführung von guppy_basecaller mit dna_r9.4.1_450bps_hac-Modell und guppy_barcoder mit FLO-MIN106 und Standardparametern) base-aufgerufen und demultiplext. Die erhaltenen Lesevorgänge wurden mit NanoFilt53 (v.2.8.0) qualitätsgefiltert (-l 100 – headcrop 50 – tailcrop 50) und mit ngmlr54 (v.0.2.7) gegen das GRCh37/hg19-Referenzgenom abgeglichen. Um SVs aufzurufen, haben wir Sniffles54 (v.1.0.12) (--min_homo_af 0.7--min_het_af 0.1--min_length 50--min_support 4) angewendet. Um die gruppierte Abdeckung zu erhalten, haben wir deepTools55 (v.3.5.1) bamCoverage verwendet. Alle diese Schritte sind als Snakemake-Pipeline verfügbar (https://github.com/henssen-lab/nano-wgs).

Circle-seq in Massenpopulationen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt3. Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll finden Sie auf dem Nature Protocol Exchange-Server.

Wir haben H3K27me3-ChIP-seq-Daten für CHP-212 gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll generiert28. Kurz gesagt, 5–10 Millionen CHP-212-Zellen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10 % FCS-PBS mit 1 % Paraformaldehyd fixiert. Chromatin wurde wie zuvor beschrieben28 hergestellt und bis zu einer Fragmentgröße von 200–500 bp geschert. H3K27me3-DNA-Komplexe wurden 15 Stunden lang bei 4 ° C mit einem polyklonalen Anti-H3K27me3-Antikörper (Katalog-Nr. 07-449, Sigma-Aldrich) immunpräzipitiert. Insgesamt wurden 10–15 μg Chromatin und 2,5 μg Antikörper für die Immunpräzipitation verwendet. Bibliotheken für die Sequenzierung wurden mit Illumina Nextera-Adaptern gemäß den bereitgestellten Empfehlungen vorbereitet. Bibliotheken wurden im 50-bp-Single-Read-Modus in einem Illumina HiSeq 4000-Sequenzer sequenziert. FASTQ-Dateien wurden mit FASTQC (v.0.11.8) qualitätskontrolliert und Adapter wurden mit BBMap (v.38.58) zugeschnitten. Die Lesevorgänge wurden mithilfe des BWA-MEM48 (v.0.7.15) mit Standardparametern auf hg19 ausgerichtet. Doppelte Lesevorgänge wurden mit Picard (v.2.20.4) entfernt.

Wir haben öffentliche CHP-212-Kopienzahlvariationen, ChIP-seq- (H3K27ac, H3K4me1, CTCF) und ATAC-seq-Daten erhalten28,56. Für die weitere Analyse verwendeten wir die verarbeiteten Bigwig-Tracks, gefiltert, um Regionen auszuschließen, die auf der schwarzen Liste des ENCODE Data Analysis Center (DAC) standen, und normalisierten sie auf Read Counts per Million (CPM) in 10-bp-Bins sowie Peak Calls von Helmsauer et al.28. Um die Korrelation epigenetischer Markierungen mit Kreisregionen zu beurteilen, haben wir nur Kreisregionen berücksichtigt, die sich nicht mit der Variation der Kopienzahl in Regionen überschneiden, die auf der schwarzen Liste von CHP-212 oder ENCODE DAC stehen. Für H3K27ac-, H3K4me1- und H3K27me3-ChIP-seq- und ATAC-seq-Daten haben wir das mittlere CPM-Signal über alle Kreisregionen berechnet, gewichtet mit den jeweiligen Kreisgrößen. Um die statistische Assoziation zu testen, haben wir 1.000 Datensätze mit randomisierten Kreispositionen innerhalb eines Genoms erstellt, das für Variationen der Kopienzahl in Regionen, die auf der schwarzen Liste von CHP-212 und ENCODE DAC stehen, maskiert wurde, unter Verwendung von regioneR57 (v.1.24.0). Wir haben einen empirischen P-Wert aus der Verteilung des mittleren CPM-Signals über die randomisierten Kreisregionen abgeleitet. Für CTCF-ChIP-seq-Daten haben wir den Prozentsatz der Kreiskanten berechnet, die sich mit einem CTCF-Peak überlappen, und die statistische Signifikanz mithilfe derselben Randomisierungsstrategie wie oben beschrieben bewertet.

Die extrachromosomale zirkuläre DNA-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt3. Die Lesevorgänge wurden sowohl hinsichtlich der Qualität als auch der Adaptersequenzen um 3′ gekürzt, wobei die Lesevorgänge entfernt wurden, wenn die Länge weniger als 20 Nukleotide betrug. BWA-MEM (v.0.7.15) mit Standardparametern wurde verwendet, um die Lesevorgänge an der menschlichen Referenzbaugruppe GRCh37/hg19 auszurichten; PCR und optische Duplikate wurden mit Picard (v.2.16.0) entfernt. Mutmaßliche Kreise wurden mit einem zweistufigen Verfahren klassifiziert. Zunächst wurden alle geteilten Lesevorgänge und Lesepaare mit einer nach außen gerichteten Leseausrichtung in einer neuen BAM-Datei abgelegt. Zweitens wurden in der BAM-Datei „Alle Lesevorgänge“ mithilfe von Fenstern mit variabler Breite von Homer v.4.11 findPeaks (http://homer.ucsd.edu/) Regionen erkannt, die für Signal über Hintergrund angereichert waren und eine falsche Entdeckungsrate < 0,001 hatten. Die Kanten dieser angereicherten Regionen wurden mit den kreisunterstützenden Lesevorgängen geschnitten. Der Schwellenwert für die Zirkelerkennung wurde dann empirisch anhand eines Positivkontrollsatzes zirkulärer DNAs aus Massensequenzierungsdaten bestimmt. Als kreisförmige Regionen wurden nur angereicherte Regionen klassifiziert, die von mindestens zwei kreisunterstützenden Lesevorgängen durchschnitten wurden.

Um eine ausreichende Anreicherung zirkulärer DNA zu bewerten, verwendeten wir die Abdeckung über mtDNA als interne Kontrolle. Zellen mit weniger als zehn Lesevorgängen pro Basenpaar-Sequenzlesetiefe über mtDNA oder weniger als 85 % der in mtDNA erfassten genomischen Basen wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Cutoff-Werte wurden basierend auf den maximalen Lesetiefenwerten ausgewählt, die in Endonukleasekontrollen ermittelt wurden (mit PmeI; ergänzende Abbildung 1c). Für alle nachgelagerten Analysen haben wir nur Sequenzierungsdaten von Zellen berücksichtigt, die 5 Tage lang mit Exonuklease verdaut wurden. Da mtDNA nicht in Kernen vorhanden ist, haben wir Einzelkern-Circle-seq-Daten nur auf der Grundlage der RNA-Qualitätskontrolle gefiltert.

Lesezahlen aus mutmaßlichen Kreisen wurden mithilfe von Bedtools Multicov (https://bedtools.readthedocs.io) aus Einzelzell-BAM-Dateien in 100-kb-Bins über alle kanonischen Chromosomen der Genomassemblierung GRCh37/hg19 quantifiziert. Die Zählungen wurden auf die Sequenzierungstiefe in jeder Zelle normalisiert und jedes Bin wurde als positiv markiert, wenn es eine Kreis-Read-Anreicherung mit P < 0,05 im Vergleich zur Hintergrund-Read-Verteilung aufwies. Die Bins wurden dann anhand der genomischen Koordinaten in drei Gruppen eingeteilt: (1) ecDNA, wenn die Region das aus den Massensequenzierungsdaten zusammengestellte Amplifikat überlappte; (2) chM; und (3) alle anderen Websites. Anschließend wurde das Wiederauftreten analysiert, indem in jeder der drei Kategorien der Anteil der Zellen aufgezeichnet wurde, die einen erkannten Kreis enthielten.

Referenzphasen wurden verwendet, um jeden SNP basierend auf Massen-WGS-Daten einem der beiden Allele zuzuordnen. Anschließend wurden einzelne Zellen genotypisiert, um zu vergleichen, ob in allen das gleiche Allel gewonnen wurde. Für diese Analyse verwendeten wir die bekannten SNPs, die vom 1000 Genomes Project58 identifiziert wurden, und extrahierten Abdeckung und Nukleotidzahlen für jede annotierte Position. In Regionen mit allelischem Ungleichgewicht, wie den hohen Kopienzahlzuwächsen an ecDNA-Loci, unterscheidet sich die B-Allelfrequenz eines heterozygoten SNP deutlich von 0,5. Daher könnten wir jeden SNP in diesen Regionen entweder dem gewonnenen oder dem nicht gewonnenen Allel zuordnen. Anschließend haben wir auch alle einzelnen Zellen an jedem bekannten SNP-Standort genotypisiert und die resultierenden B-Allel-Häufigkeitswerte visualisiert, während wir die Allelzuordnung aus den WGS-Massendaten beibehalten haben.

Die durchschnittliche Abdeckung aller annotierten Gene wurde berechnet und die Gene wurden in Amplikon- und Nicht-Amplikon-Gene aufgeteilt, basierend darauf, ob ihre genomische Position mit den identifizierten ecDNA-Regionen pro Zelle überlappte. Die Abdeckung aller Amplikon-Gene wurde durch die Hintergrundabdeckung normalisiert, d. h. die winsorisierte mittlere Abdeckung aller Nicht-Amplikon-Gene. Es wurde ein Winsor-Mittelwert gewählt, um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass die Identifizierung von ecDNA-Regionen möglicherweise unvollständig war; Daher wurden die oberen und unteren 5 % der Werte aus der Hintergrundabdeckung entfernt. Die resultierenden Werte wurden log2-transformiert und als Proxy für die ecDNA-Kopienzahl verwendet.

Der SV-Aufruf für scCircle-seq wurde mit lumpy-sv55 (v.0.2.14) und SvABA (v.1.1.0) durchgeführt. Unseres Wissens ist kein dedizierter SV-Caller für Einzelzell-DNA-Daten verfügbar. Aufgrund der hohen Kopienzahl der ecDNA funktionieren jedoch Bulk-Methoden.

SAMtools59 (v.1.11) wurde verwendet, um alle Alignment-Dateien derselben Zelllinie in einem Pseudobulk-Alignment zusammenzuführen. Um eine Abdeckung zu erreichen, die näher an der Standard-Massensequenzierung liegt, wurde die resultierende BAM-Datei anschließend mithilfe von SAMtools auf 10 % ihrer ursprünglichen Größe heruntergerechnet. Die Identifizierung von SVs in WGS und zusammengeführten scCircle-seq-Daten für die Zelllinien TR14 und CHP-212 wurde mit lumpy-sv60 (v.0.3.1) und SvABA61 (v.1.1.0) durchgeführt, beide mit Standardparametern. Die Vorverarbeitung der BAM-Dateien, die die Filterung von Lesevorgängen geringerer Größe (<20 bp) und geringerer Qualität (MAPQ < 5) sowie die Unterstützung von Lesezahlen und VAF-Berechnungen umfasste, wurde mit SAMtools59 (v.1.10) durchgeführt. Alle Analyseschritte wurden unter Verwendung des GRCh37/hg19-Referenzgenoms durchgeführt. Die Identifizierung und Zählung der Lesevorgänge, die die SV-Breakpoints unterstützen, wurde unter Berücksichtigung geteilter und abnormal zugeordneter Lesevorgänge sowie dem Herausfiltern doppelter Lesevorgänge und sekundärer Alignments durchgeführt.

Um die Kompatibilität mit der Standardberichterstattung über mitochondriale Variationen62 sicherzustellen, wurde jede einzelne Zellsequenzierungsprobe mit BWA-MEM63 (v.0.7.17) auf GRCh37/hg19 mit einer ersetzten überarbeiteten mitochondrialen Referenzsequenz der Cambridge Reference Sequence (GenBank-Nr. NC_012920) ausgerichtet. Doppelte Lesevorgänge wurden mit Picard (v.2.23.8) entfernt. GATK4/Mutect264 (v.4.1.9.0) mit Standardparametern wurde verwendet, um Varianten im Gesamtgenom-Bulk und zusammengeführten scCircle-seq-Sequenzierungsdaten (Pseudobulk) aufzurufen. Nur Varianten auf kanonischen Chromosomen (einschließlich chrM) und vorbeigehenden GATK4/FilterMutectCalls wurden beibehalten und anschließend für die Regionen gefiltert, die zuvor für die jeweiligen Zelllinien rekonstruiert wurden (Abb. 3a), unter Verwendung des bcftools-Filters mit Flag-r.

Für die mitochondriale SNV-Identifizierung in einzelnen Zellen haben wir eine benutzerdefinierte Pipeline bestehend aus GATK4/Mutect2 (Ref. 64) (v.4.1.9.0) im Mitochondrienmodus und Mutserve65 (v.2.0.0-rc12), einem für optimierten Variantenaufrufer, angewendet Erkennen Sie heteroplasmatische Stellen in mitochondrialen Sequenzierungsdaten mit Standardparametern. Zunächst wurden Varianten von beiden Anrufern für jede einzelne Zelle separat aufgerufen. Anschließend wurden Varianten in einem zweistufigen Prozess gefiltert: (1) Varianten wurden nur beibehalten, wenn sie in mindestens zwei Stichproben vom selben Aufrufer aufgerufen wurden; und (2) verbleibende Varianten wurden nur beibehalten, wenn sie von beiden Anrufern aufgerufen wurden. Von Mutserve als „schwarze Liste“ gekennzeichnete Varianten wurden entfernt. Um die Allelhäufigkeit für jede Variante im endgültigen Satz abzuleiten, wurde jede einzelne Zelle dann einer Genotypisierung mit alleleCount (v.4.0.2) (https://github.com/cancerit/alleleCount) unterzogen. Es wurden nur Lesevorgänge beibehalten, die eindeutig der mitochondrialen Referenz zugeordnet sind und eine Zuordnungsqualität von ≥ 30 aufweisen. Für jedes sogenannte alternative Allel b an Position x wurde die Allelfrequenz (AF) wie folgt berechnet:

Die resultierende Einzelzellen-x-Varianten-AF-Matrix wurde manuell und separat für jede Zelllinie weiter gefiltert. Einzelzellen mit weniger als drei Varianten und Varianten mit einer maximalen Säulen-Allelfrequenz < 5 %, mittlerer AF (MAF) > 30 % und MAF < 0,1 % für CHP-212 sowie MAF > 30 % und MAF < 0,1 % für TR14 wurden für die Clusterbildung als nicht aussagekräftig erachtet und aufgrund von Stichproben entfernt.

Die Heatmap-Visualisierung der gefilterten Einzelzellen-x-Varianten-AF-Matrix wurde mit dem R-Paket ComplexHeatmap66 (v.2.6.2) generiert. Anschließend wurde hierarchisches Clustering auf die einzelnen Zellen mithilfe des R-Pakets hclust mit dem Agglomerationsmethodenparameter „complete“ angewendet. Phylogenetische Bäume wurden mit dem R-Paket dendextend (v.1.15.2) gerendert.

Die Mikrohomologieanalyse wurde mit NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mit den folgenden Parametern durchgeführt: blown -task megablast -word_size = 4 -evalue = 1 -outfmt '6 qseqid length evalue ' -subject_besthit -reward = 1 -penalty = -2. Diese Parameter streben nach einer Mikrohomologie-Mindestlänge von 4 bp und den standardmäßigen Belohnungs- und Strafwerten für Nukleotidübereinstimmung und -fehlpaarung. Darüber hinaus haben wir nur signifikante Ergebnisse mit einem Expect-Wert < 1 berücksichtigt. Um das Vorhandensein von Mikrohomologie um die zirkulären DNA-Verbindungen herum zu bewerten, haben wir Dateien erstellt, die 100 bp um den Anfang und das Ende des Kreises (50 bp innerhalb der zirkulären DNA und) umfassen 50 bp lineare DNA). Um diese Analyse durchführen zu können, haben wir alle Kreise mit einer Länge <100 bp herausgefiltert. Anschließend verglichen wir die Sequenzen für jedes Start- und Endpaar (ein Kreisknotenpunkt) und bewerteten und ermittelten mikrohomologe Sequenzen rund um den Kreisknotenpunkt. Diese Analyse wurde für jeden einzelnen Kreis in den Zelllinien CHP-212 und TR14 wiederholt.

Zellen und Kerne wurden in Seurat67 (v.4.10) geladen; Es wurden Merkmale einbezogen, die in mindestens drei Zellen erkannt wurden. Anschließend wurden Zellen mit 5.000 oder mehr Merkmalen in Zelllinien und 2.000 Merkmalen in T-Zellen und Kernen für die weitere Analyse ausgewählt. Zellen oder Kerne mit hoher Expression mitochondrialer Gene (>15 % in Einzelzellen und >2,5 % in Kernen) wurden ebenfalls ausgeschlossen. Die Daten wurden mit einem Skalierungsfaktor von 10.000 normalisiert und mit den Standardeinstellungen von ScaleData skaliert. Um die Genlänge und die Gesamtzahl der Lesevorgänge in jeder Zelle zu berücksichtigen, wurden die Smart-seq2-Daten unter Verwendung von Transkripten pro Million normalisiert; Anschließend wurde ein Pseudocount von eins hinzugefügt und eine Natural-Logarithmus-Transformation angewendet. Die ersten vier Hauptkomponenten waren von Bedeutung; Daher wurden die ersten fünf Hauptkomponenten für FindNeighbors und RunUMAP verwendet, um so viel Variation wie möglich zu erfassen, wie von den Seurat-Autoren empfohlen. Die Auflösung für FindClusters wurde auf 0,5 eingestellt.

Die Zellzyklusphase wurde einzelnen Zellen basierend auf der Expression von G2/M- und S-Phasenmarkern mithilfe der Seurat CellCycleScoring-Funktion zugeordnet.

Sehr kleine zirkuläre DNAs wurden als Kreise definiert, die kürzer als 3 kb sind. Um die relative Anzahl dieses Subtyps kleiner zirkulärer DNAs pro Zelle zu berechnen, wurde die Anzahl der <3 kb zirkulären DNAs durch die Gesamtzahl der Kreise in einer Zelle dividiert. Die Zellen wurden nach ihrer relativen Anzahl geordnet und nach den oberen und unteren 40 % der Rangliste gruppiert, die als „hoch“ bzw. „niedrig“ definiert sind. Die logarithmische Faltungsänderung der Genexpression zwischen den beiden Gruppen wurde mithilfe der FindMarkers-Funktion im Seurat R-Paket67 (v.4.10) ohne logarithmische Faltungsänderungsschwelle und einer minimalen Erkennungsrate pro Gen von 0,05 berechnet. Das R-Paket „clusterProfiler68“ (v.4.0.5) wurde verwendet, um eine unbeaufsichtigte GSEA von Begriffen der Genontologie unter Verwendung von gseGO durchzuführen und Gensätze mit mindestens drei Genen und maximal 800 Genen einzubeziehen.

Die Abdeckung der ecDNA-Amplikonregionen in den scCircle-seq- und scRNA-seq-BAM-Dateien wurde mit bamCoverage55 unter Verwendung der CPM-Normalisierung berechnet. Die Korrelation zwischen der Circle-seq- und der RNA-seq-Abdeckung wurde durch Anpassen eines linearen Modells analysiert.

Die Einzelzell-Paired-End-RNA-seq-FASTQ-Dateien wurden zusammengeführt (96 Zellen für TR14 und 192 Zellen für CHP-212). Die erhaltenen zusammengeführten Daten wurden mit STAR69 (v.2.7.9a) auf den Referenz-Köder GRCh37/hs37d5 abgeglichen, wobei die GENCODE 19-Genannotation verwendet wurde, was eine chimäre Ausrichtung ermöglichte (--chimOutType WithinBAM SoftClip). Um Fusionsgene aufzurufen und zu visualisieren, wurde Arriba70 (v.2.1.0) mit den benutzerdefinierten Parametern -F 150 -U 700 angewendet. Der endgültige sichere Aufrufsatz umfasste nur Fusionen mit (1) Gesamtabdeckung über den Haltepunkt ≥ 50× und (2) ≥30 % der zugeordneten Lesevorgänge sind geteilte oder nicht übereinstimmende Lesevorgänge. Für die Downstream-Analyse wurden nur Fusionsgene in der Nähe (± 10 Mb) der Amplikongrenzen berücksichtigt.

Wir verwendeten die Amplikon-Rekonstruktionen von Helmsauer et al.28 für CHP-212 und Hung et al.23 für TR14. Kurz gesagt, diese Rekonstruktionen wurden durch Organisieren eines gefilterten Satzes von SV-Aufrufen von Illumina WGS (CHP-212) und Nanopore WGS (TR14) als Genomdiagramme unter Verwendung von gGnome71 (v.0.1) (Genomintervalle als Knoten und Referenz oder SVs als Kanten) erhalten. Anschließend wurden kreisförmige Pfade durch diese Diagramme identifiziert, die die amplifizierten Onkogene einschlossen und die in der jeweiligen Zelllinie beobachteten Hauptschritte der Kopienzahl erklären könnten. Für die beiden in die Studie aufgenommenen Patienten, Patient Nr. 1 und Patient Nr. 2: Flache Nanoporendaten für das gesamte Genom wurden wie von Helmsauer et al.28 beschrieben generiert. Basecalling, Lesefilterung (NanoFilt −l 300), Mapping und SV-Aufruf wurden wie zuvor in den Methoden beschrieben („Nanopore scCircle-seq-Datenverarbeitung“) durchgeführt. Für die ecDNA-Rekonstruktion wurde eine Reihe sicherer SV-Aufrufe zusammengestellt (Varianten-AF > 0,2 und unterstützende Lesevorgänge ≥ 50×). Für CHP-212 und TR14 wurde ein Genomdiagramm mit gGnome61 (v.0.1) erstellt und manuell kuratiert. Um die Korrektheit der Amplikonstruktur für die Patientenproben zu überprüfen, wurden in silico-simulierte Nanopore-Lesevorgänge aus dem rekonstruierten Amplikon unter Verwendung einer angepassten Version von PBSIM2 (Ref. 72) (https://github.com/madagiurgiu25/pbsim2) entnommen und als vorverarbeitet Original-Patientenproben. Abschließend wurden die SV-Profile zwischen Originalproben und In-Silico-Simulationen verglichen. Alle rekonstruierten Amplikons wurden mit gTrack (v.0.1.0; https://github.com/mskilab/gTrack) visualisiert, einschließlich des GRCh37/hg19-Referenzgenoms und des GENCODE 19-Tracks.

Wir haben den zuvor beschriebenen Kreisklassifizierungsalgorithmus verwendet, um zirkuläre DNA-angereicherte Regionen in einzelnen Zellen zu definieren. Für jede einzelne Zelle haben wir mithilfe der Funktion findOverlaps aus dem R-Paket GenomicRanges73 (v.1.44.0) definiert, ob die mit zirkulärer DNA angereicherten Regionen das aus TR14-Massensequenzierungsdaten zusammengestellte ecDNA-Amplikon (MYNC, CDK4, MDM2) überlappen. Das Vorhandensein oder Fehlen einer Überlappung wurde für jede der drei MYNC-, CDK4- und MDM2-ecDNAs unabhängig definiert, mit Ausnahme der von MYCN- und CDK4-ecDNAs gemeinsam genutzten Amplikonregionen.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Die Experimente waren nicht randomisiert und die Forscher waren nicht blind gegenüber der Zuordnung während der Experimente und der Ergebnisbewertung. Die FISH-Experimente wurden einmal pro Zelllinie und Primärtumor durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten sind im Europäischen Genom-Phänomen-Archiv unter der Zugangsnummer verfügbar. EGAS00001007026. Die ChIP-seq-NarrowPeak- und Bigwig-Dateien wurden von https://data.cyverse.org/dav-anon/iplant/home/konstantin/helmsaueretal/ heruntergeladen. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der mit dieser Veröffentlichung verknüpfte Datenanalysecode ist unter https://github.com/henssen-lab/scEC-T-seq zu finden.

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AGH wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert (Fördernummer 398299703). Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union gefördert (Fördernummer 949172). AGH wird durch das Mildred-Scheel-Professurenprogramm Nr. 1 der Deutschen Krebshilfe unterstützt. 70114107. Dieses Projekt wurde vom Berlin Institute of Health (BIH) gefördert. Die Berechnung wurde im Cluster HPC for Research des BIH durchgeführt. Das Projekt, das zu diesen Ergebnissen führte, wurde durch ein Stipendium der Stiftung „la Caixa“ (Nr. 100010434) unterstützt. Der Stipendiencode lautet LCF/BQ/EU20/11810051. ER-F. wird von der Alexander von Humboldt-Stiftung gefördert. RX wird von der Deutschen Krebshilfe unterstützt. RPK ist ein von der Stiftung Charité geförderter BIH-Gastprofessor. MCS wird durch das DFG-geförderte Graduiertenkolleg 2424/CompCancer gefördert. RFS ist Professor am Krebsforschungszentrum Köln-Essen, gefördert vom Ministerium für Kultur und Wissenschaft des Landes Nordrhein-Westfalen. Diese Arbeit wurde teilweise vom Bundesministerium für Bildung und Forschung als BIFOLD (Berliner Institut für die Grundlagen des Lernens und Daten) finanziert (Ref. 01IS18025A und 01IS18037A). Diese Arbeit wurde im Rahmen des eDyNAmiC-Teams durchgeführt, das von der Cancer Grand Challenges-Partnerschaft unterstützt wurde, die von Cancer Research UK (HYC-Nr. CGCATF-2021/100012, AGH-Nr. CGCATF-2021/100017) und dem National Cancer Institute (HYC-Nr. OT2CA278688, AGH-Nr. OT2CA278644).

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Richard P. Koche und Anton G. Henssen.

Department of Pediatric Oncology and Hematology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Rocío Chamorro González, Robin & Anton G. Henssen

Experimentelles und klinisches Forschungszentrum des MDC und der Charité Berlin, Berlin, Deutschland

Rocío Chamorro González, Robin Xu, Mădălina Giurgiu, Elias Rodriguez-Fos, Lotte Brückner, Eric van Leen, Konstantin Helmsauer, Heathcliff Dorado Garcia, Yi Bei, Hedwig E. Deubzer, Kerstin Haase und Anton G. Henssen

Genomics Technology Platform, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft, Berlin, Deutschland

Thomas Konrad

Berliner Institut für Medizinische Systembiologie, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft, Berlin, Deutschland

Maja C. Stöber, Sascha Sauer & Roland F. Schwarz

Charité–Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Maja C. Stöber

Faculty of Life Science, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Maja C. Stöber

Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Mădălina Giurgiu

Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie, Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse IZI-BB, Potsdam, Deutschland

Katharina Kasack

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin, Germany

Lotte Brückner & Anton G. Henssen

AG Entwicklung und Krankheit, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin, Deutschland

Maria E. Stefanova & Stefan Mundlos

Institute for Medical Genetics, Charité–Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Maria E. Stefanova & Stefan Mundlos

Zentrum für persönliche dynamische Regulome, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

König L. Hung und Howard Y. Chang

Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies, Charité–Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Stefan Mundlos

Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Howard Y. Chang

Deutsches Krebskonsortium, Partnerstandort Berlin und Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland

Hedwig E. Deubzer, Angelika Eggert, Johannes H. Schulte, Kerstin Haase & Anton G. Henssen

Berlin Institute of Health, Berlin, Deutschland

Hedwig E. Deubzer, Angelika Eggert & Johannes H. Schulte

Institut für Computational Cancer Biology, Zentrum für Integrierte Onkologie, Krebsforschungszentrum Köln, Medizinische Fakultät Essen und Universitätsklinikum Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Roland F. Schwarz

Berliner Institut für Grundlagen des Lernens und Daten, Berlin, Deutschland

Roland F. Schwarz

Zentrum für epigenetische Forschung, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA

Richard P. Koche

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RCG, TC, RPK und AGH trugen zum Studiendesign sowie zur Datenerfassung und -interpretation bei. RCG, TC und KK führten die Einzelzellexperimente durch. RPK, RCG und K.Haase führten die Analyse der scCircle-seq-Daten und des WGS durch. ER-F. und MG führte die SV-Analyse der Einzelzellen- und WGS-Daten durch. EV und MCS führten die scRNA-seq-Datenanalyse durch. MG führte die Fusionsgen-Nachweisanalysen durch. RX führte die SNV-Analysen in den Einzelzellen- und WGS-Daten durch. LB führte den FISH durch und analysierte ihn. K. Helmsauer und MG führten die Amplikon-Rekonstruktionsanalysen durch. MES führte die ChIP-Sequenz durch. K. Helmsauer führte die ChIP-seq-Analysen durch. HDG, KS, YB, ML und KLH führten die Experimente durch und trugen zur Datenanalyse bei. SM, HYC, HED, SS, AE, JHS und RFS trugen zum Studiendesign bei. RCG, RPK und AGH leiteten das Studiendesign, führten die Datenanalyse durch und verfassten das Manuskript, zu dem alle Autoren beitrugen.

Korrespondenz mit Anton G. Henssen.

RPK und AGH sind Gründer von Econic Biosciences Ltd.

Nature Genetics dankt Andrea Ventura, Jan Korbel und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildungen. 1–18, Tabelle 7 und Anmerkung 1.

Ergänzungstabellen 1–7.

Statistische Quelldaten für Abb. 1.

Statistische Quelldaten für Abb. 4.

Statistische Quelldaten für Abb. 5.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Chamorro González, R., Conrad, T., Stöber, MC et al. Parallele Sequenzierung extrachromosomaler zirkulärer DNAs und Transkriptome in einzelnen Krebszellen. Nat Genet 55, 880–890 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01386-y

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Eingegangen: 20. Dezember 2021

Angenommen: 28. März 2023

Veröffentlicht: 04. Mai 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01386-y

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