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Oct 27, 2023

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Naturbiomedizinische Technik

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Während einer Operation ist eine schnelle und genaue histopathologische Diagnose für die klinische Entscheidungsfindung unerlässlich. Doch die vorherrschende Methode der intraoperativen Konsultationspathologie ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv und erfordert das Fachwissen ausgebildeter Pathologen. Hier zeigen wir, dass Biopsieproben innerhalb von 30 Minuten analysiert werden können, indem nacheinander die physikalischen Phänotypen singularisierter suspendierter Zellen, die vom Gewebe dissoziiert wurden, bewertet werden. Die Diagnosemethode kombiniert die enzymfreie mechanische Dissoziation von Geweben, Echtzeit-Verformbarkeitszytometrie mit Raten von 100–1.000 Zellen s−1 und Datenanalyse durch unbeaufsichtigte Dimensionsreduktion und logistische Regression. Aus Hellfeldbildern einzelner Zellen extrahierte physikalische Phänotypparameter unterschieden Zellsubpopulationen in verschiedenen Geweben und verbesserten oder ersetzten sogar die Messung molekularer Marker. Wir verwendeten die Methode, um den Grad der Dickdarmentzündung zu quantifizieren und gesundes und tumoröses Gewebe in Biopsieproben von Maus- und menschlichen Dickdarmproben genau zu unterscheiden. Dieser schnelle und markierungsfreie Ansatz kann die intraoperative Erkennung pathologischer Veränderungen in soliden Biopsien unterstützen.

Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Zellen, wie z. B. Zellgröße, -form oder -verformbarkeit, sind für die Pathologie einiger Krankheiten von entscheidender Bedeutung und bergen großes Potenzial als diagnostischer oder prognostischer Marker1,2. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von Instrumenten zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Zellen entwickelt, darunter Mikropipettenaspiration, Rasterkraftmikroskopie, Mikrokügelchen-Rheometrie und optische Fallen3,4. Auf diesem Gebiet ist ein exponentieller Anstieg an Veröffentlichungen zu verzeichnen, die auf eine starke Korrelation zwischen dem zellmechanischen Phänotyp und dem Krankheitszustand schließen lassen, darunter Sepsis5,6, Malaria7, Diabetes8, Sichelzellenanämie9 und Krebs10,11,12. Leider leiden diese herkömmlichen Techniken an einem geringen Zelldurchsatz und erfordern für die Operation umfassende Fachkenntnisse, was ihre Verwendung als Diagnoseinstrument einschränkt. Echtzeit-Fluoreszenz- und Verformbarkeitszytometrie (RT-FDC)13,14 ist eine von mehreren neuen mikrofluidischen Techniken10,15,16,17,18,19,20,21,22, die diese Nachteile überwunden haben und die Beurteilung physikalischer Eigenschaften ermöglichen von einzelnen Zellen auf markierungsfreie Weise und mit hohem Durchsatz, was einen neuen Weg für die klinische Diagnostik eröffnet. RT-FDC ist nicht nur schnell (mit bis zu 1.000 analysierten Zellen pro Sekunde), sondern liefert zusätzlich zur Zellverformbarkeit auch mehrdimensionale Informationen, die direkt aus Zellbildern gewonnen werden. Das diagnostische Potenzial von RT-FDC wurde bei vielen Erkrankungen des Menschen nachgewiesen, von Leukämie bis hin zu bakteriellen und viralen Infektionen, einschließlich der Coronavirus-Krankheit 2019 (Ref. 23, 24, 25, 26, 27). Bisher war die Anwendbarkeit der Technik jedoch auf die Analyse kultivierter Zellen oder flüssiger Biopsien aus Blut oder Knochenmark beschränkt.

Die Biopsie von festem Gewebe ist die gebräuchlichste Methode zur Charakterisierung von Malignität und von grundlegender Bedeutung für die Anleitung von Chirurgen bei der intraoperativen und perioperativen Behandlung von Krebspatienten. Die diagnostische Beurteilung fester Gewebebiopsien erfolgt üblicherweise durch eine intraoperative Konsultationspathologie, die auf der histopathologischen Analyse gefrorener Biopsieschnitte beruht28. Der herkömmliche Arbeitsablauf der intraoperativen Diagnose umfasst zahlreiche Verarbeitungsschritte, Färbereagenzien und die mikroskopische Untersuchung von Gewebeschnitten durch erfahrene Pathologen zur fachmännischen Analyse. Darüber hinaus ist die Probenvorbereitung zeit-, ressourcen- und arbeitsintensiv. Alternative Arbeitsabläufe wurden vorgeschlagen28, einschließlich stimulierter Raman-Spektroskopie29,30, optischer Kohärenztomographie31 und Fluoreszenzmikroskopie32,33, aber noch nicht implementiert. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem Ansatz, der die Probenvorbereitung und die Zeit bis zur Diagnose verkürzt.

In diesem Artikel stellen wir eine schnelle, markierungsfreie Diagnosemethode für solide Gewebebiopsien vor. Der Ansatz kombiniert die enzymfreie, mechanische Dissoziation von Geweben mithilfe eines Gewebezerkleinerers (TG) zur schnellen und einfachen Isolierung lebensfähiger Einzelzellen34,35 mit der sequentiellen Bewertung der zellulären physikalischen Phänotypen Tausender einzelner Zellen mithilfe von RT-FDC. Zunächst screenen wir eine Reihe verschiedener Mausgewebe und bewerten die Zellausbeute, die Lebensfähigkeit und die Durchführbarkeit der RT-FDC-Messung bei der mechanischen Dissoziation von Gewebe. Wir veranschaulichen die Fähigkeit, Subpopulationen von Gewebezellen allein auf der Grundlage der bildabgeleiteten physikalischen Parameter ohne Vorkenntnisse oder zusätzliche molekulare Markierung zu unterscheiden, was die konventionelle Durchflusszytometrie verbessern kann, die zur Identifizierung von Zellen auf mehrfarbigen Markertafeln beruht. Wir zeigen auch, dass unser Ansatz entzündliche Veränderungen im Dickdarmgewebe bestimmen kann, basierend auf der Messung der Zellverformbarkeit im Mikrofluidsystem. Darüber hinaus untersuchen wir gefrorene und frische Biopsieproben aus dem Dickdarm von Mäusen und Menschen und zeigen, dass RT-FDC mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und maschinellem Lernen auf den mehrdimensionalen Daten gesundes von krebsartigem Gewebe unterscheiden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass die Beurteilung des physikalischen Phänotyps von aus Gewebe stammenden Einzelzellen mittels RT-FDC eine alternative Strategie zur Erkennung eines entzündlichen oder bösartigen Zustands ist. Unser Verfahren, das innerhalb von 30 Minuten Ergebnisse liefern kann, hat das Potenzial, als intraoperative Diagnosepipeline empfindlich pathologische Veränderungen in Biopsien zu erkennen und allgemeiner Zellpopulationen in Geweben auf unvoreingenommene und markerfreie Weise zu identifizieren und zu charakterisieren.

Vor der Beurteilung des physikalischen Phänotyps von Zellen bestand die erste Herausforderung darin, einzelne Zellen innerhalb von Minuten schnell aus festen Geweben zu extrahieren und gleichzeitig eine möglichst genaue Darstellung der Heterogenität von Zellsubpopulationen anzustreben. Hierzu verwendeten wir ein TG, ein mechanisches Dissoziationsgerät, das auf gegenläufig rotierenden Reihen von Schleifzähnen basiert (Abb. 1), die in einem Falcon-Rohr35 montiert sind. Das Gerät führt automatisch eine vordefinierte Abfolge abwechselnder Schneid- und Schleifschritte aus, um einzelne Zellen aus einem festen Gewebe zu isolieren. Insgesamt wurden zehn verschiedene Mausgewebe zum Vergleich entweder mit TG oder herkömmlichen enzymatischen Protokollen verarbeitet (Ergänzungstabellen 1 und 2). Die Lebensfähigkeit betrug in den meisten Geweben 70–90 %; Die Zellausbeute ähnelte der enzymatischen Dissoziation und war gewebeabhängig (Erweiterte Daten, Abb. 1). Der Hauptvorteil der mechanischen Dissoziation bestand darin, dass die Verarbeitungszeit pro Probe weniger als 5 Minuten dauerte, im Gegensatz zu mehreren zehn Minuten oder sogar mehreren Stunden bei den enzymatischen Protokollen. Die Geschwindigkeit der Extraktion trägt vermutlich dazu bei, biochemische und biophysikalische Phänotypen unter Bedingungen zu erhalten, die denen in situ nahe kommen.

Die Gewebeprobe wird in kleine Stücke zerlegt und in den Innenrotor der TG-Einheit mit Kulturmedium gegeben35. Die mechanische Dissoziation erfolgt durch eine vorprogrammierte, automatisch ausgeführte Abfolge von Drehungen im und gegen den Uhrzeigersinn. Dissoziierte Zellen werden zentrifugiert und im Messpuffer resuspendiert. Die Probe wird auf einen Mikrofluidikchip geladen und mittels RT-FDC analysiert. Von jeder einzelnen der typischerweise 10.000 Zellen wird ein Hellfeldbild aufgenommen. Aus den Bildern werden verschiedene Merkmale extrahiert, die für die mehrdimensionale Analyse verwendet werden. Insgesamt dauert der Eingriff vom Gewebe bis zum Ergebnis weniger als 30 Minuten.

Anschließend wurden die extrahierten Einzelzellen mittels RT-FDC analysiert. Bei einer RT-FDC-Messung werden Hunderte von Zellen pro Sekunde, suspendiert in einem hochviskosen Methylzellulosepuffer, durch eine mikrofluidische Kanalverengung gedrückt, wo sie durch Scherspannung und Druckgradienten deformiert werden und ein Bild jeder Zelle erhalten wird. Aus den Bildern wurden in Echtzeit mehrere physikalische Parameter berechnet, nämlich Verformung, Zellgröße, Helligkeit, Standardabweichung der Helligkeit, Seitenverhältnis und Flächenverhältnis (Einzelheiten siehe Ergänzungstabelle 3). Zusätzlich wurde das Fluoreszenzmodul14 verwendet, um die Expression von Zelloberflächenmarkern zu erfassen.

Anschauliche Beispiele für die Verteilung der physikalischen Parameter von aus Leber, Dickdarm und Niere extrahierten Zellen sind in Abb. 2 dargestellt. Jeder dieser Cluster bestand aus Zellen mit ähnlichem physikalischen Phänotyp (getrennt gemäß dem Dichtediagramm) und Oberflächenmarker-Expression (erweitert). Daten Abb. 2). Beispielsweise bestand ein Zellcluster mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften (in diesem Fall definiert durch durchschnittliche Helligkeit und Zellgröße) hauptsächlich aus Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM)-positiven Zellen (Abb. 2a), was zeigt, dass es sich um eine saubere Epithelpopulation handelt Zellen können markierungsfrei unterschieden werden, indem ausschließlich bildbasierte physikalische Parameter verwendet werden.

a: Illustratives Streudiagramm der durchschnittlichen Helligkeit im Vergleich zur Zellgröße für aus der Leber isolierte Zellen, das zahlreiche Zellcluster zeigt. Die markierte Zellpopulation (die einen Cluster mit einer Zellgröße von 25–50 μm2 und einer durchschnittlichen Helligkeit von 100–115 bildet) ist angereichert mit EpCAM-positiven (Epithel-)Zellen, aber frei von CD31-positiven (Endothel-)Zellen oder CD45-positiven Zellen (Leukozyten). ). FITC, Fluoresceinisothiocyanat; PE, Phycoerythrin; APC, Allophycocyanin. b, Illustrative Streudiagramme von Dickdarmzellen, die auf EpCAM- und CD45-Zelloberflächenmarker gefärbt wurden. Innerhalb der EpCAM-positiven Population können anhand von Dichtediagrammen physikalischer Parameter wie Helligkeit und Zellgröße sieben Subpopulationen von Zellen identifiziert werden. c, Illustrative Streudiagramme von Nierenzellen, die für EpCAM und CD45 gefärbt wurden. Innerhalb der CD45-Population werden vier Subpopulationen basierend auf Ähnlichkeiten in der Zellgröße und -deformation identifiziert. Die Farbkarte in den Streudiagrammen stellt die Ereignisdichte dar.

Abbildung 2b,c verdeutlicht den Vorteil der bildbasierten physikalischen Phänotypisierung zusätzlich zur herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie allein. In der konventionellen Durchflusszytometrie ist es kaum möglich, einzelne Subpopulationen von Epithelzellen (EpCAM+) zu unterscheiden, es sei denn, es werden zusätzliche Panels fluoreszierender Antikörper gegen bekannte und vordefinierte Zelltypen verwendet. Aufgrund der zusätzlichen Informationstiefe, die durch physikalische Phänotypparameter bereitgestellt wird, war mit RT-FDC die Unterscheidung verschiedener Subpopulationen möglich. Innerhalb der Epithelzellen des Dickdarms identifizierten wir sieben Zellcluster, die ausschließlich auf Helligkeit und Größe beruhten (Abb. 2b). In ähnlicher Weise fanden wir innerhalb der Leukozytenpopulation (CD45+) der Niere vier verschiedene Cluster, basierend auf der Zellgröße und den Verformungsparametern (Abb. 2c). Wir stellen fest, dass mit der kürzlich für RT-FDC36 entwickelten Sortiermethode jede dieser Zellpopulationen anhand der bildabgeleiteten Parameter isoliert und beispielsweise durch anschließende RNA-Sequenzierung auf ihre molekulare Identität analysiert werden kann.

RT-FDC kann auch zur Erfassung von Zellinteraktionen verwendet werden. Mithilfe des Seitenverhältnisses und der Zellgrößenparameter identifizierten wir Zelldubletts in Thymus-, Milz- und Nierenproben. Viele Dubletten bestanden gemäß den Zelloberflächenmarkern aus zwei verschiedenen Zelltypen (Extended Data Abb. 3). Die Position der Zelle innerhalb des Kanals in Kombination mit der Position des Fluoreszenzpeaks ermöglichte es uns beispielsweise zu identifizieren, dass ein Dublett aus einem Leukozyten (CD45+) und einer Endothelzelle (CD31+) bestand (Extended Data Abb. 3b, d,f). Mit dem RT-FDC-Sortiermodul36 können Zelldubletts markierungsfrei für weitere molekulare Analysen und nachgelagerte Anwendungen isoliert werden, einschließlich Studien physikalisch interagierender Immunzellen im Gewebe37.

Eine wichtige Frage, die bei der mechanischen Dissoziation von Geweben und der markierungsfreien Analyse nach physikalischem Phänotyp berücksichtigt werden muss, ist, ob dieser Ansatz die Verteilung der im Gewebe vorhandenen Zelltypen getreu wiedergibt. Während dies nicht für alle Gewebe und Anwendungen im Allgemeinen beurteilt werden kann, ist es aufschlussreich, die Leber als spezifisches Gewebe genauer zu betrachten (Extended Data Abb. 4a–c). Die mechanische Dissoziation scheint für empfindliche Zellen wie Hepatozyten, die zum Zelltod neigen und bei Standard-Isolierungsverfahren häufig verloren gehen, weniger störend zu sein38. Bei der Dissoziation von murinem Lebergewebe wurden Zellen mit einer Zellquerschnittsfläche von mehr als 150 μm2 (Radius ~ 7 μm) entsprechend ihrer Morphologie und Größe als Hepatozyten bestimmt39. Als wichtigster parenchymaler Zelltyp der Leber machen Hepatozyten 70 % der Leberzellpopulation aus und nehmen fast 80 % des Lebervolumens ein40. In der mit TG gewonnenen Zellsuspension lag der Anteil der Hepatozyten an der Gesamtzahl der Zellen im Durchschnitt bei 52,5 % und lag damit viel näher an der tatsächlichen Darstellung im Gewebe im Vergleich zu 7,7 % bei der enzymatischen Verdauung. Darüber hinaus konnten anhand der Zellgröße unterschiedliche Subpopulationen von Hepatozyten identifiziert werden. Wir gehen davon aus, dass diese Populationen Hepatozyten unterschiedlicher Ploidie entsprechen, da der DNA-Gehalt stark mit dem Zellvolumen korreliert41. Wenn dies beispielsweise durch Korrelation mit einer quantitativen Fluoreszenzanalyse der DNA-Menge in jeder Zelle bestätigt wird, könnte unsere Methode als Werkzeug zur markierungsfreien Überwachung von Alterungs- und pathophysiologischen Prozessen in der Leber dienen, die mit dem Anteil an Polyploiden verbunden sind Hepatozyten42. In anderen Geweben, beispielsweise der Lunge, waren die Unterschiede zwischen mechanischer und enzymatischer Dissoziation nicht so ausgeprägt, und keine der beiden Techniken ergab eine Tendenz zu einer bestimmten Zellpopulation (Extended Data, Abb. 4d). Für die allgemeine Anwendbarkeit unseres Ansatzes auf die vielfältigen Möglichkeiten, die er für die Gewebeanalyse eröffnet, sind jedoch natürlich weitere experimentelle Arbeiten erforderlich.

Es gibt spezifische – insbesondere diagnostische – Anwendungen unseres Ansatzes, bei denen die genaue Bestimmung der ursprünglich im Gewebe vorhandenen Zellzahlen in situ weniger wichtig ist. Schließlich spiegeln die erfassten physikalischen Phänotypen auch unterschiedliche zelluläre Reaktionen auf die Probenverarbeitung, die Adhäsion der Zellen untereinander und an der extrazellulären Matrix sowie die Konnektivität und mechanische Festigkeit innerhalb des Gewebes wider. Alle diese Aspekte können bei pathologischen Zuständen verändert sein und werden von unserem Ansatz aufgegriffen. Wir demonstrieren den diagnostischen Nutzen in zwei spezifischen klinisch relevanten Anwendungsfällen im Zusammenhang mit dem Dickdarm.

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Darms, die mit einer beeinträchtigten Epithel-/Schleimhautbarriere und der Aktivierung/Rekrutierung von Immunzellen einhergehen43. Obwohl die Ätiologie von IBD immer noch nicht vollständig geklärt ist, stammen viele unserer Erkenntnisse über IBD aus experimentellen Tiermodellen für Darmentzündungen. Ein solches Modell ist der adoptive Transfer naiver T-Zellen in Mäuse mit Rag1-Mangel, um eine experimentelle Kolitis auszulösen (T-Zell-Transfermodell der chronischen Kolitis, im Folgenden als Transferkolitis bezeichnet). Der Schweregrad wird dann üblicherweise über einen histopathologischen Score quantifiziert, der aus mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Objektträgern des Dickdarmgewebes erstellt wird.

Unser Ziel war es, Veränderungen im physikalischen Phänotyp von Dickdarmzellen während einer Transferkolitis zu untersuchen. Streudiagramme der Verformung gegenüber der Zellgröße lassen auf einen Unterschied zwischen erkranktem und gesundem Gewebe schließen (Abb. 3a), wobei Zellen aus erkranktem Gewebe weniger deformiert erscheinen als Zellen aus gesundem Gewebe. Bei der Untersuchung der CD45+-Zellen (Abb. 3b, c) wurde deutlich, dass die Transferkolitis-Proben durch eine hohe Häufigkeit von Leukozyten mit geringer Verformung gekennzeichnet waren, wahrscheinlich Lymphozyten. Insgesamt fanden wir in den Transfer-Colitis-Proben eine signifikante Abnahme der mittleren Deformation mit starker Effektgröße, begleitet von einem signifikanten Anstieg des Leukozytenanteils, entsprechend der Infiltration adoptiv übertragener Lymphozyten (N = 14; Abb. 3d). Die mittlere Verformung der Zellen korrelierte stark negativ mit dem Prozentsatz der Leukozyten, mit einem Pearson-Korrelationskoeffizienten von r(12) = –0,69 (P = 0,0065; Abb. 3e). Darüber hinaus wurden die Medianwerte der Zellgröße und -verformung mit der H&E-Bewertung durch Experten verknüpft (ergänzende Abbildung 1); obwohl eine Korrelation mittels linearer Anpassung nicht möglich war. Transfer-Colitis-Proben mit hohem H&E-Score zeigten im Vergleich zu gesundem Gewebe eine größere Zellgröße und eine geringere Verformung. Eine bemerkenswerte Beobachtung war, dass das gesunde Gewebe schwieriger mechanisch in einzelne Zellen aufzubrechen war als das erkrankte Gewebe, was mehr Ereignisse für die Analyse ergab.

a, Streudiagramme der Zellgröße gegenüber der Deformation von Zellen, die aus Transfer-Colitis-Gewebeproben (TC) isoliert wurden, im Vergleich zu gesundem murinem Dickdarmgewebe (Kontrolle); mit entsprechenden Zellgrößen- und Verformungshistogrammen. b: Dieselben beiden Dickdarmproben, die auf CD45-positive Zellen untersucht wurden, zeigen die Anreicherung von Leukozyten in Transferkolitis-Proben, begleitet von Veränderungen der physikalischen Phänotypparameter. Die Farbkarte in den Streudiagrammen stellt die Ereignisdichte dar. c, Diagramme zur Schätzung der Kerndichte der in a und b gezeigten Proben, wobei die Konturen die Werte 0,5 (heller Farbton, äußere Kontur) und 0,95 (dunkler Farbton, innere Kontur) markieren. d, Quantifizierung der mittleren Verformung und Prozentsatz CD45-positiver Zellen (n = 14 biologisch unabhängige Tiere über drei unabhängige Experimente). Die Kästchen erstrecken sich vom 25. bis zum 75. Perzentil mit einer Linie am Median; Whisker überspannen das 1,5-fache des Interquartilbereichs. Statistische Vergleiche wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt; mittlere Verformung *P = 0,0227 und r = 0,55, % CD45+ **P = 0,0041 und r = 0,7 (r, Effektgröße). e, Zweiseitige Pearson-Korrelation der mittleren Verformung aller Zellen und des Anteils an Leukozyten (CD45+-Zellen); P = 0,0065 und r = −0,69.

Unsere Beobachtungen, dass sich der physische Phänotyp von Zellen bei einer Entzündung verändert, zusammen mit den zunehmenden Beweisen, dass chronische Entzündungen mit Malignität verbunden sind44,45, veranlassten uns zu der Vermutung, dass unser Ansatz Veränderungen in Biopsieproben von Tumoren erkennen könnte. Wir bestätigen diese Möglichkeit sowohl für Maus- als auch für menschliche Proben.

Frühere Studien haben Unterschiede zwischen den mechanischen Eigenschaften von Krebszellen und ihren gesunden Gegenstücken festgestellt11,12,46,47,48,49. Ein großer Nachteil dieser Studien ist die aufwändige Probenvorbereitung und der geringe Messdurchsatz, was die Umsetzung dieser Studien in tatsächliche diagnostische Ansätze einschränkt. Angesichts der Schnelligkeit unseres Ansatzes zur Gewinnung und Untersuchung des mechanischen Phänotyps einzelner Zellen aus festem Gewebe haben wir sein Potenzial zur Erkennung von Darmkrebs untersucht. Wir verwendeten Mäuse, denen ein für Darmepithelzellen spezifisches Protein fehlte, das eine Schlüsselrolle für die Epithelintegrität spielt. Diese Tiere entwickeln spontan Dickdarmtumoren. Wir untersuchten insgesamt 16 Mäuse und verglichen aus Tumoren isolierte Zellen mit Zellen aus einem gesunden Teil des Dickdarms desselben Tieres. Wir analysierten Zellen mit einer Größe von mehr als 60 µm2 (bestimmt durch die Querschnittsfläche), da die Probe unterhalb dieses Schwellenwerts hauptsächlich aus Immunzellen und kleinen Ablagerungen bestand (ergänzende Abbildung 2).

Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich der physikalische Phänotyp von Zellen aus Tumorgewebe deutlich von den Kontrollproben unterschied. Repräsentative Diagramme einer einzelnen Maus in Abb. 4a – c zeigen, dass Zellen aus dem Tumor eine größere Zellgröße und stärkere Verformung aufwiesen als ihre gesunden Gegenstücke. Die Analyse aller 32 Proben ergab, dass Zellen aus Tumoren eine signifikant höhere mittlere Zellgröße (Abb. 4d), Verformung (Abb. 4e) und Flächenverhältnis (Abb. 4g) aufwiesen, mit moderaten bis starken Effektgrößen. Die Tumorproben zeigten auch eine größere Heterogenität, was durch die breitere Verteilung in Abb. 4c und deutlich höhere Standardabweichungen der Zellgröße und des Flächenverhältnisses (Abb. 4d, g) belegt wird.

a,b, Streudiagramme der Zellgröße gegenüber der Verformung einer Kontrollprobe (a) von murinem Dickdarmgewebe im Vergleich zu Tumorgewebe (b). Die Farbkarte in den Streudiagrammen stellt die Ereignisdichte dar. c, Diagramme zur Schätzung der Kerndichte der in a und b gezeigten Proben, wobei die Konturen die Werte 0,5 (heller Farbton, äußere Kontur) und 0,95 (dunkler Farbton, innere Kontur) markieren. Die Zellgrößen- und Verformungshistogramme zeigen eine größere Heterogenität der Zellgröße und Verformung im Tumor (grün) im Vergleich zum Kontrollgewebe (lila). d–g, Mittelwerte und Standardabweichungen der physikalischen Phänotypparameter von 16 Kontroll- (lila) und 16 Tumorproben (grün) (n = 16 biologisch unabhängige Tiere über sechs unabhängige Experimente). Die Kästchen erstrecken sich vom 25. bis zum 75. Perzentil mit einer Linie am Median; Whisker überspannen das 1,5-fache des Interquartilbereichs. Statistische Vergleiche wurden unter Verwendung des zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rang-Tests durchgeführt; r, Effektgröße: Zellgröße (**P = 0,0019, r = 0,55), Standardabweichung der Zellgröße (***P = 0,0005, r = 0,61) (d); Verformung (*P = 0,026, r = 0,39), Standardabweichung der Verformung (NS, nicht signifikant) (e); Seitenverhältnis (NS), Standardabweichung des Seitenverhältnisses (NS) (f); Flächenverhältnis (**P = 0,0023, r = 0,54), Standardabweichung des Flächenverhältnisses (*P = 0,013, r = 0,44) (g). h, PCA von Maus-Dickdarmgewebeproben, wobei grüne Punkte Tumorproben und violette Punkte die Kontrollproben darstellen. Für PC1 und PC2 wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt, wobei die resultierenden zwei Kategorien als violette (Kontrolle) und grüne (Tumor) Hintergrundfarben angezeigt wurden.

Als nächstes untersuchten wir, ob die physikalischen Phänotypunterschiede für die zuverlässige Unterscheidung zwischen tumorösem und gesundem Gewebe genutzt werden können. Dazu haben wir die Zellen nach Zellgröße in drei Kategorien eingeteilt (60–90, 80–120 und 120–400 μm2). Für jede Größenkategorie wurden 12 Parameter abgeleitet: Mittelwert, Median und Standardabweichungen der Zellgröße, Verformung, Seitenverhältnis und Flächenverhältnis; Insgesamt ergeben sich für jede Probe 36 Parameter (ergänzende Abbildung 3). Diese Parameter wurden für PCA verwendet, Abb. 4h. Die beiden Hauptkomponenten PC1 (39,8 %) und PC2 (18,7 %) erklärten 58,5 % der Varianz. Die relative Bedeutung physikalischer Merkmale bei der Bestimmung der Hauptkomponenten ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Das dominanteste Merkmal für PC1 war die Verformung von Zellen zwischen 60 und 120 µm2, während im Fall von PC2 die Zellgrößenparameter vorherrschten. Die an der PCA durchgeführte logistische Regression (dargestellt durch die lineare Teilung in Abb. 4h) zeigte, dass die komprimierten physikalischen Phänotypinformationen, die durch die Hauptkomponenten dargestellt werden, ausreichen, um zwischen gesundem und Tumorgewebe zu unterscheiden; 29 von 32 Proben lagen im richtigen Bereich. Schließlich analysierten wir die Korrelation zwischen Verformung und Zellgröße und stellten fest, dass sie schwach oder nicht vorhanden ist (ergänzende Abbildung 4). Dies führte uns zu dem Schluss, dass Verformung und Zellgröße unabhängige Prädiktoren für Tumoren in murinen Dickdarmproben sind, was den Mehrwert der mittels RT-FDC gemessenen Verformung als diagnostischen Marker weiter verdeutlicht.

Als nächstes versuchten wir, unsere Methode zum Nachweis von Tumoren aus menschlichen Biopsieproben in Frage zu stellen. Als ersten Schritt führten wir eine RT-FDC-Analyse an Zellen durch, die aus 13 kryokonservierten Biopsieproben von Darmkrebs und 13 Proben gesunden umgebenden Gewebes derselben Patienten isoliert wurden. PCA wurde an 45 Parametern durchgeführt (Abb. 5a und ergänzende Abb. 5), wobei 41,7 % der Varianz durch die beiden Hauptkomponenten erklärt wurden (25,3 % bzw. 16,4 % für PC1 und PC2); Die Auswahl der RT-FDC-Parameter wurde optimiert, um eine gute Trennung zwischen gesundem und Tumorgewebe zu erreichen. Die PCA zeigte, dass sich Tumor- und gesunde Proben entlang PC2 gut trennten, hauptsächlich durch die Verformung und Standardabweichung der Helligkeit von Zellen, die größer als 100 µm2 waren (Abb. 5a). Zellgrößenparameter von Zellen unter 100 µm2 trugen ebenfalls zur Trennung der Proben bei. Der Ausschluss des wichtigsten Parameters (Verformung von Zellen größer als 100 µm2) führte zu einer schlechteren Trennung zwischen gesunden und Tumorproben (ergänzende Abbildung 6). Für die PCA wurde eine logistische Regression durchgeführt (dargestellt durch die lineare Teilung im PCA-Diagramm) und zur Vorhersage der Klassifizierung von sechs Blindproben (in Abb. 5a als Kreuze dargestellt) verwendet. Alle sechs Proben wurden korrekt als gesundes bzw. Tumorgewebe klassifiziert. Wir untersuchten die minimale Anzahl von Zellen, die für die korrekte Klassifizierung dieser Blindproben erforderlich sind (ergänzende Abbildung 7). Für eine korrekte Klassifizierung mussten etwa 1.500 Zellen einer Probe analysiert werden, was einer RT-FDC-Messzeit von etwa 5 Minuten entspricht.

In den PCA-Diagrammen auf der linken Seite stellt jeder grüne Punkt eine Tumorprobe eines Patienten dar; Lila Punkte stellen das entsprechende gesunde umliegende Gewebe desselben Patienten dar. Für jedes der PCAs wurde eine logistische Regression durchgeführt, wobei die resultierenden zwei Kategorien als violette (gesund) und grüne (Tumor) Hintergrundfarben angezeigt wurden. Kreuze stellen Blindexperimente dar, die zur Validierung des trainierten Modells verwendet werden. Die Merkmalswichtigkeitsanalyse rechts neben dem PCA-Diagramm zeigt die farbcodierte Bedeutung jedes Merkmals für die Bestimmung von PC1 und PC2 für dieses bestimmte Gewebe. die x-Achse listet Zellengrößenkategorien auf; Auf der Y-Achse sind RT-FDC-Parameter und ihre statistischen Merkmale aufgeführt, die über Zellen in der entsprechenden Größenkategorie abgeleitet wurden (in Klammern). sd, Standardabweichung. a, PCA der RT-FDC-Parameter von 32 gefrorenen Dickdarmproben (16 Tumorbiopsien und 16 Proben von gesundem umgebendem Gewebe; n = 16 biologisch unabhängige Proben über 16 unabhängige Experimente). b, PCA der RT-FDC-Parameter von 28 frischen Dickdarmbiopsieproben (14 Tumorproben, 14 gesunde; n = 14 biologisch unabhängige Proben über 14 unabhängige Experimente). c, PCA der RT-FDC-Parameter von 18 frischen Lungenbiopsieproben (9 Tumorproben, 9 gesunde; n = 9 biologisch unabhängige Proben über 9 unabhängige Experimente).

Die kurze kombinierte Verarbeitungs- und Analysezeit (<30 Minuten) und die positiven Ergebnisse an gefrorenen Gewebebiopsieschnitten legen den Einsatz der Methode für die intraoperative Pathologie – die Untersuchung der Biopsieprobe eines Patienten während der Operation – nahe. Um herauszufinden, ob sogar der Schritt des Einfrierens entfallen könnte, analysierten wir frisch entnommene Biopsien von Patienten mit Darmkrebs (N = 14). Der auf gefrorenes Dickdarmgewebe trainierte Algorithmus zeigte bei frischem Gewebe keine gute Leistung, möglicherweise aufgrund von Unterschieden im physikalischen Phänotyp zwischen gefrorenem und frischem Gewebe (Erweiterte Daten, Abb. 5). Daher wurde eine neue PCA mit Daten aus frischen Dickdarmbiopsien in zwei Größenkategorien (20–50 und 50–600 µm2) durchgeführt (Abb. 5b), wobei 68,5 % der Varianz durch die beiden Hauptkomponenten (36,5 % und 36,5 %) erklärt wurden 32 % für PC1 bzw. PC2). Hier trug die Verformung der Zellen stark zum PCA bei und die Zellgröße war weniger wichtig als die anderen physikalischen Phänotypparameter. Bei der logistischen Regression wurden nur 3 von 22 für PCA verwendeten Proben und 1 von 6 der Blindproben nicht korrekt klassifiziert, was auf Heterogenität zwischen Tumoren oder innerhalb des Tumors zurückzuführen sein könnte. Dennoch erreichten wir mit unserem Ansatz bei Blindproben eine Genauigkeit von 100 % bei der Klassifizierung gesunder und Tumorproben aus gefrorenen Biopsien und eine Genauigkeit von 83 % bei frischen Biopsieproben.

Um unsere Methode an Gewebe aus einem anderen Organ zu validieren, haben wir sie auf frisch entnommene Lungenbiopsieproben von neun Krebspatienten angewendet. PCA kombiniert mit logistischer Regression trennte problemlos sieben gesunde von sieben Tumorproben und weitere vier blinde Proben wurden korrekt klassifiziert (Abb. 5c). In der PCA wurden 46,9 % der Varianz durch PC1 und PC2 erklärt (31,2 % bzw. 15,7 %). Verformungsparameter trugen stark zu PC1 bei, was erneut zeigt, dass die einzigartigen Informationen, die die Messung der Zellverformbarkeit liefert, für die Unterscheidung zwischen Tumor und gesundem Gewebe nützlich sind.

Wir haben auch die Empfindlichkeit unseres Ansatzes für den Fall getestet, dass in den verfügbaren Gewebeproben nur wenige Krebszellen vorhanden sind (Tumoren mit geringer Tumorzellularität und hohem desmoplastischem Tumorstroma-Gehalt) oder verbleiben (Tumoren nach Chemo- oder Radiochemotherapie mit nahezu vollständiger Remission). . Dieser Aspekt ist besonders wichtig für klinische Situationen, in denen eine intraoperative Analyse verwendet wird, um festzustellen, ob der Operationsrand krebsfrei ist (sogenannte Gefrierschnitte), was besonders schwierig sein kann, wenn nur sehr wenige Tumorzellen vorhanden sind. Wir führten ein Experiment durch, bei dem wir eine Mischung aus frischen Tumor- und gesunden Lungengewebeproben in unterschiedlichen Verhältnissen analysierten (ergänzende Abbildung 8). Als Tumorprobe wurde eine Probe klassifiziert, die zu 50 % aus gesundem und zu 50 % aus Tumorgewebe bestand. Natürlich besteht nicht das gesamte Tumorgewebe aus Krebszellen, so dass die tatsächliche Empfindlichkeit zur Erkennung von Krebszellen höher ist als hier dargestellt. Tatsächlich wiesen einige der Dickdarmtumorproben einen relativ hohen Stromagehalt auf. In den Extremfällen (Ergänzungstabelle 5, gefrorene Dickdarmgewebeproben 7 und 11) betrug der Stromagehalt 98 % bzw. 80 %, was bedeutet, dass die Patienten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie nahezu keinen Resttumor mehr aufwiesen. Dennoch wurden diese Proben korrekt als Tumor klassifiziert. Dieses Ergebnis ist bemerkenswert, da es eine mögliche Lösung für das Probenahmeproblem bei der konventionellen histopathologischen Analyse aufzeigt – insbesondere bei Gefrierschnittszenarien. Das Ergebnis hängt stark davon ab, ob der Pathologe die richtige Gewebestelle untersucht und auswählt, an der noch Krebszellen vorhanden sind. Aufgrund von Zeitbeschränkungen und technischen Einschränkungen bei der Objektträgervorbereitung bei Gefrierschnittszenarien kann nur ein kleiner Teil der gesamten resezierten Gewebeprobe sichtbar gemacht werden. Wenn die Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen und die Analyse einer zufälligen Untergruppe davon das Vorhandensein von nur 20 % – oder sogar 2 % – der in einer bestimmten Gewebeprobe vorhandenen Krebszellen empfindlich nachweisen können, wäre dies der Fall ein klarer Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik. Um dies eindeutig zu belegen, sind weitere spezifische Untersuchungen erforderlich. Schließlich kann unsere Methode auch niedriggradigen Krebs erkennen, bei dem Unterschiede in den physikalischen Parametern voraussichtlich schwieriger zu erkennen sind als bei hochgradigem Krebs. Die überwiegende Mehrheit der analysierten Proben war G2 (mäßig differenziert) oder G3 (schlecht differenziert/undifferenziert, oft auch als „hochgradig“ bezeichnet; Ergänzungstabellen 5–10). Im Lungengewebedatensatz wurde eine der Proben als G1 mit dem niedrigsten Grad eingestuft (gut differenziert; Ergänzungstabelle 10). Daher ist die Methode nicht auf hochgradige Krebserkrankungen beschränkt.

Wir haben eine schnelle und einfache Methode zur Verarbeitung und Analyse von Zellen aus festem Gewebe gezeigt, die für die biopsiebasierte Diagnostik geeignet ist. Auf die mechanische Dissoziation des Gewebes folgt eine Hochdurchsatzanalyse der Zellen im Deformationsfluss. Innerhalb weniger Minuten werden Tausende von Zellen abgebildet und aus jedem Zellbild werden verschiedene physikalische Phänotypmerkmale extrahiert. Die Methode ist markierungsfrei und basiert lediglich auf Hellfeldbildern, im Gegensatz zu molekulardiagnostischen Werkzeugen oder der herkömmlichen Durchflusszytometrie, wo teure Reagenzien oder Fluoreszenzmarker erforderlich sind. Wichtig ist, dass die Informationen innerhalb von 30 Minuten nach der Biopsieentfernung verfügbar sind, was von Vorteil sein kann, wenn eine Pathologie schnell erkannt werden muss. Dies ist bei der intraoperativen Beratung der Fall, die während einer Krebsoperation diagnostische Informationen liefert und häufig den weiteren Verlauf des Eingriffs festlegt. Der Standardarbeitsablauf erfordert den Transport der Biopsieprobe zur Pathologieabteilung, wo sie in ein Einbettungsmedium (Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur) eingebettet, eingefroren und mithilfe eines Kryostats in dünne Scheiben geschnitten wird. Anschließend werden die Objektträger mit H&E-Färbung präpariert und Pathologen beurteilen mithilfe eines Mikroskops zahlreiche Merkmale, darunter die Art der Läsion (d. h. ihre Bösartigkeit)30,50. Unser Arbeitsablauf umgeht die Schritte des Einfrierens und Färbens, könnte direkt vor Ort durchgeführt werden und ermöglicht die Erkennung von Malignität auf der Grundlage der automatisierten Bewertung physikalischer Parameter einzelner Zellen.

Über die intraoperative Diagnose hinaus zeigen wir, dass die Methode für die schnelle Untersuchung von IBD-Proben nützlich ist. Die klinische Diagnose von IBD erfordert in den meisten Fällen die Kombination verschiedener Tests, einschließlich einer Blutuntersuchung, einer Stuhluntersuchung, einer Endoskopie und einer histologischen Analyse von Schleimhautbiopsien51,52. Die histologische Bewertung gewinnt bei IBD zunehmend an Bedeutung, da das histologische Ausmaß der Entzündung mit dem Wiederauftreten der Erkrankung, der Wahrscheinlichkeit einer Operation und dem Krebsrisiko korreliert. Wir zeigen, dass der Grad der Gewebeentzündung in einer Dickdarmbiopsieprobe durch die Überwachung des physikalischen Phänotyps der Zellen mittels RT-FDC ermittelt werden kann, ohne dass eine Färbung oder eine Expertenbewertung erforderlich ist. Wir gehen davon aus, dass die Methode zur Überwachung zeitlicher Entzündungsveränderungen eingesetzt werden könnte, um das Fortschreiten der Krankheit und das Ansprechen auf die Behandlung zu beurteilen und ein objektives diagnostisches Bewertungssystem für die tägliche klinische Praxis bereitzustellen, das derzeit bei IBD fehlt.

Frühere Studien an Krebszellen haben einen starken Zusammenhang zwischen Bösartigkeit und den mechanischen Eigenschaften der Zellen gezeigt10,11,12,46,49,53. Hier nutzen wir diese Korrelation zur Erkennung von Malignität in menschlichen Gewebebiopsien. RT-FDC untersucht die Verformbarkeit von Zellen mit hoher Durchsatzrate, indem Zellen in einem Mikrofluidikkanal einer Scherströmung ausgesetzt werden; und es ermöglicht die mechanische Phänotypisierung einzelner Zellen mithilfe eines analytischen Modells und numerischer Simulationen54,55. Unter der Annahme einer anfänglichen kugelförmigen Zelle unter normalen (spannungsfreien) Bedingungen kann RT-FDC einen Elastizitätsmodul als quantitatives Maß für die Zellsteifigkeit liefern. In heterogenen Gewebeproben, wie sie in dieser Studie verwendet wurden, sind die Zellen jedoch oft nicht kugelförmig, bevor sie in den Mikrofluidikkanal gelangen, und es kann kein Elastizitätsmodul erhalten werden. Dennoch kann der Verformungsgrad in diesem Standard-Verformungstest als qualitatives Maß für die Verformbarkeit interpretiert werden und die den Bildern innewohnenden Verformungsinformationen erweisen sich als wertvoller diagnostischer Marker. Die PCA von murinen Dickdarmproben und menschlichen kolorektalen Biopsien ergab, dass die Zellverformung unter standardisierten Kanalflussbedingungen der Schlüssel zur Unterscheidung zwischen gesundem und tumorösem Gewebe in den untersuchten Biopsietypen ist. Dies unterstreicht die Einzigartigkeit der Informationen, die diese Methode liefert und die derzeit in der routinemäßigen Diagnosepraxis fehlen, die bisher hauptsächlich auf histologischer Beurteilung beruht. Im Anschluss an diese Proof-of-Concept-Studie muss untersucht werden, ob die Methode auf verschiedene Krebsarten oder Gewebe angepasst werden kann. Wir gehen davon aus, dass sich Veränderungen der Zellverformbarkeit bei bestimmten Krebsarten stärker manifestieren als bei anderen. Es kann bestimmte Anwendungsbereiche geben, in denen die Methode Potenzial zur Verbesserung der diagnostischen Praxis hat.

Für den praktischen klinischen Einsatz wird es von Vorteil sein, die Gewebeverarbeitung und die Analyse des Einzelzellphänotyps in einer einzigen automatisierten Pipeline zu integrieren. Obwohl die mechanische Dissoziation mit einem TG eine effiziente Möglichkeit ist, einzelne Zellen aus Geweben für diagnostische Anwendungen zu gewinnen, wird es wichtig sein, die manuellen Handhabungsschritte wie das Filtern und Konzentrieren von Zellen zu reduzieren. Allerdings ist sie auch in ihrer jetzigen Form schneller und kostengünstiger als die enzymatische Gewebeaufbereitung. Ein wesentlicher Vorteil der mechanischen Dissoziation bestand darin, dass die Verarbeitungszeit pro Probe weniger als 5 Minuten dauerte, im Gegensatz zu mehreren zehn Minuten oder sogar mehreren Stunden bei enzymatischen Dissoziationsprotokollen. Darüber hinaus erfordern enzymatische Protokolle typischerweise probenabhängige Reagenzien, die oft teuer sind und spezielle Lagerbedingungen erfordern, wohingegen die mechanische Dissoziation in Standardkulturmedium durchgeführt werden kann. Obwohl unterschiedliche enzymatische Protokolle oft für die Anreicherung spezifischer Zelltypen eingesetzt werden, glauben wir, dass die Einzelzellsuspension aus der mechanischen Dissoziation möglicherweise repräsentativer für die tatsächlichen Populationen im Gewebe ist und daher für eine unvoreingenommene Untersuchung der Zelllandschaft geeignet ist. Eine schnelle Dissoziation hat auch das Potenzial, die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Zellen in einem Zustand nahezu in situ zu bewahren; Bei anderen Ansätzen ist es wahrscheinlich, dass sich diese Eigenschaften mit längeren Verarbeitungszeiten verschlechtern. Aufgrund der Geschwindigkeit der mechanischen Dissoziation können Zellen weniger proteomische oder transkriptionelle Veränderungen erfahren, die bekanntermaßen während der enzymatischen Verarbeitung auftreten34,57,58,59,60. Zur Beurteilung dieser Annahmen sind weitere vergleichende und molekulare Studien erforderlich.

Zukünftig werden Untersuchungen an größeren Patientenkohorten es ermöglichen, maschinelles Lernen für diagnostische oder prognostische Entscheidungen zu nutzen. Künstliche Intelligenz unterstützt Pathologen bereits bei der Untersuchung histologischer Vollbildbilder, der Diagnose von Krebs oder der Klassifizierung von Tumoren61,62,63. Die großen Datensätze, die durch die RT-FDC-Analyse gewonnen werden und aus Tausenden von Zellbildern und mehrdimensionalen Informationen bestehen, eignen sich für solche Ansätze der künstlichen Intelligenz. In dieser Studie haben wir uns auf Parameter konzentriert, die aus Bildern in Echtzeit berechnet wurden. Zusätzliche physikalische Phänotypparameter können jedoch nach der Erfassung berechnet und als weitere Eingaben für maschinelles Lernen verwendet werden, beispielsweise Form- oder Texturmerkmale. Zukünftige Arbeiten werden sich auch auf die Korrelation zwischen den physikalischen Phänotypdaten und der Bewertung der Tumormalignität, dem Metastasierungspotenzial und der Überlebensrate konzentrieren.

Schließlich besteht ein wichtiger Aspekt der Methode darin, dass der physikalische Phänotyp von Zellen zur Identifizierung von Zellpopulationen im Gewebe verwendet werden kann, entweder völlig markierungsfrei oder synergistisch mit molekularen Markern, wodurch die Fluoreszenzmessungen verbessert werden. Darüber hinaus kann dank der kürzlich zu RT-FDC36 hinzugefügten Sortiermodalität eine bestimmte Zellpopulation anhand von Parametern isoliert werden, die aus Bildern in Echtzeit oder mithilfe trainierter neuronaler Netze berechnet werden64,65. Dies könnte zur Anreicherung uncharakterisierter Zellpopulationen im Gewebe für die nachgelagerte Omics-Analyse oder sogar für Zwecke der regenerativen Medizin eingesetzt werden, beispielsweise für die markierungsfreie Isolierung von aus Gewebe stammenden Stammzellen.

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die physikalische Phänotypisierung von Zellen mittels RT-FDC nach enzymfreier mechanischer Gewebedissoziation eine schnelle und einfache Methode ist, mit der pathologische Zustände in Gewebebiopsien diagnostiziert werden können. Insbesondere kann es eine schnelle und unvoreingenommene Vorhersage des Krankheitszustands bei entzündlichen Erkrankungen und bösartigen Erkrankungen ermöglichen.

Alle Tierversuche wurden in Zusammenarbeit mit der Klinik für Innere Medizin 1 des Universitätsklinikums Erlangen unter Einhaltung aller institutionellen und ethischen Richtlinien durchgeführt und durch entsprechende Tierversuchsantrag Nr. 55.2.2-2532-2-1032/55.2 abgedeckt. 2-2532-2-473). Tierversuche wurden geschlechts- und altersangepasst durchgeführt, wobei für jedes Experiment Wurfgeschwister verwendet wurden. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Tiere verwendet. Alle Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations routinemäßig auf Krankheitserreger untersucht. Die Mäuse wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 20–23 °C und 40–60 % Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Versuche wurden nach den Richtlinien des Anstaltsausschusses Tierpflege und Tiernutzung der Landesregierung Mittelfranken durchgeführt. Die Tiere wurden durch Genickbruch getötet und die Organe operativ entfernt. Zum Vergleich der enzymatischen und TG-Verarbeitung wurden weibliche und männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8–19 Wochen verwendet. Dem enzymatischen Dissoziationsprozess ging die Perfusion des Lungen- und Lebergewebes voraus. Zur mechanischen Dissoziation mithilfe einer TG wurden die Organe gründlich mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen, bevor sie in Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS), gegeben und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelegt wurden. Enzymatische Protokolle wurden der Literatur entnommen und sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Sowohl für die enzymatischen Protokolle als auch für die TG wurde das Gewicht des verwendeten Gewebes aufgezeichnet. Am Ende des Dissoziationsverfahrens wurde die Gesamtzellausbeute mit einem LUNA-Zellzähler gezählt.

Immundefiziente Rag1–/– Mäuse erhielten 1 Million CD4+ CD25– T-Zellen über eine intraperitoneale Injektion. Mononukleäre Zellen wurden aus der Milz von C57/BL6-Spendermäusen isoliert und mithilfe der magnetisch aktivierten Zellsortiertechnologie gereinigt, bevor sie wie zuvor beschrieben in immundefiziente Mäuse injiziert wurden66,67. Die Tiere wurden 3 Wochen nach dem Zelltransfer getötet und das Dickdarmgewebe wurde wie im Abschnitt „Gewebedissoziation und Einzelzellpräparation“ beschrieben verarbeitet.

Um eine spezifische Deletion eines für Darmepithelzellen spezifischen Proteins mit einer Schlüsselrolle für die Epithelintegrität zu erzeugen, wurden Mäuse, die LoxP-Cre trugen, flankiert für das spezifische Protein, mit VillinCre-Mäusen gekreuzt. Im Dickdarm wurde eine spontane Tumorentstehung mit einer Penetranz von 100 % beobachtet.

Chirurgisch resezierte menschliche Biopsieproben (bezogen vom Pathologischen Institut Erlangen) aus Tumor oder gesundem Gewebe wurden sofort in Advanced DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % GlutMAX, 1 % HEPES und 1 % Penicillin/Streptomycin, gegeben und bei 4 °C gelagert C, sofort verarbeitet oder zur späteren Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Es wurden übereinstimmende Probenpaare analysiert, wobei von jedem Patienten zwei Proben stammten: eine Tumorprobe und eine Kontrollprobe, die aus gesundem Gewebe um den Tumor herum stammte.

Die Biopsieproben wurden nicht speziell für diese Forschungsstudie entnommen, sondern waren Teil der Standardpraktiken der Patientenversorgung. Von den Patienten, die Proben zur Verfügung stellten, wurde eine Einverständniserklärung eingeholt, und alle Experimente wurden gemäß der Erklärung von Helsinki durchgeführt. Das Protokoll zur Gewinnung menschlicher Biopsieproben für diese Studie wurde durch Ethikvoten des Universitätsklinikums der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (24. Januar 2005, 18. Januar 2012; Institutional Review Board des Universitätsklinikums der Friedrich-Alexander-Universität) genehmigt Erlangen-Nürnberg-Zulassungsnummer: Re.-Nr. 4607).

Die ergänzenden Tabellen 5–10 enthalten die Populationsmerkmale und pathologischen Informationen für alle analysierten menschlichen Proben. Die in den Stromatumor infiltrierenden Lymphozyten und der Stromagehalt der Tumore wurden von Pathologen wie zuvor beschrieben bewertet68.

Die Gewebedissoziation wurde mit einem TG (Fast Forward Discoveries GmbH) durchgeführt, wie in Lit. beschrieben. 34,35. Kurz gesagt wurde die Gewebeprobe in kleine Stücke von etwa 1–2 mm geschnitten und mit 800 μl DMEM, ergänzt mit 2 % FBS, in die Rotoreinheit des TG gegeben. Die Rotoreinheit wurde im Deckel eines 50-ml-Falcon-Röhrchens positioniert; Der Statoreinsatz mit einem 100 μm-Zellsieb wurde oben auf der Rotoreinheit platziert. Ein 50-ml-Falcon-Röhrchen wurde auf den Deckel gelegt, verschraubt und auf dem TG-Gerät positioniert (Abb. 1). Die Mahlprozessparameter für jeden Gewebetyp sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst. TG-Protokolle wurden vom Hersteller mit einigen geringfügigen Änderungen bereitgestellt34,35. Nach dem Mahlvorgang wurde das Falcon-Röhrchen auf ein Gestell gestellt, geöffnet und das Zellsieb mit 5 ml DMEM, 2 % FBS gewaschen. Der Durchfluss wurde in ein 15-ml-Falcon-Röhrchen überführt und 8 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet mit 2 ml PBS, 2 % FBS gewaschen, durch ein Durchflusszytometrieröhrchen mit rundem Boden und Zellsiebdeckel geleitet und 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in dem hochviskosen Messpuffer resuspendiert, der unter Verwendung von 0,6 % (Gew./Gew.) Methylcellulose (4.000 cPs; Alfa Aesar), verdünnt in PBS ohne Calcium und Magnesium, hergestellt und auf eine Osmolalität von 270–290 mOsm kg−1 eingestellt wurde und pH 7,4. Die Viskosität des Puffers wurde mit einem Viskosimeter (HAAKE Falling Ball Viscometer Type C, Thermo Fisher Scientific) auf (25 ± 0,5) mPa s−1 bei 24 °C eingestellt.

RT-FDC-Messungen wurden wie zuvor beschrieben13,14 unter Verwendung eines AcCellerator-Instruments (Zellmechanik Dresden GmbH) durchgeführt. Die Zellsuspension wurde in eine 1-ml-Luer-Lok-Spritze (BD Biosciences) aufgezogen, die an einer Spritzenpumpe befestigt und über einen PEEK-Schlauch (IDEX Health & Science LLC) mit einem Mikrofluidikchip aus Polydimethylsiloxan verbunden war, der auf einem Deckglas befestigt war. Eine zweite mit reinem Messpuffer gefüllte Spritze wurde am Chip angebracht und zur hydrodynamischen Fokussierung der Zellen im Verengungskanal verwendet. Der mikrofluidische Chip bestand aus einem Probeneinlass, einem Hülleneinlass und einem Auslass, die durch eine zentrale Kanalverengung mit einem quadratischen Querschnitt von 20 × 20, 30 × 30 oder 40 × 40 μm und einer Länge von 300 μm verbunden waren. Die entsprechenden verwendeten Gesamtflussraten betrugen: 0,06 µl s für 20 µm-1-Kanäle, 0,12 µl s-1 für 30 µm-Kanäle und 0,2 µl s-1 für 40 µm-Kanäle. Das Verhältnis von Hülle zu Probenfluss betrug 3:1. Der Chip wurde auf dem Tisch eines inversen Hochgeschwindigkeitsmikroskops montiert, das mit einer komplementären Hochgeschwindigkeits-Metalloxid-Halbleiterkamera ausgestattet war. Die Laserleistung für jedes Fluorophor wurde entsprechend angepasst, basierend auf Einzelfärbungskontrollen und einer ungefärbten Probe. Von jeder Zelle wurde ein Bild in einem interessierenden Bereich von 250 × 80 Pixeln mit einer Bildrate von 2.000 fps aufgenommen. Morphologische, mechanische und Fluoreszenzparameter wurden in Echtzeit erfasst. Der Fluoreszenzschwellenwert für jeden Antikörper wurde entsprechend einer ungefärbten Zellprobe aus demselben Gewebe angepasst. In der Ergänzungstabelle 3 sind die in Echtzeit und während der Nachbearbeitungsanalyse erfassten Merkmale aufgeführt. ausführlich in früheren Veröffentlichungen beschrieben69,70. Die Daten wurden mit der ShapeIn-Software (ShapeIn2; Zellmechanik Dresden GmbH) erfasst.

Bei Bedarf wurden Einzelzellsuspensionen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 200 μl der entsprechenden Antikörper (zur Antikörperverdünnung siehe Ergänzungstabelle 4), verdünnt in PBS, ergänzt mit 0, 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich) und Fc-Rezeptorblockierung, inkubiert Reagenz der entsprechenden Spezies (Miltenyi Biotec, Mensch: 130-059-901; Maus: 130-092-575). Die Antikörper wurden durch Zugabe von 1 ml PBS und 2 % FBS gewaschen und 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Das endgültige Zellpräparat wurde dann im Messpuffer resuspendiert, bevor es zur RT-FDC-Analyse auf den Mikrofluidikchip geladen wurde. Bei gefrorenen Biopsieproben wurde das Gewebe in vorgewärmtes DMEM gelegt, 10 Minuten lang mit 10 % FBS ergänzt und vor der Verarbeitung wie oben beschrieben auftauen gelassen.

RT-FDC-Daten wurden mit öffentlichen Paketen in Python 3.7 analysiert. Für das anfängliche Laden, Vorverarbeiten und Filtern der Daten wurde die Bibliothek Dclab 0.32.3 verwendet71. Um Bilder von Trümmern, beschädigten Zellen und roten Blutkörperchen zu entfernen, verwendeten wir Gates für eine minimale Querschnittsfläche (20 µm2), ein Flächenverhältnis (1:1,1) und ein Seitenverhältnis (1:2). Kleine Zellen <60 µm2 wurden durch zusätzliches Gating für ein Flächenverhältnis von 1:1,05 und ein Seitenverhältnis von 1:2 identifiziert. Alle Ereignisse außerhalb dieser Tore und alle Ereignisse <5 µm2 wurden als Trümmer betrachtet. In den Streudiagrammen der RT-FDC-Parameter erfolgt die Farbcodierung anhand von Kerndichteschätzungen, die zwischen 0 und 1 normalisiert sind.

Die statistische Analyse wurde mit dem Paket SciPy 1.3.0 durchgeführt. Der Wilcoxon-Signed-Rang-Test wurde verwendet, um gepaarte Proben zu bewerten (gesunde Mausproben im Vergleich zu Tumorproben und frische menschliche Dickdarmgewebeproben im Vergleich zu gefrorenen Proben). Auf Daten zur Transferkolitis wurde ein Mann-Whitney-U-Test angewendet. In Diagrammen werden P-Werte durch * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001 dargestellt. Die Effektgrößen wurden als r = |z|/√N berechnet, wobei z die z-Statistik des Tests und N die Anzahl der Stichproben ist. Die Effektgrößen wurden gemäß den Cohen-Kriterien wie folgt beurteilt: 0,1–0,3 kleiner Effekt, 0,3–0,5 mäßiger Effekt und >0,5 großer Effekt. Die Pearson-Korrelation wurde durchgeführt, um die Korrelation zwischen Zelldeformation und der Anzahl der CD45+-Zellen sowie die Korrelation zwischen Zellgröße und Fläche von gesunden Mäuse- und Tumorproben zu beurteilen.

Für die weitere Datenverarbeitung und -analyse wurde das Paket Scikit learn 0.23.2 verwendet72. Die aus RT-FDC erhaltenen Parameter wurden transformiert, indem jedes Merkmal auf den Bereich zwischen 0 und 1 skaliert wurde. PCA wurde zur linearen Dimensionsreduktion verwendet, wobei die Singulärwertzerlegung der Daten zur Projektion auf einen zweidimensionalen Raum (PC1 gegenüber PC2) verwendet wurde. Die logistische Regression wurde für die Klassifizierung gesunder und Tumorproben verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die für Abb. generierten und analysierten RT-FDC-Datensätze. 2–5 und erweiterte Datenabbildungen. 3–5 sind im Deformability Cytometry Open Repository (https://dcor.mpl.mpg.de/organization/soteriou-kubankova)73 verfügbar. Individuelle Kennungen für jeden Datensatz finden Sie in der Ergänzungstabelle 11. Quelldaten für die erweiterten Daten in Abb. 1 werden ebenfalls mit diesem Dokument bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Python-Code für die Verarbeitung und Visualisierung von RT-FDC-Daten ist unter https://github.com/marketakub/physical_phenotyping_tissues verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken R. Grützmann und K. Bende (Universitätsklinikum Erlangen) für die freundliche Unterstützung bei der Bereitstellung von Biopsieproben. Wir danken außerdem J. Kayser und M. Urbanska für die kritische Durchsicht des Artikels. Wir danken der DFG für finanzielle Unterstützung (SFB/TRR241 „IBDome“ an R.LP., MW, RA und MN; FOR2438 an MN; DI 1537/20-1, DI 1537/22-1, SFB CRC1181 und SFB TR221 an JD), das IZKF Erlangen (Forschungsstipendium A79 an JD und das Clinician Scientist Program Stufe 2 an ME) und die Kernfinanzierung der Max-Planck-Gesellschaft (an JG).

Open-Access-Förderung durch die Max-Planck-Gesellschaft.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Despina Soteriou, Markéta Kubánková.

Max Planck Institute for the Science of Light and Max-Planck-Zentrum für Physik und Medizin, Erlangen, Germany

Despina Soteriou, Markéta Kubánková, Christine Schweitzer & Jochen Guck

Medizinische Abteilung 1 – Gastroenterologie, Pneumologie und Endokrinologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) und Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Deutschland

Dew Lopez-Inns, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Raja Atreya und Markus F. Neurath

Deutsches Zentrum für Immuntherapie (DZI), Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU) and University Hospital Erlangen, Erlangen, Germany

Dew Lopez-Posadas, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei, Maximilian Waldner, George HW Distler, Raja Atreya und Markus F. Neurath

Comprehensive Cancer Center Erlangen-EMN (CCC ER-EMN), Erlangen, Deutschland

Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock, Raja Atreya, Markus F. Neurath & Arndt Hartmann

Klinik für Innere Medizin 3 – Rheumatologie und Immunologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) und Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Deutschland

Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei & Jörg HW Distler

Klinische Gesundheitstechnologien, Fraunhofer IPA, Mannheim, Deutschland

Stefan Scheuermann & Jens Langejürgen

Institute of Pathology, University Hospital, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg (FAU), Erlangen, Germany

Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock & Arndt Hartmann

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MK, DS und JG konzipierten die Studie und leiteten den Projektfortschritt. DS und MK koordinierten die Experimente und Analysen. DS entwickelte experimentelle Protokolle und führte Experimente zusammen mit CS durch. Die Datenanalyse und -visualisierung wurde von MK durchgeführt. Andere Autoren unterstützten die Experimente und beteiligten sich an kritischen Diskussionen. MK und DS haben das Papier verfasst, wobei alle Autoren Feedback gaben.

Correspondence to Jochen Guck.

SS, JL und JG sind Mitbegründer der Firma Fast Forward Discoveries GmbH, die die TG-Technologie kommerzialisiert. DS, MK und JG werden als Erfinder einer Patentanmeldung für die Kombination von TG und RT-DC für die Diagnose solider Biopsien genannt. MK und JG sind Mitbegründer der Firma Rivercyte GmbH, die diagnostische Anwendungen der Deformationszytometrie vermarktet. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Dino Di Carlo, Per Uhlen und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a,b, Prozentsatz lebensfähiger Zellen für verschiedene Organe, dissoziiert mit einem Gewebezerkleinerer (TG; rot markiert) oder Standarddissoziation (blau markiert). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung von (a) Propidiumiodid und RT-FDC und (b) Trypanblau-Ausschlusstest bewertet. c, Anzahl der Zellen (erhalten mit einem Zellzählgerät) pro mg verarbeitetem Gewebe. Mit enzymatischer Dissoziation verarbeitete Lunge, Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse und Magen wurden vor den Experimenten nicht gewichtet. Die Linie stellt den Mittelwert dar und das Kästchen erstreckt sich vom Minimal- bis zum Maximalwert. TG-Daten Niere und Milz: n = 5, alle anderen Organe n = 5; für enzymatische Dissoziation Niere, Bauchspeicheldrüse, Magen: n = 3; alle anderen Organe n = 4; biologisch unabhängige Wiederholungen, die als unabhängige Experimente durchgeführt werden).

Quelldaten

a: Repräsentative Streudiagramme der Fluoreszenzintensitäten in drei verschiedenen Detektionskanälen von RT-FDC, die die Möglichkeit der Verwendung fluoreszierender Zelloberflächenmarker zur Charakterisierung der Zellen zeigen. Die Diagramme zeigen die Expression eines Endothelmarkers (CD31-PE) im Vergleich zum Leukozytenmarker (CD45-FITC); und ein Epithelmarker (EpCAM-APC) vs. CD45-FITC. b, Repräsentative Bilder von Zellen und ihre entsprechenden Fluoreszenzspuren; Die zeitliche Form des Fluoreszenzpeaks entspricht der subzellulären Lokalisierung des Fluorophors. Oben von links nach rechts: Zelle negativ für alle Marker, eine Zelle positiv für CD45; Unten von links nach rechts: Zelle nur positiv für EpCAM und Zelle positiv nur für CD31.

Repräsentative Streudiagramme des Seitenverhältnisses gegenüber der Zellgröße von Zellen, die aus a, Thymus, c, Milz und e, Niere der Maus isoliert wurden, zeigen die Gating-Strategie zur Identifizierung von Zelldubletts. In b, Thymus und d, Milz und f, Niere identifizierte Zelldubletts mit entsprechenden Fluoreszenzspuren (b,d), die einen Leukozyten (CD45) zeigen, der an eine Endothelzelle (CD31) gebunden ist, oder (f) die Interaktion zweier Leukozyten.

a, Streudiagramme der Verformung vs. Zellgröße für Zellen, die mithilfe eines Gewebezerkleinerers (TG) oder enzymatischer Dissoziation aus Mäuselebergewebe isoliert wurden. Sie zeigen die Anreicherung von Hepatozyten nach mechanischer Dissoziation für drei unabhängige biologische Wiederholungen. b, Streudiagramm der Verformung vs. Zellgröße, das 3 Zellcluster zeigt, die Hepatozyten unterschiedlicher Größe entsprechen; mit dem entsprechenden KDE-Diagramm (Kernel Density Estimate) und repräsentativen Bildern (r = Zellradius). c, Prozentsatz der Hepatozyten an der Gesamtzahl der Leberzellen, nachgewiesen durch RT-DC für fünf unabhängige biologische Wiederholungen. d, Streudiagramme der Verformung vs. Zellgröße für Zellen, die aus Mäuselungengewebe mithilfe eines Gewebezerkleinerers oder enzymatischer Dissoziation für 3 unabhängige biologische Wiederholungen isoliert wurden.

Streudiagramme der Zellgröße vs. Verformung einzelner Zellen, die entweder aus frischen (lila) oder gefrorenen (grün) Dickdarmbiopsieproben extrahiert wurden; a, gesunde Probe; b, Tumorprobe; einschließlich 3 repräsentativer Zellbilder für jedes Diagramm mit einer Maßstabsleiste = 10 μm2. Die KDE-Diagramme (Kernel Density Estimate) auf der rechten Seite entsprechen den Streudiagrammen auf der linken Seite. Die Histogramme zeigen die Verteilungen von Zellgröße und Verformung. c, Mediane und Standardabweichungen von Zellgröße, Verformung, Flächenverhältnis und Seitenverhältnis von frischen (N = 6) und entsprechenden gefrorenen (N = 6) Proben. Die Kästchen erstrecken sich vom 25. bis zum 75. Perzentil mit einer Linie am Median; Whisker überspannen das 1,5-fache des Interquartilbereichs. Statistische Vergleiche wurden unter Verwendung eines zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rang-Tests, der Standardabweichung der Zellgröße (*p = 0,0277, r = 0,64), des mittleren Flächenverhältnisses (*p = 0,0277, r = 0,64) und des Standardabweichungsflächenverhältnisses (*S = 0,0277, r = 0,64); r: Effektgröße; NS: nicht signifikant.

Abbildungen, Tabellen und Referenzen.

Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Soteriou, D., Kubánková, M., Schweitzer, C. et al. Schnelle physikalische Einzelzell-Phänotypisierung mechanisch dissoziierter Gewebebiopsien. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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Eingegangen: 01. Dezember 2021

Angenommen: 22. Februar 2023

Veröffentlicht: 06. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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