Nachricht

Oct 25, 2023

TREM2+ und interstitiell

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1914 (2023) Diesen Artikel zitieren

1262 Zugriffe

10 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die immunpathologischen Mechanismen, die die Entwicklung einer schweren COVID-19-Erkrankung vorantreiben, sind nach wie vor unzureichend geklärt. Hier verwenden wir ein Rhesusaffen-Modell einer akuten SARS-CoV-2-Infektion, um Störungen im angeborenen Immunsystem darzustellen. SARS-CoV-2 initiiert eine schnelle Infiltration plasmazytoider dendritischer Zellen in die unteren Atemwege, die mit der IFNA-Produktion, der Aktivierung natürlicher Killerzellen und einem signifikanten Anstieg der CD14-CD16+-Monozyten im Blut einhergeht. Um den Beitrag von Lungen-Myeloid-Untergruppen zur Atemwegsentzündung zu untersuchen, erstellen wir einen longitudinalen scRNA-Seq-Datensatz von Atemwegszellen und kartieren diese Untergruppen den entsprechenden Populationen in der menschlichen Lunge. Eine SARS-CoV-2-Infektion löst eine schnelle Rekrutierung von zwei Makrophagen-Untergruppen aus: CD163+MRC1- und TREM2+-Populationen, die die Hauptquelle für entzündliche Zytokine darstellen. Die Behandlung mit Baricitinib (Olumiant®), einem JAK1/2-Inhibitor, beseitigt wirksam den Zustrom nicht-alveolärer Makrophagen und verringert gleichzeitig die Zahl der entzündlichen Zytokine. Diese Studie beschreibt die wichtigsten Lungenmakrophagen-Untergruppen, die eine Atemwegsentzündung während einer SARS-CoV-2-Infektion verursachen.

Die COVID-19-Pandemie begann mit einer Reihe von Berichten über lokale Ausbrüche einer Lungenentzündung, die durch ein neuartiges Coronavirus, SARS-CoV-2, in Wuhan, China, im Dezember 20191,2 verursacht wurde. Bis Anfang 2023 gab es über 672 Millionen dokumentierte Infektionen und fast 7 Millionen Todesfälle, die auf Folgen von COVID-19 zurückzuführen sind. Die schnelle Entwicklung und Verfügbarkeit wirksamer Impfstoffe3,4,5 gegen eine SARS-CoV-2-Infektion hat den dringend benötigten Optimismus geweckt, dass die Infektionsraten sinken werden und die Eindämmung des Virus auf Bevölkerungsebene möglich ist. Trotz dieser bahnbrechenden Erfolge sind weitere Forschungsanstrengungen unerlässlich, um sich vor potenziellen bahnbrechenden Varianten zu schützen, Therapien für die Betroffenen zu entwickeln, während die Einführung des Impfstoffs andauert, und um die Auswirkungen künftiger Virusausbrüche zu verhindern oder zu minimieren. Vor diesem Hintergrund ist die Grundlagenforschung zu den angeborenen und adaptiven Immunantworten auf SARS-CoV-2 weiterhin von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Impfstoffen und therapeutischen Ansätzen, die auf die Beendigung der COVID-19-Pandemie oder die Senkung der Sterblichkeit abzielen.

Seit dem Auftreten der COVID-19-Pandemie hat die Forschung zur Virologie, Immunantwort und Pathogenese der SARS-CoV-2-Infektion in einem beispiellosen Tempo zugenommen, und es sind zahlreiche Hypothesen entstanden, um die zugrunde liegenden Mechanismen einer schweren COVID-19-Erkrankung zu erklären. Von diesen Konzepten gibt es die meisten unterstützenden Belege: (1) Umgehung oder Beeinträchtigung früher Interferon-(IFN)-Reaktionen vom Typ I6, (2) Gefäßkomplikationen aufgrund von Hyperkoagulabilitätssyndromen7 und (3) Störungen der Granulozyten und Myeloidzellen Kompartimente in den unteren Atemwegen und im Blut, was sich in einer entzündlichen Zytokinproduktion äußert8,9. Immunologisch gesehen wurde eine schwere Erkrankung bei COVID-19-Patienten mit einem weit verbreiteten Anstieg der Konzentrationen von Entzündungsmediatoren (z. B. CXCL10, IL-6 und TNFα) im Plasma und in der bronchoalveolären Lavage (BAL)-Flüssigkeit in Verbindung gebracht, was üblicherweise als a bezeichnet wird „Zytokinsturm“10 und eine Ausbreitung von Makrophagen, Neutrophilen und Lymphozyten in den unteren Atemwegen8. Trotz dieser beeindruckenden Datenanhäufung sind die genauen frühen immunologischen Ereignisse und die Infiltration von Immunzellen, die Entzündungen in den unteren Atemwegen auslösen, noch nicht charakterisiert.

Modelle nichtmenschlicher Primaten (NHP) der SARS-CoV-2-Infektion (hauptsächlich Makakenarten und Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGMs)) haben sich als entscheidende Werkzeuge erwiesen, vor allem aufgrund der Fähigkeit, frühe Ereignisse nach der Infektion im Längsschnitt und nicht in Geweben zu untersuchen in den meisten Humanstudien verfügbar11. NHPs unterstützen ein hohes Maß an Virusreplikation in den oberen und unteren Atemwegen12,13,14, teilen die Gewebeverteilung von ACE2 und TMPRSS2 mit Menschen15 und waren unschätzbare präklinische Modelle für Impfstoffe16,17,18 und Therapeutika19,20. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass leichtes bis mittelschweres COVID-19 bei SARS-CoV-2-infizierten NHPs erneut auftritt11, die typischerweise 10–15 Tage nach der Infektion (dpi) verschwinden11,20,21. Mechanistische Studien zur SARS-CoV-2-Infektion in NHPs nutzten verschiedene Hochdurchsatztechniken und berichteten, dass (1) IFN-Reaktionen vom Typ I stark im Blut und in den unteren Atemwegen sehr früh nach der Infektion induziert werden20,22, (2) erhöht proinflammatorische Zytokine, die mit dem beim Menschen beobachteten „Zytokinsturm“ übereinstimmen, sind im Plasma und im BAL nachweisbar23, (3) Gefäßpathologie und Genexpression im Zusammenhang mit Hyperkoagulabilität sind in den unteren Atemwegen offensichtlich22 und (4) erhöhte Produktion von entzündlichen Zytokinen durch Myeloide Ursprungszellen20,24.

In der aktuellen Studie verwendeten wir SARS-CoV-2-infizierte Rhesusaffen (RMs), um die frühen Entzündungsereignisse im Blut und in den unteren Atemwegen mithilfe hochdimensionaler Durchflusszytometrie, Multianalyt-Zytokin-Detektion sowie Massen- und Einzelzell-RNA zu untersuchen -Seq (scRNA-Seq). Um die Rolle einzelner Immununtergruppen innerhalb der myeloischen Fraktion bei SARS-CoV-2-bedingten Entzündungen zu untersuchen, verwendeten wir zwei verschiedene Strategien: Wir verwendeten scRNA-Seq- und Bulk-RNA-Seq-Referenzdatensätze, um die Makrophagen-/Monozytenpopulationen zu klassifizieren und zu identifizieren analoge Populationen in menschlichen Atemwegsdatensätzen. Mit diesem Ansatz identifizierten wir die wichtigsten Untergruppen entzündungsfördernder Makrophagen, die sich nach einer SARS-CoV-2-Infektion ausdehnen und die Hauptquelle für entzündliche Zytokine in den Atemwegen sind. Wir beobachteten auch eine frühe Induktion plasmazytoider dendritischer Zellen (pDCs) im Blut und in den unteren Atemwegen, die mit dem Höhepunkt der IFN-Signalübertragung zusammenfiel. Abschließend haben wir beschrieben, dass die Behandlung von SARS-CoV-2-infizierten RMs mit Baricitinib, einem JAK1/2-Inhibitor, vor kurzem nachweislich die Krankenhausaufenthaltszeit und die Mortalität bei Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung reduzierte25 und die Entzündung der Atemwege unterdrückte, indem die Infiltration entzündungsfördernder Makrophagen verhindert wurde der Alveolarraum. Insgesamt definiert diese Studie die frühe Kinetik der pDC-Rekrutierung und Typ-I-IFN-Reaktionen und identifiziert diskrete Untergruppen infiltrierender Makrophagen als vorherrschende Quelle der proinflammatorischen Zytokinproduktion bei SARS-CoV-2-Infektionen.

Eine Übersicht über das Studiendesign ist in Abb. 1a dargestellt. Wir haben drei separate Kohorten von Makaken analysiert: Kohorte 1, mit Baricitinib behandelt und Kohorte 2. Für Kohorte 1 und mit Baricitinib behandelte wurden insgesamt acht RMs (Durchschnittsalter 14 Jahre; Bereich 11–17 Jahre) intranasal und intratracheal geimpft mit 1,1 × 106 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) von SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020). Bei 2 dpi begannen vier der acht Tiere mit der Verabreichung von Baricitinib20. Für diese Studie umfassen die Ausgangszeitpunkte vor der Infektion und die hyperakuten Zeitpunkte (1–2 dpi) n = 8 RMs, alle unbehandelt, und die verbleibenden Längsschnittzeitpunkte, die zur Bestimmung der Pathogenese der SARS-CoV-2-Infektion bewertet wurden, umfassen n = 4 der RMs, die unbehandelt blieben. Die Inokulation mit SARS-CoV-2 führte zu reproduzierbar hohen Virustitern, die in den oberen und unteren Atemwegen durch genomische und subgenomische qPCR-Assays nachweisbar waren (Abb. 1b). Der Höhepunkt der Virämie im Nasengang, Rachen und BAL lag bei 2–4 dpi (Abb. 1b). Um die Leistung unserer scRNA-Seq- und Durchflusszytometrie-Experimente zu erhöhen, haben wir weitere sechs Makaken analysiert, die mit der gleichen Dosis und dem gleichen Stamm von SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) infiziert waren (Durchschnittsalter 10,5 Jahre). ; Bereich 6–19,5 Jahre alt), bezeichnet als Kohorte 2. Tiere aus Kohorte 2 dienten als SARS-CoV-2-infizierte, unbehandelte Kontrollen im Rahmen einer größeren Studie, in der die Auswirkungen der Interferonblockade getestet wurden26.

ein Studiendesign; RMs wurden intranasal und intratracheal mit SARS-CoV-2 infiziert und in Längsrichtung verfolgt (Kohorte 1: n = 4, Baricitnib-Kohorte: n = 4, Kohorte 2: n = 6). Baricitinib wurde täglich an 4 RMs (Baricitinib-Kohorte) verabreicht, beginnend mit 2 dpi. Die 4 RMs aus Kohorte 1 und 6 RMs aus Kohorte 2 waren unbehandelt. (Erstellt mit BioRender.com). b Nach der SARS-CoV-2-Inokulation wurden Nasen-, Rachen- und bronchoalveoläre Spülungen (BAL) gesammelt und die Viruslast durch qRT-PCR für Gesamt-gRNA und sgRNA quantifiziert. c Längsschnittwerte von Monozyten in BAL und Blut, dargestellt als % der CD45+-Zellen. p-Werte: CD14−CD16+ Monozyten Blut: 1 dpi vs. −5 dpi = 0,03 und 2 dpi vs. −5 dpi = 0,004; CD14+CD16+ Monozyten Blut 2 dpi vs. −5 dpi = 0,004. d Längsspiegel der plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) in BAL und Blut, dargestellt als Prozentsatz der CD45+-Zellen. p-Wert für pDCs Blut 2 dpi vs. −5 dpi = 0,02. e Längsschnittwerte von NK-Zellen, die Granzym B in BAL und Blut exprimieren. p-Werte für Granzyme B+ NK-Zellen 2 dpi vs. −5 dpi BAL = 0,01 und Blut = 0,008. n = 8 RM aus Kohorte 1 und Baricitinib-Kohorte. Die roten Balken stellen den Mittelwert dar. Die statistische Analyse wurde mithilfe des einseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Tests in Graphpad Prism v7.02 durchgeführt, wobei jeder Zeitpunkt mit –5 dpi verglichen wurde. *p-Wert <0,05, **p-Wert <0,01. Quelldaten (b–e) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die angeborene Immunantwort nach einer SARS-CoV-2-Infektion zu charakterisieren, analysierten wir Veränderungen in angeborenen Populationen mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie in Blut- und BAL-Proben in den ersten 2 dpi, der „hyperakuten“ Phase der Infektion (Abb. 1c–e). und ergänzende Abbildung 1) und über den gesamten Infektionsverlauf (ergänzende Abbildung 2). Im Blut beobachteten wir weder bei 2 dpi (Abb. 1c) noch zu längeren Zeitpunkten (ergänzende Abb. 2a, d) einen signifikanten Anstieg des Anteils klassischer Monozyten (CD14 + CD16−). Ähnlich wie bei Berichten beim Menschen9 beobachteten wir einen schnellen, aber vorübergehenden Anstieg der CD14-CD16+- und CD14+CD16+-Monozyten im Blut (Abb. 1c und ergänzende Abb. 2a, d). Unter Verwendung dieser herkömmlichen Marker für Blutmonozyten-Untergruppen konnten wir keine signifikanten Veränderungen bei CD14-CD16+, CD14+CD16+ oder CD14-CD16+ innerhalb der BAL beobachten (Abb. 1c und ergänzende Abb. 2a).

Wir beobachteten einen signifikant erhöhten pDC-Spiegel im Blut bei 2 dpi und in ähnlicher Weise einen Trend erhöhter pDCs in BAL-Proben (Abb. 1d und ergänzende Abb. 2c, f). Diese Erweiterung war vorübergehend, da die pDC-Zahlen um 4 dpi auf den Ausgangswert zurückkehrten. Während sich die Gesamthäufigkeit der natürlichen Killerzellen (NK) im Blut oder in der BAL nicht veränderte (ergänzende Abbildung 2b, e), stiegen der Anteil und die absolute Anzahl der Granzyme B + NK-Zellen bei 2 dpi im Blut signifikant von 4 auf 25 % (Abb. 1e) und blieb während des gesamten Infektionsverlaufs erhöht (ergänzende Abb. 2b, e). In ähnlicher Weise wurde auch in der BAL ein Anstieg der NK-Zellaktivierung beobachtet, der bei 2 dpi von 12 auf 33 % anstieg (Abb. 1e) und auf diesem Niveau bis zum Abschluss der Studie bei 10/11 dpi anhielt (ergänzende Abb. 2b, z. B ). Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass es während der hyperakuten Phase der SARS-CoV-2-Infektion zu einer erheblichen Mobilisierung angeborener Immunzellen kommt, die in der Lage sind, Effektorreaktionen des Typ-I-IFN-Systems auszulösen und zu orchestrieren.

Um das Ausmaß der durch eine SARS-CoV-2-Infektion hervorgerufenen immunologischen Störungen zu verstehen, führten wir umfangreiche Genexpressionsprofile von PBMC- und BAL-Proben durch. Während der hyperakuten Phase führte die BAL zu einer weit verbreiteten Induktion von Signalwegen, die mit angeborener Immunität und Entzündung verbunden sind (Abb. 2a). Insbesondere beobachteten wir eine schnelle und robuste Induktion von Interferon-stimulierten Genen (ISGs) in den PBMC- und BAL-Kompartimenten ab 1 oder 2 dpi (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3a). Obwohl die ISG-Reaktion weit verbreitet war, war sie mit 10/11 dpi weitgehend auf den Ausgangswert zurückgekehrt (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3a). Wir stellten auch einen Trend zu erhöhtem IFNα-Protein bei 4/6 bzw. 5/8 Tieren in BAL und Plasma fest (Abb. 2c, d) und einen signifikanten Anstieg der RNA-Seq-Lesezahlen, die auf IFNA-Gene bei 2 dpi in BAL abgebildet wurden (Abb. 2e), was mit der Ausbreitung von pDCs in den Atemwegen und im Blut zusammenfiel (Abb. 1d). Eine signifikante Anreicherung von Genen, die die Zytotoxizität von NK-Zellen darstellen (Abb. 2a), wurde bei 2 dpi in BAL beobachtet, was mit unserer Beobachtung erhöhter Granzyme B + NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie übereinstimmt (Abb. 1e). Zusammengenommen belegen diese Daten das Vorhandensein von Primärzellen, die in der Lage sind, IFNs vom Typ I (d. h. pDCs) zu produzieren, was mit nachweisbaren IFNA-Transkripten und -Proteinen sowie mit nachgeschalteten IFN-induzierten Effektorfunktionen (ISGs, NK-Zellaktivierung) nach SAR-CoV zusammenfällt -2-Infektion und dass diese Reaktionen vorübergehender Natur waren und um 10/11 dpi weitgehend abgeklungen waren.

n = 8 RM aus Kohorte 1 und Baricitinib-Kohorte für −5 dpi und 2 dpi, mit Ausnahme von (c), wo n = 6 (3 RM Kohorte 1 + 3 RM Baricitinib-Kohorte) bei 2 dpi. n = 4 RM aus Kohorte 1 ab 4 dpi. a Punktdiagramme, die normalisierte Anreicherungswerte und nominale p-Werte für Gensätze zeigen. Die Anreicherung wird durch die Punktfarbe angezeigt (rot: positiv angereichert vs. –5 dpi; blau: negativ angereichert), die Punktgröße gibt die Signifikanz an. Normalisierte Anreicherungswerte und nominale p-Werte wurden mithilfe von GSEA65 bestimmt. Die genauen nominalen p-Werte sind in den Zusatzdaten 1 enthalten. b Heatmap der Längsreaktionen für den ISG-Gensatz. Die Farbskala zeigt den log2-Ausdruck relativ zum Median der −5-dpi-Proben an. c Zytokinbewertung (Mesoscale) in BALF-p-Werten für 2 dpi vs. −5 dpi: IL6 = 0,02 und IP-10 = 0,03 und d Plasma; Es werden nur signifikante Zytokine angezeigt (p-Werte für 2 dpi vs. −5 dpi: IP-10 = 0,008, MCP-1 = 0,008, MCP-2 = 0,004). e Summe der normalisierten Expression aller IFNA-Gene in BAL. *p-Wert = 0,04. f GSEA-Anreicherungsdiagramm, das eine negative Anreicherung der AM-Gensignatur (abgeleitet von SingleR) beim Vergleich von BAL-RNA-Seq-Massenproben von 4 dpi bis −5 dpi zeigt (nomineller p-Wert = 0). Der rote Balken stellt den Mittelwert dar. Die statistische Analyse für (c)–(e) wurde unter Verwendung des einseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Tests in R v4.2.2 durchgeführt, wobei jeder Zeitpunkt mit –5 dpi verglichen wurde. *p-Wert <0,05, **p-Wert <0,01. Quelldaten (c–e) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir beobachteten, dass eine SARS-CoV-2-Infektion eine signifikante Anreicherung mehrerer inflammatorischer Zytokin-Signalwege, nämlich IFNA, IL4, IL6, IL10, IL12, IL23 und TNF, sowie der Chemokinwege CXCR4 und CXCR3 sowohl in PBMCs als auch in BAL von RMs induzierte. mit höherer Größe im BAL (Abb. 2a und ergänzende Daten 1–3). Für viele dieser Wege konnten wir signifikante Erhöhungen des vorgeschalteten Regulators entweder auf Protein- oder mRNA-Ebene oder auf beiden quantifizieren: Die IL6-Proteinspiegel waren in der BAL-Flüssigkeit (BALF) signifikant erhöht (Abb. 2c). RNA-Transkripte in BAL (ergänzende Abbildung 3b). In ähnlicher Weise stimmte die Induktion der CXCR3-Signalübertragung mit dem Nachweis eines erhöhten IP10/CXCL10-Proteins in BALF und RNA bei 2 dpi in BAL überein (Abb. 2c und ergänzende Abb. 3b). In zahlreichen Studien am Menschen wurde über das Auftreten von Entzündungswegen im Blut und in den Atemwegen berichtet (Übersicht in Lit. 27). Wir haben jedoch festgestellt, dass eine SARS-CoV-2-Infektion auch die frühe Expression mehrerer immunregulatorischer/immunsuppressiver Signalwege im BAL vorantreibt, nämlich: PD1- und CTLA4-Signalisierung sowie negative Regulatoren der MAP-Kinase und der DDX58/RIG-I-Signalisierung (Abb. 2a). . Zuvor haben wir berichtet, dass die myeloische Fraktion in BAL in erster Linie für die Produktion entzündungsfördernder Mediatoren verantwortlich ist, die spezifischen Immunphänotypen wurden jedoch nicht definiert. Um das Vorhandensein verschiedener Makrophagen-Untergruppen in den unteren Atemwegen nach einer SARS-CoV-2-Infektion weiter zu untersuchen, führten wir eine GSEA an Massen-BAL-Daten unter Verwendung der für RM-Lungenmakrophagen spezifischen AM-Gensignatur (erhalten von SingleR28) durch. Wir beobachteten, dass für Alveolarmakrophagen (AMs) spezifische Gene zu Studienbeginn signifikant angereichert waren (–5 dpi) im Vergleich zu 4 dpi, was auf eine Herunterregulierung dieses Gensatzes nach einer SARS-CoV-2-Infektion hinweist (Abb. 2f). Insgesamt deuten diese RNA-Seq-Massendaten auf eine schnelle und signifikante Verschiebung des Gleichgewichts der Makrophagenpopulationen in den unteren Atemwegen nach einer SARS-CoV-2-Infektion hin.

In unserer früheren Arbeit zu RMs haben wir gezeigt, dass Zellen myeloischen Ursprungs die vorherrschende Untergruppe sind, die für die Produktion entzündlicher Zytokine in den unteren Atemwegen nach einer SARS-CoV-2-Infektion verantwortlich ist20. Während unsere früheren scRNA-Seq-Analysen ergaben, dass die Mehrzahl der Zellen im BAL nach der Infektion Monozyten-/Makrophagen-Ursprung mit relativ wenigen Neutrophilen oder Granulozyten waren, konnten die genauen Immunphänotypen der myeloischen Zellen, die die Entzündung in den unteren Atemwegen auslösen, nicht genau beschrieben werden .

Die Zellklassifizierung auf der Grundlage von Zelloberflächen-Markergenen ist in scRNA-Seq-Daten aufgrund der technologiebedingten Genausfälle typischerweise problematisch. Eine genaue Klassifizierung wird im Rhesus-Modellsystem noch komplizierter, da Genomreferenzen unvollständige Annotationen aufweisen und Marker von anderen Modellarten möglicherweise keine Phänokopie aufweisen. In jüngster Zeit wurden mehrere bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung der in der Lunge vorhandenen Gewebemakrophagen-Untergruppen und ihrer Funktion bei Virusinfektionen und Entzündungen erzielt29,30,31,32. Die Analyse von scRNA-Seq-Daten aus RM-Lungensuspensionen und BAL im Steady-State-Zustand zeigte jedoch, dass mehrere Schlüsselmarker, die zur Differenzierung von Makrophagen in der Mauslunge verwendet werden (z. B. Lyve1), nicht in ausreichender Menge exprimiert wurden, um Populationen im Rhesus-Lungenmyeloid zu unterscheiden Populationen (Ergänzende Abbildung 7). Daher verwendeten wir zwei überlappende alternative Strategien, um Gewebemakrophagen und von Monozyten abgeleitete/infiltrierende Makrophagen im RM-Atemweg nach einer SARS-CoV-2-Infektion in unseren scRNA-Seq-Daten genau zu klassifizieren. Die erste Strategie basierte auf der Verwendung vorhandener Lungen-scRNA-Seq-Daten von nicht infizierten RMs als Referenz für die Kartierung und Kommentierung der BAL-Zellen. Wir haben Lungen-10X-Daten von drei nicht infizierten RMs (NCBI GEO: GSE149758)33 über die Seurat-Pipeline34 verarbeitet und die vier gemeldeten Makrophagen-/Monozyten-Untergruppen reproduziert: CD163+MRC1+, ähnlich alveolären Makrophagen; CD163+MRC1+TREM2+ Makrophagen, ähnlich infiltrierenden Monozyten; CD163+MRC1−, ähnlich wie interstitielle Makrophagen; und CD16 + nicht-klassische Monozyten (Ergänzende Abbildung 4a – d). Wir haben Seurat verwendet, um BAL-Makrophagen/Monozyten aus SARS-CoV-2-infizierten RMs zu kartieren und Anmerkungen aus der Lungenreferenz zu übertragen. Die zweite Strategie umfasste die Verwendung von Bulk-RNA-Seq auf sortiertem AM und IM aus der Lunge von drei nicht infizierten RMs35 gemäß dem von Cai et al.36 definierten Phänotyp, basierend auf der Expression von CD206/MRC1 und CD163, um Zellen mit SingleR28 Supplementary zu annotieren Abb. 4e, f). Insgesamt wurde festgestellt, dass 2069 Gene zwischen IMs und AMs unterschiedlich exprimiert werden (FDR <0, 05, Fold-Change > 2) (ergänzende Abbildung 4e). Bemerkenswert ist, dass CX3CR1 in den IMs hochreguliert war, was sowohl mit murinen als auch mit menschlichen Definitionen dieser Untergruppe übereinstimmt (ergänzende Abbildung 4f). APOBEC3A, eine RNA-editierende Cytidin-Desaminase, wurde in IMs ebenfalls hochreguliert, zusammen mit PTGS2, einem entzündungsfördernden COX-2-Cyclooxygenase-Enzym, TIMP1, das die Migration von Zellen über den Abbau von Bindegewebe ermöglicht, VCAN, einem immunsuppressiven Regulator, und PDE4B , das die Expression von TNFα reguliert (ergänzende Abbildung 4f). Wir haben die Lungenmakrophagen-/Monozyten-Untergruppen mithilfe der massensortierten AM- und IM-Datensätze annotiert und festgestellt, dass fast der gesamte CD163+MRC1+-Cluster und einige CD163+MRC1+TREM2+-Zellen als AM und die übrigen als IM annotiert waren (ergänzende Abbildung 4g). Der Vergleich unserer Lungen-scRNA-Seq-basierten Referenz mit rudimentären transkriptomischen Bulk-Signaturen zeigte somit ihre Genauigkeit bei der Auflösung des AM-Phänotyps von Nicht-AM unter Steady-State-Bedingungen.

Als nächstes analysierten wir Veränderungen in den myeloischen Populationen innerhalb der BAL von RMs nach einer SARS-CoV-2-Infektion, indem wir diese Signaturen auf zwei unabhängige scRNA-Seq-Datensätze von Rhesusaffen anwendeten, die intranasal und intratracheal mit 1,1 × 106 PFU des USA-WA1/2020 infiziert waren Stamm von SARS-CoV-2: Kohorte 1, bestehend aus einem Datensatz von n = 3 (Grundlinie und 4 dpi)20 und Kohorte 2, bestehend aus n = 5 (Grundlinie) und n = 6 (4 dpi)26. Unter Verwendung der Lungen-/scRNA-Seq-Referenz stellten wir fest, dass die meisten BAL-Makrophagen/Monozyten zur AM-ähnlichen CD163+MRC1+-Makrophagen-Untergruppe bei –5 dpi gehörten, zusammen mit einigen Zellen aus der CD163+MRC1+TREM2+-Makrophagen-Untergruppe (Abb. 3a, b und ergänzende Abb. 5a). Bei 4 dpi kam es zu einem Zustrom sowohl von CD163+MRC1+TREM2+-Makrophagen als auch von IM-ähnlichen CD163+MRC1−-Makrophagen, wobei nur wenige Zellen als nichtklassische CD16+-Monozyten gekennzeichnet waren. Die Expression von Genmarkern wie MARCO, FABP4 und CHIT1 unterstützte die Annotationen der Zelluntergruppen zusätzlich (Abb. 3c). Wir beobachteten auch einen ähnlichen Anstieg von APOBEC3A und einen Rückgang der Expression der Alveolarmakrophagen-assoziierten Gene MARCO und CHIT1 in BAL-Proben, die mittels Bulk-RNA-Seq analysiert wurden, was auf einen Verlust von CD163+MRC1+-Zellen hinweist (Abb. 3d). Durch die Analyse der sc-RNA-Seq-Datensätze verringerte sich der Gesamtprozentsatz der CD163+MRC1+-Makrophagen zu Studienbeginn im Vergleich zu 4 dpi von 93,3 % auf 55 % und von 89,3 % auf 63,1 % aller Makrophagen/Monozyten in BAL in den Kohorten 1 und 2 bzw. (Abb. 3e, f). Schätzungen der Zellfrequenzen in gepoolten scRNA-Seq-Datensätzen können durch unausgeglichene Zellzahlen aus einzelnen Proben bestimmt werden. Um dieser möglichen Verzerrung Rechnung zu tragen, haben wir die Veränderungen der Myeloidpopulationen bei einzelnen Tieren untersucht. Wir beobachteten, dass in Kohorte 1 die CD163+MRC+-Zellen von durchschnittlich 90,2 % (Standardabweichung = 5,2 %) auf durchschnittlich 65,4 % (Standardabweichung = 32 %) abnahmen, p = ns, und in Kohorte 2 sanken sie signifikant von durchschnittlich 92 %. (sd = 5,1 %) bedeutet 65,7 % (sd = 16,4 %) p = 0,0087 (Abb. 3g, h). Im Gegensatz dazu sahen wir insgesamt einen Anstieg des Prozentsatzes der CD163+MRC1+TREM2+-Makrophagen von 6,5 auf 36,8 % (Kohorte 1) und 10,3 auf 19,8 % (Kohorte 2) (Abb. 3e, f). Auf individueller Ebene beobachteten wir, dass die Konzentrationen von CD163+MRC1+TREM2+-Zellen von durchschnittlich 9,7 % (Standardabweichung = 5,3 %) auf durchschnittlich 28,6 % (Standardabweichung = 25,2 %) in Kohorte 1 (p = ns) und durchschnittlich 7,7 % anstiegen. (sd = 4,9 %) bedeutet 20,0 % (sd = 10,4 %) (p = 0,03) (Abb. 3g, h). Darüber hinaus beobachteten wir einen Anstieg der IM-ähnlichen CD163+MRC1−-Makrophagen: in den gepoolten scRNA-Seq-Daten von 0,2 auf 8 % in Kohorte 1 und 0,4 auf 17 % in Kohorte 2 (Abb. 3e, f). Bei einzelnen Tieren stiegen die CD163+MRC1−-Zellen von durchschnittlich 0,15 % (Standardabweichung = 0,19 %) auf durchschnittlich 5,9 % (Standardabweichung = 6,9 %) in Kohorte 1 und signifikant von durchschnittlich 0,28 % (Standardabweichung = 0,18 %) auf durchschnittlich 14,2 %. (sd = 9,1 %) (p = 0,004) (Abb. 3g, h). Somit führte eine SARS-CoV-2-Infektion zu einem Zustrom von aus Monozyten stammenden und IM-ähnlichen Makrophagen in BAL bei 4 dpi.

a Projektion einzelliger Makrophagen/Monozyten aus –5 dpi (grün) und 4 dpi (magenta) 10X BAL-Proben von drei SARS-CoV-2-infizierten Rhesusaffen (Kohorte 1) auf die Referenz-UMAP von Lungenmakrophagen/Monozyten aus nicht infizierte Rhesusaffen (NCBI GEO: GSE14975833). b UMAP-Projektionen, die die vorhergesagten Zelltypanmerkungen basierend auf der nicht infizierten Lungenreferenz, aufgeschlüsselt nach Zeitpunkt der Probenentnahme (Kohorte 1), zeigen. c DotPlots, die die Expression von Markergenen für die verschiedenen Makrophagen-/Monozyten-Untergruppen in SARS-CoV-2-infizierten BAL-Proben (Kohorte 1) zeigen. d Log2-Faltungsänderungen im Vergleich zu –5 dpi für APOBEC3A, CHIT1 und MARCO in Massen-BAL-RNA-Seq-Daten (Kohorte 1). Die Signifikanz wurde mit DESeq2 bestimmt. Die mit der Standardmethode von Benjamini und Hochberg korrigierten p-Werte wurden verwendet: *adj p-Wert <0,05, ***adj p-Wert <0,001. Die genauen p-Werte sind in den Zusatzdaten 2 enthalten. Prozentsatz einer bestimmten Teilmenge aller Makrophagen-/Monozyten-Teilmengen bei –5 dpi und 4 dpi von allen drei gepoolten Tieren (Kohorte 1) (e) und bei –7 dpi und 4 dpi von allen sechs gepoolten Tieren (Kohorte 2) (f). Prozentsatz einer bestimmten Teilmenge aller Makrophagen-/Monozyten-Teilmengen für jedes Tier bei −5 dpi und 4 dpi aus Kohorte 1 (n = 3) (g) und bei −7 dpi (n = 5) und 4 dpi (n = 6). ) für Kohorte 2 (h). Die schwarzen Linien geben den Median an. p-Werte für Kohorte 2 (f) für 4 dpi vs. −7 dpi: CD163+MRC1+ = 0,009, CD163+MRC1+TREM2+ = 0,03 und CD163+MRC1− = 0,004. Beitrag jeder Makrophagen-/Monozyten-Untergruppe zur Produktion der proinflammatorischen Gene und ISG – Kohorte 1 gepoolt (i), Kohorte 2 gepoolt (j), Kohorte 1 Individuum (k) und Kohorte 2 Individuum (l). p-Werte für (l): * = 0,03. Der prozentuale Beitrag wurde berechnet, indem die Summe der normalisierten Expression eines bestimmten Gens in einer Makrophagen-/Monozyten-Untergruppe durch die Summe der normalisierten Expression des Gens in allen Makrophagen-/Monozyten-Untergruppen dividiert wurde. a–c, e, g, i, k Kohorte 1: n = 3 für sowohl −5 dpi als auch 4 dpi, d Kohorte 1: n = 8 für 2 dpi und n = 4 für 4 dpi, f, h, j, l Kohorte 2: n = 5 für −7 dpi und n = 6 für 4 dpi. Die schwarzen Linien geben den Median an. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des zweiseitigen Wilcoxon-Singed-Rank-Tests für (g, k, l) und des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests für (h) in R v4.2.2 durchgeführt. *p-Wert <0,05, **p-Wert <0,01. Quelldaten (d–l) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um unsere Zellklassifizierung weiter zu validieren und die Beobachtung zu untermauern, dass es die infiltrierenden Zellen sind, deren Zahl zunimmt und überwiegend Entzündungsmediatoren produziert, haben wir die zweite Strategie verwendet, bei der wir die Genexpression von in großen Mengen sortierten AM- und IM-Zellen zur Klassifizierung der BAL-Makrophagen/Monozyten nutzen. Anhand dieser Definition haben wir bestätigt, dass der Anteil der Nicht-AM-Bevölkerung zunimmt und die AM-Bevölkerung entsprechend abnimmt (ergänzende Abbildung 5b, d). Es wurde auch festgestellt, dass die Nicht-AM-Population eine höhere Expression entzündungsfördernder Zytokine aufwies (ergänzende Abbildung 5e).

Die Analyse der differentiellen Expression von 4-dpi- und −5-dpi-BAL-Makrophagen/Monozyten zeigte, dass CHIT1, MARCO und MRC1 zu den Genen mit der höchsten Herunterregulierung im BAL gehörten, während dies bei Genen wie ADAMDEC137 und S100A838 der Fall war, die mit von Monozyten abgeleiteten Makrophagen assoziiert sind gehören zu den am stärksten hochregulierten (Supplementary Data 4). Diese Daten zeigen, dass unsere Beobachtung eines Zustroms infiltrierender Makrophagen in den BAL bei 4 dpi über mehrere Definitionen dieses Phänotyps hinweg konsistent war.

Aufgrund unserer Beobachtung der Dynamik von Lungenmakrophagen im Alveolarraum während der frühen SARS-CoV-2-Infektion haben wir die Transkriptionsveränderungen in jeder Makrophagen-/Monozytenpopulation (Abb. 3) und auch in herkömmlichen myeloischen dendritischen Zellen charakterisiert. Myeloische DCs waren in sehr geringer Häufigkeit vorhanden (<2 %), und es wurde festgestellt, dass insgesamt nicht mehr als 70 Zellen nach der Infektion mRNA von TNF, IL6 oder IL10 enthielten. Die IL1B-Expression war etwas höher, machte jedoch <2, 5% der IL1B-exprimierenden Zellen im BAL bei 4 dpi aus (ergänzende Abbildung 6a – e). Mehrere Chemokine (CCL4L1, CCL3, CXCL3, CCL2), mehrere ISGs, NFKB1A, S100A8 und GZMB gehörten bei 4 dpi zu den am stärksten hochregulierten Genen in BAL-Populationen (Supplementary Data 4). Eine erhöhte Expression mehrerer Entzündungsgene, einschließlich IL6, TNF, IL10 und IL1B, wurde in den Untergruppen CD163+MRC1+TREM2 Mac und CD163+MRC1− sowohl in Kohorte 1 als auch 2 beobachtet (Abb. 3i – l und ergänzende Abb. 7). ) nach einer Infektion. Es wurde auch beobachtet, dass die infiltrierenden Makrophagen mehrere Chemokine hochregulieren, einschließlich derjenigen, die spezifisch für die Rekrutierung von Neutrophilen (CXCL3, CXCL8), Makrophagen (CCL2, CCL3, CCL5, CCL4L1) und aktivierten T-Zellen (CXCL10) sowie mehrerer ISGs sind (Ergänzende Abbildungen). 7 und 8). Als wir CD163+MRC1+-Makrophagen untersuchten, waren viele der gleichen entzündlichen Zytokine und Gensätze, die in den infiltrierenden Makrophagen zu sehen waren, um 4 dpi erhöht, wenn auch in viel geringerem Ausmaß (ergänzende Abbildungen 7 und 8). Nachdem wir im Vergleich zu CD163+MRC1+-Makrophagen eine signifikant höhere durchschnittliche Expression inflammatorischer Zytokine in infiltrierenden Makrophagen beobachtet hatten, verglichen wir die Fraktionen der Sequenzierungsablesungen, die aus jeder der Untergruppen erkannt wurden, um den Gesamtbeitrag zur Produktion inflammatorischer Zytokine zu bewerten (Abb. 3i). In Kohorte 1 beobachteten wir bei 4 dpi, dass die CD163+MRC1+TREM2+-Makrophagen 55 % der IL6-, 57 % der TNF- und 86 % der IL10-Expression ausmachten, während die CD163+MRC1−-Makrophagen 20 % der IL6-Expression ausmachten. 21 % der TNF- und 6 % der IL10-Expression (Abb. 3i). In Kohorte 2 beobachteten wir auch, dass die infiltrierenden Makrophagen mehr zur Expression der meisten entzündlichen Zytokine beitrugen als Alveolarmakrophagen: Die Expression in CD163+MRC1+TREM2+- und CD163+MRC1−-Zellen betrug 39,2 % und 47 % für IL10, 17,4 % und 17,4 % 74,9 % für IL6 und 22,4 % bzw. 46,6 % für TNF (Abb. 3j). Um eine mögliche Verzerrung der Zellzahlen in unseren gepoolten Daten zu berücksichtigen, haben wir auch die Beiträge von Zytokinen zur BAL-Expression bei einzelnen Tieren untersucht (Abb. 3k, l). In Kohorte 1 wurde der in den gepoolten Daten beobachtete Gesamttrend eines höheren Beitrags zur Entzündungsexpression in den infiltrierenden Makrophagenpopulationen nur für IL10 und CCL4L1 beobachtet, was größtenteils auf Ungleichgewichte bei der Zellzahl und eine geringe statistische Aussagekraft zurückzuführen ist (Abb. 3k). In Kohorte 2 beobachteten wir jedoch durchweg erhöhte Werte in den infiltrierenden CD163+MRC1+TREM2+- und CD163+MRC1−-Makrophagenpopulationen (Abb. 3l). Für IL10 betrug die mittlere ± sd-Expression in CD163+MRC1+ 17,3 ± 12,4 %, verglichen mit 40,4 ± 12,1 % in CD163+MRC1+TREM2+-Zellen (p = 0,03) und 42,3 ± 21,2 % für CD163+MRC1− (ns) ( Abb. 3l). Für IL6 betrug die mittlere ± SD-Expression in CD163+MRC1+ 9,4 ± 12,2 %, verglichen mit 12,2 ± 24,5 % in CD163+MRC1+TREM2+-Zellen (ns) und 78,4 ± 28,8 % für CD163+MRC1− (p = 0,065). Während unsere Beobachtung für IL6 einen signifikanten Trend zeigte, fanden wir außerdem eine große Variabilität in den Prozentsätzen in CD163+MRC1−-Zellen; Um dieses Problem anzugehen, analysierten wir einen weiteren Datensatz26, in dem wir die scRNA-Seq-Expression von BAL-Makrophagen nach 2 dpi einer SARS-CoV-2-Infektion erhielten – diese Daten deuteten auch auf eine viel höhere Expression von IL6 in den CD163+MRC1−-Zellen hin ( 67,1 ± 32,4 % im Vergleich zu CD163+MRC1+-Makrophagen (27,7 ± 29,5 %) (ergänzende Abbildung 9). Für CCL4L1 trug CD163+MRC1+ 9,6 ± 6,3 % zur Expression bei, im Vergleich zu 23,7 ± 13,5 % in CD163+MRC1+TREM2+-Zellen (p = 0,03) und 66,7 ± 18,2 % in CD163+MRC1−-Zellen (p = 0,03). Der Beitrag verschiedener Untergruppen zur CXCL10-Expression betrug 19,2 ± 16,7 % bei CD163+MRC1+ im Vergleich zu 15,3 ± 9,3 % bei den CD163+MRC1+TREM2+- und 65,4 ± 15,2 % bei den CD163+MRC1−-Populationen. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die infiltrierenden Makrophagenpopulationen für den Großteil der entzündlichen Zytokinproduktion der unteren Atemwege während einer akuten SARS-CoV-2-Infektion verantwortlich sind.

Um den Anstieg der infiltrierenden myeloischen Populationen zu validieren, haben wir mittels Durchflusszytometrie die Häufigkeit von CCR2+ myeloischen Populationen im peripheren Blut und in der BAL von weiteren sechs SARS-CoV-2-infizierten Rhesusaffen quantifiziert (ergänzende Abbildung 10). Es wurde gezeigt, dass CCR2 die Monozyteninfiltration in das Lungenparenchym von SARS-CoV-2-infizierten Mäusen reguliert39 und seine Expression ist im BAL infiltrierender Makrophagen in mit Influenzaviren infizierten NHPs hochreguliert35. In Übereinstimmung mit unserer Beobachtung erhöhter infiltrierender myeloischer Zellen durch scRNA-Seq stellten wir fest, dass es gleichzeitig zu einem Anstieg der Häufigkeit von CCR2+ CD14−CD16+- und CD14+CD16+-Monozyten bei 2 dpi kam. Diese Ergebnisse unterstützen die Infiltration von entzündlichen Monozyten in BAL nach einer SARS-CoV-2-Infektion weiter.

Um unsere Ergebnisse im NHP-Modell auf eine menschliche SARS-CoV-2-Infektion zu übertragen, verwendeten wir einen ähnlichen bioinformatischen Ansatz wie bei der Definition von Rhesus-Myeloid. Wir verwendeten Makrophagen/Monozyten aus öffentlich zugänglichen scRNA-Seq-Datensätzen der Lunge von sechs gesunden menschlichen Spendern (GEO: GSE13589340) und klassifizierten diese basierend auf einer aktuellen Klassifizierung in FABP4hi, SPP1hi, FCN1hi und proliferierende Makrophagen41 (Abb. 4a). Beim Vergleich der kanonischen Markergene zwischen den gesunden Lungenmakrophagen/Monozyten von Menschen und Rhesusaffen stellten wir fest, dass es zwischen beiden vergleichbare Populationen gab (Abb. 4a – c). Die CD163+MRC1+-Rhesus-Untergruppe war nämlich der menschlichen FABP4hi-Untergruppe sehr ähnlich; die Rhesus-Untergruppe CD163+MRC1+TREM2+ stimmte mit der menschlichen Untergruppe SPP1hi überein; und die CD163+MRC1−-Makrophagen und CD16+-Monozyten-Rhesus waren der menschlichen FCN1hi-Untergruppe transkriptionell ähnlich. Als nächstes kombinierten wir Daten aller Makrophagen- / Monozytenzellen aus den sechs gesunden menschlichen Proben mit den drei gesunden Rhesusproben und wendeten in Seurat eine referenzbasierte Integration an, wobei wir die menschlichen Proben als Referenz verwendeten (ergänzende Abbildung 11a, b). Wir untersuchten die Verteilung verschiedener menschlicher und Rhesuszelltypen in jedem Cluster und stellten fest, dass die früheren Beobachtungen hinsichtlich der Ähnlichkeit von Teilmengen auf der Grundlage kanonischer Marker durch die globale Genexpression dieser Zellen weiter gestützt wurden (ergänzende Abbildung 11c). Um schließlich die Robustheit unserer zellulären Klassifizierungen zur genauen Identifizierung von Makrophagen-Untergruppen zwischen Arten zu testen, haben wir Gensignaturen für jede Untergruppe/Art-Kombination generiert und auf Anreicherung bei den entgegengesetzten Arten getestet. Bei allen Vergleichen erzielte eine Signatur mit der entsprechenden Gegenteilmenge die höchste Punktzahl (ergänzende Abbildung 11d).

eine UMAP von Makrophagen-Untergruppen in der Lunge von sechs gesunden menschlichen Spendern (GEO: GSE135893). b UMAP von Makrophagen-Untergruppen in der Lunge von drei gesunden Rhesusaffen (GEO: GSE149758). c DotPlots, die die Expression von Markergenen zeigen. Der Farbverlauf stellt den Grad der Expression dar und die Größe des Punkts stellt den Prozentsatz der Zellen dar, die ein bestimmtes Gen exprimieren. d UMAP von BAL-Proben von menschlichen Spendern, die gesund (n = 3) sind oder an mittelschwerem (n = 3) oder schwerem (n = 6) COVID-19 leiden (GEO: GSE145926), zugeordnet zur gesunden Lungenreferenz mithilfe des Seurat MapQuery-Funktion. e Prozentsatz der vorhergesagten Zelltypen aller Makrophagen/Monozyten in jeder menschlichen BAL-Probe. Der schwarze Balken gibt den Median an. Die statistische Analyse wurde mit dem paarweisen zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test in R v4.2.2 durchgeführt. p-Wert * = 0,02. Beitrag jeder vorhergesagten Makrophagen-/Monozyten-Untergruppe im menschlichen BAL zur Produktion der proinflammatorischen Gene und ISG – gepoolt (f) und individuell (g). Der prozentuale Beitrag wurde berechnet, indem die Summe der normalisierten Expression eines bestimmten Gens in einer Makrophagen-/Monozyten-Untergruppe durch die Summe der normalisierten Expression des Gens in allen Makrophagen-/Monozyten-Untergruppen dividiert wurde. Die schwarzen Balken stellen den Median dar. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Tests in R v4.2.2 durchgeführt. *p-Wert 0,03 für alle außer FABP4 vs. Proliferating für IL6, IL1B, TNF, CXCL3, CXCL8 und SPP1hi vs. Proliferating für CCR2: p-Wert = 0,04. Quelldaten (z. B. g) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unter Verwendung des gesunden menschlichen Datensatzes als Referenz klassifizierten wir Makrophagen/Monozyten aus dem myeloischen Cluster (ergänzende Abbildung 11e, f) in einem öffentlich verfügbaren scRNA-Seq-Datensatz menschlicher BAL-Proben von gesunden Spendern oder Probanden mit mittelschwerer oder schwerer COVID-19-Infektion8 (Abb. 4d und ergänzende Abb. 11g). Wie in der ursprünglichen Studie8 berichtet, stellten wir fest, dass es bei einer COVID-19-Infektion zu einem signifikanten Anstieg der SPP1hi- und FCN1hi-Untergruppen kam, während die FABP4hi-Population, die weitgehend repräsentativ für die residenten Alveolarmakrophagen ist, sowohl bei mittelschwerer als auch bei schwerer Infektion signifikant reduziert war COVID-19-Infektion (Abb. 4d, e). Darüber hinaus untersuchten wir auch den Beitrag dieser verschiedenen Populationen zur Entzündung und stellten fest, dass die nicht ansässigen SPP1hi- und FCN1hi-Untergruppen maßgeblich für die Expression entzündungsfördernder Mediatoren bei Patienten mit schwerem COVID-19 verantwortlich waren (Abb. 4f und Ergänzung). Abb. 12). Entsprechend (FABP4hi, SPP1hi und FCN1hi) betrug der Beitrag jeder Population zur Gesamtexpression: IL10 (1,3 %, 56,7 %, 42 %), IL1B (6,6 %, 37 %, 56 %), IL6 (2,4 %, 40,8). %, 56,7 %), TNF (1,6 %, 44,1 %, 54,1 %), CXCL10 (1,8 %, 36,5 %, 61,7 %) und CXCL8 (2,6 %, 48,1 %, 49,1 %) (Abb. 4f). Bemerkenswert ist, dass die ISG-Expression (IFI27, ISG15, ISG20, MX2) in den SPP1hi- und FCN1hi-Populationen im Vergleich zur FABP4hi bei schweren Erkrankungen, jedoch nicht in mittelschweren Fällen, signifikant hochreguliert war. Als wir schließlich den Beitrag der Zytokin-Expression bei einzelnen Patienten in diesem Datensatz untersuchten, stellten wir fest, dass wir bei schwerem COVID-19 beobachteten, dass die infiltrierenden Populationen eine signifikant höhere Expression von IL10 aufwiesen (Mittelwert ± Standardabweichung SPP1hi 50,9 ± 8,7 %, p = 0,03; FCN1hi 46,9 ± 8,3 %, p = 0,03), IL1B (Mittelwert ± SD SPP1hi 31,7 ± 14,9 %, p = 0,03; FCN1hi 63,3 ± 20,1 %, p = 0,03), TNF (Mittelwert ± SD SPP1hi 43,4 ± 9,3 % , p = 0,03; FCN1hi 53,7 ± 13,7 %, p = 0,03), CXCL10 (Mittelwert ± SD SPP1hi 27,3 ± 9,5 %, p = 0,03; FCN1hi 69,8 ± 11,1 %, p = 0,03), CXCL3 (Mittelwert ± SD SPP1hi 55,9 ± 9,6 %, p = 0,03; FCN1hi 37,6 ± 13 %, p = 0,06) und CXCL8 (Mittelwert ± SD SPP1hi 42,7 ± 14 %, p = 0,03; FCN1hi 53,4 ± 17,4 %, p = 0,03) im Vergleich zur FABP4hi-Population (Mittelwert). ± sd für IL10 2,2 ± 2,8 %, IL1B 4,7 ± 8,2 %, TNF 2,7 ± 4,5 %, CXCL10 2,6 ± 2,9 %, CXCL3 6,4 ± 9,5 % und CXCL8 3,8 ± 5,9 %) (Abb. 4g). Zusammengenommen zeigen diese Analysen, dass die in RMs transkriptionell definierten myeloischen Untergruppen analoge Populationen in der menschlichen Lunge aufweisen und eine allgemeine Übereinstimmung in ihrer Ausbreitung und ihrem Beitrag zu SARS-CoV-2-induzierten Entzündungen in den unteren Atemwegen aufweist.

Baricitinib ist ein JAK1/2-Inhibitor, der für die Behandlung von aktiver rheumatoider Arthritis zugelassen ist, der kürzlich von der FDA für die Behandlung von COVID-19 bei bestimmten hospitalisierten Erwachsenen zugelassen wurde42 und Berichten zufolge die Mortalität senkt, wenn er als Monotherapie43 oder in Kombination mit Remdesivir25 verabreicht wird. In unserer früheren Studie haben wir unter Verwendung von Daten aus Kohorte 1 und mit Baricitinib behandelten Tieren (Abb. 1a) festgestellt, dass Baricitinib die Expression proinflammatorischer Zytokine in der BAL von mit SARS-CoV-220 infizierten RMs unterdrücken konnte. Hier haben wir diese Studie erweitert, um den Einfluss von Baricitinib auf die myeloischen Populationen in den Atemwegen von fünf RMs vor der Infektion (−5 dpi) und bei 4 dpi weiter zu charakterisieren, wobei drei RMs unbehandelt blieben und zwei Baricitinib erhielten. Wir fanden heraus, dass eine zweitägige Verabreichung von Baricitinib den Zustrom von infiltrierenden Makrophagen in den Alveolarraum bei 4 dpi praktisch aufhob, da wir keinen Anstieg der CD163+MRC1−- oder CD163+MRC1+TREM2+-Populationen bei mit Baricitinib behandelten Tieren feststellen konnten (Abb . 5a–d). Diese Beobachtung stimmte überein, wenn Makrophagenklassifizierungen verwendet wurden, die entweder auf der Zuordnung zur 10-fachen Lungenreferenz oder auf der Grundlage sortierter AM/IM-Massenzellen basierten (Abb. 5a – d und ergänzende Abb. 5a – d). Die Behandlung mit Baricitinib verhinderte nicht nur den Zustrom infiltrierender Makrophagen, sondern führte auch zu einer deutlich geringeren Expression von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen, die ISG-Expression blieb jedoch vergleichbar mit unbehandelten Tieren (Abb. 5e – g und ergänzende Abb. 5e). Zusammenfassend verdeutlichen diese Daten den Wirkmechanismus, durch den die Behandlung mit Baricitinib die Atemwegsentzündung bei einer SARS-CoV-2-Infektion aufhebt20, indem sie ihre Fähigkeit belegen, die Infiltration einzelner proinflammatorischer Makrophagenpopulationen in das Alveolarkompartiment zu blockieren. Ähnlich wie bei unseren Beobachtungen mittels Durchflusszytometrie gab es einen Anstieg der pDC-Häufigkeit bei 4 dpi im BAL, der durch scRNA-Seq-Daten nachgewiesen wurde. Dieser Anstieg wurde jedoch bei mit Baricitinib behandelten Tieren aufgehoben (Abb. 5h, i).

a Projektion von Makrophagen/Monozyten aus –5 dpi und 4 dpi 10X BAL-Proben von drei unbehandelten und zwei mit Baricitinib behandelten Rhesusaffen auf der Referenz-UMAP nicht infizierter Lungenmakrophagen/Monozyten (NCBI GEO: GSE149758). b UMAP, aufgeteilt nach Behandlung und Zeitpunkt, zeigt vorhergesagte Zellanmerkungen basierend auf der Zuordnung zu den Referenz-Makrophagen/Monozyten der Lunge. Prozentsatz einer bestimmten Makrophagen-/Monozyten-Untergruppe aller Makrophagen/Monozyten in den BAL-Proben – gepoolt (c) und einzeln (d). Violindiagramme, die die Expression von proinflammatorischen Zytokinen (e), Chemokinen (f) und ISG (g) in den verschiedenen Makrophagen-/Monozyten-Untergruppen in BAL 10X-Proben aus mit Baricitinib behandelten und unbehandelten Proben zeigen. h Absolute Anzahl von pDC in BAL-Proben aus scRNA-Seq und i Prozentsatz von pDC aller Zellen in den BAL-Proben aus scRNA-Seq. Quelldaten (c, d, h, i) werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Mechanismen, durch die eine SARS-CoV-2-Infektion zu einer schweren Erkrankung führt, sind noch weitgehend unbekannt, bleiben aber eine wichtige Priorität bei der Reduzierung der Opferzahlen der COVID-19-Pandemie. Da die Symptome 2 bis 14 Tage nach der SARS-CoV-2-Infektion auftreten, ist die Charakterisierung der frühen immunologischen Ereignisse anhand klinischer Proben eine Herausforderung. Hier verwendeten wir das RM-Modell der SARS-CoV-2-Infektion und eine integrierte Systemanalyse, um die Immunantwort während einer hyperakuten Infektion zu analysieren. Unsere Ergebnisse waren: (1) Eine SARS-CoV-2-Infektion löste eine robuste Typ-I-IFN-Reaktion im Blut und in den unteren Atemwegen aus, die bei 1–2 dpi sichtbar war; (2) SARS-CoV-2 induzierte einen schnellen Zustrom von zwei infiltrierenden Makrophagenpopulationen in den bronchoalveolären Raum, was den Großteil der entzündlichen Zytokinproduktion auslöste; und (3) der Wirkungsmechanismus von Baricitinib, einem Medikament, das kürzlich von der FDA zur Behandlung von COVID-19 bei bestimmten hospitalisierten Erwachsenen zugelassen wurde42, besteht darin, die Infiltration dieser Entzündungszellen in die Atemwege zu verhindern. Unsere Daten stellen die bislang umfassendste Analyse der immunpathologischen Ereignisse dar, die während einer hyperakuten SARS-CoV-2-Infektion auftreten.

Anhand unserer Referenzdatensätze von RM-Lungenmakrophagen identifizierten wir zwei myeloische Zelluntergruppen, die sich beide deutlich von Alveolarmakrophagen unterscheiden und nach einer SARS-CoV-2-Infektion in die Atemwege eindringen und die Hauptproduzenten von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen der unteren Atemwege sind. Eine Population, definiert als CD163+MRC1+TREM2+-Zellen, war den murinen Definitionen infiltrierender CCR2+-Monozyten sehr ähnlich. Der zweite, CD163+MRC1−, ähnelte weitgehend interstitiellen Makrophagen. Unsere Daten stimmen mit einer kürzlichen Beobachtung eines schnellen (3 dpi) Anstiegs von IMs im BAL von RMs mithilfe der Durchflusszytometrie überein21. In ähnlicher Weise wurde eine Akkumulation von Nicht-AMs (definiert als CD16+CD206-HLA-DR+/CD11b+) und eine reziproke Reduktion von AMs im BAL und in der Lunge infizierter RMs und AGMs beobachtet23. Wir fanden heraus, dass diese myeloischen Untergruppen, die in NHPs transkriptionell definiert wurden, analoge Populationen in der menschlichen Lunge aufwiesen. Schließlich stimmen unsere Daten mit unseren jüngsten Erkenntnissen im Mausmodell überein, in dem SARS-CoV-2 die Rekrutierung zirkulierender Monozyten im Lungenparenchym auslöste, bei Mäusen mit CCR2-Mangel jedoch deutlich aufgehoben war39. Die CD163+MRC1+Mac/AM-ähnliche Untergruppe trug ebenfalls zum Entzündungsmilieu bei und produzierte IL6, TNF und IL10, wenn auch in deutlich geringeren Mengen.

Es ist wichtig zu beachten, dass unsere Beobachtungen während einer hyperakuten Infektion stattfanden und dass unsere Tiere keine schwere Erkrankung entwickelten. Obwohl unsere Daten darauf hinweisen, dass diese infiltrierenden Populationen frühe Entzündungen auslösen und möglicherweise zur Pathogenese der Atemwege beitragen, können wir diesen Zusammenhang nicht offiziell herstellen. Dieses Modell steht jedoch im Einklang mit aktuellen Daten von Ren et al.44, die einen signifikanten Verlust der MARCO-Expression in BAL-residenten myeloischen Populationen von Patienten mit schwerem COVID-19 im Vergleich zu Patienten mit mittelschwerer Erkrankung beobachteten, ähnlich wie unsere Beobachtungen wodurch das Auftreten infiltrierender Makrophagen die Population von MARCO+-Makrophagen verdünnte. Diese Beobachtungen legen zusammen mit unseren Daten nahe, dass der hier identifizierte entzündliche Makrophagen-Phänotyp möglicherweise bevorzugt in den unteren Atemwegen von Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung erhalten bleibt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die In-vivo-Behandlung mit dem JAK1/2-Inhibitor Baricitinib, der sich als wirksam bei der Reduzierung schwerer Erkrankungen erwiesen hat, die Rekrutierung dieser entzündlichen Makrophagen in die Atemwege praktisch unterbinden konnte, was einen zusätzlichen mechanistischen Zusammenhang mit der Entwicklung von COVID darstellt -19-bedingte Pathogenese.

Zusätzlich zu den entzündlichen Zytokinen beobachteten wir, dass die infiltrierenden Makrophagen-Untergruppen hohe Mengen an IL10 produzierten und an IL10-Signalwegen angereichert waren. Lungen-IMs gelten als „professionelle IL10-produzierende Zelle“, die IL10 sowohl im Steady-State als auch als Reaktion auf angeborene Reize (LPS, unmethylierte CpGs) produziert45. Der Großteil der bisherigen Daten hat eine immunregulatorische und schützende Rolle von IMs in Mausmodellen für Asthma, Lungenfibrose und allergeninduzierte Entzündungen gezeigt30. Obwohl das entzündungsfördernde Potenzial von IMs bisher relativ wenig erforscht ist, hat sich gezeigt, dass sie als Reaktion auf TLR-Liganden effizient IL6 und TNF produzieren46. Aufgrund unserer Beobachtungen einer hohen IL10-Produktion in infiltrierenden Makrophagen können wir eine mögliche immunregulatorische Rolle dieser Untergruppe nicht ausschließen, und tatsächlich stellt sie eine interessante Hypothese dar, bei der das Gleichgewicht von infiltrierenden IM- und TREM2+-Makrophagen in den bronchoalveolären Raum das pathogene Ergebnis bestimmt SARS-CoV-2-Infektion. Schließlich wurde in jüngsten Veröffentlichungen berichtet, dass Lungen-IMs aus zwei oder sogar drei funktionell unterschiedlichen Populationen bestehen können, die durch eine Expressionsachse von Lyve1, MHC, CD169 und CD11c29,30,31,32 definiert sind. Wir haben weder eine separate Clusterbildung zwischen BAL-IMs noch eine unterschiedliche Expression zwischen diesen Markern beobachtet, und es sind weitere Arbeiten erforderlich, um die Kongruenz der Makaken-Makrophagen-Untergruppen mit den im Mausmodell identifizierten zu verstehen.

Wir beobachteten eine sehr schnelle und robuste Induktion des Typ-I-IFN-Signalwegs bei 1–2 dpi, gekennzeichnet durch erhöhte pDCs in den Atemwegen und im Blut, IFNA- und IFNB-Transkripte und -Proteine, hochregulierte ISGs und erhöhte Granzym B in NK-Zellen. Die Typ-I-IFN-Reaktion bei einer SARS-CoV-2-Infektion wurde eingehend untersucht: In-vitro-Infektionen von Atemwegsepithelzellen führten durchweg zu einer gedämpften ISG-Reaktion47, und bei Patienten, die schweres COVID-19 entwickelten, wurde berichtet, dass sie eine höhere Inzidenz von Mutationen aufwiesen IFN-Antwortgene oder erhöhte Werte an Autoantikörpern gegen IFN-Antwortgene (Übersicht in Lit. 6,48,49,50,51,52,53,54,55). Unsere Daten, in denen die IFN-Reaktion ihren Höhepunkt bei 2 dpi erreichte und um 10/11 dpi weitgehend nachgelassen hatte, liefern eine gut definierte Kinetik der ISG-Reaktion, und ähnliche Beobachtungen wurden in anderen NHP-Studien berichtet21,22. Die schnelle und kurzlebige Natur der IFN-Reaktion unterstreicht die Schwierigkeit bei der Interpretation der IFN-Reaktion in klinischen Proben.

Unsere multiparametrischen Analysen zeigten einen Anstieg der pDCs bei 2 dpi, der mit dem Höhepunkt der ISG-Produktion, der IFNA/B-Erkennung und der NK-Zellaktivierung zusammenfiel, was darauf hindeutet, dass pDCs die primäre Zelle sind, die die IFN-Reaktion in den unteren Atemwegen orchestriert. Wir hatten zuvor eine Verringerung der Häufigkeit und Aktivität von pDCs im peripheren Blut bei menschlichen SARS-CoV-2-Infektionen beobachtet56, und andere haben über Signaturen der Apoptose von pDCs berichtet, die geringere IFN-I-Reaktionen vorhersagten57. Im Zusammenhang mit diesen klinischen Befunden deutet unsere Beobachtung der pDC-Akkumulation im BAL darauf hin, dass sie eine schnelle Mobilisierung aus dem Blut in die unteren Atemwege erfahren, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich frühe schützende angeborene Immunantworten auslösen. Allerdings können pDCs auch zu pathologischen Entzündungen beitragen; und zukünftige interventionelle Studien, die auf die pDC/IFN-Achse in Tiermodellen abzielen, werden notwendig sein, um diese Hypothesen zu testen.

In unserer vorherigen Studie haben wir die Fähigkeit von Baricitinib gezeigt, die Produktion proinflammatorischer Zytokine in den Atemwegen bei SARS-CoV-2-infizierten RMs zu blockieren und gleichzeitig Typ-I-IFN-Reaktionen aufrechtzuerhalten20. Die Wirksamkeit von Baricitinib zur Behandlung schwerer COVID-19-Erkrankungen wurde kürzlich in zwei klinischen Phase-3-Studien (ACTT-2 und COV-BARRIER) getestet und erhielt kürzlich die Zulassung als Monotherapie zur Behandlung von COVID-19 bei Patienten, die zusätzlichen Sauerstoff oder mechanische Beatmung benötigen42. Bisher haben fast eine Million Patienten Baricitinib zur Behandlung einer schweren COVID-19-Erkrankung erhalten, was die Bedeutung des Verständnisses des Wirkmechanismus unterstreicht. Hier haben wir unsere ursprünglichen Erkenntnisse erweitert, um zu zeigen, dass Baricitinib den Einstrom von entzündlichen Makrophagen in den bronchoalveolären Raum blockiert. Diese Daten tragen zu unserem mechanistischen Verständnis der Wirkung von Baricitinib bei und liefern eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Wirkung von Baricitinib auf die IFN- und die IL6/TNF-Signalübertragung, wenn man den Zeitpunkt der Arzneimittelverabreichung berücksichtigt. Wir verabreichten Baricitinib mit 2 dpi, nach dem höchsten Zustrom von pDCs, aber vor dem wahrscheinlichen Auftreten der entzündlichen Makrophagen bei 3–4 dpi. Die anhaltende ISG-Reaktion und die unterdrückte TNF/IL6-Reaktion legen nahe, dass der primäre Mechanismus, durch den Baricitinib die Atemwege schützt, darin besteht, die Rekrutierung von Entzündungszellen im bronchoalveolären Raum zu blockieren. Bemerkenswert ist, dass in Gegenwart von Baricitinib und gleichzeitiger Eliminierung infiltrierender Monozyten/Makrophagen die Viruslast im BAL im Vergleich zu den Kontrollen unverändert blieb, was darauf hindeutet, dass diese Populationen nur eine minimale Kontrolle über die Viruskonzentrationen ausüben. Da das Rhesus-Modell von SARS-CoV-2 jedoch in den meisten Studien tendenziell mit einer milden COVID-19-Erkrankung übereinstimmt, wird es von entscheidender Bedeutung sein, den Mechanismus von Baricitinib in einem Modell einer schweren Erkrankung zu untersuchen. Im Hinblick auf die Steuerung künftiger klinischer Anwendungen von Baricitinib deuten unsere Daten darauf hin, dass der Zeitpunkt entscheidend ist und eine frühere Arzneimittelverabreichung begünstigen würde. Darüber hinaus wären angesichts der Verbreitung von SARS-CoV-2 und der wachsenden Fähigkeit zur erneuten Infektion zukünftige Studien zur Anwendung von Baricitinib zur Behandlung von Zweitinfektionen von Nutzen.

Unsere Studie hatte einige Einschränkungen; Erstens wurde das RM/SARS-CoV-2-Modell zwar schnell von mehreren Gruppen für präklinische Tests von Anti-COVID-Medikamenten und -Impfstoffen übernommen, aber keine Gruppe konnte eine offensichtliche, reproduzierbare symptomatische Erkrankung nachweisen11. Daher muss der Zusammenhang zwischen frühen immunologischen Ereignissen und der Entwicklung einer schweren COVID-19-Erkrankung durch Humanstudien validiert werden, wie beispielsweise die oben erwähnten Beobachtungen einer verringerten MARCO-Expression in den myeloischen Atemwegspopulationen von Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung44. Um den Gesamtbeitrag zur entzündlichen Zytokinproduktion in Makrophagen abzuschätzen, haben wir außerdem den Anteil der Sequenzierungsablesungen für ein bestimmtes mRNA-Transkript berechnet, das einer Untergruppe zugeordnet ist. Allerdings haben wir die Proteinmengen nicht auf Einzelzellebene gemessen, sondern waren auf diese beschränkt Beurteilung des Gesamtniveaus in BALF. Frühere Studien haben versucht, die Korrelation von Zytokin-mRNA mit den sekretierten Proteinspiegeln abzuschätzen, und haben eine gute Übereinstimmung für TNF, IL6, CXCL10 und CXCL8, aber eine schlechtere Übereinstimmung für IL10 und IL1B58 berichtet. Ein weiterer Nachteil war die relativ geringe Aussagekraft unserer Studie. Während unsere Beobachtungen bei 0, 1 und 2 dpi n = 8 waren, waren wir für die Beobachtungen am 4.–10. Tag auf n = 4 beschränkt. Für unser scRNA-Seq-Experiment haben wir uns mit Leistungsproblemen befasst, indem wir unsere Analyse an zwei unabhängigen Kohorten für insgesamt neun Tiere durchgeführt haben. Insgesamt gab es keinen Mangel an statistischer Aussagekraft für unsere wichtigsten Beobachtungen.

Während die weltweite Einführung von Impfstoffen große Fortschritte bei der Verringerung der Übertragung und Schwere der SARS-CoV-2-Infektion gemacht hat, bleiben Millionen von Menschen weiterhin gefährdet. Das Verständnis der frühen Ereignisse einer SARS-CoV-2-Infektion und der Mechanismen, durch die klinisch zugelassene Medikamente Schutz bieten, bleibt eine globale Priorität. In dieser Studie haben wir zwei Populationen entzündlicher myeloischer Zellen identifiziert, die für das Überwiegen von Atemwegsentzündungen bei einer akuten SARS-CoV-2-Infektion verantwortlich sind. Wir haben auch gezeigt, dass die Behandlung mit Baricitinib, die von der Weltgesundheitsorganisation im Januar 2022 zur Behandlung schwerer COVID-19-Erkrankungen empfohlen wurde, die Infiltration dieser Entzündungszellen in den Alveolarraum blockiert. Diese Daten identifizieren sowohl ein wichtiges medikamentöses Ziel (in die Atemwege infiltrierende Makrophagen) als auch einen wirksamen Mechanismus zur Verringerung von Atemwegsentzündungen und sollten sich als nützlich für die Identifizierung zusätzlicher Medikamente zur Verringerung der Inzidenz und Mortalität schwerer COVID-19-Erkrankungen erweisen.

Die Tierpflegeeinrichtungen am ENPRC sind von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) sowie dem US-Landwirtschaftsministerium (USDA) akkreditiert. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Emory University hat alle Tierversuche im Rahmen der Genehmigung PROTO202000035 überprüft und genehmigt. Alle Verfahren wurden gemäß den institutionellen Vorschriften und Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage) durchgeführt und unter Narkose und angemessener anschließender Schmerzbehandlung durchgeführt, um das Leiden der Tiere zu minimieren. Acht (4 Frauen, 4 Männer, Alter > 11 Jahre) spezifisch pathogenfreie Rhesusaffen indischen Ursprungs wurden über intranasale und intratracheale Wege mit 1,1 × 106 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) SARS-CoV-2 infiziert, wie zuvor beschrieben20 und wurden im ABSL3 bei YNPRC gepflegt (IACUC-Genehmigung PROTO202000035). Die Verarbeitung von Nasopharynxabstrichen, BAL und mononukleären Zellen erfolgte wie zuvor beschrieben20. Sechs (2 Weibchen, 4 Männchen, Alter > 6 Jahre) weitere spezifisch pathogenfreie Rhesusaffen indischen Ursprungs wurden in die Studie aufgenommen (IACUC-Genehmigung PROTO202100003) und wurden ebenfalls über intranasale und intratracheale Wege mit 1,1 × 106 Plaquebildung infiziert Einheiten (PFU) SARS-CoV-2 zur Charakterisierung der CCR2-Expression in Vollblut und BAL.

Bei den acht Tieren mit der IACUC-Genehmigung PROTO202000035 wurden Alter und Geschlecht zwischen den unbehandelten Kontrollarmen und den mit Baricitinib behandelten Versuchsarmen abgeglichen, wobei jedem Arm zwei Weibchen und zwei Männchen zugeordnet wurden. Kohorte 2 (IACUC-Genehmigung PROTO202100003) bestand aus zwei Frauen und vier Männern, die alle als unbehandelte Kontrollen dienten. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die gleiche Anzahl von Frauen und Männern in Kohorte 2 einzubeziehen. Allerdings war die Zahl der weiblichen Makaken zum Zeitpunkt der Tierzuteilung in Kohorte 2 aufgrund der Zuchtanforderungen begrenzt. Insgesamt wurden zwischen Kohorte 1 und 2 vier weibliche und sechs männliche unbehandelte Kontrollpersonen in diese Studie einbezogen.

Die zur Infektion der 8 RMs mit der IACUC-Genehmigung PROTO202000035 verwendeten Virusbestände wurden bereits zuvor beschrieben20. SARS-CoV-2 (NR-52281: BEI Resources, Manassas, VA; USA-WA1/2020, Lot-Nr. 70033175) wurde auf der Zelllinie Vero E6 (African Green Monkey Kidney-Zelllinie; CRL-1586, ATCC) passagiert ein MOI von 0,01. Die TCID50-Methode wurde zur Vermehrung und Titrierung von SARS-CoV-2 verwendet, gefolgt von der Lagerung von Aliquots bei –80 °C. Die abgegebene infektiöse Dosis wurde durch Rücktitration der Virusvorräte mittels Plaque-Assay bestimmt. Der Virusbestand wurde sequenziert, um das Vorhandensein des Furin-Spaltungsmotivs zu bestätigen. Die verwendeten Virusbestände enthielten weniger als 6 % der Genome mit einer Mutation, die die Furinspaltung aufheben könnte. Die 6 RMs mit der IACUC-Genehmigung PROTO202100003 wurden mit dem Virusbestand NR-53899 infiziert: BEI Resources, Manassas, VA; USA-WA1/2020.

Die genomische und subgenomische RNA von SARS-CoV-2 wurde in Nasopharynxabstrichen, Rachenabstrichen und BAL wie zuvor beschrieben quantifiziert18,20. Die Abstriche wurden in 1 ml viralem Transportmedium (VTM-1L, Labscoop, LLC) aufbewahrt. Die virale RNA wurde aus frischen Proben von Nasopharyngealabstrichen (NP), Rachenabstrichen und BAL manuell mit dem QiaAmp Viral RNA Mini Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Für genomische RNA hat das CDC einen N2-Primer- und Sondensatz entwickelt: CoV2-N2-F: 5'-TTACAAACATTGGCCGCAAA-3', CoV2-N2-R: 5'-GCGCGACATTCCGAAGAA-3' und CoV2-N2-Pr: 5'- FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-3'59 wurden für die quantitative PCR (qPCR) verwendet. Für subgenomische RNA wurden die Primer- und Sondensequenzen für das subgenomische mRNA-Transkript des E-Gens60 verwendet: SGMRNA-EF: 5'-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3', SGMRNA-ER: 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACCA-3' und SGMRNA-E -Pr: 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'. Die qPCR-Reaktionen wurden mit dem TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix unter den Zyklusbedingungen des Herstellers, 200 nM jedes Primers und 125 nM der Sonde im Duplikat, durchgeführt. Insgesamt lag die Nachweisgrenze für diesen Test bei 257 Kopien/ml VTM/Plasma/BAL. Die CDC RNase P p30-Untereinheit qPCR, modifiziert für Rhesusaffen-spezifische Polymorphismen, wurde zur Überprüfung der Probenqualität unter Verwendung der folgenden Primer- und Sondensequenzen verwendet: RM-RPP30-F 5'-AGACTTGGACGTGCGAGCG-3', RM-RPP30-R 5'- GAGCCGCTGTCTCCACAAGT-3' und RPP30-Pr 5'-FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3'. Die RNA-Integrität und Probenqualität wurden überprüft, indem bei jeder Extraktion eine einzelne Vertiefung untersucht wurde.

NP-Abstriche wurden unter Narkose entnommen, indem ein sauberer Tupfer mit Viskosespitze (Thermo Fischer Scientific, BactiSwab NPG, R12300) etwa 2–3 cm in die Nasenlöcher eingeführt wurde. Oropharyngeale Abstriche wurden unter Narkose unter Verwendung von Tupfern mit Polyesterspitze (Puritan Standard Applikator mit Polyesterspitze, Griff aus Polystyrol, 25-806 2PD, VWR International) entnommen, um die Mandeln und den Rachenraum beidseitig (Hals/Rachenraum) abzustreichen. Die Tupfer wurden in 1 ml virales Transportmedium (Viral transport Media, VTM-1L, Labscoop, LLC) getaucht und 30 s lang gevortext, und das Eluat wurde gesammelt.

Um BAL zu sammeln, wurde ein faseroptisches Bronchoskop (Olympus BF-XP190 EVIS EXERA III ULTRA SLM BRNCH und BF-P190 EVIS EXERA 4,1 mm) in die Luftröhre manipuliert, in den primären Bronchus geleitet und in einem distalen subsegmentalen Bronchus befestigt, woraufhin 35– 50 ml normale Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) wurden in den Bronchus verabreicht und erneut abgesaugt, um mindestens 20 ml Spülflüssigkeit zu erhalten. BAL wurde durch ein 70-μm-Zellsieb filtriert und mehrere Aliquots wurden zur Bestimmung der Viruslast gesammelt. Als nächstes wurde die verbleibende BAL 5 Minuten lang bei 2200 U/min zentrifugiert und der BAL-Flüssigkeitsüberstand für die mesoskalige Analyse gesammelt. Pelletierte BAL-Zellen wurden in R10 resuspendiert und für nachgelagerte Analysen verwendet.

Die Lebensfähigkeit mononukleärer Zellen wurde unter Verwendung eines Countess II Automated Cell Counter (Thermo Fisher) mit Trypanblau-Färbung gezählt und in Aliquots von bis zu 2 × 107 Zellen in 10 % DMSO in hitzeinaktiviertem FBS kryokonserviert. Ganze Gewebesegmente (0,5 cm3) wurden trocken schockgefroren oder in RNAlater (Qiagen) oder Nuclisens-Lysepuffer (Biomerieux) für Analysen der Verbindungsverteilung, der RNA-Sequenz bzw. der Gewebevirusquantifizierung gelagert.

Insgesamt wurde eine durchflusszytometrische Analyse mit 23 Parametern an frischem EDTA-Vollblut61 und mononukleären BAL-Zellen aus SARS-CoV-2-infizierten RMs wie zuvor beschrieben20 unter Verwendung antihumaner monoklonaler Antikörper (mAbs) durchgeführt, die wir und andere20,62,63, einschließlich Datenbanken, die von der NHP Reagent Resource (MassBiologics) verwaltet werden, haben sich bei RMs als kreuzreaktiv erwiesen.

Ein Panel der folgenden mAbs wurde für die longitudinale Phänotypisierung angeborener Immunzellen in Vollblut (500 μl) und mononukleären Zellen (106 Zellen), die aus BAL aus Kohorte 1 und mit Baricitinib behandelten Tieren stammten, verwendet: Anti-CD20-BB700 (Klon 2H7; 2,5 ul; Kat.-Nr. 745889), Anti-Ki-67-BV480 (Klon B56; 5 ul; Kat.-Nr. 566109), Anti-CD14-BV605 (Klon M5E2; 2,5 ul; Kat.-Nr. 564054), Anti -CD56-BV711 (Klon B159; 2,5 ul; Kat.-Nr. 740781), Anti-CD115-BV750 (Klon 9-4D2-1E4; 2,5 ul; Kat.-Nr. 747093), Anti-CD3-BUV395 (Klon SP34-2; 2,5 ul; Kat.-Nr. 564117), Anti-CD8-BUV496 (Klon RPA-T8; 2,5 ul; Kat.-Nr. 612942), Anti-CD45-BUV563 (Klon D058-1283; 2,5 ul; Kat.-Nr. 741414), Anti -CCR2-BUV661 (Klon LS132.1D9; 2,5 µl; Kat.-Nr. 750472), Anti-CD16-BUV737 (Klon 3G8; 2,5 µl; Kat.-Nr. 564434), Anti-CD69-BUV805 (Klon FN50; 5 µl; Kat.-Nr . # 748763) und Fixable Viability Stain 700 (2 ul; Kat. # 564997), alle von BD Biosciences; Anti-CD38-FITC (Klon AT1; 5 ul; Kat.-Nr. 60131FI) von STEMCELL Technologies; Anti-CD161-BV421 (Klon HP-3G10; 5 ul; Kat.-Nr. 339914), Anti-HLA-DR-BV650 (Klon L243; 5 ul; Kat.-Nr. 307650), Anti-CD11c-BV785 (Klon 3.9; 5 ul; Kat.-Nr. 301644), Anti-CD11b-PE (Klon ICRF44; 2,5 ul; Kat.-Nr. 301306) und Anti-CD123-APC-Fire750 (Klon 315; 2,5 ul; Kat.-Nr. 306042), alle von Biolegend; Anti-GranzymeB-PE-TexasRed (Klon GB11; 2,5 ul; Kat.-Nr. GRB17) von Thermo Fisher; anti-CD66abce-PE-Vio770 (Klon TET2; 1 ul; Kat.-Nr. 130-119-849) von Miltenyi Biotec; und Anti-CD27-PE-Cy5 (Klon 1A4CD27; 2,5 ul; Kat.-Nr. 6607107) und Anti-NKG2A-APC (Klon Z199; 5 ul; Kat.-Nr. A60797) von Beckman Coulter (ergänzende Abbildung 4).

Für Tiere der Kohorte 2 wurde ein anderes Panel der folgenden mAbs für die longitudinale Phänotypisierung angeborener Immunzellen in Vollblut (500 μl) verwendet, wie in Lit. beschrieben. 26 und mononukleäre Zellen (2 × 106 Zellen), abgeleitet von BAL: Anti-CD20-BB700 (Klon 2H7; 2,5 μl; Kat.-Nr. 745889), Anti-CD11b-BV421 (Klon ICRFF44; 2,5 μl; Kat.-Nr. 562632) , Anti-Ki-67-BV480 (Klon B56; 5 μl; Kat.-Nr. 566109), Anti-CD14-BV605 (Klon M5E2; 2,5 μl; Kat.-Nr. 564054), Anti-CD56-BV711 (Klon B159; 2,5 μl ; Kat.-Nr. 740781), Anti-CD163-BV750 (Klon GHI/61; 2,5 μl; Kat.-Nr. 747185), Anti-CD3-BUV395 (Klon SP34-2; 2,5 μl; Kat.-Nr. 564117), Anti-CD8 -BUV496 (Klon RPA-T8; 2,5 μl; Kat.-Nr. 612942), Anti-CD45-BUV563 (Klon D058-1283; 2,5 μl; Kat.-Nr. 741414), Anti-CCR2-BUV661 (Klon LS132.1D9; 2,5 μl ; Kat.-Nr. 750472), Anti-CD16-BUV737 (Klon 3G8; 2,5 μl; Kat.-Nr. 564434), Anti-CD101-BUV805 (Klon V7.1; 2,5 μl; Kat.-Nr. 749163), Anti-CD169-PE (Klon 7-239; 2,5 μl; Kat.-Nr. 565248) und Anti-CD206-PE-Cy5 (Klon 19.2; 20 μl; Kat.-Nr. 551136) und Fixable Viability Stain 700 (2 μl; Kat.-Nr. 564997) alle von BD Biosciences; Anti-ACE2-AF488 (Klon Polyklonal; 5 μl; Kat.-Nr. FAB9332G-100UG) von R&D; Anti-HLA-DR-BV650 (Klon L243; 5 μl; Kat.-Nr. 307650), Anti-CD11c-BV785 (Klon 3.9; 5 μl; Kat.-Nr. 301644) und Anti-CD123-APC-Fire750 (Klon 315; 2,5 μl; Kat.-Nr. 306042), alle von Biolegend; Anti-GranzymeB-PE-TexasRed (Klon GB11; 2,5 μl; Kat.-Nr. GRB17) von Thermo Fisher; Anti-CD66abce-PE-Vio770 (Klon TET2; 1 μl; Kat.-Nr. 130-119-849) von Miltenyi Biotec; Anti-NKG2A-APC (Klon Z199; 5 μl; Kat.-Nr. A60797) von Beckman Coulter. mAbs für Chemokinrezeptoren (d. h. CCR2) wurden 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und die Zellen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; Kat.-Nr. 554714) fixiert und permeabilisiert. Für jede Probe wurden mindestens 1,2 × 105 Stop-Gate-Ereignisse (lebende CD3+-T-Zellen) aufgezeichnet. Alle Proben wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und innerhalb von 24 Stunden nach der Fixierung erfasst. Die Datenerfassung wurde auf einem FACSymphony A5 (BD Biosciences) durchgeführt, das mit der Software FACS DiVa Version 8.0 betrieben wurde, und mit FlowJo (Version 10.7; Becton, Dickinson und Company) analysiert. Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Die Daten für –5 dpi, 2 dpi und 4 dpi für BAL-Massenproben stammen aus unserer vorherigen Studie20. Hier haben wir unsere Studie um Proben mit 7 dpi und 10 dpi/11 dpi für BAL und −5 dpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi und 10/11 dpi für PBMC erweitert. Zellsuspensionen wurden in BSL3 hergestellt, für Bulk-RNA-Seq wurden 250.000 Zellen (PBMCs) oder 100.000 Zellen (BAL) direkt in 700 µl QIAzol-Reagenz lysiert. Zur Isolierung von RNA wurden die RNeasy Mini- oder Micro-Kits (QIAGEN) mit DNase-Verdau auf der Säule verwendet. Die Qualität der RNA wurde mit einem Agilent Bioanalyzer bestimmt und die cDNA-Synthese wurde unter Verwendung der Gesamt-RNA mit dem Clontech SMARTSeq v4 Ultra Low Input RNA Kit (Takara Bio) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Doppelt indizierte Barcodes wurden nach der Fragmentierung mit dem NexteraXT DNA Library Prepared Kit (Illumina) an die amplifizierte cDNA angehängt. Die Agilent 4200 TapeStation wurde zur Validierung der Bibliotheken durch Kapillarelektrophorese verwendet und die Bibliotheken wurden in äquimolaren Konzentrationen gepoolt. Die Bibliotheken wurden auf einem Illumina NovaSeq6000 bei 100 SR sequenziert, was 20–25 Millionen Lesevorgänge pro Probe ergab.

Die BCL-Dateien wurden mit bcl2fastq v2.20.0.422 in Fastq konvertiert. Die Genomsequenzen für Macaca mulatta (Mmul10 Ensembl Release 100), SARS-CoV-2 (Stamm MN985325.1 – NCBI) und ERCC-Sequenzen wurden wie zuvor beschrieben kombiniert, um einen STAR-Index (v2.7.3a) zu erstellen, und die Lesevorgänge wurden abgeglichen zu dieser Referenz20. Die ReadsPerGene-Dateien wurden in das htseq-Format konvertiert und dann mit der Funktion DESeqDataSetFromHTSeqCount in DESeq2 v1.24.064 importiert. Das verwendete Design war: ∼ Proband + Gruppe * Zeitpunkt, an dem die Gruppe zwischen Proben unterschied, die während des Zeitverlaufs unbehandelt oder mit Baricitinib behandelt wurden. Differenziell exprimierte Gene für BAL und PBMC wurden unter Verwendung eines Schwellenwerts von padj <0,05, Fold-Change >2 und des Herausfilterns niedrig exprimierter Gene bestimmt, bei denen alle Proben zu einem bestimmten Zeitpunkt eine nachweisbare Expression durch normalisierte Lesevorgänge >0 aufweisen mussten Gen.

Die Eingabe für GSEA v4.1.065 waren die von DESeq2 erhaltenen regulierten Protokollausdruckswerte. Die folgenden Gensätze wurden für die GSEA-Analyse verwendet: Hallmark und Canonical Pathways (MsigDB), NHP ISGs66 und rheumatoide Arthritis (KEGG map05323). Da die Gennamen zwischen den Rhesusaffen- und menschlichen Genomreferenzen weitgehend übereinstimmen, wurden sie unverändert mit menschlichen MsigDB-Gensätzen verwendet. Die Standardparameter wurden verwendet, um GSEA mit dem Permutationstyp gene_set auszuführen. Vulkandiagramme der differentiellen Expression zu jedem Zeitpunkt wurden mit der EnhancedVolcano (v1.8.0) R-Bibliothek67 erstellt. Die regulierten Protokollausdruckswerte von DESeq2 wurden zum Generieren von Heatmaps mithilfe der R-Bibliothek ComplexHeatmap (v2.0.0)68 verwendet.

Die gefilterten Zählmatrizen für BAL wurden von GEO GSE15921420 erhalten. Für jede BAL-Probe von mit SARS-CoV-2 infizierten Rhesusaffen wurde die Zählmatrix gefiltert, um nur die Protein-kodierenden Gene einzuschließen. Auf dem Y-Chromosom kodierte Gene, mitochondriale Gene, RPS- und RPL-Gene, B-Zell-Rezeptor- und T-Zell-Rezeptor-Gene sowie HBB wurden herausgefiltert. Zur Durchführung der Analyse wurde die Seurat-Bibliothek v4.0.434 verwendet. Die folgenden Parameter wurden zum Filtern von Zellen verwendet: (1) nFeature_RNA ≥ 200 und ≤ 4000, (2) % des HBB-Gens <10, (3) % der mitochondrialen Gene <20, (4) % der RPS/RPL-Gene <30 und (5) log10(nFeature_RNA) / log10(nCount_RNA) ≥ 0,8. Die Anzahl der Zellen aus jeder Probe, die die QC-Metriken bestanden hat, ist in den Zusatzdaten 5 enthalten. Alle BAL-Proben jedes Tieres mit –5 dpi und 4 dpi wurden dann gemäß der Seurat-Integrationspipeline69 unter Verwendung der Standard-CCA-Methode nach Normalisierung der Proben integriert mit der SCTransform-Methode. Die ersten 30 Dimensionen wurden mit den Funktionen RunUMAP und FindNeighbors verwendet.

Zur Identifizierung von DC wurden alle BAL-Proben von –5 dpi und 4 dpi sowohl für behandelte als auch für unbehandelte Rhesusaffen mithilfe von CCA integriert. Die Cluster wurden mit der FindClusters-Funktion in Seurat bestimmt und die Zellen mit SingleR (v1.4.0) mit Anmerkungen versehen (ergänzende Abbildung 10a, b). Der Seurat-Cluster 11 wurde basierend auf der Expression kanonischer Marker als pDC klassifiziert (ergänzende Abbildung 10c). Die Cluster 17 und 22 wurden basierend auf der zuvor berichteten Expression von Markergenen als mDC und aktivierte mDC klassifiziert70.

Um die Teilmenge der Makrophagen/Monozyten zu erhalten, wurde der größte Cluster ausgewählt, der hauptsächlich aus Makrophagen/Monozyten besteht, die mit SingleR (BluePrintEncode-Datenbank) annotiert wurden. Zellen, die als ein anderer Zelltyp in diesem Cluster annotiert waren, wurden herausgefiltert. Die Makrophagen/Monozyten aus allen BAL-Proben wurden dann in einzelne Proben aufgeteilt, mit der SCTransform-Methode normalisiert und dann erneut mit 30 Dimensionen integriert. Wir haben die FindMarkers-Funktion in Seurat verwendet, um den Differentialausdruck mit der MAST-Methode (v1.16.0)71 zu testen.

Die Makrophagen/Monozyten aus BAL-Proben wurden mithilfe von zwei Ansätzen in Teilmengen annotiert: (1) Kartierung auf Makrophagen/Monozyten aus der Lungenreferenz mit Seurat und (2) Verwendung sortierter Massenzellen als Referenz mit SingleR28. Die 10X Lungen-scRNA-seq-Daten von drei nicht infizierten Makaken wurden aus einer veröffentlichten Studie (NCBI GEO: GSE149758)33 gewonnen. Die folgenden Parameter wurden zum Filtern von Zellen verwendet: (1) nFeature_RNA ≥ 200 und ≤ 4000, (2) % der mitochondrialen Gene <20, (3) % der RPS/RPL-Gene <50 und (4) log10(nFeature_RNA) / log10 (nCount_RNA) ≥ 0,8. Die Proben wurden mit SCTransform normalisiert und integriert. Die ersten 40 Dimensionen wurden für die anfängliche Clusterbildung verwendet. Anschließend wurden die von SingleR annotierten Makrophagen-/Monozytenzellen ausgewählt, in einzelne Proben aufgeteilt und erneut unter Verwendung von 30 Dimensionen integriert. Das Louvain-Clustering führte zu vier Clustern, die anhand der Expression von Markergenen annotiert wurden. Dieser integrierte Datensatz diente als Referenz für die Kartierung der Makrophagen/Monozyten aus SARS-CoV-2-infizierten BAL mithilfe von FindTransferAnchors und MapQuery, wobei „reference.reduction“ auf „pca“ und „umap“ als „reduction.model“ festgelegt war.

Die BAL-Proben wurden auch unter Verwendung der SingleR-Bibliothek mit den IM- und AM-Massensortierungszellen als Referenz annotiert. Um Referenzen für die Zuordnung von Zelltypen in Einzelzelldaten zu erhalten, wurden Massen-RNA-Seq-Daten von interstitiellen (IM) und Alveolarmakrophagen (AM) von drei nicht infizierten Javaneraffen35 mit DESeq2 analysiert. Die regulierten Protokollausdruckswerte wurden mithilfe der rlog-Funktion mit den Parametern blind = FALSE und filtType = „parametric“ ermittelt. Die signifikanten Gene wurden nach folgenden Kriterien gefiltert: padj <0,05; Fold-Change >2 und normalisierter mittlerer Ausdruck >5000 für IM- oder AM-Proben.

Zur Analyse menschlicher Lungendaten haben wir das rds-Objekt für GEO GSE13589340 erhalten und alle Zellen mit Ausnahme derjenigen, die als Makrophagen, Monozyten und proliferierende Makrophagen gekennzeichnet sind, aus Kontrollproben gefiltert. Es gab insgesamt zehn Kontrollproben von zwei verschiedenen Standorten. Wir beobachteten einige potenzielle Batch-Effekte in UMAP und wählten nur sieben Proben vom Standort „Vanderbilt“ aus. Wir ließen außerdem eine Probe fallen, da die Anzahl der Makrophagen/Monozyten gering war, was zu insgesamt sechs gesunden Proben führte. Das Objekt wurde basierend auf dem Sample_Name aufgeteilt und mithilfe der CCA-Methode in Seurat wieder integriert. Basierend auf der Expression von Markergenen, die in Morse et al.41 beschrieben wurden, wurden die vier Seurat-Cluster, die unter Verwendung von 15 Dimensionen und einer Auflösung von 0,1 erhalten wurden, als FABP4hi, SPP1hi, FCN1hi und proliferierende Makrophagen annotiert. Anschließend wurden Rhesus und menschliche Makrophagen/Monozyten von gesunden Personen mithilfe des referenzbasierten Ansatzes mit menschlichen Proben als Referenz integriert, wobei Gene verwendet wurden, die gemäß ENSEMBL als Eins-zu-eins-Orthologe zwischen GRCh38 und Mmul10 klassifiziert wurden und denselben Gennamen hatten . Das Paket UCell (v1.3.1)72 wurde verwendet, um Anreicherungswerte für die Markergenexpression zwischen Rhesus- und menschlichen Makrophagen/Monozyten-Untergruppen zu erhalten. Die Marker für jede Teilmenge wurden mit der FindMarkers-Funktion in Seurat für jede Art unter Verwendung der MAST-Methode ermittelt und gefiltert, um diejenigen mit einem angepassten p-Wert <0,05 und einer Fold-Change von >1,5 einzuschließen. Diese wurden weiter gefiltert, um nur Gene einzuschließen, die als Eins-zu-Eins-Orthologe klassifiziert wurden und den gleichen Gennamen zwischen GRCh38 und Mmul10 hatten (Supplementary Data 6).

Für menschliches BAL haben wir die im Rahmen von GEO verfügbaren Proben verwendet: GSE1459268. Die Zellen wurden anhand der folgenden Kriterien gefiltert: nFeature_RNA > 100, nFeature_RNA < 3500 und percent.mito <10 und die Proben wurden unter Verwendung reziproker PCA integriert. Die Zellen wurden mithilfe der BPEncode-Datenbank in SingleR annotiert und nur die als Makrophagen/Monozyten annotierten Zellen im größten Cluster bestehend aus Makrophagen/Monozyten wurden für die weitere Analyse verwendet (ergänzende Abbildung 8d, e). Diese Zellen wurden dann mit dem gesunden Lungenmakrophagen/Monozyten als Referenz unter Verwendung der Funktionen FindTransferAnchors und MapQuery in Seurat annotiert. Die Expression von Markergenen wurde verwendet, um die Genauigkeit der Vorhersagen zu beurteilen (ergänzende Abbildung 8f).

Um den Beitrag jedes Zelltyps zur Expression eines Gens zu berechnen, wurden die CPM-Werte mithilfe der RC-Normalisierungsmethode mit einem Skalierungsfaktor von 1e6 ermittelt. Der Gesamt-CPM-Wert wurde pro Gen berechnet und die Summe der CPM-Werte für einen bestimmten Zelltyp wurde durch den Gesamtwert dividiert, um einen Prozentwert zu erhalten.

Für den Plasma- und BALF-Zytokinnachweis wurden U-PLEX-Assays (Meso Scale MULTI-ARRAY Technology) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, wobei 25 Mikroliter als Input verwendet wurden.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Die Stichprobengröße wurde größtenteils durch (1) die Verfügbarkeit von NHP bestimmt, die zum Zeitpunkt der Studie (März 2020) mit SARS-CoV-2 infiziert und in BSL-3 untergebracht sein könnten, und (2) die erwartete starke Wirkung von Baricitinib bei der Blockierung der durch SARS-CoV-2 verursachten Entzündung. Die 8 RMs aus Kohorte 1 wurden zwei Tage nach der Infektion randomisiert einer behandelten und einer unbehandelten Gruppe bestehend aus jeweils vier RMs zugeteilt. Kohorte 2 bestand aus 6 mit SARS-CoV-2 infizierten RMs26. Die nasale sgRNA-Viruslast bei 2 dpi wurde bei 4 Tieren (n = 2 Kohorte 1 und n = 2 Baricitinib-Kohorte) nicht gemessen, und die sgRNA-Viruslast im Rachen bei 6 dpi und 8 dpi wurde bei einem Tier der Kohorte 1 aufgrund der begrenzten RNA nicht gemessen. Vollblut wurde für die Durchflusszytometrie nicht mit 1 dpi für ein Kohorten-1- und zwei Baricitinib-Tiere und 6 dpi für ein Kohorten-1-Tier gefärbt. Der BAL-Flüssigkeitsüberstand wurde für ein Kohorten-1- und ein Baricitinib-Tier nicht mit 2 dpi gesammelt und anschließend nicht für die mesoskalige Analyse verwendet. Eine scRNA-Seq-Basisprobe aus Kohorte 2 wurde aufgrund des großen Anteils an Epithelzellen entfernt. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuteilung. Statistische Tests wurden mit R (Version 4.2.2) oder GraphPad Prism v7.02 durchgeführt und entsprechend aufgeführt. Die spezifischen Tests, die verwendet wurden: einseitiger/zweiseitiger Mann-Whitney-U/Wilcoxon-Signed-Rank-Test, wurden für jeden Vergleich angegeben. Für die differenzielle Genexpressionsanalyse von Massen- und Einzelzell-RNA-Seq-Daten wurden die angepassten p-Werte nach mehrfacher Testkorrektur verwendet, die im Rahmen der DESeq2- und MAST-Analysen ermittelt wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Massen-RNA-Seq-Daten für 7 dpi- und 10 dpi/11 dpi-Proben für BAL und –5 dpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi und 10/11 dpi für PBMC wurde in NCBI GEO (GSE198882) hinterlegt. Die scRNA-Seq-Daten für BAL von SARS-CoV-2-infizierten Rhesusaffen und die Bulk-RNA-Seq-Daten für −5 dpi, 2 dpi und 4 dpi für Bulk wurden von GEO GSE15921420 erhalten. Die 10X einzelligen, nicht infizierten Rhesusaffen-Lungenproben wurden von GEO GSE14975833 erhalten. Die Massen-RNA-Seq-Daten für sortierte interstitielle und alveoläre Makrophagen aus Javaneraffen wurden von GEO GSE22531635 erhalten. Die nicht infizierten Einzelzell-Lungenproben und die menschlichen BAL-Proben wurden von GEO GSE13589340 bzw. GSE1459268 erhalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die zur Analyse verwendeten Skripte sind unter https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_273 verfügbar.

Zhou, P. et al. Ein Ausbruch einer Lungenentzündung im Zusammenhang mit einem neuen Coronavirus, das wahrscheinlich von Fledermäusen stammt. Natur 579, 270–273 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. Ein neuartiges Coronavirus von Patienten mit Lungenentzündung in China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baden, LR et al. Wirksamkeit und Sicherheit des mRNA-1273 SARS-CoV-2-Impfstoffs. N. engl. J. Med. https://doi.org/10.1056/nejmoa2035389 (2020).

Mulligan, MJ et al. Phase-I/II-Studie zum COVID-19-RNA-Impfstoff BNT162b1 bei Erwachsenen. Natur 586, 589–593 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Polack, FP et al. Sicherheit und Wirksamkeit des mRNA-Covid-19-Impfstoffs BNT162b2. N. engl. J. Med. 383, 2603–2615 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carvalho, T., Krammer, F. & Iwasaki, A. Die ersten 12 Monate von COVID-19: eine Zeitleiste immunologischer Erkenntnisse. Nat. Rev. Immunol. 21, 245–256 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wichmann, D. et al. Autopsiebefunde und venöse Thromboembolien bei Patienten mit COVID-19: eine prospektive Kohortenstudie. Ann. Praktikant. Med. 173, 268–277 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Liao, M. et al. Einzelzelllandschaft bronchoalveolärer Immunzellen bei Patienten mit COVID-19. Nat. Med. 26, 842–844 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Silvin, A. et al. Erhöhtes Calprotectin und abnormale Untergruppen myeloischer Zellen unterscheiden zwischen schwerem und mildem COVID-19. Zelle 182, 1401–1418.e18 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, JB & June, CH Zytokinfreisetzungssyndrom bei schwerem COVID-19. Wissenschaft 368, 473–474 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Muñoz-Fontela, C. et al. Tiermodelle für COVID-19. Natur 586, 509–515 (2020).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Munster, VJ et al. Atemwegserkrankung bei mit SARS-CoV-2 geimpften Rhesusaffen. Natur 585, 268–272 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rockx, B. et al. Vergleichende Pathogenese von COVID-19, MERS und SARS in einem nichtmenschlichen Primatenmodell. Science 368, 1012–1015 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chandrashekar, A. et al. Eine SARS-CoV-2-Infektion schützt vor einer erneuten Infektion bei Rhesusaffen. Wissenschaft 369, 812–817 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ziegler, CGK et al. Der SARS-CoV-2-Rezeptor ACE2 ist ein Interferon-stimuliertes Gen in menschlichen Atemwegsepithelzellen und wird in bestimmten Zelluntergruppen in verschiedenen Geweben nachgewiesen. Zelle 181, 1016–1035.e19 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corbett, KS et al. Bewertung des mRNA-1273-Impfstoffs gegen SARS-CoV-2 bei nichtmenschlichen Primaten. N. engl. J. Med. 383, 1544–1555 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mercado, NB et al. Der einmalige Ad26-Impfstoff schützt vor SARS-CoV-2 bei Rhesusaffen. Natur 586, 583–588 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Routhu, NK et al. Der modifizierte vektorbasierte Vaccinia-Ankara-Impfstoff schützt Makaken vor SARS-CoV-2-Infektionen, Immunpathologie und Funktionsstörungen der Lunge. Immunität 54, 542–556 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williamson, BN et al. Klinischer Nutzen von Remdesivir bei mit SARS-CoV-2 infizierten Rhesusaffen. Natur 585, 273–276 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoang, TN et al. Die Behandlung mit Baricitinib löst die Entzündung von Makrophagen in den unteren Atemwegen und die Rekrutierung von Neutrophilen bei SARS-CoV-2-infizierten Rhesusaffen. Zelle 184, 460–475.21 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Singh, DK et al. Reaktionen auf eine akute Infektion mit SARS-CoV-2 in der Lunge von Rhesusaffen, Pavianen und Krallenaffen. Nat. Mikrobiol. 6, 73–86 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aid, M. et al. Gefäßerkrankungen und Thrombosen bei SARS-CoV-2-infizierten Rhesusaffen. Zelle 183, 1354–1366.e13 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fahlberg, MD et al. Zelluläre Ereignisse von akutem, abklingendem oder fortschreitendem COVID-19 bei SARS-CoV-2-infizierten nichtmenschlichen Primaten. Nat Commun. 11, 6078 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Speranza, E. et al. Einzelzell-RNA-Sequenzierung zeigt SARS-CoV-2-Infektionsdynamik in der Lunge afrikanischer grüner Meerkatzen. Wissenschaft. Übers. Med. 13, eabe8146 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalil, AC et al. Baricitinib plus Remdesivir für hospitalisierte Erwachsene mit Covid-19. N. engl. J. Med. 384, 795–807 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoang, TN et al. Die Modulation von Typ-I-Interferon-Reaktionen hemmt wirksam die SARS-CoV-2-Replikation und Entzündung bei Rhesusaffen. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.21.512606 (2022).

Schultze, JL & Aschenbrenner, AC COVID-19 und das angeborene Immunsystem des Menschen. Zelle 184, 1671–1692 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aran, D. et al. Eine referenzbasierte Analyse der Lungeneinzelzellsequenzierung zeigt einen vorübergehenden profibrotischen Makrophagen. Nat. Immunol. 20, 163–172 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibbings, SL et al. Drei einzigartige interstitielle Makrophagen in der murinen Lunge im Steady State. Bin. J. Atmung. Zellmol. Biol. 57, 66–76 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chakarov, S. et al. Zwei unterschiedliche interstitielle Makrophagenpopulationen koexistieren gewebeübergreifend in spezifischen subtissulären Nischen. Wissenschaft 363, eaau0964 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ural, BB et al. Identifizierung einer nervenassoziierten, lungenresidenten interstitiellen Makrophagen-Untergruppe mit unterschiedlicher Lokalisierung und immunregulatorischen Eigenschaften. Wissenschaft. Immunol. 5, eaax8756 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schyns, J. et al. Nichtklassische Gewebemonozyten und zwei funktionell unterschiedliche Populationen interstitieller Makrophagen bevölkern die Mauslunge. Nat. Komm. 10, 3964 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Esaulova, E. et al. Die Immunlandschaft bei Tuberkulose zeigt Populationen, die mit Krankheit und Latenz verbunden sind. Cell Host Microbe 29, 165–178.e8 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hao, Y. et al. Integrierte Analyse multimodaler Einzelzelldaten. bioRxiv 184, 3573–3587.e29 (2020).

Google Scholar

Corry, J. et al. Die Infiltration von entzündlichen Makrophagen und Neutrophilen sowie eine weit verbreitete Pyroptose in der Lunge führen bei nichtmenschlichen Primaten zur Influenza-Letalität. PLoS Pathog. 18, e1010395 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai, Y. et al. In-vivo-Charakterisierung alveolärer und interstitieller Lungenmakrophagen bei Rhesusaffen: Auswirkungen auf das Verständnis von Lungenerkrankungen beim Menschen. J. Immunol. 192, 2821–2829 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kumagai, T., Fan, S. & Smith, AM ADAMDEC1 und seine Rolle bei entzündlichen Erkrankungen und Krebs. Metalloproteinasen Med. 7, 15–28 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Coillard, A. & Segura, E. In-vivo-Differenzierung menschlicher Monozyten. Vorderseite. Immunol. 10, 1907 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanderheiden, A. et al. CCR2-abhängige, von Monozyten abgeleitete Zellen schränken die SARS-CoV-2-Infektion ein. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.03.442538 (2021).

Habermann, AC et al. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zeigt die profibrotische Rolle verschiedener epithelialer und mesenchymaler Abstammungslinien bei Lungenfibrose. Wissenschaft. Adv. 6, eaba1972 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morse, C. et al. Proliferierende SPP1/MERTK-exprimierende Makrophagen bei idiopathischer Lungenfibrose. EUR. Atmung. J. 54, 1802441 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubin, R. Baricitinib ist die erste zugelassene immunmodulatorische Behandlung für COVID-19. JAMA 327, 2281 (2022).

CAS PubMed Google Scholar

Bronte, V. et al. Baricitinib hemmt die Immundysregulation bei Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung. J. Clin. Investieren. 130, 6409–6416 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren, X. et al. COVID-19-Immunmerkmale, die durch einen groß angelegten Einzelzell-Transkriptomatlas aufgedeckt wurden. Zelle 184, 1895–1913 e1819 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, CJ, Marichal, T. & Bureau, F. Der interstitielle Makrophage: ein lange vernachlässigtes Teil im Puzzle der Lungenimmunität. Zelle. Immunol. 330, 91–96 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoppstädter, J. et al. Differenzielle Zellreaktion auf die Aktivierung der Toll-like-Rezeptoren 4 und 9 in menschlichen alveolären und interstitiellen Makrophagen der Lunge. Atmung. Res. 11, 124 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Blanco-Melo, D. et al. Eine unausgewogene Wirtsreaktion auf SARS-CoV-2 treibt die Entwicklung von COVID-19 voran. Zelle 181, 1036–1045.e9 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Asano, T. et al. X-chromosomal rezessiver TLR7-Mangel bei etwa 1 % der Männer unter 60 Jahren mit lebensbedrohlicher COVID-19-Erkrankung. Wissenschaft. Immunol. 6, eabl4348 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bastard, P. et al. Autoantikörper, die IFNs vom Typ I neutralisieren, sind bei etwa 4 % der nicht infizierten Personen über 70 Jahre vorhanden und sind für etwa 20 % der COVID-19-Todesfälle verantwortlich. Wissenschaft. Immunol. 6, eabl4340 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bastard, P. et al. Vorbestehende Autoantikörper gegen Typ-I-IFNs liegen einer kritischen COVID-19-Pneumonie bei Patienten mit APS-1 zugrunde. J. Exp. Med. 218, e20210554 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bastard, P. et al. Autoantikörper gegen Typ-I-IFNs bei Patienten mit lebensbedrohlichem COVID-19. Science 370, eabd4585 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopez, J. et al. Die frühe nasale Typ-I-IFN-Immunität gegen SARS-CoV-2 ist bei Patienten mit Autoantikörpern gegen Typ-I-IFNs beeinträchtigt. J. Exp. Med. 218, e20211211 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solanich, X. et al. Vorbestehende Autoantikörper neutralisieren hohe Konzentrationen von Typ-I-Interferonen bei fast 10 % der in Barcelona auf die Intensivstation eingelieferten COVID-19-Patienten. J. Clin. Immunol. 41, 1733–1744 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Wijst, MGP et al. Autoantikörper gegen Interferon Typ I werden mit systemischen Immunveränderungen bei Patienten mit COVID-19 in Verbindung gebracht. Wissenschaft. Übers. Med. 13, eabh2624 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Q. et al. Angeborene Fehler der Typ-I-IFN-Immunität bei Patienten mit lebensbedrohlichem COVID-19. Science 370, eabd4570 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arunachalam, PS et al. Systembiologische Bewertung der Immunität gegen leichte versus schwere COVID-19-Infektionen beim Menschen. Science 369, eabc6261 (2020).

Artikel Google Scholar

Liu, C. et al. Die zeitaufgelöste Systemimmunologie zeigt einen späten Zeitpunkt im Zusammenhang mit tödlichem COVID-19. Zelle 184, 1836–1857.e22 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shebl, FM et al. Vergleich der mRNA- und Proteinmessungen von Zytokinen nach der Impfung mit virusähnlichen Partikeln des humanen Papillomavirus-16 L1. Krebs-Epidemiol. Biomarker Vorher. 19, 978–981 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waggoner, JJ et al. Triplex-Echtzeit-RT-PCR für das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2. Emerg. Infizieren. Dis. 26, 1633–1635 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolfel, R. et al. Virologische Beurteilung von Krankenhauspatienten mit COVID-2019. Natur 581, 465–469 (2020).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Kuri-Cervantes, L. et al. Umfassende Kartierung von Immunstörungen im Zusammenhang mit schwerem COVID-19. Wissenschaft. Immunol. 5, eabd7114 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGary, CS et al. CTLA-4(+)PD-1(-)-Gedächtnis-CD4(+)-T-Zellen tragen entscheidend zur Viruspersistenz bei durch antiretrovirale Therapie unterdrückten, SIV-infizierten Rhesusaffen bei. Immunität 47, 776–788.e5 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Micci, L. et al. Interleukin-21 in Kombination mit ART reduziert Entzündungen und das Virusreservoir bei SIV-infizierten Makaken. J. Clin. Investieren. 125, 4497–4513 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian, A. et al. Gen-Set-Anreicherungsanalyse: ein wissensbasierter Ansatz zur Interpretation genomweiter Expressionsprofile. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 102, 15545–15550 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandler, NG et al. Typ-I-Interferon-Reaktionen bei Rhesusaffen verhindern eine SIV-Infektion und verlangsamen das Fortschreiten der Krankheit. Natur 511, 601–605 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blighe, K., Rana, S. & Lewis, M. EnhancedVolcano: publikationsreife Vulkandiagramme mit verbesserter Farbgebung und Beschriftung. https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano (2020).

Gu, Z., Eils, R. & Schlesner, M. Komplexe Heatmaps offenbaren Muster und Korrelationen in mehrdimensionalen Genomdaten. Bioinformatik 32, 2847–2849 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E. & Satija, R. Integration transkriptomischer Einzelzelldaten über verschiedene Bedingungen, Technologien und Arten hinweg. Nat. Biotechnologie. 36, 411–420 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang-Huau, TL et al. Vom Menschen in vivo erzeugte, von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen und Makrophagen kreuzpräsentieren Antigene über einen vakuolären Weg. Nat. Komm. 9, 2570 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finak, G. et al. MAST: ein flexibler statistischer Rahmen zur Bewertung von Transkriptionsänderungen und zur Charakterisierung der Heterogenität in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. Genombiol. 16, 278 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreatta, M. & Carmona, SJ UCell: Robuste und skalierbare Einzelzell-Gensignaturbewertung. Berechnen. Struktur. Biotechnologie. J. 19, 3796–3798 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Upadhyay, AA & Tharp, GK TREM2+ und interstitielle Makrophagen orchestrieren Atemwegsentzündungen bei SARS-CoV-2-Infektionen bei Rhesusaffen, NHP_COVID-19_2. https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_2; https://doi.org/10.5281/zenodo.7626608 (2023).

Referenzen herunterladen

Wir danken dem Direktor des Emory National Primate Research Center (ENPRC), Paul Johnson; Abteilung für Tierressourcen, insbesondere Joyce Cohen, Stephanie Ehnert, Stacey Weissman, Sherrie Jean, Jennifer S. Wood, Fawn Connor-Stroud, Rachelle L. Stammen, Racquel A. Sampson-Harley, Denise Bonenberger, John M. Wambua, Dominic M . D'Urso und Sanjeev Gumber für ihre Unterstützung in der Tierpflege und Pathologie. Darüber hinaus danken wir Kalpana Patel und Maureen Thompson für die Beratung zur biologischen Sicherheit sowie Ernestine Mahar, Kyndal Goss, Christina Gavegano und Sudhir Kasturi für technische, rechnerische und zytometrische Unterstützung. Wir danken Raymond F. Schinazi für die Bereitstellung des Baricitinib, des Virus und der ursprünglichen Idee. Wir entschuldigen uns für das Weglassen wichtiger Veröffentlichungen aus Platzgründen. NIH Office of Research Infrastructure Programs (ORIP) P51 OD11132, das eine Grundfinanzierung für ENPRC und Emory NPRC Genomics Core bereitstellt; und P51 OD11132-61S1 und P51 OD11132-60S4 auf M.Pa. Emory University COVID-19 Molecules and Pathogens to Populations and Pandemics (MP3) Initiative Seed Grant an M.Pa., AP und RFS YNPRC Coronavirus Pilot Research Project Program Grant (an M.Pa. unter Auszeichnung P51 OD11132). Fast Grants #2144 an M.Pa. Der Zuschuss der William IH und Lula E. Pitts Foundation an M.Pa. NIH-Stipendium 5R01-MH-116695 an RFS vergeben. Sequenzierungsdaten wurden auf einem Illumina NovaSeq6000 erfasst, finanziert von NIH S10 OD026799 an SEB. Wir möchten dieses Manuskript Dr. Timothy N. Hoang widmen, der sich für dieses Projekt und die wissenschaftliche Entdeckung engagiert hat entscheidend für die Weiterentwicklung dieser Studie. Dr. Hoang wird für seine Intelligenz, seinen Tatendrang und seine Liebe zur Wissenschaft und für alle Leben, die er während seiner kurzen, aber wirkungsvollen Karriere berührt hat, in Erinnerung bleiben.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Amit A. Upadhyay, Elise G. Viox, Timothy N. Hoang.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Mirko Paiardini, Steven E. Bosinger.

Verstorben: Timothy N. Hoang.

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Emory National Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA, USA

Amit A. Upadhyay, Elise G. Viox, Timothy N. Hoang, Maria Pino, Michelle Y.-H. Lee, Zachary Strongin, Justin L. Harper, Christopher T. Edwards, Kevin Nguyen, Rama R. Amara, Thomas H. Vanderford, Mirko Paiardini und Steven E. Bosinger

Emory NPRC Genomics Core Laboratory, Emory National Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA, USA

Arun K. Boddapati, David A. Cowan, Elizabeth N. Beagle, Tristan R. Horton, Sydney Hamilton, Hadj Aoued, Kathryn L. Pellegrini und Gregory K. Tharp

Abteilung für Infektionskrankheiten und Mikrobiologie, Universität Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA

Jacqueline Corry und Simon M. Barratt-Boyes

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA

Anne Piantadosi, Susan P. Ribeiro, Rafick P. Sekaly, Mirko Paiardini und Steven E. Bosinger

Medizinische Abteilung, School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA

Rebecca D. Levitt

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Emory School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA

Rama R. Amara

Abteilung für Immunologie, Universität Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA

Simon M. Barratt-Boyes

Abteilung für Pädiatrie, School of Medicine, Emory University und Children's Healthcare of Atlanta, Atlanta, GA, USA

Raymond F. Schinazi

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung: AAU, TNH, EGV, M. Pino, M. Paiardini, RFS und SEB; Methodik: TNH, M. Pino, EGV, SPR, MY-HL, JC, ZS, DAC, ENB, TRH, SH, HA, JLH, KN, KLP, AP, RDL und THV; Formale Analyse: AAU, TNH, M. Pino, AKB, MY-HL, CTE, ZS, EGV, GKT und THV; Untersuchung: AAU, EGV, TNH, M. Pino, M. Paiardini und SEB; Ressourcen: SEB, SMBB, RRA, RFS, RPS, M. Paiardini und SEB; Schreiben – Originalentwurf: AAU, M. Pino und SEB; Schreiben, Überprüfen und Redigieren: TNH, SPR, EGVM Paiardini und RFS Visualisierung: AAU, TNH, M. Pino, AKB und GKT Aufsicht: M. Paiardini und SEB; Finanzierungseinwerbung: M. Paiardini, SEB und RFS

Korrespondenz mit Mirko Paiardini oder Steven E. Bosinger.

RFS war in der Vergangenheit als unbezahlter Berater für Eli Lilly tätig, dessen Medikamente in der in diesem Dokument beschriebenen Forschung evaluiert werden, und besitzt Anteile an Eli Lilly. Er erhält außerdem Lizenzgebühren aus den Verkäufen von Baricitinib gegen COVID-19 in den USA und Mexiko. Die Bedingungen dieser Vereinbarung wurden von der Emory University in Übereinstimmung mit ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und genehmigt. Alle anderen Autoren haben keine Konflikte zu deklarieren.

Nature Communications dankt Jincun Zhao und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Upadhyay, AA, Viox, EG, Hoang, TN et al. TREM2+ und interstitielle Makrophagen orchestrieren Atemwegsentzündungen bei SARS-CoV-2-Infektionen bei Rhesusaffen. Nat Commun 14, 1914 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

Zitat herunterladen

Eingegangen: 04. Oktober 2021

Angenommen: 16. März 2023

Veröffentlicht: 06. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.