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Aktuelle Methoden zur Beurteilung der Zellproliferation in 3D-Gerüsten basieren auf Veränderungen der Stoffwechselaktivität oder der Gesamt-DNA. Die direkte Quantifizierung der Zellzahl in 3D-Gerüsten bleibt jedoch eine Herausforderung. Um dieses Problem anzugehen, haben wir einen unvoreingenommenen Stereologie-Ansatz entwickelt, der systematische Zufallsstichproben und optische Schnitte der Gerüste in einer dünnen Brennebene verwendet, gefolgt von einer Schätzung der Gesamtzellzahl (StereoCount). Dieser Ansatz wurde anhand einer indirekten Methode zur Messung der Gesamt-DNA (DNA-Gehalt) validiert; und die Bürker-Zählkammer, die aktuelle Referenzmethode zur Quantifizierung der Zellzahl. Wir haben die Gesamtzellzahl für die Zellaussaatdichte (Zellen pro Volumeneinheit) anhand von vier Werten bewertet und die Methoden im Hinblick auf Genauigkeit, Benutzerfreundlichkeit und Zeitaufwand verglichen. Die Genauigkeit von StereoCount übertraf den DNA-Gehalt bei Fällen mit ~ 10.000 und ~ 125.000 Zellen/Gerüst deutlich. Für Fälle mit ~ 250.000 und ~ 375.000 Zellen/Gerüst zeigten sowohl StereoCount als auch DNA-Gehalt eine geringere Genauigkeit als der Bürker, unterschieden sich jedoch nicht voneinander. Im Hinblick auf die Benutzerfreundlichkeit war StereoCount aufgrund der Ausgabe in Form absoluter Zellzahlen sowie der Möglichkeit eines Überblicks über die Zellverteilung und der zukünftigen Nutzung von Automatisierung für Hochdurchsatzanalysen von großem Vorteil. Zusammenfassend ist die StereoCount-Methode ein effizienter Ansatz zur direkten Zellquantifizierung in 3D-Kollagengerüsten. Sein Hauptvorteil besteht darin, dass das automatisierte StereoCount die Forschung mithilfe von 3D-Gerüsten beschleunigen könnte, die sich auf die Entdeckung von Arzneimitteln für eine Vielzahl menschlicher Krankheiten konzentrieren.

Die Quantifizierung der Zellzahl in einem definierten Volumen ist eine wesentliche Messgröße für die weltweiten Gemeinschaften von Biowissenschaftlern und präklinischen Forschern. In Disziplinen, in denen es um die Verteilung von Zellen in 3D-Volumina geht, z. B. 3D-Kollagengerüste, sind zuverlässige Schätzungen der Zellen für den Start von Experimenten erforderlich, z. B. für die Aussaat von Zellen und die Beurteilung von Zelltod und -proliferation im Laufe der Zeit. Die Zählung der Zellzahlen ist in diesen Fällen auf zwei Hauptansätze beschränkt: Die Bürker-Kammer für direkte Zellzählungen aus homogenen Zellsuspensionen (flüssige Phase); und fluoreszenzbasierte Ansätze zur Gesamt-DNA-Schätzung, z. B. CyQuant®1,2. Die Nachteile des Gesamt-DNA-Ansatzes sind die Zelllyse aufgrund der Probenvorverarbeitung, wie z. B. Gerüstverdau durch Kollagenase, und die Notwendigkeit einer Kalibrierungskurve für jedes Experiment, um eine korrekte Auslesung und Korrelationen zwischen der Linearität der Signalintensität und der Zellzahl sicherzustellen. Daher gibt es keine direkte quantitative Methode zur Schätzung der Zellzahl in 3D-Gerüsten.

Um dieses Problem anzugehen, stellen wir StereoCount™ vor, eine neuartige stereologiebasierte Methode zur direkten Quantifizierung der absoluten Zellzahl in 3D-Kollagengerüsten (Abb. 1).

3D-Kollagengerüst, das mit Zellen besät und zur Quantifizierung der Zellzahl verwendet wird.

Wir demonstrieren den Ansatz mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie, gefolgt von einem optischen Schnitt und einer Bildanalyse, wie in „Materialien und Methoden“ und Abb. 2 beschrieben. Zweitens führen wir einen automatisierten Workflow mit FIJI-ImageJ3 ein, um Verzerrungen durch manuelles Zählen zu vermeiden und den Durchsatz zu verbessern verwendet zwei Makroskripte und einen Zwischenschritt, der auf flachem maschinellen Lernen (NL) basiert. Zu den Vorteilen gehört, dass die Methode keinen Gerüstaufschluss oder Mikrotomschnitte erfordert und als mikroskopbasierter Ansatz einen Überblick über die Zellverteilung im Gerüst als zusätzliche Information liefert. Hier vergleichen und kontrastieren wir StereoCount mit der DNA-Gehaltsmethode, die auf der Fluoreszenzdetektion der gesamten DNA basiert. und Zellzählungen mit der Zählkammermethode (Bürker), einer allgemein zuverlässigen Methode zur Zellquantifizierung.

StereoCount-Probenahmeverfahren während der Mikroskopie. Die dreidimensionalen (3D) Kollagengerüste werden in 9 XY-Gesichtsfelder und 30 Z-Stapel aufgeteilt. Die Zellzahl wird für jede Spalte mithilfe einer dünnen optischen Abtastung in der Brennebene (optische Disektormethode) bestimmt. Die Zellzahl aus den Säulen wird auf das Gesamtvolumen des Kollagengerüsts umgerechnet.

Zu Validierungszwecken vergleichen wir die Genauigkeit, Benutzerfreundlichkeit, Geräteanforderungen und Zeitanforderungen für die Probenvorbereitung der Zellzahlen für die Zellaussaatdichte (Zellen pro Volumeneinheit) anhand von vier Werten, die mit den drei Methoden – StereoCount, DNA – geschätzt wurden Inhalt und Bürker (Referenzstandard). Die Genauigkeit der Methoden wird anhand dieser Indikatoren bewertet (Abb. 3): (i) Bias (systematische Unter- oder Überschätzung der Zellzahlen im Verhältnis zum Mittelwert der Bürker-Methode), (ii) Streuung der Schätzungen (absolute/quadratische Abweichung). aus der mittleren Schätzung der gegebenen Methode, mit anderen Worten, wie nahe die Daten beieinander liegen) und (iii) Gesamtgenauigkeit (absolute/quadratische Abweichung vom theoretischen Wert [d. h. der mittleren Schätzung der Bürker-Methode], mit anderen Worten der Bias und die Streuung gegenseitig berücksichtigt).

Indikatoren für die Genauigkeit der Methoden. Dazu gehören Bias (systematische Unter- oder Überschätzung der Zellzahlen im Verhältnis zum Mittelwert der Bürker-Methode), Indikatoren, die die Streuung um den Mittelwert widerspiegeln (absolute/quadratische Abweichung von der mittleren Schätzung der gegebenen Methode) und schließlich Indikatoren für die Gesamtgenauigkeit (absolute/quadratische Abweichung). vom theoretischen Wert [tv]), der sowohl den Bias als auch die Streuung (a) widerspiegelt. Sowohl eine hohe Streuung als auch eine Verzerrung verringern gemeinsam die Genauigkeit der Methoden (b).

Mit der Bürker-Methode wurde die Gesamtzellzahl in den Zellsuspensionen vor der Infusion in die 3D-Kollagengerüste ermittelt. Vier Konzentrationen von Zellsuspensionen (10.000; 125.000; 250.000 und 375.000 Zellen) wurden in den 3D-Gerüsten verteilt. Zwei Methoden (StereoCount und DNA-Gehalt) wurden verwendet, um die Gesamtzellzahl einen Tag nach der Zellaussaat aus verschiedenen Gerüsten abzuschätzen.

Die Genauigkeit von StereoCount und DNA-Gehalt in 3D-Kollagengerüsten wurde mit der Zählung in den Zellsuspensionen nach der Bürker-Methode verglichen (Ergänzungstabelle S1). Vergleiche wurden mithilfe der Methode der verallgemeinerten kleinsten Quadrate (GLS) durchgeführt, wie in Abb. 4 und Tabelle 1 dargestellt. Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Bestimmte Zellzahlen in 3D-Gerüsten mit der Zellaussaatdichte über vier Werte (a) 10.000, (b) 125.000, (c) 250.000 und (d) 375.000 Zellen/Gerüst (oberer Teil) und Abweichung vom theoretischen Wert (tv, definiert). als Mittelwert der Bürker-Methode; dargestellt in roter gestrichelter Linie), beide werden in Tausenden von Zellen angezeigt. Die schwarze horizontale Linie zeigt den Mittelwert.

Die Referenzwerte basierten auf Mittelwertschätzungen der Bürker-Methode. Die Bürker-Zahlen betrugen 13.450 ± 2477 Zellen (Mittelwert ± SD) für die Konzentration von 10.000 Zellen/Gerüst (Abb. 4a, Tabelle 1a). Die Schätzung von StereoCount zeigte keinen Unterschied zu Bürker hinsichtlich der Genauigkeit oder Streuung (Variation) der Schätzungen. Im Gegensatz dazu fehlte der DNA-Gehaltsmethode die Sensitivität für eine Schätzung bei dieser niedrigen Zelldichte.

Für die mit etwa 125.000 Zellen infundierten Gerüste schätzte Bürker 125.400 ± 18.536 Zellen (Abb. 4b, Tabelle 1b), und weder StereoCount noch DNA-Gehalt zeigten Unterschiede zu Bürker. Allerdings entsprach die StereoCount-Methode hinsichtlich der Gesamtgenauigkeit und Streuung weitgehend der Referenzmethode (Bürker). Im Gegensatz dazu zeigte der DNA-Gehalt eine statistisch größere Differenz von ~ 30.400 Zellen (95 %-KI [20.200; 40.700], p < 0,001) von der mittleren Schätzung der Referenzmethode im Vergleich zu StereoCount und eine um 32.200 Zellen höhere Abweichung vom theoretischen Wert ( KI [24.300; 40.100], p = 0,001). Interessanterweise zeigten die Ergebnisse von StereoCount eine noch geringere Streuung als die von Bürker (Referenzmethode), da die Abweichung vom Mittelwert um 7200 Zellen geringer war (CI [1700; 12.600], p = 0,021), d. h. näher an der ursprünglichen Anzahl der ausgesäten Zellen ( 125.000 Zellen/Gerüst).

Für die Gerüste von 250.000 Zellen schätzte Bürker 253.200 ± 6197 Zellen (Abb. 4c, Tabelle 1c). Sowohl die StereoCount- als auch die DNA-Gehaltsmethode zeigten Unterschiede zu diesen Referenzwerten hinsichtlich der Gesamtgenauigkeit und Streuung. Konkret war die Abweichung von Bürker bei StereoCount um 31.600 Zellen höher [CI 14.900; 48.300] und für den DNA-Gehalt von 51.000 Zellen [CI 32.200; 69.900]. Obwohl nur der DNA-Gehalt die Zellzahl um 38.000 Zellen unterschätzte [CI -72.200; -3800], p = 0,044), die Streuung und die Gesamtgenauigkeit von StereoCount und DNA-Gehalt unterschieden sich nicht voneinander (p > 0,05).

Schließlich schätzte Bürker für die höchste Zellzahl in den Gerüsten (375.000 Zellen) 349.200 ± 37.542 Zellen (Abb. 4d, Tabelle 1d). Sowohl StereoCount als auch der DNA-Gehalt weichen von diesen Referenzwerten ab und unterschieden sich hinsichtlich der Gesamtgenauigkeit nicht voneinander. Der DNA-Gehalt führte jedoch tendenziell zu einer geringeren Streuung der Schätzungen als bei StereoCount: wohingegen die Abweichung vom Mittelwert bei StereoCount um 77.500 Zellen höher war [29.100; 125.800] im Vergleich zu Bürker (p = 0,005) zeigte der DNA-Gehalt eine vergleichbare Abweichung vom Mittelwert wie bei Bürker (der Unterschied von 2300 Zellen [-11.200; 15.700] p = 0,743). Obwohl der DNA-Gehalt eine Verzerrung (Unterschätzung) von -86.000 Zellen aufwies [CI -123.400; -49.100] (p = 0,003) tendierte die Methode zu einer geringeren Streuung der Schätzungen als StereoCount (die Abweichung des DNA-Gehalts vom Mittelwert war im Vergleich zu StereoCount (p = 0,005) um 79.800 Zellen kleiner [32.200; 127.300]). Ergänzende Tabelle S2 bietet weitere Informationen Ergebnisse der Analysen der quadratischen Abweichung vom Mittelwert und der quadratischen Abweichung vom theoretischen Wert.

Neben der Genauigkeit im Vergleich zur Referenzmethode sind auch Benutzerfreundlichkeit, Kosten, Geräteanforderungen und Zeitaufwand für jede Methode zu berücksichtigen.

Der DNA-Gehalt ist eine weit verbreitete fluoreszenzbasierte Methode, die schnell und einfach durchzuführen ist. Es wird ein Mikroplattenlesegerät mit Fluoreszenzsignalerkennung benötigt. Der Ansatz eignet sich gut für das Format mit mehreren Vertiefungen, wohingegen mehr Gerüste eine ähnliche Verarbeitungszeit erfordern wie die Zellschätzung für ein einzelnes Gerüst. Beispielsweise dauert die Analyse von einem oder zehn Gerüsten etwa drei Stunden (Abb. 5). Aufgrund der erforderlichen Gerüstverdauung gehen jedoch Informationen über die Zellverteilung verloren und eine weitere Verarbeitung oder Analyse ist nicht möglich. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass es sich bei der Ausgabe nicht um die Zellzahl, sondern um eine relative Fluoreszenzeinheit der gesamten DNA pro Vertiefung handelt (Tabelle 2), was eine Referenzstandardkurve zur Umrechnung der Probenfluoreszenzwerte in Zellzahlen erfordert.

Schema der DNA-Inhalts- (oberes Feld) und StereoCount-Prozesse (unteres Feld) mit Zeitaufwand für jeden Ansatz in einer Schritt-für-Schritt-Anleitung. Die Prozessdauer ist unabhängig von der Stichprobengröße (blau). Prozessdauer einer Gerüstanalyse (orange). Prozessdauer von zehn Gerüstanalysen (grün). Prozessdauer bei Nutzung der Automatisierung (Skript) zur Datenverarbeitung (gelb). Der Gesamtzeitbedarf für eine oder zehn Proben für jede Methode ist in roten Rahmen angegeben.

Der hier vorgeschlagene neuartige StereoCount-Ansatz basiert auf unvoreingenommenen Stereologieprinzipien für die Zellzahlschätzung in 3D-Kollagengerüsten. Für die Bildaufnahme ist ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich. Zu den Vorteilen von StereoCount gehört der Ansatz (i), der eine absolute Anzahl von Zellen pro Gerüst liefert (Tabelle 2); und (ii) erfordert keinen Gerüstverdau, wodurch Informationen über Zellverteilungen in 3D erhalten bleiben. Zeitlich gesehen dauert die StereoCount-Analyse eines Gerüsts und zehn Gerüsts etwa 3 bzw. 10 Stunden. Es wird erwartet, dass die Automatisierung die Zeit für die Datenverarbeitung abhängig von den Computerspezifikationen auf etwa 10 Minuten oder weniger reduzieren wird (Abb. 5). Das Skript für die Hochdurchsatzanalyse finden Sie im Ergänzungsmakro S1.

Hier überprüfen wir verschiedene Methoden zur Beurteilung der Zellproliferation in 3D-Gerüsten. Eine gängige Strategie zur Abschätzung der Zellproliferation basiert auf der Umwandlung verschiedener Substrate durch zelluläre Enzyme in stark fluoreszierende Produkte, z. B. MTT4,5, WST-16, WST-8/CCK-8, CCK-87 und AlamarBlue-Assay8. Da diese Methoden von der Aktivität mitochondrialer Enzyme abhängen, spiegeln die Ergebnisse die Stoffwechselaktivität der Zellen wider und nicht die Einzelzellzahl an sich. Darüber hinaus verliert dieser Prozess an Empfindlichkeit, wenn sich die Stoffwechselaktivität ändert, beispielsweise bei seneszenten oder langsam wachsenden Zellen9.

Methoden, die auf der Markierung des DNA-Inhalts basieren, z. B. CyQuant1,2, sind unabhängig von der Stoffwechselaktivität der Zellen. Diese Ansätze schätzen jedoch nur die relative Fluoreszenzeinheit, was DNA-Standardkurven zur Umrechnung in den DNA-Gehalt pro Zelle erfordert, dh eine Standardkurve, die aus dem DNA-Gehalt für eine bekannte Anzahl von auf einer Platte ausgesäten Zellen erstellt wird. Eine weitere Komplikation besteht darin, dass die Schätzung in 3D-Gerüsten im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen eine Kollagen-Hydrogel-Verdauung erfordert, bevor ein Fluoreszenzsignal von der markierten zellulären DNA erkannt wird. Obwohl diese Strategie weit verbreitet ist, liefert der Ansatz nur Informationen über die Menge der vorhandenen DNA und keine Informationen über die absolute Zellzahl oder die Zellverteilung innerhalb der 3D-Gerüste.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir eine neuartige stereologiebasierte Strategie, StereoCount, zur Quantifizierung der Zellzahl in einem 3D-Gerüst entwickelt, ohne dass für jedes Experiment Verdauungs- oder Kalibrierungskurven erforderlich sind. Wir haben StereoCount im Vergleich mit einer aktuellen und häufig verwendeten Methode, dem DNA-Gehalt, bewertet und dabei die Zählkammer (Bürker) als Referenzmethode verwendet. Schließlich haben wir als Erweiterung einen automatisierten Workflow (Pipeline) entwickelt, um die Einführung von Subjektivitätsfehlern durch manuelle Zählung zu vermeiden. Die Effizienz des automatisierten Workflows könnte möglicherweise durch eine Änderung der Makroskripte verbessert und durch die Kombination aller Schritte in einem Makro oder den Wechsel zu verschiedenen Plattformen für jeden Schritt weiter automatisiert werden. Unser einfach anzuwendender Arbeitsablauf sorgt für zuverlässige Ergebnisse mit identischen Fehlern, die auf jedes Bild angewendet werden, und vermeidet Fehler zwischen Bewertern, die dadurch verursacht werden, dass unterschiedliche Untersucher jede Aufgabe manuell ausführen.

Unsere Daten zeigen, dass der DNA-Gehalt bei geringen Zellzahlen (10.000 Zellen/Gerüst) nicht verwendbar ist, da das Hintergrundfluoreszenzsignal das Signal der fluoreszierend gefärbten DNA übersteigt. Bei geringer Zelldichte ist daher StereoCount die bevorzugte Wahl, da der Ansatz auf der einfachen Zählung von Zellen in einem bekannten Bruchteil des Gesamtvolumens basiert. Für höhere Zellzahlen (125.000 und 250.000 Zellen/Gerüst) liefern sowohl StereoCount als auch der DNA-Gehalt nützliche Ergebnisse, obwohl StereoCount die Ladezahl der Zellen bei Verwendung der Referenz-Bürker-Methode besser widerspiegelt. Für eine höhere Zelldichte (250.000 Zellen/Gerüst und höher) sind sowohl der DNA-Gehalt als auch StereoCount gleichermaßen wirksam. Die Einschränkung für StereoCount ist der zusätzliche Zeit- und Sorgfaltsaufwand, der erforderlich ist, um überlappende Zellen zu vermeiden, wenn die Zelldichte zunimmt. Wenn dieses Problem nicht berücksichtigt wird, kann dies zu einem systematischen Fehler (Bias) führen, der bei zunehmender Zelldichte Unterzählungen begünstigt. In ähnlicher Weise zeigen unsere Ergebnisse eine Unterschätzung der Zellzahlen durch den DNA-Gehalt als direkte Funktion der zunehmenden Zelldichte, was darauf hindeutet, dass auch für diesen Ansatz eine Bias-Korrektur erforderlich sein könnte. Der Unterschied besteht darin, dass diese Unterzählungen bei StereoCount durch sorgfältige Aufmerksamkeit bei hoher Zelldichte vermieden werden können, während diese Strategie für die DNA-Gehaltsmethode nicht verfügbar ist.

Abschließend betrachten wir Machbarkeit, Material, Maschinenanforderungen und Zeitbedarf der StereoCount- und DNA-Content-Methoden. Ein großer Vorteil des DNA-Inhalts ist die Option zum Formatieren mehrerer Wells, die im Vergleich zu StereoCount eine weniger zeitaufwändige Methode ist, obwohl die Datenverarbeitung (insbesondere die Analyse mehrerer Proben) durch die Verwendung eines automatisierten Workflows für StereoCount erheblich verkürzt wird. Der schnelleren Analyse der Daten zum DNA-Gehalt steht jedoch die Notwendigkeit gegenüber, für jedes Experiment eine Kalibrierungskurve zu erstellen, um die Zellzahl anhand der relativen Fluoreszenzeinheiten abzuschätzen. Der stärkste Vorteil von StereoCount ist die Möglichkeit der direkten Zellzählung und Visualisierung der Zellverteilung in 3D mithilfe einfacher mikroskopischer Bilder, ohne dass ein Gerüstaufschluss oder Mikrotomschnitte erforderlich sind. Obwohl der StereoCount-Ansatz hier anhand fluoreszierend gefärbter Zellen veranschaulicht wird, ist derselbe Ansatz zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen anwendbar, wenn DAPI- und Calcein-AM-Färbung kombiniert wird, sowie Ansätze, die eine immunhistochemische Färbung von Zellen in den 3D-Gerüsten verwenden.

Obwohl Hydrogelgerüste heutzutage eine gewöhnliche Art der 3D-Zellkultur sind, besteht nach wie vor ein großer und wachsender Bedarf an quantitativen Werkzeugen zur Beurteilung der Zellproliferation und anderer Parameter nach verschiedenen experimentellen Manipulationen. Unser neuartiger, auf Stereologie basierender Freeware-Ansatz StereoCount nutzt die optische Schnittierung gefärbter Zellen in unverdauten Kollagenhydrogelen mit schnellerem Durchsatz mithilfe des bereitgestellten automatisierten Arbeitsablaufs. Wir berichten, dass StereoCount besser für niedrigere Zelldichten (~ 10.000 und ~ 125.000 Zellen/Gerüst) geeignet ist, wo die DNA-Gehaltsmethode nicht empfindlich genug für die Schätzung solch niedriger Zelldichten war, während dies bei der fluoreszenzbasierten indirekten Methode der Fall sein könnte bevorzugt für eine höhere Zelldichte (~ 250.000 und ~ 375.000 Zellen/Gerüst).

Normale menschliche Hautfibroblasten (NHDF) wurden nach plastisch-chirurgischen Eingriffen nach Genehmigung durch die örtliche Ethikkommission des Universitätskrankenhauses in Pilsen, E. Benese 13, 305 99 Pilsen, Tschechische Republik, Beschluss vom 5. November 2015, aus der Haut isoliert. Die Richtlinien in der Deklaration von Helsinki wurden befolgt. Alle Spender gaben vor dem Eingriff eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Proben wurden mit Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gewaschen, die Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (0,1 mg/ml) (Biochrom, Cambridge, UK) und Gentamicin (50 μg/ml) enthielt ) (Biochrom). Die Proben wurden geschnitten und über Nacht bei 37 °C in HBSS mit Kollagenase Typ I (100 U/ml, Merck KGaA) verdaut. Am folgenden Tag wurde die Suspension intensiv geschüttelt und durch ein 100-µm-Nylon-Zellsieb (Falcon™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) filtriert. Die Zellsuspension wurde dann in einen Kultivierungskolben (TPP) überführt, der Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Merck KGaA) mit niedrigem Glucosegehalt, 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) (Merck KGaA) und Penicillin (100 U/ml) enthielt )/Streptomycin (0,1 mg/ml) (Biochrom), 0,5 % L-Glutamin (Biosera, Nuaille, Frankreich) und 1,0 % nicht-essentielle Aminosäuren (Biosera). Die NHDF wurden bei 37 °C, 5 % CO2 bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert und dann passagiert. In den Experimenten wurden nur die NHDF aus der 2.–5. Passage verwendet.

Das zur Herstellung des 3D-Kollagengerüsts verwendete Kollagen Typ I wurde aus Rattenschwänzen isoliert. Die Sammlung von Rattenschwänzen zur Kollagenisolierung wurde vom Tierschutz-Beratungsausschuss des Ministeriums für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik (Genehmigungs-ID MSMT-249/2017-2) genehmigt und unter der Aufsicht des Tierschutz-Beratungsausschusses durchgeführt Ausschuss der Medizinischen Fakultät der Karls-Universität in Pilsen, der die in der Richtlinie 2010/63/EU und den FELASA-Richtlinien und -Empfehlungen (Arbeitsplatzakkreditierungsnummer 4891/2015-MZE-17214) festgelegten technologischen, hygienischen, gesundheitsbezogenen und ethischen Standards befolgt. Der Rattenstamm war Wistar, das Geschlecht war männlich und das Alter betrug 6–7 Monate. Die Ratten wurden in einer weiteren unabhängigen Studie verwendet, ohne dass sich dies auf die Schwänze auswirkte. Daher wurden die Schwänze nach der Tötung von Tieren gesammelt, die durch das obige Protokoll genehmigt wurden (Genehmigungs-ID MSMT-249/2017-2). Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Die Sehnen wurden von den Rattenschwänzen entfernt und 3 × 24 Stunden in PBS auf einem Laborschüttler bei Raumtemperatur gehalten. PBS wurde jeden Tag ausgetauscht. Anschließend wurde der Vorgang mit Citratpuffer (0,08 M, pH 3,7) wiederholt. Anschließend wurden die Sehnen 48 Stunden lang bei 4 °C in 0,1 M Essigsäure aufgeschlossen. Das in Essigsäure aufgeschlossene Kollagen wurde mit einem Mixer homogenisiert und die Suspension 1 Stunde lang bei maximaler Geschwindigkeit (ca. 46.000 × g) ultrazentrifugiert, um die Gewebereste zu entfernen. Der Überstand, der das Kollagen Typ I enthielt, wurde lyophilisiert und bei -20 °C gelagert. Die Kollagenlösung zur Herstellung des 3D-Kollagengerüsts wurde durch Auflösen des lyophilisierten Kollagens in 0,02 M Essigsäure bei 4 °C über mindestens 5 Tage bis zu einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt und als Stammlösung bei 4 °C gelagert maximal 1 Monat.

3D-Kollagengerüste, die Zellen enthalten, wurden wie folgt hergestellt. 600 µl Kollagen-Stammlösung (5 mg/ml) wurden ordnungsgemäß mit 290 µl Kulturmedium, 10 µl Natriumbicarbonat (Merck KGaA) und 100 µl Zellsuspension in Medium auf Eis gemischt. 0,5 ml Kollagensuspension mit Zellen wurden in die 24-Well-Platte ausplattiert. Die endgültige Kollagenkonzentration betrug 3 mg/ml und die endgültige ausgesäte Zellzahl betrug 10.000; 125.000; 250.000 und 375.000 Zellen pro 0,5 ml. 0,5 ml Kollagensuspension mit homogen verteilten Zellen wurden in die 24-Well-Platte ausplattiert. Die Polymerisation erfolgte bei 37 °C, 5 % CO2 und feuchter Atmosphäre nach 20 Minuten. Die Änderung des pH-Werts von sauer auf neutral und bei 37 °C führte dazu, dass das Kollagen polymerisierte und sich selbst zu einem Gel zusammenfügte. Nach der Kollagenpolymerisation wurden vorsichtig 0,5 ml Kulturmedium oben auf die Hydrogele gegeben. Das Kulturmedium wurde 2–3 Mal pro Woche ausgetauscht.

Am Tag nach ihrer Herstellung wurden die mit Zellen besäten Kollagengerüste (N = 25 für 10.000 Zellen/Gerüst; N = 19 für 125.000 Zellen/Gerüst; N = 17 für 250.000 Zellen/Gerüst; N = 7 für 375.000 Zellen/Gerüst) fixiert mit 4 % Paraformaldehyd (Merck KGaA) für 30 Min. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Kollagengerüste 30 Minuten lang in 0,2 % Triton X-100 (Merck KGaA) gehalten, gefolgt von 30 Minuten in 5 % BSA (Merck KGaA). NHDF-Kerne in Kollagengerüsten wurden 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit DAPI (1:1000) gefärbt. Der Prozess des optischen Schneidens von mit Zellen besäten Kollagengerüsten war wie folgt. Neun Z-Achsen-Säulen befanden sich durch die XYZ-Achsen jedes Kollagengerüsts (Abb. 2). Die Säulen umfassten 30 getrennte Z-Stapel mit einem Abstand von 0,02 mm zwischen den einzelnen Stapeln, was einem Gesamtvolumen jeder Säule von 1,4 mm3 = 1,4 μl entspricht. Somit betrug das Gesamtvolumen aller 9 Säulen 12,6 mm3. Der mittlere Varianzkoeffizient (CV) für die Probenahme von 9 Säulen lag im Bereich von 9–20 % und ist vergleichbar mit dem CV des DNA-Gehalts und den Bürker-Methoden (Ergänzungstabelle S1) sowie mit anderen Studien10,11. 2D-Bilder jedes Abschnitts wurden mit dem Olympus UPlanFL N 10x/0,30-Objektiv aufgenommen und die Bilder der Säulen wurden als Bildsequenz (*.stk-Datei) mit der VisiView®-Software gespeichert. Die Anzahl der Zellen wurde auf das gesamte Kollagengerüstvolumen umgerechnet.

Die Zellzahlen innerhalb der Säulen wurden mit der FIJI-ImageJ-Software (National Institute of Health, Bethesda, USA) gezählt und die Zellzahl im Gesamtvolumen eines Kollagengerüsts wurde aus jeder Säule unter Verwendung des optischen Disektorprinzips12 geschätzt. Weitere Einzelheiten zum Schema finden Sie in der ergänzenden Abbildung S1.

Nach der Aufnahme verarbeiten wir die Bilder zunächst stapelweise, um die Arbeit mit ihnen zu erleichtern. Das erste bereitgestellte Kurzmakro (Ergänzungsmakro S1) wandelt die erfassten Bilder automatisch in 8-Bit-Bilder und eine Z-Projektion mit maximaler Intensität um (Abb. 6a). Der folgende Zwischenschritt erfordert zu Beginn erhebliche Benutzereingaben (Abb. 6b). Hier haben wir ein LABKIT13-Plugin in FIJI verwendet, das einen flachen maschinellen Lernansatz verwendet, um Bilder basierend auf Training zu segmentieren. Um einen Trainingsdatensatz zu erstellen, haben wir sechs Beispielbilder (vorverarbeitet mit Schritt A des Arbeitsablaufs) aus unterschiedlichen Zellaussaatdichten verkettet. Anschließend wurde ein benutzerinduziertes Training angewendet, um einen Klassifikator zu generieren. Dieser Klassifikator wurde verwendet, um alle vorverarbeiteten Bilder aus Schritt A stapelweise zu verarbeiten und Segmentierungen zu generieren. Diese Segmentierungen wurden dann in Schritt C (Abb. 6c) des Arbeitsablaufs analysiert. Wir haben ein zusätzliches kurzes Makro (Ergänzungsmakro S2) angewendet, um die Masken stapelweise zu analysieren und die Anzahl der erkannten Objekte pro Bild zu melden. Wir nutzen die Makros zur freien Nutzung ohne jegliche Gewährleistung und Wartung.

Schema eines automatisierten Workflows, der aus zwei Makroskripten (a,c) und einem Zwischenschritt (b) besteht, der auf flachem maschinellem Lernen basiert.

Das Volumen des Kollagengerüsts wurde nach dem Archimedes-Prinzip geschätzt. Ein 5-ml-Messzylinder mit 0,1-ml-Markierungen wurde mit genau 3 ml PBS gefüllt. Jedes Kollagengerüst wurde mit PBS in den Zylinder gegeben und das aufgewirbelte PBS-Volumen wurde auf der Zylinderskala abgelesen. Das vergrößerte Volumen im Zylinder entsprach dem Volumen des Kollagengerüsts.

Die Zellzahl in erfassten Bildsequenzen (XYZ-Spalte) wurde auf das gesamte mit Zellen besäte Kollagengerüst umgerechnet, d. h. zur Schätzung der Zellzahl in einem Kollagengerüst wurde die Zellzahl aus 9 Bildsequenzen (dh 9 Spalten) auf das Gesamtkollagen umgerechnet Gerüstvolumen. Diese Berechnung wurde anhand der 9 Spalten durchgeführt und der Mittelwert der Werte wurde als Ergebnis (Gesamtzellzahl) für ein Kollagengerüst berücksichtigt.

Die mit NHDF beimpften Kulturschalen wurden trypsiniert und in frischem Kulturmedium resuspendiert. Ein Teil der Suspension wurde zur Bestimmung der Zellzahl mit Trypanblau (Merck KGaA) verdünnt (fünf Wiederholungen). Die mittlere Schätzung der Zellzahl diente als anfängliche Zellzahl für weitere Verdünnungen.

Aus den anfänglichen Zellsuspensionen wurden 5 × 0,5 ml (enthaltend 10.000; 125.000; 250.000 und 375.000 Zellen) hergestellt. Von diesen 0,5 ml-Suspensionen wurde ein Teil mit Trypanblau verdünnt und die Zellzahl geschätzt. Diese Zählung wurde in 10 Wiederholungen von zwei unabhängigen Beobachtern durchgeführt (N = 10 jeder Zellaussaatdichte).

Zellbeladene Kollagengerüste (N = 4 für 10.000 Zellen/Gerüst; N = 8 für 125.000 Zellen/Gerüst; N = 9 für 250.000 Zellen/Gerüst; N = 5 für 375.000 Zellen/Gerüst) wurden gemäß 5.3 hergestellt. Am nächsten Tag wurden die Gerüste mit PBS gewaschen und bei –80 °C platziert. Am Tag der Analyse waren die Kollagengerüste aufgetaut.

Zunächst wurde Proteinase K (0,2 mg/ml; 2,5 DMC-U/ml, Serva, Heidelberg, Deutschland) in phosphatgepuffertem EDTA (PBE) im Verhältnis 1:1 zu Gerüsten mit Zellen gegeben. Anschließend wurden die Proben 90 Minuten lang bei 50 °C inkubiert. Anschließend wurde die aufgeschlossene Probenflüssigkeit durch Pipettieren homogenisiert und gevortext. 462 µl der Probenflüssigkeit (die Hälfte des Probenvolumens) wurden in ein frisches Röhrchen überführt und mit 17,6 µl RNAse A (1 mg/ml, Serva), 1 µl EDTA (0,5 M, Thermo Fisher Scientific) und 20 µl NaCl versetzt -Tris-EDTA (TE)-Pufferlösung (10,5 mg NaCl pro Probe, verdünnt in 50 × TE-Puffer) wurde zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Mit RNAse behandelte Probenflüssigkeit wurde auf eine schwarze 96-Well-Platte (100 µl/Well) übertragen und 50 µl CyQuant-Lösung (Thermo Fisher Scientific) in TE-Puffer wurden zugegeben (endgültige TE-Pufferkonzentration 1 ×, CyQuant:TE-Puffer 1:200). ). Die Proben wurden bei Raumtemperatur inkubiert, 10 Minuten lang vor Licht geschützt und gelegentlich geschüttelt. Das Fluoreszenzsignal wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Synergy HT, Biotek, Winooski, Vermont) bei 520 nm/480 nm gemessen und mit dem gemäß der CyQuant-Herstellungsbroschüre hergestellten DNA-Standard korreliert.

Der DNA-Gehalt in mit Zellen besäten Kollagengerüsten wurde anhand der Zellzahl-Kalibrierungskurve, die aus den normalerweise auf einer Platte ausgesäten Zellen erstellt wurde, auf die Zellzahl umgerechnet.

Die Daten wurden mit der Statistiksoftware R analysiert14. Zur Datenvisualisierung wurden die R-Pakete „beeswarm“15 und „vioplot“16 verwendet.

Die Genauigkeiten wurden verglichen unter Verwendung von: (i) Abweichung von den theoretischen Werten, die angibt, wie stark die durchschnittlichen Schätzungen der StereoCount- und DNA-Gehaltsschätzer von der Bürker-Referenzmethode abweichen. Als nächstes verwendeten wir zwei Maße, die die Streuung widerspiegeln, wobei wir die potenzielle Verzerrung ignorierten und so einen aussagekräftigen Vergleich der Bürker-Methode mit anderen Methoden ermöglichten. Dies sind (ii) Abweichungen vom [gruppenspezifischen] Mittelwert und (iii) quadratische Abweichungen vom Mittelwert. Schließlich geben zwei weitere Maße die Gesamtgenauigkeit der Methoden an und spiegeln sowohl die Verzerrung als auch die Streuung wider: (iv) Abweichung vom theoretischen Wert und (v) quadratische Abweichung vom theoretischen Wert (Abb. 3).

Alle diese fünf Genauigkeitsmaße wurden ursprünglich unter Verwendung der verallgemeinerten kleinsten Quadrate (GLS) verglichen, wobei die Varianzfunktion eine schätzerspezifische Varianz ermöglichte, und zwar unter Verwendung des Pakets „nlme“17. Da Modelle mit quadratischen Abweichungen eine nichtnormale Verteilung der standardisierten Residuen aufwiesen (visuell anhand von Histogrammen und QQ-Diagrammen sowie mittels Shapiro-Wilk-Test überprüft), wurden sie mithilfe verallgemeinerter linearer Modelle mit Gammaverteilung und Log-Link (Gamma GLM) erneut analysiert.

In jedem Modell stellte eines der fünf oben genannten Maße das Ergebnis dar (Antwortvariable), während der Methodentyp einen Prädiktor (erklärende Variable) darstellte. Der P-Wert (zweiseitig) basierte auf dem permutationellen T-Test (Bias und absolute Abweichungen) oder dem permutationellen Gamma-GLM (quadratische Abweichungen) gemäß dem zuvor gezeigten Skript18 unter Verwendung von 5000 Monte-Carlo-Randomisierungen. Der Permutationsansatz wurde gewählt, weil er statistische Signifikanzen zuverlässig schätzt, selbst wenn die Stichprobengrößen klein sind und die Annahmen der vollständig parametrischen Methoden (einschließlich der Normalverteilung der Residuen) nicht erfüllt sind19. Für Mehrfachvergleiche wurden die P-Werte nicht korrigiert, da wir uns insbesondere auf den Einzelvergleich (StereoCount vs. DNA-Gehalt) konzentrierten und 95 %-Konfidenzintervalle für die Effektgröße aus den GLS- und Gamma-GLM-Modellen abgeleitet wurden.

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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