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May 13, 2023

Förderung neutralisierender Antikörper

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4831 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Es wurde gezeigt, dass sowohl T-Zellen als auch B-Zellen nach einer Infektion mit SARS-CoV-2 entstehen, Protokolle oder experimentelle Modelle zur Untersuchung des einen oder anderen sind jedoch weniger verbreitet. Hier erzeugen wir ein chimäres Protein (SpiN), das die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von Spike (S) und die Nukleokapsid-Antigene (N) von SARS-CoV-2 umfasst. Im Blut sowohl von Personen, die mit dem Coronavac SARS-CoV-2-Impfstoff geimpft wurden, als auch von COVID-19-Rekonvaleszenten konnten für SpiN spezifische Gedächtnis-CD4+- und CD8+-T-Zellen nachgewiesen werden. Bei Mäusen löste SpiN eine starke IFN-γ-Reaktion der T-Zellen und hohe Konzentrationen an Antikörpern gegen das inaktivierte Virus, jedoch keine nachweisbaren neutralisierenden Antikörper (nAbs) aus. Wichtig ist, dass die Immunisierung von syrischen Hamstern und den menschlichen Angiotensin-Konvertase-Enzym-2-transgenen (K18-ACE-2) Mäusen mit Poly ICLC-adjuvantiertem SpiN eine robuste Resistenz gegen den Wildtyp SARS-CoV-2 fördert, was durch die Viruslast in der Lunge angezeigt wird Entzündung, klinisches Ergebnis und Verringerung der Letalität. Der durch SpiN induzierte Schutz wurde durch die Depletion von CD4+- und CD8+-T-Zellen aufgehoben und nicht durch Antikörper von geimpften Mäusen übertragen. Schließlich schützt die Impfung mit SpiN die K18-ACE-2-Mäuse auch vor einer Infektion mit Delta- und Omicron-SARS-CoV-2-Isolaten. Daher können Impfstoffformulierungen, die für die N- und RBD-Proteine ​​spezifische Effektor-T-Zellen hervorrufen, zur Verbesserung von COVID-19-Impfstoffen und möglicherweise zur Umgehung der Immunflucht durch besorgniserregende Varianten verwendet werden.

Seit Ende 2019 wurden weltweit über 500 Millionen Fälle und sechs Millionen Todesfälle durch COVID-19 gemeldet. Die meisten, wenn nicht alle derzeit verwendeten COVID-19-Impfstoffe basieren auf dem Spike (S)-Protein und neutralisierenden Antikörpern (nAbs)1,2. Allerdings ist die positive Selektion von SARS-CoV-2-Mutanten mit Aminosäureveränderungen in der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und angrenzenden Segmenten des S-Proteins ein häufiges Ereignis3,4, das besorgniserregende Varianten (VOCs) erzeugt. Die VOCs weisen Konformationsänderungen im RBD auf, was ihre Affinität zum Angiotensin-Konvertase-Enzym-2 (ACE-2) und die Fähigkeit erhöht, der Wirkung von nAbs5 zu entgehen. Während die Fitness erhalten bleibt, sind diese Konformationsänderungen im S-Protein oft mit einer erhöhten Virusinfektiosität und -verbreitung beim Menschen verbunden6,7. Tatsächlich wurde die Wirksamkeit der aktuellen Impfstoffe, die auf konformationelle RBD-Epitope abzielen, durch das Auftreten von VOCs1,6,8,9,10,11,12 in Frage gestellt.

Die nAbs binden an das RBD des Spike (S)-Proteins und verhindern die Interaktion von SARS-CoV-2 mit ACE-2 und die Invasion der hinteren Wirtszelle13. Während die durch Impfung oder Infektion hervorgerufenen nAb-Spiegel als Hauptindikatoren für die schützende Immunität gelten, muss noch ein Kausal-Wirkungs-Zusammenhang hergestellt werden14,15,16. Wichtig ist, dass es Hinweise auf die Funktion von T-Zellen bei der Vermittlung der Immunität gegen SARS-CoV-2 gibt17. Beispielsweise haben asymptomatische Patienten niedrige, oft nicht nachweisbare Werte an Anti-SARS-CoV-2-nAbs, während Patienten mit mittelschwerer oder schwerer COVID-19 mittlere bis hohe Werte an zirkulierenden nAbs aufweisen18,19,20,21,22,23, 24,25.

Eine koordinierte Reaktion von CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen und nAbs scheint ideal für einen günstigen Krankheitsverlauf zu sein14,26. In SARS-CoV-2-Proteinen wurden mehrere T-Zell-Epitope identifiziert, von denen einige Homologie zu Polypeptiden anderer Coronaviren aufweisen, die in der menschlichen Bevölkerung zirkulieren, und die Resistenz einiger seronegativer Personen gegen symptomatisches COVID-19 erklären könnte16,27,28, 29. Zusammengenommen deuten diese Studien auf eine wichtige Beteiligung von Effektor-T-Zellen an der Vermittlung der Resistenz gegen eine Primärinfektion mit SARS-CoV-230 hin. Allerdings basieren die meisten zum Schutz vor COVID-19 entwickelten Impfstoffe auf Konformationsepitopen des S-Proteins und der Induktion von nAbs.

Hier zeigen wir, dass ein chimäres Protein, das das ungefaltete RBD des kanonischen Spike-Proteins und N-Proteins (SpiN) enthält, von IgG-Antikörpern erkannt wird und die IFN-γ-Produktion durch CD4+- und CD8+-T-Zellen von genesenen und geimpften menschlichen Spendern induziert. Bei Mäusen zeigen wir, dass SpiN starke humorale und T-Zell-Reaktionen, aber keine nachweisbaren nAbs induziert. Unabhängig davon entwickeln die SpiN-immunisierten Mäuse eine hohe Resistenz gegen die Wildtyp-, die Delta- und die Omicron-Variante von SARS-CoV-2. Somit stellen wir ein Modell bereit, mit dem die Funktion von Effektor-CD4+- und CD8+-T-Zellen untersucht werden kann, die auf konservierte Epitope von SARS-CoV-2 abzielen und möglicherweise das Immun-Escape von VOCs umgehen.

Zunächst führten wir eine Silico-Analyse der N- und S-Proteine ​​durch, um die Regionen zu identifizieren, die mit T-Zell-Epitopen angereichert sind31,32. Wie in Abb. 1a gezeigt, zeigen die vertikalen Linien unter den Balken, die die S- und N-Proteine ​​darstellen, jedes der mutmaßlichen CD8+ T- (rote Linien) bzw. CD4+ T-Zellepitope (schwarze Linien) für den Menschen an. Die in den Ergänzungstabellen 1–4 dargestellten Ergebnisse zeigen die Epitopsequenzen in RBD und N für HLA-I, HLA-DR und Mäuse MHC-I und II. In Übereinstimmung mit einer früheren Studie haben wir herausgefunden, dass das N-Protein stark mit T-Zell-Epitopen angereichert ist29. Die in der Ergänzungstabelle 1 (Perzentilrang-Spalte) dargestellten Ergebnisse sind die Bindungswerte von IEDB und NETMHCII zur Validierung der ausgewählten T-Zell-Epitope. Wir haben nur die Peptide in die Tabelle aufgenommen, die Werte < 1 für HLA-ABC und HLA-DR aufwiesen; < 1,3 für Maus-MHC I; und < 2,0 für Maus-MHC II. Basierend auf dieser virtuellen Analyse verfügt das N-Protein über 32 immunogene Peptide mit höherer Affinität für HLA-ABC (Ergänzungstabelle 1), das von CD8+-T-Zellen erkannt wird, und 11 für HLA-DR (Ergänzungstabelle 2), das von CD4+-T-Zellen erkannt wird. Im S-Protein weist das RBD-Segment die größte Prävalenz potenzieller T-Zell-Epitope auf und weist 10 und 8 Epitope mit hoher Affinität zu HLA-ABC (Ergänzungstabelle 1) und HLA-DR (Ergänzungstabelle 2) auf, wie durch die Bindung bestimmt Punktzahl. Dementsprechend haben sich sowohl N- als auch RBD-Proteine ​​als immunogen für CD4+-, CD8+-T-Zellen und B-Lymphozyten erwiesen16,26,28,33,34,35.

ein Nadeldiagramm, das die Anzahl der Aminosäuredivergenzpunkte in der Proteinsequenz von Nucleocapsid (N) und Spike (S) von fünf Varianten im Verhältnis zu den N- und S-Sequenzen aus der SARS-CoV-2-Linie B (Wuhan) angibt. Die Spitzen mit Kreisen geben die Position der häufigsten Aminosäureveränderungen an. Die Höhe der Spitzen gibt die Häufigkeit der Änderungen an jedem Divergenzpunkt an. Die blauen und violetten Kreise zeigen häufige Mutationen bzw. Mutationen an, die bei besorgniserregenden Varianten beobachtet wurden. Die Summe der Aminosäureänderungen für jedes Segment (S1, RBD und S2) der S- und N-Proteine ​​unter Berücksichtigung der 6 SARS-CoV2-Linien wird ebenfalls angezeigt. Die vertikalen schwarzen und roten Linien unter den Balken, die die N- und S-Polypeptide darstellen, geben jeweils die Position jedes mutmaßlichen CD4+-T- und CD8+-T-Zell-Epitops an, die durch In-silico-Epitopvorhersage identifiziert wurden. bg UMAP-Projektion von FACS-Daten, die die IFN-γ-Produktion durch verschiedene CD4+- (b) oder CD8+-T-Zellkompartimente (c) zeigen, bestimmt durch die Oberflächenmarker CD45RO, CD27 und CD69. Die Daten werden auch durch den prozentualen Anteil jeder Subpopulation an den gesamten CD4+- (d, f) oder CD8+- (e, g) IFN-γ+-T-Zellen dargestellt. Die Anzahl der in diesen Experimenten verwendeten Personen betrug 5 Kontrollpersonen, 8 Geimpfte und 8 Rekonvaleszenten. Die statistische Analyse der IFN-γ-Produktion (f, g) wurde unter Verwendung zweiseitiger, mit Wilcoxon übereinstimmender Paare mit Vorzeichenrang durchgeführt; „ns“ bedeutet, dass der Unterschied statistisch nicht signifikant ist und NS = nicht stimulierte PBMCs.

Als nächstes analysierten wir die N- und S-Proteinsequenzen des Wildtyp-Wuhan-Isolats und fünf weltweit verbreitete VOC-Linien (Alpha-B.1.1.7, Beta-B.1.351, Gama-P.1, Delta und Omicron)36. Die Peaks mit Kreisen zeigen die Position der häufigsten Aminosäureveränderungen in den N- und S-Proteinen an, und die Höhe der Peaks gibt die Häufigkeit an, mit der diese Veränderungen in der Wuhan- und den fünf VOC-Linien auftreten. Die blauen und violetten Kreise zeigen die häufigsten Aminosäureveränderungen an, die in den VOCs beobachtet wurden. Wichtig ist, dass nur zwei im N-Protein gefundene T-Zell-Epitope mit Stellen mit Aminosäureveränderungen überlappten, die mit den Varianten assoziiert sind (Peaks mit violetten Kreisen) (Abb. 1a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Großteil der mutmaßlichen T-Zell-Epitope des N-Proteins in den VOCs konserviert ist. Darüber hinaus wird das N-Protein im Zytosol von Wirtszellen stark exprimiert37 und steht daher wahrscheinlich leicht für die Verarbeitung und Präsentation über HLA-I für die zytotoxischen CD8-T-Zellen zur Verfügung. Daher scheint das N-Protein ein ideales Antigen für einen T-Zell-basierten Impfstoff zu sein, der eine breite Wirkung gegen Varianten hat.

Mit dem Ziel, einen Impfstoff zu entwickeln, der eine starke T-Zell-vermittelte Immunität induziert, haben wir ein Fusionsprotein namens SpiN konstruiert, das das RBD von Spike und das Nucleocapsid (N)-Protein von SARS-CoV-2 trägt. Polyacrylamidgele (ergänzende Abbildung 1a) und Western Blots (ergänzende Abbildungen 1b, c) zeigen die hochgereinigten N- (~45 kDa) und RBD-Proteine ​​(~25 kDa), die in Escherichia coli exprimiert werden, sowie das S-Oberflächenantigen (~200). kDa), gewonnen aus eukaryotischen Zellen. Das ebenfalls aus Bakterien stammende rekombinante SpiN hat ein scheinbares Molekulargewicht von 70 kDa (Ergänzende Abbildung 1a – c). Die Proteine ​​wurden entweder auf einer Nickelsäule (RBD und N) oder durch Ionenaustauschchromatographie (SpiN) gereinigt. Die Immunoblots wurden entweder mit polyklonalen Anti-N- (ergänzende Abbildung 1b) oder Anti-RBD-Seren (ergänzende Abbildung 1c) von Kaninchen erstellt und zeigen, dass das SpiN-Protein von beiden Antikörpern erkannt wird. Um sicherzustellen, dass N- oder RBD-Proteine ​​sowohl von Antikörpern als auch von T-Zellen des Menschen erkannt werden, verwendeten wir Proben von COVID-19-Rekonvaleszenten und Personen, die mit einem inaktivierten Virusimpfstoff (CoronaVac) geimpft wurden. Der Zeitpunkt der Serumprobenentnahme variierte zwischen 2 und 8 Monaten nach dem Virusnachweis durch RT-PCR bei Rekonvaleszenten und 1 bis 2 Monaten nach der zweiten Dosis bei geimpften Personen. Rekonvaleszente Personen entwickelten eine hohe, aber variable Antikörperreaktion auf S- (ergänzende Abbildung 1d) und N-Proteine ​​(ergänzende Abbildung 1e) und eine niedrige Reaktion auf die in Bakterien exprimierte RBD (ergänzende Abbildung 1f). Geimpfte Personen zeigten eine geringe Antikörperreaktion sowohl auf N- als auch auf RBD-Proteine ​​(ergänzende Abbildung 1e, f) und eine hohe Reaktion auf das S-Protein (ergänzende Abbildung 1d). Als nächstes bewerteten wir die Reaktion von PBMCs auf die S-, N- und RBD-Proteine. Wichtig ist, dass PBMCs von genesenen und geimpften Personen, jedoch nicht von seronegativen gesunden Spendern (HD), eine robuste IFN-γ-Reaktion auf das rekombinante S (ergänzende Abbildung 1g), N (ergänzende Abbildung 2h) und RBD (ergänzende Abbildung 1i) zeigten ), was darauf hinweist, dass sie für T-Zellen stark immunogen sind.

Wir haben auch die T-Zell-Reaktion von immunisierten und rekonvaleszenten Personen auf SpiN mithilfe eines zytometrischen Th1/Th2/Th17-Bead-Arrays bewertet. Die In-vitro-Stimulation von PBMCs mit SpiN induzierte die Produktion sehr hoher Mengen an IFN-γ sowie IL-2, TNF, IL-6 und IL-10, jedoch nicht IL-4 und IL-17, was darauf hindeutet, dass beide geimpft waren und rekonvaleszente Personen zeigten eine Typ-I-Helfer-T-Zellen-Reaktion (Th1) auf die RBD- und N-Proteine ​​von SARS-CoV-2 (ergänzende Abbildung 1j). Wir untersuchten auch, welche T-Zellpopulation IFN-γ produzierte, das Hauptzytokin, das von Th1-Lymphozyten produziert wird. Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Zuerst haben wir CD4+ T-Zellen (Abb. 1b) oder CD8+ T-Zellen (Abb. 1c) angesteuert. Die Zelloberflächenmarker CD45RO, CD27 und CD69 wurden verwendet, um das zentrale Gedächtnis, das Effektorgedächtnis sowie die Effektor- und naiven T-Zellen zu definieren. Als nächstes haben wir ausgewertet, welche T-Zell-Untergruppen hauptsächlich IFN-γ exprimieren. Sowohl IFNγ-produzierende zentrale als auch Effektor-Gedächtnis-CD4+-T- und CD8+-T-Zellen expandierten, wohingegen die Effektoren und naiven Untergruppen nach der Stimulation mit SpiN kontrahierten oder unverändert blieben (Abb. 1b – e). Wir fanden auch heraus, dass sowohl bei den CD4+ T- (Abb. 1d) als auch bei den CD8+ T-Lymphozyten (Abb. 1e) die Hauptuntergruppe, die IFN-γ exprimierte, die Effektor-Gedächtnis-T-Zellen waren, gefolgt von den zentralen Gedächtnis-T-Zellen. Die Häufigkeit des IFNγ-produzierenden zentralen Gedächtnisses, des Effektorgedächtnisses, der Effektor-T-Zellen und der naiven CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten vor und nach der Stimulation mit SpiN ist in Abb. 1f bzw. g dargestellt.

Als nächstes bewerteten wir die Immunogenität und ob die Immunisierung mit RBD, N oder SpiN Mäuse vor der SARS-CoV-2-Herausforderung schützt. Mäuse wurden mit einem der beiden rekombinanten Proteine ​​immunisiert, indem zwei intramuskuläre Dosen im Abstand von 21 Tagen verabreicht wurden (Abb. 2a). Als immunologisches Adjuvans verwendeten wir die synthetische Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly I:C), gemischt mit den Stabilisatoren Carboxymethylcellulose und Polylysin (Poly-ICLC, Hiltonol). Wir haben uns für dieses Adjuvans entschieden, weil es nachweislich eine wirksame Immunität gegen Influenza induziert, die auch Menschen über die Atemwege infiziert38,39. Darüber hinaus sind die Poly-IC-Derivate wirksame Aktivatoren des Toll-Like-Rezeptors 3 (TLR3) und MDA5 aus der RIG-I-Familie. Beide zytosolischen angeborenen Immunrezeptoren erkennen auch doppelsträngige RNA und begünstigen die T-Zell-vermittelte Immunität40,41. Bemerkenswert ist, dass Poly ICLC auch in mehreren klinischen Studien zur Krebstherapie eingesetzt wurde40,42,43.

ein Immunisierungsprotokoll, das in den in den Abbildungen gezeigten Experimenten verwendet wurde. 2–8 zur Analyse der Immunantwort und des Schutzes gegen SARS-CoV-2. Antigenspezifische IgG-Antikörper wurden in der bronchoalveolären Lavage (BALF) im Verhältnis 1:1 (b) und in seriell verdünnten Seren von immunisierten Mäusen (c) gemessen. Die Konzentrationen von IFNγ (d) und IL-10 (e) wurden im Kulturüberstand von Splenozyten gemessen, die mit RBD- oder N-Antigenen stimuliert wurden. sein, n = 3/Gruppe. f, g Körpergewicht und Überleben von K18-hACE2-Mäusen, die mit RBD, N oder SpiN, assoziiert mit Poly ICLC, immunisiert und mit dem Wuhan-Stamm von SARS-CoV-2 infiziert wurden. h, i Viruslast, gemessen durch RT-PCR, im Lungen- und Gehirngewebe von ungeimpften und Mäusen, die entweder mit RBD, N oder SpiN in Verbindung mit Poly ICLC geimpft wurden. f–in = 4/Gruppe. j, k Spiegel des zirkulierenden Gesamt-IgG, das entweder für N-, RBD- und S-Proteine ​​oder inaktiviertes SARS-CoV-2 in mit SpiN immunisierten Mäusen spezifisch ist (n = 4/Gruppe). l, m Gesamt-IgG-Antwort von rekonvaleszenten Personen auf entweder N oder RBD und inaktiviertes SARS-CoV-2 oder S (n = 5/Gruppe). n Die Konzentrationen von Anti-N-Antikörpern (linkes Feld) und Anti-RBD-Antikörpern (rechtes Feld) wurden in BALF von Mäusen gemessen, die Poly ICLC allein oder SpiN plus Poly ICLC erhielten (n = 4/Gruppe). j–nn = 3-5/Gruppe. Spiegel an anti-inaktiviertem SARS-CoV-2 (o) und neutralisierenden Antikörpern (p) in gepoolten Seren von Mäusen, die mit PBS, N, RBD oder SpiN immunisiert wurden, und von COVID-19-Rekonvaleszenten. q Immunfluoreszenz von SARS-CoV-2-infizierten Zellen, gefärbt mit Seren von Mäusen, die Adjuvans allein erhielten (linkes Feld) oder mit N (linkes mittleres Feld), RBD (rechtes mittleres Feld) oder SpiN (rechtes Feld) assoziiert mit Poly ICLC immunisiert wurden . Pfeile zeigen auf kleine Vesikel, die das S-Protein enthalten, das mit polyklonalen Anti-RBD- und Anti-SpiN-Antikörpern reagierte. Die statistische Analyse des in BALF (b, n) gemessenen IgG wurde unter Verwendung eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests durchgeführt. Die Zytokinmessungen (d, e) wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachtests analysiert. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. b, d–e, h–i, n, Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. * P < 0,05 und *** P < 0,001.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass entweder rekombinantes RBD- oder N-Protein, das mit Poly ICLC assoziiert ist, immunogen ist und hohe Mengen an Anti-RBD- oder Anti-N-Antikörpern sowohl in der bronchioalveolären Flüssigkeit (BALF) (Abb. 2b) als auch in den Seren (Abb. 2c) von geimpften Mäusen. Wir beobachteten auch eine starke IFN-γ- (Abb. 2d) und IL-10-Reaktion (Abb. 2e) durch Splenozyten, die entweder mit N oder RBD stimuliert wurden. Die K18-ACE-2-Mäuse sind ein Modell für schwere Erkrankungen44 und wurden zur Bewertung der Wirksamkeit der Immunisierung mit rekombinanten N- oder RBD-Proteinen im Zusammenhang mit Poly-ICLC verwendet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung mit beiden Proteinen zu einem teilweisen Schutz vor der SARS-CoV-2-Exposition führte, was durch den Verlust des Körpergewichts (Abb. 2f), die Mortalität (Abb. 2g) sowie die Viruslast in der Lunge (Abb. 2h) und Gehirn (Abb. 2i).

Wichtig ist, dass wir berichten, dass die Immunisierung mit adjuvantiertem SpiN robuste virusspezifische T-Zell- und Antikörperreaktionen induzierte und einen äußerst wirksamen Schutz vor experimentellen Herausforderungen mit SARS-CoV-2 bietet. Seren von Mäusen, die mit Poly-ICLC-assoziiertem SpiN immunisiert wurden, zeigten sehr hohe Titer an IgG-Antikörpern, die spezifisch für RBD (1:5.000) und N-Proteine ​​(1:25.000) (Abb. 2j) sowie für inaktiviertes Virus (1:5.000) sind niedrige Titer von Anti-S-Antikörpern (Abb. 2k). Die Konzentrationen von IgG-Anti-N (1:400) (Abb. 2l) sowie Anti-SARS-CoV-2 (1:200) (Abb. 2m) waren in Seren von COVID-19-Rekonvaleszenten höher als von gesunde Kontrollen, aber im Vergleich zu SpiN-immunisierten Mäusen relativ niedrig (Abb. 2j, k). Im Gegensatz zu immunisierten Mäusen waren die Anti-RBD-Titer in Seren von Rekonvaleszenten niedrig (Abb. 2l) und Anti-S (1:200) hoch (Abb. 2m). Die in Abb. 2n dargestellten Ergebnisse zeigen die erhöhten Konzentrationen der Antikörper Anti-N (linkes Feld) und Anti-RBD (rechtes Feld) im BALF von Mäusen, die mit SpiN geimpft wurden.

In Übereinstimmung mit der hohen Expression des N-Proteins37 in infizierten Zellen erkannten Antikörper von Mäusen, die entweder mit N- oder SpiN-Proteinen immunisiert wurden, UV-inaktiviertes SARS-CoV-2 in einem ELISA stark (Abb. 2o). Relevant für diese Studie stellten wir fest, dass die Immunisierung weder mit dem chimären N-, RBD- noch dem SpiN-Protein nAbs gegen SARS-CoV-2 hervorrief, was im Gegensatz zu den messbaren Werten in Seren von rekonvaleszenten COVID-19-Patienten steht (Abb. 2p). In Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnissen (Abb. 2o) reagierten Seren von mit dem N-Protein immunisierten Mäusen stark mit Paraformaldehyd-fixierten SARS-CoV-2-infizierten Zellen und zeigten eine diffuse Expression des N-Proteins im Zytosol, wie durch Immunfluoreszenz (IFA) nachgewiesen wurde. (Abb. 2q). Im Gegensatz dazu reagierten die Antikörper von mit RBD immunisierten Mäusen mit kleinen Vesikeln, was möglicherweise mit der Spike-Protein-Assemblierung im endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Zwischenkompartiment (ERGIC) vor der ordnungsgemäßen Faltung vereinbar ist. Die Reaktivität von Seren von SpiN-immunisierten Mäusen zeigte ein gemischtes Muster, das mit einer diffusen Expression von N-Protein im Zytosol und einer punktuellen Färbung von RBD übereinstimmt, wie sie bei Anti-N- bzw. Anti-RBD-Antiseren beobachtet wurde (Abb. 2q).

Um die Polarisierung der durch die Impfung induzierten Immunantwort zu bewerten, haben wir die Zytokinspiegel in den Überständen von Splenozyten gemessen, die mit RBD oder N-Protein stimuliert wurden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Splenozyten von SpiN-geimpften Mäusen, die entweder mit RBD- (Abb. 3a) oder N-Proteinen (Abb. 3b) stimuliert wurden, hohe Mengen an IFN-γ und in geringerem Maße IL-6 und IL-10 produzierten . Im Gegensatz dazu waren die IL-4- und IL-17-Spiegel entweder niedrig oder wurden nicht als Reaktion auf RBD- oder N-Antigene produziert (Abb. 3a, b). Bei Mäusen, die mit Poly-ICLC-assoziiertem SpiN immunisiert wurden, sind die Konzentrationen von IgG2c-Antikörpern gegen RBD höher als die von IgG1, was einen Trend zu einer Typ-1-Immunantwort zeigt (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied in den Spiegeln der für das N-Protein spezifischen IgG1- und IgG2c-Antikörper sowie inaktiviertem SARS-CoV-2 (Abb. 3d, e). Wie für das Gesamt-IgG gezeigt (Abb. 2k), waren die Spiegel der für das S-Protein spezifischen IgG1- und IgG2c-Antikörper sehr niedrig (Abb. 3f). Wir haben auch die Recall-T-Zell-Reaktion bei geimpften Mäusen untersucht. Sowohl das N- als auch das RBD-Protein induzierten hohe Mengen an CD4+CD44+- und CD8+CD44+-aktivierten T-Zellen aus der Milz von SpiN-geimpften Mäusen, jedoch nicht von Kontrollmäusen, wie durch Durchflusszytometrie angezeigt (Abb. 4a, b). Um den UMAP zu erzeugen, haben wir CD4+ T-Zellen (Abb. 4c, linke Felder) oder CD8+ T-Zellen (Abb. 4c, rechte Felder) aktiviert. Die Zelloberflächenmarker CD44 und CD62L wurden verwendet, um das zentrale Gedächtnis (Tcm), das Effektor/Effektor-Gedächtnis (Teff/em) und naive T-Zellen zu definieren. Die Zellen wurden auch mit Anti-IFN-γ gefärbt. Wir fanden heraus, dass CD4-Teff/em- und CD8-Tcm-Lymphozyten die Hauptquellen für IFN-γ in Splenozyten immunisierter Mäuse waren (Abb. 4d, e, ergänzende Abb. 3a).

Zytokinspiegel im Überstand von Splenozyten von Kontrollmäusen und geimpften Mäusen, die mit den RBD- (a) und N-Proteinen (b) stimuliert (stim) oder nicht (NS) wurden, gemessen mit dem zytometrischen Bead Array (CBA). Die Konzentrationen von IgG1 und IgG2c, die für die Proteine ​​RBD (c), N (d), SARS-CoV-2 (e) und S (f) spezifisch sind, in Seren von Mäusen, die nur Adjuvans erhielten (schwarze Symbole unten) oder immunisiert wurden mit SpiN-Protein, das mit Poly ICLC assoziiert ist. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente, n = 3–4 Mäuse/Gruppe. Die statistische Analyse der CBA wurde mit mehreren t-Tests durchgeführt, und die Antikörpermessungen wurden mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest analysiert. **** P < 0,0001.

Die Häufigkeit aktivierter CD4+ T- (a) und CD8+ T-Lymphozyten (b) wurde durch Messung der Expression von CD44 auf der Zelloberfläche bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. c UMAP-Projektion von FACS-Daten, bei der Splenozyten entweder auf CD4+-T- oder CD8+-T-Zellpopulationen gezielt wurden. Die Färbung mit Anti-CD62L, Anti-CD44 und Anti-IFN-γ wurde verwendet, um IFNγ-produzierende naive T-Zellen, T-Zellen mit zentralem Gedächtnis (Tcm) und Effektor/Effektor-Gedächtnis (Teff/em) zu definieren. Die Häufigkeit naiver, Gedächtnis- und Effektor-CD4+-T- und CD8+-T-Populationen, die IFN-γ mit oder ohne Stimulation mit SpiN produzieren, ist in den Feldern d bzw. e dargestellt. f, g Immunphänotypisierung der Lunge von immunisierten oder nicht immunisierten Mäusen. Die Zellen wurden mit SpiN-Protein kultiviert und durch Durchflusszytometrie als CD4+ CD69+ CD103+ (f, linkes Feld), CD4+ CD69+ CD103+ IFN-γ+ (f, mittleres Feld), CD4+ CD69+ CD103+ TNF+ (f, rechtes Feld), CD8+ CD69+ charakterisiert CD103+ (g, linkes Feld), CD8+ CD69+ CD103+ IFN-γ+ (g, mittleres Feld) und CD8+ CD69+ CD103+ TNF+ (g, rechtes Feld). Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente, n = 3–4 Mäuse/Gruppe. Die statistische Analyse wurde mittels zweiseitiger Mann-Whitney-Methode durchgeführt. * P < 0,05 und ** P < 0,01.

Wir haben auch die lokale T-Zell-Reaktion in der Lunge mittels Durchflusszytometrie ausgewertet (Abb. 4f, g, ergänzende Abb. 3b) und es wurde beobachtet, dass SpiN-immunisierte Mäuse einen Anstieg des geweberesidenten Gedächtnisses (Trm) CD4+ aufwiesen (Abb . 4f, linkes Feld) und CD8+ (Abb. 4g, linkes Feld) T-Zellen bei Stimulation mit SpiN. Wichtig ist, dass SpiN auch die Produktion von IFN-γ und TNF sowohl durch CD4+- als auch CD8+-Trm von SpiN-immunisierten Mäusen induzierte (Abb. 4f, g, mittlere und rechte Tafel). Daher ist es wahrscheinlich, dass lokale T-Zell-Reaktionen eine wichtige Funktion bei der Kontrolle des Viruswachstums und der daraus resultierenden Entzündung bei SpiN-immunisierten Mäusen haben.

Die syrischen Hamster wurden in unseren Experimenten als Modell für eine mittelschwere COVID-19-Erkrankung verwendet46. Die in Abb. 5a dargestellten Ergebnisse zeigen, dass mit Poly ICLC assoziiertes SpiN bei immunisierten Hamstern hohe Spiegel an Gesamt-IgG-Anti-N induzierte. Die Anti-RBD-Werte waren niedriger (Abb. 5a). Bemerkenswert ist, dass die nAb-Werte bei geimpften Hamstern nicht nachweisbar waren (Abb. 5b). Dennoch war die durch RT-PCR nachgewiesene Viruslast bei geimpften Hamstern im Vergleich zu ungeimpften Hamstern, die mit SARS-CoV-2 infiziert waren, deutlich geringer (Abb. 5c). Die histopathologische Analyse von Hamstern 4 Tage nach der Infektion (dpi) mit dem Wuhan-Stamm zeigt, dass die Lungen in der PBS-Gruppe eine diffuse interstitielle Pneumonie aufweisen (Abb. 5d, rechte Tafel). Im Vergleich dazu wiesen Hamster, die mit SpiN-Adjuvans mit Poly-ICLC immunisiert waren, eine leichte fokale Stauung (schwarzer Pfeil) unter Erhaltung des Alveolarraums auf (Abb. 5d, linke Felder).

a Die Gesamt-IgG-Anti-N- und Anti-RBD-Werte in Seren von Hamstern, die mit Poly-ICLC-assoziiertem SpiN geimpft wurden. b Spiegel neutralisierender Antikörper in den Seren von mit SpiN + Poly ICLC geimpften Hamstern im Vergleich zu Seren von genesenen Personen. c Viruslast gemessen durch RT-PCR in der Lunge von Kontrolltieren und Hamstern, die mit SpiN plus Poly ICLC immunisiert wurden, 4 Tage nach der Infektion (dpi) mit SARS-CoV-2. Die Daten werden als Mittelwert +/- SEM (b, c) dargestellt. d Die histopathologische Analyse bei 2,5-facher, 5-facher und 20-facher Vergrößerung von Hamstern bei 4 dpi mit dem Wuhan-Stamm zeigt, dass die Lungen in der PBS-Gruppe eine akzentuierte diffuse Alveolarwandverdickung mit mäßigem multifokalem Kollaps (Sternchen) aufweisen, verbunden mit akzentuierter diffuse Stauung (schwarzer Pfeil) und gemischtes entzündliches Infiltrat (mononukleäre und polymorphkernige Zellen). Im Bronchialraum werden Entzündungszellen festgestellt, wobei Neutrophile im Zusammenhang mit Zelltrümmern überwiegen (Pfeilspitze) (d, rechte Tafel). Im Vergleich dazu wiesen Hamster, die mit SpiN-Adjuvans mit Poly-ICLC immunisiert wurden, eine leichte fokale Stauung (schwarzer Pfeil) mit Erhaltung des Alveolarraums auf (d, linke Felder). a–d Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. an = 5 Hamster/Gruppe. d PBS n = 3, SpiN + Poly ICLC n = 4, Rekonvaleszent n = 3. c Gepoolte Daten aus zwei unabhängigen Experimenten, n = 7–8 Hamster/Gruppe. Die Daten zur Quantifizierung der Viruslast wurden mithilfe eines zweiseitigen Mann-Whitney-Tests analysiert.

Die Immunisierung mit Poly-ICLC-assoziiertem SpiN schützte die K18-ACE-2-Mäuse, ein Modell für schweres COVID-19, auch vor Gewichtsverlust (Abb. 6a) und anderen klinischen Anzeichen der Krankheit, wie beeinträchtigter Motilität, gesträubtem Fell und Buckelbildung . Wichtig ist, dass 100 % der immunisierten Mäuse die Infektion überlebten, wohingegen alle Mäuse, die Poly ICLC allein erhielten, der Infektion erlagen (Abb. 6b). Darüber hinaus war bei 5 dpi die virale RNA-Belastung sowohl in der Lunge als auch im Gehirn (Abb. 6c, d) geringer, wenn SpiN-geimpfte mit nicht geimpften Kontrollen verglichen wurden, die nur Adjuvans erhielten, wie durch RT-PCR angezeigt. Wichtig ist, dass die nAbs-Spiegel in Seren von Mäusen, die mit SpiN bei 5 dpi immunisiert wurden, nicht nachweisbar waren (Abb. 6e). Die histopathologische Analyse zeigt, dass die Lungen der Poly-ICLC-Gruppe bei 5 dpi eine diffuse interstitielle Pneumonie aufwiesen (Abb. 6f, obere Felder). Im Vergleich dazu zeigte die immunisierte Gruppe (SpiN plus Poly ICLC) eine Erhaltung der Lungenarchitektur (Abb. 6f, untere Felder).

Mäuse wurden mit dem Wuhan-Stamm von SARS-CoV-2 infiziert. Körpergewicht (a), Überleben (b) und Viruslast in Lunge (c) und Gehirn (d) wurden bei mit SpiN plus Poly ICLC immunisierten K18-hACE-2-Mäusen und bei Kontrollen, die Poly ICLC allein erhielten, bewertet. e Titer von nAbs in den Seren von Kontrollmäusen und immunisierten Mäusen bei 5 dpi. Als Positivkontrolle dienten rekonvaleszente Patienten. c–e Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. f Histopathologische Analyse bei 2,5-facher, 5-facher und 20-facher Vergrößerung der Lungen von Poly-ICLC- oder SpiN + Poly-ICLC-Gruppen bei 5 dpi. Schwarze Pfeile: Stau; weiße Pfeile: intraalveoläres Exsudat; weißer Stern: hämorrhagische Herde; Sternchen: Alveolarkollaps; rote Pfeile: entzündliches Infiltrat. g, h mRNA-Expression von Zytokinen (g) und Chemokinen (h), quantifiziert durch qRT-PCR in der Lunge von Mäusen bei 5 dpi. i–o, Häufigkeit von myeloischen (i) und lymphoiden (j) sowie Gesamtzahl von Neutrophilen (k), Monozyten (l), von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (m), residenten CD8+ T-Zellen (n) und konventionellen dendritischen Zellen (o) in den Lungen der Kontrolle, ob geimpft, infiziert (infiziert) oder nicht (NI) mit SARS-CoV2 bei 5 dpi. g–o Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. a, b Einzelwerte gepoolter Daten aus zwei unabhängigen Experimenten, Poly ICLC n = 4 und SpiN + Poly ICLC n = 7. c–o Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente, n = 3 Mäuse/Gruppe (c–h). i–o, n = 4 PBS NI und infiziert, n = 3 SpiN + Poly ICLC NI, n = 6 SpiN + Poly ICLC infiziert. Die statistische Analyse der Gewichtsmessungen (a) wurde mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt. Die Überlebensanalyse (b) wurde mit dem Log-Rank-Test durchgeführt. Die Daten der Virusquantifizierung (c, d) wurden mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA und anschließendem Mehrfachvergleichstest von Sidak analysiert. qRT-PCR-Daten (g, h) wurden mit ungepaarten zweiseitigen t-Tests analysiert. Die Durchflusszytometrie der Lunge (i–o) wurde von Kruskal-Wallis analysiert, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 und **** P < 0,0001.

In Übereinstimmung mit der intensiven Entzündungsreaktion fanden wir hohe mRNA-Spiegel von IL-6 und TNF (Abb. 6g) sowie Chemokinen (CCL2, CCL5, CXCL9 und CXCL10) (Abb. 6h) in der Lunge von nicht geimpfte Mäuse, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind. Im Gegensatz dazu war der Spiegel der Typ-2-Zytokine (IL-4 und IL-5) bei den geimpften Mäusen höher (Abb. 6g), was darauf hindeutet, dass die Mikroumgebung in der Lungenschleimhautumgebung bei geimpften Mäusen erhalten blieb, wohingegen ein dramatischer Wechsel zu In der Lunge von Mäusen, die eine schwere Erkrankung entwickelten, wurde eine Entzündungsreaktion beobachtet.

Die Häufigkeit der gesamten myeloischen Zellen war in der Lunge von nicht geimpften Mäusen, die mit SARS-CoV-2 infiziert waren, dramatisch erhöht (Abb. 6i) und lymphoide Zellen verringert (Abb. 6j), wohingegen die Immunisierung das starke entzündliche Infiltrat verhinderte. Konsistent war die Gesamtzahl der Neutrophilen (Abb. 6k), Monozyten (Abb. 6l) und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (Abb. 6m) in der Lunge von nicht geimpften Mäusen, die mit SARS-CoV-2 infiziert waren, dramatisch erhöht. Im Gegensatz dazu war die Anzahl der residenten CD8+-T-Zellen (Abb. 6n) und der konventionellen DCs (Abb. 6o) bei geimpften Mäusen erhöht, was weiter auf eine mögliche Beteiligung der residenten T-Zellen an der Resistenz gegen SARS-CoV-2 und COVID-19 hindeutet. 1947. Somit war mit Poly ICLC assoziiertes SpiN hoch immunogen und induzierte einen robusten Schutz gegen SARS-CoV-2.

Ein relevantes Ergebnis dieser Studie ist der Nachweis, dass mit SpiN immunisierte Mäuse eine hohe Resistenz gegen SARS-CoV-2 haben, selbst wenn zum Zeitpunkt der Infektion keine zirkulierenden nAbs vorhanden waren. Eine wichtige Frage betrifft die Menge an nAbs in immunisierten Nagetieren kurz nach der Infektion mit SARS-CoV-2. Wir fanden heraus, dass bei geimpften Hamstern bei 4 dpi (Abb. 5b) und Mäusen bei 5 dpi (Abb. 6e) die Konzentrationen an nAbs nicht nachweisbar blieben, wohingegen die Entzündung mild war (Abb. 5d, 6f) und die Viruslast in der Lunge auftrat verringert (Abb. 5c und 6e). Diese Ergebnisse stützen die Hypothese einer nAb-unabhängigen Immunität bei mit SpiN immunisierten Mäusen.

Um weiter zu untersuchen, ob CD4+- und CD8+-T-Zellen für die Kontrolle der Viruslast und die schützende Immunität gegen SARS-CoV-2 unerlässlich sind, wurden SpiN-geimpfte Mäuse an den Tagen −3 mit einem oder beiden Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörpern behandelt. −2 und −1 vor der Herausforderung. Eine T-Zell-Depletion von über 90 % wurde durch Durchflusszytometrie bestätigt (ergänzende Abbildung 4). Wie in Abb. 7a, b dargestellt, zeigten 50 % der Mäuse, denen entweder CD4+- oder CD8+-T-Zellen entzogen waren, einen signifikanten Gewichtsverlust und erlagen einer Infektion, während 100 % der Mäuse, denen sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Lymphozyten entzogen waren, an Gewicht verloren und bis zum Alter von 8 Jahren starben Tage nach der Infektion. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass der Schutz bei mit SpiN immunisierten Mäusen in einem frühen Stadium der SARS-CoV-2-Infektion durch Effektor-T-Zellen und nicht durch nAbs vermittelt wird.

K18-hACE2-Mäuse wurden mit SpiN als Adjuvans mit Poly ICLC (a, b) oder Covishield (e, f) immunisiert und an den Tagen −3, −2 und −1 vor der Infektionsbelastung mit Anti-CD4+, Anti-CD8+ oder beiden behandelt . Naiven K18-hACE2-Mäusen wurden am Tag –1 vor der Infektion gepoolte Seren von Kontrollmäusen oder mit SpiN- (c, d) oder Covishield- (g, h) immunisierten Mäusen verabreicht. Körpergewicht (a, c, e, g) und Überleben (b, d, f, h) wurden 11 Tage lang nach der Infektion mit dem SARS-CoV-2-Wuhan-Stamm überwacht. a–h 4 Mäuse/Gruppe.

Obwohl geimpfte Mäuse extrem hohe Mengen an Anti-N-Antikörpern produzierten, haben wir keine Hinweise darauf, dass sie eine Resistenz gegen SARS-CoV-2 vermitteln. Da das N-Protein mit dem viralen RNA-Genom assoziiert und nicht in der Virusoberflächenmembran exprimiert wird, ist es unwahrscheinlich, dass Anti-N-Antikörper durch die Vermittlung der antikörperabhängigen Zellzytotoxizität (Antikörper-abhängige Zellzytotoxizität, ADCC), durch die Förderung der Phagozytose des opsonisierten Virus oder durch die Blockierung wirken Wirtszellinvasion durch SARS-CoV-2. Unsere Ergebnisse zeigen übereinstimmend, dass Anti-N-Antikörper nicht in der Lage sind, die In-vitro-Invasion der Wirtszelle durch SARS-CoV-2 zu blockieren (Abb. 2p). Um zu beurteilen, ob SpiN-induzierte Antikörper Mäuse vor einer SARS-CoV-2-Infektion schützen können, haben wir am Tag −1 vor der Herausforderung Serum von immunisierten Mäusen auf naive K18-ACE-2-Mäuse übertragen. Alle Tiere, die Serum von Kontrollmäusen oder geimpften Mäusen erhielten, zeigten einen Gewichtsverlust und erlagen einer SARS-CoV-2-Infektion (Abb. 7c, d).

Als Kontrolle untersuchten wir den Effekt der T-Zell-Depletion sowie den Transfer von Seren von Mäusen, die mit einem adenoviralen Vektor geimpft wurden, der das S-Protein (Covishield) kodiert. Die immunisierten Mäuse weisen hohe Konzentrationen neutralisierender Antikörper auf (PRTN > 320). Im Gegensatz zu SpiN-geimpften Mäusen überlebten 100 % der mit Covishield geimpften Tiere, denen sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen fehlten, die Belastung mit dem Wuhan-Isolat (Abb. 7e, f). In Übereinstimmung mit der Hauptfunktion von nAbs in diesem Modell schützte der Transfer von Seren von Covishield-immunisierten Mäusen die naiven K18-ACE-2-Mäuse vor einer Belastung mit SARS-CoV-2 (Abb. 7g, h).

Schließlich haben sich Delta und Omicron im Jahr 2021 als VOCs mit höherer Infektiosität48,49 herausgestellt, die sowohl in vitro als auch in experimentellen Modellen effizient der Erkennung durch nAbs entgehen50,51,52,53,54. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit aktueller S-basierter Impfstoffe, die für Massenimpfungen verwendet werden, gegen Infektionen mit Delta- oder Omicron-Isolaten geringer.55,56,57,58,59,60,61. Daher haben wir untersucht, ob die Immunisierung mit SpiN Mäuse vor Herausforderungen mit diesen VOCs schützt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung mit SpiN die K18-ACE-2-Mäuse vollständig vor einer Infektion mit der Delta-Variante schützte, gemessen an Körpergewichtsverlust und Letalität (Abb. 8a, b). In Übereinstimmung mit einer früheren Studie verloren naive K-18-ACE-2-Mäuse weder an Gewicht noch erlagen sie einer Infektion mit Omicron51 (Abb. 8c). Dennoch schützte die Immunisierung mit SpiN die K18-ACE-2-Mäuse erheblich vor der Belastung mit Omicron-Isolat, was durch eine 16-fache Verringerung der Viruslast, gemessen durch RT-PCR bei 6 dpi, angezeigt wurde (Abb. 8d). Darüber hinaus zeigte die Lunge bei Kontrollmäusen, die nur Poly ICLC erhielten, eine diffuse interstitielle Pneumonie (Abb. 8e, obere Felder), im Gegensatz zur erhaltenen Lungenarchitektur bei SpiN-immunisierten Mäusen (Abb. 8e, untere Felder).

K18-hACE2-Mäuse wurden mit Poly-ICLC-assoziiertem SpiN geimpft und 30 Tage nach der zweiten Dosis mit 5 × 104 PFU der Delta-Variante (a, b) oder 2,5 × 104 PFU der Omicron-Variante (c, d) belastet. Körpergewicht (a, c) und Überleben (b) wurden 11 Tage lang gemessen. d Die Viruslast wurde durch RT-PCR bei 6 dpi mit Omicron gemessen, die Daten werden als Mittelwert +/- SEM dargestellt. a–e 6 Mäuse/Gruppe. e Mikrofotografien von Lungengewebe von Mäusen, die mit dem SARS-CoV-2-Omicron-Stamm infiziert sind. Darüber hinaus zeigten die Kontrollmäuse, die nur Poly ICLC erhielten, eine diffuse interstitielle Pneumonie, die durch eine gemischte entzündliche Infiltration (mononukleäre und polymorphkernige Zellen) gekennzeichnet war, begleitet von starker Stauung (schwarze Pfeile) und intraalveolärem Exsudat (weiße Pfeile mit schwarzem Umriss). ), hämorrhagische Herde (weißer Stern) und Bereiche mit Alveolarkollaps (Sternchen) (e, obere Felder). In der immunisierten Gruppe wurde festgestellt, dass die Lungenarchitektur erhalten blieb und überwiegend mononukleäre entzündliche Infiltrate vorhanden waren (z. B. Bodenplatten). a–e Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Die statistische Analyse der Viruslast (d) wurde mit der Zwei-Wege-ANOVA und anschließend mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak durchgeführt. **** P < 0,0001.

Trotz des erheblichen Verlusts an nAbs behalten die aktuellen COVID-19-Impfstoffe die Fähigkeit, einen erheblichen Schutz vor Krankheiten zu bieten. Tatsächlich bleiben die meisten T-Zell-Reaktionen gegen die VOCs erhalten und sind wahrscheinlich zumindest teilweise für deren Schutzwirkung verantwortlich62,63. Dennoch weist das S-Protein der Omicron-Variante über 30 Mutationen auf, und der durch die Impfung induzierte Verlust der T-Zell-Antworten wird auf etwa 30 % geschätzt64, was die schützende Immunität weiter untergräbt. Daher könnte die Verwendung von Antigenen wie dem N-Protein, das stark an konservierten T-Zell-Epitopen29 angereichert ist und gegenüber der Selektion nicht-synonymer Mutationen resistent ist (Abb. 1a und Ergänzungstabellen 1–4), eine gute Strategie für eine universelle Strategie sein Impfung gegen die SARS-CoV-2-Varianten.

In einer begrenzten Anzahl von Studien wurden peptidbasierte COVID-19-Impfstoffe sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen auf Immunogenität getestet65,66. Bemerkenswert ist, dass ein Impfstoff, der mehrere T-Zell-Epitope enthält, die SARS-CoV-2-Varianten gemeinsam haben, in einer klinischen Phase-I-Studie am Menschen getestet wurde und ermutigende Ergebnisse in Bezug auf T-Zell-Reaktionen und Sicherheit zeigte66. Die Wirksamkeit dieser Impfstoffe wurde jedoch nicht bewertet. Das SARS-CoV-2-N-Protein scheint eine ausgezeichnete Alternative für einen Peptidimpfstoff zu sein, da dieses Antigen stark mit mutmaßlichen CD4+- und CD8+-T-Zell-Epitopen in den wichtigsten HLA-Haplotypen angereichert ist. Darüber hinaus zeigen Kinder mit asymptomatischen oder leichten Infektionen eine verstärkte CD8+-T-Zell-Reaktion auf das N-Antigen35. Darüber hinaus könnte der SpiN-Impfstoff, dessen Injektion beim Menschen sehr sicher sein dürfte, vorzugsweise bei Personen mit Erkrankungen, die die Antikörperreaktionen beeinflussen, sowie bei Kindern eingesetzt werden.

Andere Studien haben die Verwendung des SARS-CoV-2-N-Proteins als Kandidaten für einen COVID-19-Impfstoff in Betracht gezogen67,68,69,70. Sie wurden jedoch entweder mit den S- oder RBD-Proteinen in Verbindung gebracht, die nAbs auslösen 68,69 oder sie verwendeten nur das N-Protein70, was ähnlich wie unsere Ergebnisse (Abb. 2f–i) einen teilweisen Schutz hervorrief. Darüber hinaus wurde in diesen Studien die Funktion von Antikörpern gegenüber T-Zellen nicht im Detail untersucht und der Schutz gegen eine Variante nicht bewertet. Hier zeigen wir, dass der Einschluss der RBD-Region in unser chimäres Protein notwendig war, um 100 % der Mäuse zu schützen, die mit dem Wildtyp sowie einer Variante von SARS-CoV2 infiziert waren. Darüber hinaus zeigen wir, dass das N/RBD-Fusionsprotein eine robuste Immunität gegen die Delta- und Omicron-Varianten hervorruft.

In Anbetracht der Anzahl potenzieller T-Zell-Epitope, die im N-Protein gefunden werden, zusätzlich zu denen, die in der RBD-Region des S-Proteins gefunden werden, gehen wir davon aus, dass die Immunisierung mit SpiN ein vielfältiges Repertoire an T-Zellen hervorrufen würde. Dies ist von zentraler Bedeutung für die T-Zell-vermittelte Immunität gegen Virusinfektionen und äußerst relevant für die Überwindung der SARS-CoV-2-Plastizität. Da Mutationen stochastisch erzeugt werden, ist es unwahrscheinlich, dass sie gleichzeitig in verschiedenen T-Zell-Epitopen auftreten. Darüber hinaus ist der Selektionsdruck in einer oder wenigen spezifischen Mutationen unwirksam, um die schützende Immunität zu untergraben, die auf einer T-Zell-Antwort beruht, die auf mehrere Epitope abzielt. Daher gehen wir davon aus, dass ein Impfstoff, der ein breiteres Spektrum linearer T-Zell-Epitope enthält, die sowohl CD4+-Helfer-T- als auch CD8+-zytotoxische T-Zell-Reaktionen fördern, auch wirksamer gegen SARS-CoV-2-Varianten wäre, die den schützenden nAbs entgehen4,6,7 ,9,10.

Zusammenfassend berichten wir, dass die Immunisierung mit N- und RBD-Fusionsprotein (SpiN), exprimiert in einem Prokaryontensystem, adjuvantiert mit Poly ICLC, für T-Zellen hoch immunogen war. Dieser Impfstoff ist kostengünstig, stabil, sicher und sehr wirksam beim Schutz von Nagetiermodellen von COVID-19 vor experimentellen Herausforderungen mit der Wildtyp-, der Delta- oder der Omicron-Variante von SARS-CoV-2. Insgesamt stützen unsere Ergebnisse die Hypothese, dass dieser Schutz hauptsächlich durch CD4+- und CD8+-T-Zellen und nicht durch nAbs vermittelt wird. Obwohl die Definition der spezifischen Sequenzen noch weiter untersucht werden muss, legt diese Arbeit nahe, dass SpiN stark an CD4+- und CD8+-T-Zell-Epitopen angereichert ist und es unwahrscheinlich ist, dass nicht-stille Punktmutationen die SpiN-induzierte schützende Immunität untergraben. Obwohl die Bedeutung von nAbs nicht geleugnet wird, sollten daher das N-Protein und allgemeiner die Verwendung mehrerer T-Zell-Epitope in Betracht gezogen werden, um Anti-COVID-19-Impfstoffe zu verbessern und die Plastizität von SARS-CoV-2 zu überwinden.

Die Ethikkommissionen für Humanexperimente der Fundação Hospitalar do Estado de Minas Gerais (FHEMIG) haben diese mit menschlichen Spendern durchgeführte Studie genehmigt (CAAE: 43335821.4.0000.5119). Experimente mit Mäusen wurden gemäß den institutionellen Richtlinien für Tierethik durchgeführt und von den institutionellen Ethikkommissionen der Oswaldo Cruz Foundation und der Universidade Federal de São Paulo Ethics genehmigt. Commission on Animal Use (CEUA) LW 25/20 bzw. 105/2020.

Menschliche Blutproben wurden von geimpften Personen (n = 33), rekonvaleszenten Patienten (n = 13) und gesunden Kontrollpersonen (n = 9) entnommen. Alle Personen waren zwischen 18 und 70 Jahre alt (36 ± 11, Verhältnis Frauen: Männer = 3,2) (Ergänzungstabelle 5). Geimpfte Personen erhielten zwei Dosen Coronavac (Sinovac, China) und 27–54 Tage nach der zweiten Dosis wurden Proben entnommen. Rekonvaleszente Personen berichteten, dass sie zwischen 24 und 196 Tagen vor der Probenahme eine leichte COVID-19-Erkrankung hatten, was durch PCR bestätigt wurde. Alle Personen wurden vor der Probenahme und der Unterzeichnung der Einverständniserklärungen kurz befragt, und es gab keine Teilnehmerentschädigung.

Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6–10 Wochen wurden vom Center for Laboratory Animal Facilities der Federal University of Minas Gerais (CEBIO-UFMG) gekauft. Transgene Mäuse mit humanem Angiotensin-Converting-Enzym (K18-hACE2) im C57BL/6-Hintergrund, 6–10 Wochen alt, ursprünglich von Jackson Laboratories, wurden in Fiocruz-Minas oder in Fiocruz-São Paulo-Tiereinrichtungen gezüchtet und als Modell verwendet schweres COVID-19. Weibliche Goldhamster, 8–10 Wochen alt, stammten aus dem Tierheim Fiocruz-Minas und dienten als Modell für mildes COVID-19. Die Experimente wurden gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Brasilianischen Nationalen Rats für Tierversuche (CONCEA) durchgeführt. Mäuse und Hamster wurden in Mikroisolatoren in Fiocruz-Minas und an der Universidade de São Paulo in einem 12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus gezüchtet und gehalten, der Temperaturbereich lag bei 68–79 °F und die Luftfeuchtigkeit zwischen 30 und 70 %. Der in dieser Studie verwendete Virusstamm des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) stammte aus den Varianten Linie B (Isolat BRA/SP02/2020), Delta (EPI_ISL_2965577) und Omicron (EPI_ISL_7699344). Virusbestände wurden in Vero E6-Zellen (ATCC CRL-1586) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 vermehrt und täglich bis zu 72 Stunden lang auf zytopathische Effekte (CPE) beobachtet. Viren wurden in Vero E6-Zellen durch einen Plaque-Forming-Units-Assay (PFU) titriert71. Virale Aliquots wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80 ° C aufbewahrt.

Die Epitopvorhersage wurde über die IEDB-Plattform (Immune Epitope Database and Analysis Resource) für Klasse-I-Analyse und NetMHCII für Klasse-II-Analyse durchgeführt31,32. Potenzielle HLA-ABC-, HLA-DR- und MHC-I/II-Bindungsepitope von Mäusen wurden in den Sequenzen von Spike (6VSB https://doi.org/10.2210/pdb6VSB/pdb) und Nucleocapsid (7SD4_1 10.2210/pdb7SD4/pdb) gesucht. Proteine. Wir haben Epitope ausgewählt, die Bindungswerte <1 für HLA-ABC und HLA-DR aufwiesen; < 1,3 für Maus-MHC I; und <2,0 für Maus-MHC II. Der Needle-Plot wurde aus den Spike- und Nucleocapsid-Aminosäuresequenzen erstellt, die aus dem Alignment der Referenzgenome der Varianten Alpha (MZ344997), Beta (MW598419.1), Delta (MZ359831.1), Gamma (MZ169911.1) gewonnen wurden. Omicron BA.1 (OL672836.1), Omicron BA.2 (PRJNA784038). Die kodierenden Sequenzen der Proteine ​​wurden abgegrenzt, übersetzt und neu ausgerichtet, um die erworbenen Mutationen in Bezug auf die ursprüngliche Abstammungslinie zu identifizieren (B1 – Wuhan – EPI_ISL_402123 https://www.epicov.org/epi3/frontend#4c5e54). Die Ausrichtungen wurden mit dem MUSCLE-Tool und Standardparametern durchgeführt. Mutationen wurden durch „selbstgemachte“ Skripte gezählt und benannt und das R-Mutsneedle-Paket mit spezifischen Modifikationen wurde verwendet, um die Figur zu erstellen und Informationen über die Antigene einzubeziehen.

Plasmide, die Sequenzen enthalten, die das N in voller Länge, die RBD von Spike und das chimäre SpiN-Protein mit für die Expression in E. coli optimierten Codons kodieren, wurden von Genscript erworben. Kompetente E. coli Star (DE3) wurden mit dem pET24-Vektor mit N oder den RBD-Sequenzen und E. coli pRARE mit pET24_mit SpiN transformiert. Transformierte Bakterien wurden in LB-Medium mit Kanamycin (50 µg/ml) bei 37 °C gezüchtet, bis eine OD600 von 0,6 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zur Kultur in einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert. Die Induktion der Expression der drei Proteine ​​erfolgte bei 37 °C für 3 Stunden für N und RBB und für 18 Stunden für SpiN. Die N- und RBD-Proteine ​​enthielten einen Histidin-Tag und wurden durch einen Affinitätschromatographieschritt mit der Histrap HP-Säule (GE HealthCare) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Nach der bakteriellen Lyse wurde das N-Protein aus der löslichen Fraktion und das RBD-Protein aus der unlöslichen Fraktion durch Zugabe von 8 M Harnstoff zu den Puffern zur Solubilisierung gereinigt. Das ohne Histidin-Tag exprimierte SpiN-Protein wurde nach Zugabe von 8 M Harnstoff und durch zwei Chromatographieschritte aus den löslichen und unlöslichen Fraktionen des Bakterienzelllisats gereinigt. Einer Kationenaustauschchromatographie mit der Hitrap SP HP-Säule (GE HealthCare) folgte ein molekularer Ausschluss mit der Säule HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR (GE HealthCare) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das in Säugetierzellen exprimierte S-Protein wurde freundlicherweise von Dr. Leda Castilho von der Universidade Federal do Rio de Janeiro zur Verfügung gestellt.

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden durch einen Ficoll-Gradienten aus heparinisiertem Blut isoliert. Kurz gesagt, auf Ficoll-Paque plus (GE-Healthcare) geschichtetes Blut wurde bei 410 x g, 40 Minuten, RT zentrifugiert. Eine Million Zellen pro Vertiefung wurden in 96-Well-Platten mit flachem Boden verteilt und in Komplettmedium (RPMI 1640, 10 % FBS, 100 mg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin) mit 5 µg/ml von entweder N, Rekombinantes RBD- und S-Antigen oder Anti-CD3 (1 µg/ml) und Anti-CD28 (0,5 µg/ml) als Positivkontrollen. Zur Beurteilung der Hintergrundproduktion von Zytokinen wurden nicht stimulierte Zellen verwendet. Die Kulturüberstände wurden nach 72 Stunden geerntet und bis zur Analyse bei –80 °C eingefroren. Die IFN-γ-Spiegel wurden mittels ELISA gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen (BD, OptEIA Human IFN-γ, Cat 555142). Alternativ wurden die Zytokine im Überstand mittels Cytmetric Bead Array (CBA) mithilfe der Kits Human Inflammatory CBA und Human Th1/Th2/Th17 CBA (BD Biosciences, Cat 551811 bzw. 560484) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Proben wurden auf FACSVerse (BD Biosciences) gelesen und analysiert.

PBMCs von gesunden Spendern, Rekonvaleszenten oder Coronavac-geimpften Spendern wurden in RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) Benzonase-Nuklease (20 U/ml, Sigma) aufgetaut. Die Zellen wurden in Vollmedium (RPMI 1640, 10 % FBS, 100 mg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin) ausplattiert, 5 Stunden ruhen gelassen und dann mit Positivkontrollen (Anti-CD3, 1 µg/ml und Anti-CD28) inkubiert , 0,5 µg/ml, BD), Negativkontrollen (SpiN-Vehikel) oder 20 µg/ml SpiN in 5 % CO2 bei 37 °C. Nach 12-stündiger Inkubation wurden jeweils 2,5 µg/ml BFA und Monensin für weitere 6 Stunden hinzugefügt. Nach insgesamt 18 Stunden Inkubation wurden die Zellen geerntet und auf Lebensfähigkeit (7-AAD, BD Pharmingen) und Oberflächenantigene Anti-CD4 (BV605, RPA-T4, BD), Anti-CD8 (AlexaFluor700, SK1, Biolegend) und Anti-CD45RO gefärbt (BV786, UCHL1, BD) und Anti-CD27 (APC-Cy7, O323, Biolegend). Nach dem Waschen wurden die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers fixiert und permeabilisiert (FoxP3-Färbepufferset, eBioscience). Anschließend wurden die Zellen auf die intrazellulären Antigene Anti-IFN-γ (PE-Cy7, 4 S.B3, eBioscience), Anti-CD3 (FITC, UCHT1, BD), Anti-CD69 (BV421, FN50, Biolegend) und Anti-TNF gefärbt (APC, Mab11, eBioscience). Die Proben wurden mit einem LSR-FORTESSA erfasst und mit FlowJo analysiert. T-Zell-Subpopulationen wurden auf lebensfähige CD3+CD4+- und CD3+CD8+-Ereignisse untersucht. Eine detailliertere Analyse der naiven und Gedächtnis-Subpopulationen wurde basierend auf der CD27/CD69/CD45RO-Expression und dem intrazellulären IFN-γ durchgeführt: Effektorgedächtnis (EM, CD45RO+CD27−), zentrales Gedächtnis (CM, CD45RO+CD27+), Effektor (Eff , CD45RO−CD27−) und naive (Nv, CD45RO−CD27+) Zellen. Die Dimensionsreduktionsanalyse wurde unter Verwendung der Standardeinstellungen des in FlowJo implementierten UMAP-Plugins (Uniform Manifold Approximation and Projection) durchgeführt.

Die Platten wurden über Nacht mit 0,4 µg/Vertiefung entweder der rekombinanten N-, RBD- oder S-Proteine ​​oder alternativ mit 104 PFU/Vertiefung UV-inaktiviertem SARS-CoV-2 beschichtet und 2 Stunden lang mit PBS, das 2 % Rinderserumalbumin (PBS) enthielt, blockiert -2 % BSA) bei 37 °C. Das Serum wurde seriell verdünnt und die Proben der bronchoalveolären Lavage (BALF) wurden in einer 1:1-Verdünnung in PBS-2 % BSA getestet und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und dann mit Anti-Human-IgG-HRP-Antikörper (Fapon) inkubiert. , Anti-Hamster-IgG-HRP oder Anti-Maus-Gesamt-IgG, IgG1, IgG2c, konjugiert mit Streptavidin-HRP (Southern Biotech), alle 1:5000 verdünnt. Nach fünf Wäschen wurden die Platten 15 Minuten lang im Dunkeln mit 1-Step Ultra TMB-Substratlösung (Biolegend) behandelt und die Reaktion durch Zugabe von 2 N H2SO4 (Sigma) gestoppt. Die Platten wurden bei 450 nm abgelesen und die Ergebnisse wurden als optische Rohdichte (OD) ausgedrückt. Der Antikörpertiter wurde anhand der Serumverdünnung bestimmt, die im ELISA 50 % der maximalen Antikörperreaktivität gegenüber dem Antigen ergab.

Einen Tag vor der Infektion wurden 105 Vero E6-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Vitrocell, Brasilien) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in jede Vertiefung einer Platte mit 48 Vertiefungen ausgesät. Am nächsten Tag wurden Serumproben von Mäusen oder Menschen durch einstündige Inkubation bei 56 °C in einem warmen Bad hitzeinaktiviert. Die Proben wurden zweifach seriell verdünnt (1:10 bis 1:320 (v/v)) in DMEM und mit 100 PFUs SARS-CoV-2-Virusstamm vermischt. Für die Positivkontrolle wurden nur Medien anstelle von Serumproben verwendet. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, um die Antikörperbindung an die Viruspartikel zu ermöglichen. Als nächstes wurde der Überstand der Vero-E6-Zellkultur entfernt und die Zellen mit 50 µl/Vertiefung der Serum-Virus-Mischung beimpft und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert, um eine Virusbindung an die Zellen zu ermöglichen. Dann wurde 1 ml vorgewärmtes DMEM mit 2 % FBS und 2 % Carboxymethylcellulose (CMC) vorsichtig in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden 4 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert, um die Bildung viraler Plaques zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 4%iger Formaldehydlösung, verdünnt in PBS, fixiert und zur Plaque-Visualisierung 1 Stunde lang mit 1%iger Naphtolblauschwarzlösung (Sigma, USA) gefärbt. Die Neutralisierungsaktivität wurde durch die Reduzierung der Plaqueanzahl im Vergleich zur Positivkontrolle bestimmt.

Die Gesamt-RNA wurde aus homogenisierten Mäusegeweben mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat 74104) gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen extrahiert. qRT-PCR wurde in 12-μL-Reaktionen unter Verwendung des GoTaq Probe 1-Step RT-qPCR-Systems (Promega, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, wobei 75 ng Gesamt-RNA pro Reaktion verwendet wurden. Primer und Fluoreszenzsonden wurden auf der Grundlage des zuvor beschriebenen diagnostischen qRT-PCR-Protokolls speziell für SARS-CoV-2 entwickelt, die ein 100-bp-Amplifikat aus dem E-Gen von SARS-CoV-272 amplifizieren. Sonde FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ, F 5' ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT 3', R 5' ATATTGCAGCAGTACGCACACCA 3'. Die Zyklusbedingungen waren 15 Minuten lang 45 ° C und 3 Minuten lang 95 ° C, gefolgt von 45 Zyklen bei 15 Sekunden lang bei 95 ° C und 60 Sekunden lang bei 58 ° C unter Verwendung des Quantstudio 5 Real-Time PCR-Systems (Applied Biosystems, USA). Zur Quantifizierung der Viruslast wurde eine Standardkurve erstellt, die auf einem Plasmid basiert, das die E-Gensequenz (SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-Isolatsequenz) enthält. Als Matrizen zur Erstellung der Standardkurven wurden serielle 10-fache Verdünnungen der Plasmid-DNA verwendet, die viralen Kopien im Bereich von 2 bis 2 × 105 entsprechen. Echtzeit-PCR-Assays wurden dreifach durchgeführt und die resultierenden Ct-Werte gegen die Kopienzahl des viralen Genoms aufgetragen.

Hamster und C57BL/6- oder hACE2-Mäuse erhielten zwei Verabreichungen im Abstand von 21 Tagen, die 10 μg RBD, N oder SpiN als Adjuvans mit 50 μg Hiltonol (Poly ICLC, geliefert von Oncovir, Washington, DC) enthielten40,42. Alternativ erhielten sie eine Dosis eines nicht replizierenden Schimpansen-Adenovirus, das für das S-Protein des Wuhan SARS-CoV-2 (Covishield) kodiert, in einer Konzentration von 1010 PFU/Mäuse. Die Lösungen wurden intramuskulär in einem Endvolumen von 50 μl in jeden Schienbeinmuskel geimpft. Dreißig Tage nach der Immunisierung wurden die Tiere intranasal mit 5 × 104 PFU SARS-CoV-2 Wuhan, Delta oder 2,5 × 104 Omicron-Isolaten (für hACE2-Mäuse) und 105 PFU für Hamster provoziert. Das Körpergewicht, die klinischen Symptome und das Überleben wurden 11 Tage nach der Infektion bewertet. Für die histopathologischen Analysen wurden entnommene Gewebe sieben Tage lang in phosphatgepuffertem 10 % Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, mit einem Tissue Processor PT05 TS (LUPETEC, UK) verarbeitet und in histologisches Paraffin (Histosec, Sigma-Aldrich) eingebettet. . Die 4 μm dicken Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.

K18-hACE2-Mäuse, die entweder mit SpiN + Poly ICLC oder Covishield immunisiert waren, wurden ip mit entweder 0,5 mg/Maus Ratten-Anti-Maus-CD8a- oder CD4-mAbs (BioXCell, Klon 2.43 bzw. GK1.5) oder beiden behandelt. Kontrollgruppen erhielten 0,2 mg/Maus Isotyp-Kontrollratten-Anti-KLH-IgG (Klon LTF-2, BioXCell). Die Behandlung wurde an den Tagen –3, –2 und –1 vor der Belastung durchgeführt. Die Erschöpfung wurde durch Durchflusszytometrieanalyse des Vollbluts vor der Infektion bestätigt. Für den passiven Antikörpertransfer wurden nicht immunisierten K18-hACE2-Mäusen 200 μl Seren von Mäusen verabreicht, denen entweder SpiN + Poly ICLC, Covishield oder nur Poly ICLC verabreicht wurde. Die Inokulation erfolgte per ip einen Tag vor der Belastung. Der Titer der Antikörper Anti-N und RBD wurde durch ELISA bestätigt.

Maus-Splenozyten wurden durch Mazerieren der Milz durch ein Zellsieb mit 100 μm Poren (Cell Strainer, BD Falcon) und anschließende Behandlung mit ACK-Puffer zur Erythrozyten-Lyse isoliert. Die Zellzahl wurde auf 106 Zellen pro Vertiefung eingestellt und dann mit 10 μg/ml RBD oder N stimuliert. Als Positivkontrolle wurde Concanavalin A (Sigma, 5 μg/ml) verwendet. Die Überstände wurden 72 Stunden nach der Stimulation gesammelt und die Spiegel von IFN-γ und IL-10 wurden durch ELISA (R&D Systems, Cat DY485 bzw. DY417) bestimmt. Alternativ wurden Zytokine im Kulturüberstand mit dem Maus-Th1/Th2/Th17-CBA (BD Biosciences, Kat. 560485) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Proben wurden auf FACSVerse (BD Biosciences) gelesen und analysiert.

Die aus den Lungen immunisierter und provozierter Mäuse bei 5 dpi isolierten RNA-Proben wurden mit DNase (Promega) behandelt und dann unter Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Kat. 4368814) gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umgewandelt . qPCRs-Reaktionen wurden mit Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) in einem ABI7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) unter Standardbedingungen durchgeführt. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 6 dargestellt. qRT-PCR-Daten wurden als 1/ΔCT dargestellt.

Ein Kammerobjektträger mit 16 Vertiefungen (ThermoFisher) wurde mit 104 Vero E6-Zellen/Vertiefung beschichtet und über Nacht mit SARS-CoV-2 in einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 4 Stunden lang mit Brefeldin A behandelt , fixiert mit Paraformaldehyd 4 % und permeabilisiert mit PBS-P (PBS 0,5 % BSA + 0,5 % Saponin). Später wurden die Vertiefungen mit 1 % BSA blockiert und mit Seren von Mäusen inkubiert, die mit RBD, N oder SpiN immunisiert waren. Der Sekundärantikörper Alexa Fluor 594 Anti-Maus-IgG (ThermoFisher) wurde hinzugefügt und der Zellkern mit DAPI (ThermoFisher) angefärbt. Die Objektträger wurden im konfokalen Mikroskop LSM 780 Carl Zeiss AxioObserver, Objektiv x63 Öl NA 1,4, analysiert. Die Bilder wurden mit der Software ImageJ Version 2.1 für Mac verarbeitet.

Für die Immunphänotypisierung wurden insgesamt 2 × 106 Splenozyten von immunisierten Mäusen 18 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit RPMI 1640-Medium allein oder mit 10 μg/ml SpiN-, RBD- oder N-Proteinen inkubiert. Während der letzten 6 Stunden der Kultur wurden den Zellkulturen GolgiStop- und GolgiPlug-Proteintransportinhibitoren (BD Biosciences) zugesetzt. Die Splenozyten wurden dann mit PBS gewaschen, mit Live/Dead-Reagenz (Invitrogen) gefärbt und mit FcBlock (BD Biosciences)73 inkubiert. Die folgenden mAbs wurden zur Markierung von Zelloberflächenmarkern verwendet: Anti-CD3 PerCP-Cy5.5 (BD, Klon 145-2C11) oder FITC (BD, Klon 145-2C11), Anti-CD4 Alexa Fluor 700 (Invitrogen, Klon KG1). 5), Anti-CD8 APC-Cy7 (Biolegend, Klon 53-6.7), Anti-CD62L PE-Cy7 und Anti-CD44 APC (Invitrogen, Klon IM7). Zur intrazellulären Färbung wurden die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Cytofix/Cytoperm, BD Biosciences) gewaschen, fixiert und permeabilisiert und mit Anti-IFNγ-PERCP (eBioscience, XMG1.2) gefärbt. Die Durchflusszytometrie wurde mit einem BD LSRFortessa mit der Software BD FACSDIVA V8.0.1 durchgeführt und es wurden ca. 100.000 lebende CD3+-Zellen erfasst. Die Daten wurden mit der Software FlowJo v10.5.3 analysiert.

Zur Durchflusszytometrie-Färbung wurden die Lungen herausgeschnitten, mit einer Schere zerkleinert und mit 2 mg/ml Kollagenase IV (Sigma), verdünnt in 1 ml RPMI, enzymverdaut. Die Suspensionen wurden 30 Minuten lang bei 37 °C unter regelmäßigem Schütteln inkubiert. Gewebefragmente wurden mit einem Nylonfilter-Filcon-System (BD Biosciences) mit einer Porengröße von 50 μm filtriert und dann zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Erythrozyten in den Zellpellets wurden mit ACK-Lösung lysiert. Die verbleibenden Zellen wurden in RPMI 5 % FBS resuspendiert, in der Neubauer-Kammer gezählt, 1x mit PBS gewaschen und für die extrazelluläre Durchflusszytometrie-Färbung verwendet. Die Zellen wurden dann fixiert, permeabilisiert und mit den folgenden Antikörpern gefärbt: Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Biolegend, Cat 423101), Anti-CD11b APC-Cy7 (M1/70, Biolegend), Anti-CD11c PE-Cy7 (N418, Biolegend) , Anti-Ly6C PERCP (HK1.4, Biolegend), Anti-MHC-II FITC (M5/11.15.2, Biolegend) und Anti-Ly6G APC (1A8, Biolegend). Alternativ wurden die Zellen mit SpiN-Protein kultiviert und mit Anti-CD3-FITC (145-2C11, Biolegend), Anti-CD4-APC-Cy7 (GK1.5, BD), Anti-CD8-PERCP (53–6.7, Biolegend) und Anti-CD3-FITC (145-2C11, Biolegend) gefärbt. CD69 PE (H1.2F3, Biolegend), Anti-CD103 BV421 (2E7, Biolegend), Anti-IFN-γ APC (XMG1.2, Biolegend) und Anti-TNF PE-Cy7 (MP6-XT22, Biolegend). Die Durchflusszytometrie wurde mit einem BD LSRFortessa durchgeführt und es wurden etwa 100.000 lebende Zellen erfasst. Die Daten wurden mit der Software FlowJo v10.5.3 analysiert.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 6.0 für Mac (GraphPad Inc, USA) durchgeführt. Zuerst wurden Ausreißer mit dem Grubbs-Test erkannt und dann wurde ein D'Agostino-Pearson-Test durchgeführt, um die Normalität der Daten zu überprüfen. Die bei jeder Datenanalyse verwendeten Tests werden in den Abbildungslegenden erläutert. Im Allgemeinen wurde der Vergleich zwischen den Gruppen je nach Datenverteilung mithilfe eines ungepaarten T-Tests oder eines Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Gewichtsmessungen und Durchflusszytometriedaten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Zur Überlebensanalyse wurde der Log-Rank-Test verwendet. Statistische Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p-Werte ≤ 0,05 waren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Für die Epitopvorhersage der Proteine ​​Spike (6VSB https://doi.org/10.2210/pdb6VSB/pdb) und Nucleocapsid (7SD4_1 10.2210/pdb7SD4/pdb) verwendeten wir die Immunepitopdatenbank (IEDB). Für das Nadeldiagramm verwendeten wir Spike- und Nucleocapsid-Aminosäuresequenzen, die aus dem Alignment der Referenzgenome von Alpha (MZ344997), Beta (MW598419.1), Delta (MZ359831.1), Gamma (MZ169911.1) und Omicron BA gewonnen wurden .1 (OL672836.1), Omicron BA.2 (PRJNA784038) und die ursprüngliche Linie (B1 – Wuhan – EPI_ISL_402123 https://www.epicov.org/epi3/frontend#4c5e54). Quelldaten für Abb. 1f, g; 2b–p; 3a–f; 4a–g; 5a–c; 6a–e, g–o; 7a–h; 8a–d liegen dem Papier bei. Sollten weitere Informationen benötigt werden, sind die Daten auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde von Rede Virus vom Ministerium für Wissenschaft, Technologie und Innovation finanziert (Finep 01.20.0010 und 01.20.0005.00; CNPq 403514/2020-7 und 403701/2020-1 RTG); Nationales Institut für Wissenschaft und Technologie von Impfstoffen (Fapemig APQ-03608-17/CNPq 465293/2014-0 RTG); FAPESP (2020/05527-0 RTG); Bildungsministerium (CAPES); Fundação Oswaldo Cruz (INOVA, 2020), Prefeitura de Belo Horizonte; sowie parlamentarische Änderung der Staats- und Bundesvertreter von Minas Gerais. Wir danken unserer Projektanalytikerin Frau Cristiane Gomes, unserer Sekretärin Elizabeth Araújo und den Technikern Frau Franciele Pioto, Rosangela Pereira und Rodrigo Moreli.

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Ricardo T. Gazzinelli

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JC führte Epitopvorhersagen durch. RM war für den Bau des Nadelgrundstücks verantwortlich. JC, GB und DD trugen zur Proteinkonzeption und zur Plasmidkonstruktion bei. NS und BC führten Proteinexpression und -reinigung, SDS-PAGE und Western Blots durch. GGA, LIO, TGM und MA führten IgG- und IFN-γ-ELISAS an menschlichen Proben durch. GA, BV, JC und LA führten CBA und Durchflusszytometrie an menschlichen Proben durch. JC, NSH-S. und PA waren für die Immunisierung von Mäusen und Hamstern und ELISAS verantwortlich. JC führte eine Durchflusszytometrie der Milz und des BALF von Mäusen durch. JC, MJFPA und OCN führten die Challenge-Experimente mit SARS-CoV-2 durch. MJF führte die Neutralisationstests durch. JC und MJF führten Immunfluoreszenztests durch. JC, LF und AF führten die Extraktion und Quantifizierung viraler RNA mittels RT-PCR durch. JC führte Zytokin- und Chemokin-mRNA-Messungen mittels RT-PCR durch. MP und LB waren für die Durchflusszytometrie der Mäuselungen verantwortlich. BR und SGR führten eine histopathologische Analyse durch. ED stellte SARS-CoV-2-Viren zur Verfügung. AS und OC stellten Reagenzien zur Verfügung. JC, MJF, RTG, SRT, APF, FF, HSJSS, AM und JK trugen zur Konzeption und Gestaltung der Studie bei. JC und RTG haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und das Manuskript.

Korrespondenz mit Ricardo T. Gazzinelli.

RTG, SRT, APF, FF, NS, JC, NSH-S. und PA sind Miterfinder des potenziellen COVID-19-Impfstoffs, der in dieser Studie untersucht wurde. Das Patent befindet sich im Bewertungsprozess, Anmeldenummer BR1020210095733. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Juliane Walz und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Castro, JT, Azevedo, P., Fumagalli, MJ et al. Förderung einer neutralisierenden Antikörper-unabhängigen Immunität gegen besorgniserregende Wildtyp- und SARS-CoV-2-Varianten mithilfe eines RBD-Nukleokapsid-Fusionsproteins. Nat Commun 13, 4831 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32547-y

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Eingegangen: 15. April 2022

Angenommen: 05. August 2022

Veröffentlicht: 17. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32547-y

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