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Oct 23, 2023

Ein Atemweg

Naturband 615, Seiten

Nature Band 615, Seiten 660–667 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Eine Infektion mit Krankheitserregern führt zu einem stereotypen Krankheitszustand, der neuronal orchestrierte Verhaltens- und physiologische Veränderungen mit sich bringt1,2. Bei einer Infektion setzen Immunzellen einen „Sturm“ von Zytokinen und anderen Mediatoren frei, von denen viele von Neuronen erkannt werden3,4; Dennoch bleiben die reagierenden neuronalen Schaltkreise und Neuro-Immun-Interaktionsmechanismen, die bei naturalistischen Infektionen Krankheitsverhalten hervorrufen, unklar. Rezeptfreie Medikamente wie Aspirin und Ibuprofen werden häufig zur Linderung von Krankheiten eingesetzt und wirken, indem sie die Synthese von Prostaglandin E2 (PGE2) blockieren5. Ein führendes Modell geht davon aus, dass PGE2 die Blut-Hirn-Schranke passiert und direkt hypothalamische Neuronen angreift2. Hier haben wir mithilfe genetischer Werkzeuge, die einen Atlas peripherer sensorischer Neuronen weitgehend abdecken, stattdessen eine kleine Population von PGE2-detektierenden glossopharyngealen sensorischen Neuronen (petrosale GABRA1-Neuronen) identifiziert, die für das grippebedingte Krankheitsverhalten bei Mäusen essentiell sind. Die Ablation petrosaler GABRA1-Neuronen oder das gezielte Ausschalten des PGE2-Rezeptors 3 (EP3) in diesen Neuronen eliminiert grippebedingte Rückgänge der Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme und Mobilität im Frühstadium der Infektion und verbessert das Überleben. Eine genetisch gesteuerte anatomische Kartierung ergab, dass Petrosal-GABRA1-Neuronen nach einer Infektion in Schleimhautregionen des Nasopharynx mit erhöhter Expression von Cyclooxygenase-2 vordringen und auch ein spezifisches axonales Targeting-Muster im Hirnstamm aufweisen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse einen primären sensorischen Weg von den Atemwegen zum Gehirn, der lokal produzierte Prostaglandine erkennt und systemische Krankheitsreaktionen auf Atemwegsvirusinfektionen vermittelt.

Durch Influenza und andere Krankheitserreger verursachte Atemwegsinfektionen sind weltweit die häufigste Todes- und Krankenhausursache6, und die jüngste COVID-19-Pandemie hat die menschliche Gesellschaft weitgehend erschüttert. Sich krank zu fühlen kann zutiefst schwächend sein, und die meisten Menschen sind mehrmals im Jahr krank. Das Krankheitsgefühl stellt eine neuronale Reaktion auf eine Infektion dar, die eine hochkoordinierte und anpassungsfähige Strategie zur Förderung der Genesung darstellen kann1,2. Tiere, die mit verschiedenen Krankheitserregern infiziert sind, zeigen häufige Verhaltens- und physiologische Reaktionen, die Fieber, Lethargie, Appetitlosigkeit, Kopfschmerzen und Schmerzen, Stimmungsschwankungen und verminderte Sozialisierung umfassen können, was auf einen häufigen Krankheitszustand mit Beteiligung gemeinsamer neuronaler Schaltkreise schließen lässt2,7. Zusätzlich zu den üblichen Symptomen sind auch andere Krankheitsreaktionen auf den Infektionsort zugeschnitten; Beispielsweise führen einige Atemwegsinfektionen zu Husten, Stauung und Bronchokonstriktion, wohingegen einige Darminfektionen Übelkeit, Durchfall und Erbrechen hervorrufen. Infektionsspezifische Verhaltensreaktionen deuten auf mehrere Kommunikationswege zwischen Körper und Gehirn für die Erkennung von Krankheitserregern hin.

Mehrere Zytokine und Immunmediatoren können bei isolierter Verabreichung Krankheitsverhalten auslösen, darunter Interleukine, Interferone, Tumornekrosefaktor (TNF) und Eicosanoide1,2,4,8. Diese und andere Zytokine sowie von Krankheitserregern abgeleitete Faktoren wie Lipopolysaccharide, bakterielle Toxine und Formylpeptide können eine Reihe zentraler und/oder peripherer sensorischer Neuronen aktivieren4,9. Zusammengenommen lassen diese Beobachtungen die Möglichkeit aufkommen, dass es viele Wege für neuroimmunisches Crosstalk gibt, obwohl unklar ist, wann und ob jeder dieser Wege bei naturalistischen Infektionen aktiviert wird.

Chemikalien wie Salicylsäure aus Weidenrinde, Aspirin und Ibuprofen blockieren die Biosynthese wichtiger infektionsinduzierter Lipidmediatoren durch Hemmung der Cyclooxygenase-Enzyme und stellen einen historisch wirksamen Ansatz zur Behandlung von Krankheitssymptomen dar5,10. Prostaglandin E2 (PGE2) ist ein wichtiger Cyclooxygenase-abhängiger Metabolit, der Krankheitsverhalten hervorruft, und das Ausschalten anderer Enzyme, die der Cyclooxygenase im PGE2-Biosyntheseweg nachgeschaltet sind, verbessert ebenfalls Krankheitsreaktionen11. PGE2 wird von einer kleinen Unterfamilie von 4 G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (EP1–EP4)12 erkannt, und es wird angenommen, dass einige, aber nicht alle pyrogeninduzierten Krankheitsreaktionen durch den EP3-Rezeptor2 vermittelt werden. Der EP3-Rezeptor wird in verschiedenen Gehirnregionen exprimiert, darunter im Hypothalamus und in den zirkumventrikulären Organen sowie in peripheren Neuronen, Immunzellen und vielen anderen Zelltypen12,13. Der regionalspezifische Knockout des EP3-Rezeptors im mittleren präoptischen Kern (MnPO) des Hypothalamus verringerte die durch Lipopolysaccharid induzierten Fieberreaktionen14, wobei PGE2-Rezeptoren in anderen Bereichen Berichten zufolge für die Auswirkungen auf Erregung und Nahrungsaufnahme relevant sind2. Diese und andere Erkenntnisse haben zu mehreren möglichen Modellen geführt, in denen (1) PGE2 aufgrund seiner Hydrophobie die Blut-Hirn-Schranke direkt passieren kann, (2) PGE2 an zirkumventrikulären Organen nachgewiesen werden oder in das Gehirn gelangen kann und/oder (3) PGE2 kann im Gehirn selbst synthetisiert werden2,15,16. Zentrales PGE2 könnte dann ein verteiltes neuronales Netzwerk aktivieren, wobei verschiedene empfängliche Gehirnregionen wie das MnPO bestimmte Aspekte einer charakteristischen Krankheitsreaktion hervorrufen17.

Die Rolle von Prostaglandinrezeptoren in peripheren Neuronen ist weiterhin unklar. Darüber hinaus kamen wir zu dem Schluss, dass die exogene Anwendung chemisch definierter Pyrogene eine systemische Entzündungsreaktion hervorrufen kann, während natürliche Infektionen an verschiedenen Orten und unterschiedlicher Intensität stattdessen lokale neuroimmune Reaktionswege auslösen können die noch unerforscht sind.

Wir haben ein Mausmodell entwickelt, um die neuronalen Mechanismen zu charakterisieren, die dem grippebedingten Krankheitsverhalten zugrunde liegen. Mäuse wurden durch intranasale Verabreichung des Influenza-A-Virus PR/8/34 (H1N1) infiziert und in den folgenden 10–20 Tagen auf charakteristische Krankheitsreaktionen überwacht. Eine Influenza-Infektion verringerte die Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme, Fortbewegung, das Körpergewicht und das Überleben bei Wildtyp-Mäusen. Höhere Titer des Virusinokulums verstärkten das Ausmaß des Krankheitsverhaltens, wobei die schwersten Phänotypen sechs bis sieben Tage nach der Infektion auftraten (Abb. 1a). Eine Influenza-Infektion erhöhte die PGE2-Spiegel sowohl im Plasma als auch in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) über einen ähnlichen Zeitraum, gemessen durch einen Enzymimmunoassay (ELISA) (Extended Data Abb. 1b). Die Verabreichung von PGE2 hemmte auch akut die Nahrungsaufnahme (Extended Data, Abb. 2a), und Faserphotometriemessungen zeigten eine verringerte Aktivität von Hypothalamusneuronen, die Agouti-verwandtes Peptid (AGRP) exprimieren (Extended Data, Abb. 2c), was eher mit einer verminderten Motivation zum Essen übereinstimmt als nur eine körperliche Unfähigkeit zu essen. Wir beobachteten auch eine hypothermische Reaktion auf eine Influenza-Infektion (Extended Data Abb. 3a), was mit früheren Beobachtungen bei Mäusen übereinstimmt18. Die Verabreichung von Ibuprofen (1 mg ml–1 im Trinkwasser, ad libitum) oder Aspirin (20 mg kg–1, tägliche intraperitoneale Injektion) an Influenza-infizierte Mäuse senkte die Plasma-PGE2-Spiegel, stellte die Nahrungsaufnahme, die Wasseraufnahme und das Körpergewicht wieder her und förderte Überleben nach einer Infektion (Abb. 1b und erweiterte Daten Abb. 1b und 3b). Mit Ibuprofen und Aspirin behandelte Mäuse zeigten eine geringfügige Abnahme der Nahrungsaufnahme, des Trinkens und der Motilität ohne erhöhtes PGE2, was die Möglichkeit erhöht, dass auch andere neuroimmune Kommunikationswege zu den Verhaltensreaktionen beitragen könnten. Dennoch verringerten Ibuprofen und Aspirin das grippebedingte Krankheitsverhalten erheblich, was mit einer Schlüsselrolle der Cyclooxygenase-2-Metaboliten beim neuro-immunen Crosstalk übereinstimmt.

a: Mäuse wurden intranasal mit 25 μl Influenza-A-Virus in niedriger (105 EID50 ml–1), mittlerer (106 EID50 ml–1) oder hoher (107 EID50 ml–1) Dosis und Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme, Motilität infiziert Anschließend wurde das Körpergewicht täglich überwacht. EID50 ist die 50-prozentige Ei-Infektionsdosis. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 6 Mäuse pro Gruppe. Einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett im Vergleich zur Vehikelkontrolle. Nahrungsaufnahme: P = 0,0048 (niedrig), P < 0,0001 (mittel), P < 0,0001 (hoch). Wasseraufnahme: P = 0,8185 (niedrig), P < 0,0001 (mittel), P < 0,0001 (hoch). Motilität: P = 0,5231 (niedrig), P < 0,0001 (mittel), P < 0,0001 (hoch). Körpergewicht: P = 0,0002 (niedrig), P < 0,0001 (mittel), P < 0,0001 (hoch). Überleben: P = 0,3173 (niedrig), P = 0,0185 (mittel), P = 0,0007 (hoch). b: Mäuse wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert (alle Infektionen erfolgten mit 106 EID50 ml−1, sofern nicht anders angegeben), ihnen wurde Trinkwasser mit oder ohne 1 mg ml−1 Ibuprofen verabreicht und sie wurden wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 6 Mäuse pro Gruppe. Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Wasseraufnahme: P = 0,0001; Motilität: P = 0,0001; Körpergewicht: P < 0,0001; Überleben: P = 0,0295. c, Mäuse wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert und ihnen wurden täglich (intraperitoneale Injektion, 1 mg kg−1) Antagonisten für EP1 (SC-51322), EP2 (PF-04418948), EP3 (DG-041) oder EP4 (ONO-) injiziert. AE3-208) oder Fahrzeug allein und wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 10 Mäuse für Fahrzeuggruppen; n = 8 Mäuse für alle anderen. Für EP3-Antagonisten – Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Wasseraufnahme: P < 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P = 0,0002; Überleben: P = 0,0094. b,c, Zweiseitiger ungepaarter t-Test, mit Vergleichen zwischen Gruppen, die mit Ibuprofen oder EP3-Antagonisten und Vehikel behandelt wurden, in c. Log-Rank-Test (Mantel-Cox) für Überlebensanalysen; Für Verhaltens- oder physiologische Veränderungen wurde für jede Maus eine mittlere tägliche Verhaltensänderung (Tage 1–10 nach Infektion oder Überleben) ermittelt und dann für Vergleiche zwischen Versuchsgruppen verwendet (weitere Informationen siehe Erweiterte Daten, Abb. 1a). *P < 0,05, **P < 0,005, ***P<0,0005; NS, nicht signifikant.

Quelldaten

Es wurde vorgeschlagen, dass mehrere Prostaglandinrezeptoren eine Rolle im Krankheitsverhalten spielen2,19. Wir verabreichten täglich nach einer Influenza-Infektion selektive Antagonisten für jeden PGE2-Rezeptor und maßen verschiedene Aspekte des Krankheitsverhaltens. Der EP3-Rezeptorantagonist DG-041 blockierte in jedem gemessenen Parameter effektiv grippebedingte Erkrankungen und förderte auch das Überleben (Abb. 1c), mit einer Wirkung, die der von Ibuprofen und Aspirin ähnelt. Im Gegensatz dazu hatte der Antagonismus der EP1-, EP2- oder EP4-Rezeptoren keinen Einfluss auf einen der gemessenen Parameter. Der EP3-selektive Agonist Sulproston hatte den gegenteiligen Effekt, indem er die Nahrungsaufnahme hemmte (Extended Data Abb. 2b). So zeigen Mäuse durch die Wirkung von PGE2 auf EP3-Rezeptoren charakteristische Verhaltensänderungen bei einer Influenzavirus-Infektion.

Der EP3-Rezeptor wird in mehreren Klassen zentraler und peripherer Neuronen exprimiert. Um den Schlüsselort der EP3-Rezeptorwirkung bei grippebedingten Erkrankungen zu bestimmen, haben wir Mäuse mit einem Allel (Ptger3flox) für Cre-abhängiges Knockout des Ptger3-Gens14, das den EP3-Rezeptor kodiert, erhalten. Anschließend kreuzten wir Ptger3flox-Mäuse entweder mit Nestin-cre- oder Advillin-creER-Mäusen, die Cre-Rekombinase auf die meisten zentralen bzw. peripheren Neuronen 20,21 abzielen (Extended Data Abb. 4a), und das durch Grippe verursachte Krankheitsverhalten gemessen. Advillin-creER; Ptger3flox-Mäuse wurden mindestens eine Woche vor der Virusverabreichung mit Tamoxifen behandelt, um eine Cre-vermittelte Rekombination zu induzieren. Eine vorherige Tamoxifen-Behandlung von Kontrollmäusen hatte keinen Einfluss auf die nachfolgenden Verhaltensreaktionen auf eine Influenza-Infektion (Extended Data, Abb. 4b). Influenza-bedingte Rückgänge bei Nahrungsaufnahme, Trinken, Bewegung, Körpergewicht und Überleben wurden in Advillin-creER abgeschwächt; Ptger3flox-Mäuse (Abb. 2b) mit ähnlichen Wirkungsstärken wie bei der Ibuprofen-Behandlung, blieben jedoch bei Nestin-cre bestehen; Ptger3flox-Mäuse (Abb. 2a). Ähnliche Auswirkungen der Deletion des Ptger3-Gens auf das Krankheitsverhalten wurden beobachtet, wenn niedrigere, weniger tödliche Dosen des Influenzavirus verwendet wurden (Extended Data Abb. 5). Mäuse mit abgeschwächtem Krankheitsverhalten zeigten eine ähnliche Erholungszeit, da in allen Versuchsgruppen etwa zwei Wochen nach der Infektion normales Fressen, Trinken und normale Beweglichkeit beobachtet wurden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Influenza durch die Wirkung von PGE2 auf periphere sensorische Neuronen Krankheitsreaktionen auslöst.

a,b, Nestin-cre; Ptger3flox (a), Advillin-creER; Ptger3flox-Mäuse (b) oder Ptger3flox-Mäuse (a,b) wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert und wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 8 Mäuse (Ptger3flox), n = 6 Mäuse (Nestin-cre und Advillin-creER). Zweiseitiger, ungepaarter t-Test, wie in Abb. 1 dargestellt, für Verhaltens- oder Physiologieanalysen; Log-Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse. a, Nahrungsaufnahme: P = 0,0126; Wasseraufnahme: P = 0,1006; Motilität: P = 0,0701; Körpergewicht: P = 0,9361; Überleben: P = 0,7735. b, Nahrungsaufnahme: P = 0,0004; Wasseraufnahme: P = 0,0004; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P = 0,0004; Überleben: P = 0,0216. c, Den NJP-Ganglien von Ptger3flox-Mäusen wurde AAV-cre beidseitig injiziert, dem Influenza-A-Virus oder Kochsalzlösung ausgesetzt und wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 8 Mäuse pro Gruppe. Ptger3flox, Virus – Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Wasseraufnahme: P < 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P < 0,0001; Überleben: P < 0,0001. Ptger3flox; AAV-cre, Virus – Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Wasseraufnahme: P < 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P < 0,0001; Überleben: P = 0,0376. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest, wie in Abb. 1 für Verhaltens- oder Physiologieanalysen detailliert beschrieben; Log-Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse mit Vergleichen zwischen Ptger3flox, Virus und Ptger3flox; AAV-cre, Vehikel (rote Sterne) oder zwischen Ptger3flox, Virus und Ptger3flox; AAV-cre, Virus (blaue Sterne).

Quelldaten

Der EP3-Rezeptor wird in mehreren Klassen peripherer Neuronen exprimiert, die in Advillin-creER-Mäusen markiert sind, einschließlich vagaler sensorischer Neuronen, glossopharyngealer sensorischer Neuronen, spinaler sensorischer Neuronen der Spinalganglien und möglicherweise in anderen Neuronentypen20,22. Glossopharyngeale und vagale sensorische Neuronen galten als primäre Kandidaten für den Nachweis von Atemwegspathogenen, da sie für den Großteil der Innervation in den oberen und unteren Atemwegen verantwortlich sind23. Bei Mäusen sind die Soma der sensorischen Neuronen des Vagus (nodose und jugularis) und des Glossopharynx (petrosal) auf jeder Körperseite zu einem großen Superganglion verschmolzen23. Wir injizierten ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) mit einem konstitutiven Cre-Allel (AAV-cre) bilateral in beide Nodose-Jugular-Petrosal-Ganglien (NJP) von Ptger3flox-Mäusen. Das wirksame Knockout von Ptger3 in NJP-Ganglien wurde zwei Wochen nach der AAV-Injektion durch RNA-in-situ-Hybridisierung bestätigt (Extended Data Abb. 6). Der auf das NJP-Ganglion gerichtete Ptger3-Knockout führte zu einer deutlichen Abschwächung des grippebedingten Krankheitsverhaltens (Abb. 2c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Influenza Verhaltensänderungen über den EP3-Rezeptor hervorruft, der auf vagalen und/oder glossopharyngealen sensorischen Afferenzen exprimiert wird.

Ptger3 wird in einer Untergruppe vagaler und glossopharyngealer sensorischer Neuronen exprimiert, wie durch RNA-in-situ-Hybridisierung (Extended Data, Abb. 6b) und Analyse von Einzelzell-Transkriptomdaten (Abb. 3a) gezeigt wurde. Einzelzell-RNA-Sequenzierungsansätze enthüllten Dutzende molekular unterschiedlicher sensorischer NJP-Neuronen22,24,25. Die höchste Ptger3-Expression wurde in 6 Neuronenclustern beobachtet: J1, J2, J3, NP2, NP9 und NP26 (Abb. 3a), wobei J Jugularis und NP Nodose-Petrosal-Neuronen bezeichnet. Wir kreuzten Ptger3flox-Mäuse mit Piezo2-IRES-cre-Mäusen, in denen J1, J2, J3 und andere NJP-Neuronen markiert sind, und Phox2b-cre-Mäusen, in denen NP2, NP9, NP26 und andere NJP-Neuronen markiert sind. Influenza-induziertes Krankheitsverhalten wurde bei Phox2b-cre abgeschwächt; Ptger3flox-Mäuse in einem Bereich von Virustitern, jedoch nicht in Piezo2-IRES-cre; Ptger3flox-Mäuse (Abb. 3b und Extended Data Abb. 7 und 8a), was auf eine Rolle von NP2-, NP9- oder NP26-Neuronen schließen lässt. Um diese Neuronentypen zu unterscheiden, haben wir als nächstes Ptger3flox-Mäuse mit Pdyn-IRES-cre-, Oxtr-IRES-cre- und Gabra1-IRES-cre-Mäusen gekreuzt, die ein unterschiedliches Targeting von NP26-, NP2- und NP9-Neuronen aufweisen. Gabra1-IRES-cre; Ptger3flox-Mäuse zeigten eine deutliche Abschwächung des grippebedingten Krankheitsverhaltens, ähnlich wie bei der Behandlung mit Ibuprofen, wohingegen weder bei Pdyn-IRES-cre noch bei Pdyn-IRES-cre eine Wirkung beobachtet wurde; Ptger3flox oder Oxtr-IRES-cre; Ptger3flox-Mäuse (Abb. 3b und erweiterte Daten Abb. 8a). Gabra1-IRES-cre; Ptger3flox-Mäuse zeigten zusätzlich eine abgeschwächte Hypothermie-Reaktion auf eine Influenza-Infektion (Extended Data Abb. 3a). Wir haben auch die Rolle von TRPV1-Neuronen getestet, da ihre Deletion das Überleben nach bakteriellen Lungeninfektionen, die eine tödliche Lungenentzündung verursachen, beeinträchtigt26. Allerdings war das durch Grippe verursachte Krankheitsverhalten bei Trpv1-IRES-cre normal; Ptger3flox-Mäuse (Extended Data Abb. 8b, c) und darüber hinaus sind GABRA1-Neuronen überwiegend Trpv1-negativ. Daher hat die Deletion des EP3-Rezeptors in einer kleinen Untergruppe von Gabra1-exprimierenden peripheren sensorischen Neuronen (NP9-Neuronen) weitreichende Auswirkungen auf Verhaltensreaktionen auf eine Grippeinfektion.

a: Ein UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection), abgeleitet aus veröffentlichten Einzelzell-Transkriptomdaten von sensorischen Vagus- und Glossopharyngealganglien22, das die Expression der angegebenen Gene zeigt (Farbe zeigt die relative Expression auf einer natürlichen Logarithmus-Skala). b, Zelltypen, wie in a hervorgehoben, exprimieren das angegebene Gen sowie Ptger3. Mäuse wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert und wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 8 (Piezo2-IRES-cre), n = 6–8 (Phox2b-cre; 8 Kontrolle und 6 Phox2b-cre), n = 6 (Pdyn-IRES-cre), n = 6 (Oxtr-IRES-cre ) und n = 10 (Gabra1-IRES-cre) Mäuse pro Gruppe. Zweiseitiger, ungepaarter t-Test, wie in Abb. 1 dargestellt, für Verhaltens- oder Physiologieanalysen; Log-Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse. Piezo2-IRES-cre – Nahrungsaufnahme: P = 0,2631; Motilität: P = 0,2680; Körpergewicht: P = 0,7925; Überleben: P = 0,4736. Phox2b-cre – Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P = 0,0002; Überleben: P = 0,0181. Pdyn-IRES-cre – Nahrungsaufnahme: P = 0,4539; Motilität: P = 0,4946; Körpergewicht: P = 0,2675; Überleben: P = 0,7937; Oxtr-IRES-cre – Nahrungsaufnahme: P = 0,4786; Motilität: P = 0,6333; Körpergewicht: P = 0,3297; Überleben: P = 0,7121; Gabra1-IRES-cre – Nahrungsaufnahme: P = 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P = 0,0004; Überleben: P = 0,0263.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir, wie sich Manipulationen sensorischer Neuronen auf die viralen Transkriptniveaus und die Zytokinproduktion auswirken. Eine Influenza-Infektion induzierte PGE2 auf ähnliche Werte im Plasma und BALF von Gabra1-IRES-cre; Ptger3flox, Phox2b-cre; Ptger3flox, Advillin-creER; Ptger3flox- und Ptger3flox-Mäuse (Extended Data Abb. 9a), was eher mit Veränderungen in der PGE2-Erkennung als in der PGE2-Synthese übereinstimmt, die den beobachteten Verhaltensunterschieden zugrunde liegen. Bei Kontrollmäusen erreichten die viralen Transkriptspiegel drei Tage nach der Infektion in den oberen Atemwegen und fünf Tage nach der Infektion in der Lunge ihren Höhepunkt. In Gabra1-IRES-cre; Bei Ptger3flox-Mäusen waren die viralen Transkriptspiegel in den oberen Atemwegen teilweise verringert und in der Lunge verringert, verzögert und anhaltend (Erweiterte Daten, Abb. 9b). Die Spiegel von Interferon-gamma (IFNγ), TNF und Interleukin 6 (IL-6) erreichten in BALF von Kontrollmäusen 5 Tage nach der Infektion ebenfalls ihren Höhepunkt und waren in Gabra1-IRES-cre ebenfalls verringert und verzögert; Ptger3flox-Mäuse (Extended Data Abb. 9c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das gezielte Ausschalten des EP3-Rezeptors in sensorischen Neuronen nicht nur das Krankheitsverhalten, sondern auch die Immunantwort und den Übergang von einer Infektion der oberen zu einer unteren Atemwegsinfektion beeinflusst.

Wir nutzten einen komplementären Ansatz mit Diphtherietoxin-gesteuerter Zellablation, um die Rolle von Gabra1-exprimierenden vagal-glossopharyngealen sensorischen Neuronen bei grippebedingten Erkrankungen zu klären und eine Rolle für andere Gabra1-Expressionsstellen auszuschließen. Mauszellen sind normalerweise resistent gegen Diphtherietoxin, können jedoch durch die Expression des menschlichen Diphtherietoxinrezeptors (DTR) empfindlich gemacht werden. NJP-Ganglien von Gabra1-IRES-cre; lsl-DTR-Mäusen wurde beidseitig Diphtherietoxin injiziert (wir nennen diese Mäuse Gabra1-ABLATE), was zu einer hocheffizienten Ablation vagaler und glossopharyngealer GABRA1-Neuronen führte (Abb. 4c). Wir haben zuvor gezeigt, dass dieser Ansatz keine Auswirkungen auf Cre-negative Neuronen in NJP-Ganglien oder entfernt gelegene Cre-positive Neuronen hat27. Gabra1-ABLATE-Mäuse zeigten abgeschwächte Krankheitsreaktionen auf eine Grippeinfektion, die denen in Gabra1-IRES-cre ähnelten; Ptger3flox-Mäuse oder mit Ibuprofen behandelte Mäuse (Abb. 4a).

a, Gabra1-IRES-cre; lsl-DTR-Mäusen wurden bilateral in NJP-Ganglien mit oder ohne Diphtherietoxin (DT) injiziert und dann mit dem Influenza-A-Virus infiziert und wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 8 Mäuse pro Gruppe. Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Wasseraufnahme: P < 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P = 0,0004; Überleben: P = 0,049. b: Wildtyp-Mäuse mit beidseitiger Durchtrennung des Nervus glossopharyngeus oder Scheinoperation wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert und wie angegeben überwacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 8 Mäuse pro Gruppe. Nahrungsaufnahme: P < 0,0001; Wasseraufnahme: P < 0,0001; Motilität: P < 0,0001; Körpergewicht: P < 0,0001; P = 0,036. Zweiseitiger ungepaarter T-Test, wie in Abb. 1 dargestellt, zur Verhaltens- oder Physiologieanalyse; Log-Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse. c, Immunfärbung für DTR in Whole-mount-Präparaten von NJP-Ganglien vier Wochen nach der Injektion. Maßstabsbalken, 200 μm. d: Durch PGE2 (1 μM) oder KCl (150 mM) hervorgerufene Calciumtransienten wurden mit Calbryte 520 AM in tdTomato-positiven Neuronen abgebildet, die akut aus NJP-Ganglien von Gabra1-IRES-cre gesammelt wurden; lsl-tdTomatenmäuse. Maßstabsbalken, 10 μm. Die Bilder sind repräsentativ für drei technische Nachbildungen. AU, beliebige Einheiten.

Quelldaten

NP9-Neuronen fehlt die Expression von Hoxb4 (Lit. 22), und GABRA1-Neuronen sind häufig in NJP-Ganglien in der Nähe des Glossopharyngealzweigs geclustert (Extended Data Abb. 10a), was darauf hindeutet, dass sie eher Teil des Nervus glossopharyngeus als des Nervus vagus sind. Da sich die Injektion von Diphtherietoxin in ähnlicher Weise auf Vagus- und Glossopharyngealneuronen auswirkte, haben wir die Beiträge dieser Nerven unterschieden, indem wir den Glossopharyngealnerv beidseitig durchtrennt und gleichzeitig den Vagusnerv erhalten haben. Mäuse mit beidseitiger Durchtrennung des Nervus glossopharyngealis zeigten eine ähnliche Abschwächung der grippebedingten Erkrankung (Abb. 4b). Es wurde zuvor gezeigt, dass PGE2 Transkriptionsänderungen in spinalen und vagalen Afferenzen aktiviert und/oder induziert28,29,30,31, daher haben wir getestet, ob GABRA1-Neuronen auch direkt aktiviert werden. Wir beobachteten, dass PGE2 direkt Kalziumtransienten in GABRA1-Neuronen hervorrief, die akut aus NJP-Sensorganglien von Gabra1-IRES-cre kultiviert wurden; lsl-tdTomato-Mäuse (Abb. 4d, 16 von 26 oder 61,5 % der tdTomato-positiven, auf KCl reagierenden Neuronen). So erkennen seltene glossopharyngeale NP9-Neuronen indirekt über den EP3-Rezeptor das Vorhandensein einer respiratorischen Virusinfektion und lösen als Reaktion darauf ein mehrstufiges Krankheitsverhaltensprogramm aus.

Gabra1-IRES-cre-Mäuse stellen ein wertvolles Werkzeug zur Visualisierung seltener glossopharyngealer sensorischer Neuronen dar, die am neuroimmunen Crosstalk beteiligt sind. Daher haben wir genetische Kartierungsansätze verwendet, um die peripheren und zentralen Projektionen von GABRA1-Neuronen zu markieren (Abb. 5a). Den NJP-Ganglien von Gabra1-IRES-cre-Mäusen wurde entweder ein AAV injiziert, das ein Cre-abhängiges Reportergen enthielt, das für tdTomato (AAV-flex-tdTomato) oder alkalische Phosphatase (AAV-flex-AP) kodiert, sowie ein AAV, das ein Cre enthielt -unabhängiges Reportergen, das für GFP (AAV-GFP) kodiert, um das globale NJP-Projektionsfeld zu visualisieren. Anschließend wurden Fasern in den Atemwegen und im Gehirn sichtbar gemacht.

a: NJP-Ganglien von Gabra1-IRES-cre-Mäusen wurden bilateral Cre-unabhängiges AAV-GFP und Cre-abhängiges AAV-flex-tdTomato injiziert, und fluoreszierende Axone wurden sichtbar gemacht (grün: alle sensorischen NJP-Axone; rot: GABRA1 NJP-Axone). durch Immunhistochemie für tdTomato und GFP in fixierten koronalen Kryoschnitten des Maushirnstamms. Maßstabsbalken, 200 μm. b: NJP-Ganglien von Gabra1-IRES-cre-Mäusen wurde bilateral AAV-flex-tdTomato injiziert, und Axone wurden durch Immunfärbung für tdTomato in fixierten koronalen Kryoschnitten des Nasopharynx sichtbar gemacht. Maßstabsbalken, 100 μm (oben), 50 μm (unten). c, Oben, Immunhistochemie von COX2 in fixierten Kryoschnitten des Nasopharynx bei nicht infizierten Mäusen (Kontrolle) oder Mäusen, die fünf Tage lang mit dem Influenza-A-Virus infiziert waren. Maßstabsbalken, 100 μm. Unten: Quantifizierung der COX2-Immunfluoreszenz im Nasopharynx der angegebenen Mäuse. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 29 Schnitte von 5 Mäusen pro Gruppe über 3 unabhängige Experimente. Zweiseitiger ungepaarter t-Test, P < 0,0001. Linkes Bild teilweise mit Genehmigung von Lit. angepasst. 35, Elsevier. Oberes Panel in Teil b, erstellt mit BioRender.com.

Quelldaten

Zentral durchqueren sensorische Neuronen der Nodose- und Petrosalganglien den Schädel und innervieren Hirnstammregionen, zu denen der Kern des Tractus solitaris (NTS) und die Area postrema gehören32, während sensorische Jugularisneuronen den paratrigeminalen Kern innervieren33. Verschiedene Cre-definierte vagale Afferenzen zielen auf räumlich begrenzte Unterregionen des NTS ab, wobei einige, aber nicht alle afferenten Typen auch auf den Bereich postrema zugreifen24,34,35. Die Axone von NJP-GABRA1-Neuronen waren im lateralen NTS stark eingeschränkt (Abb. 5a), wurden im Bereich postrema nicht beobachtet und waren von NTS-Positionen entfernt, auf die Axone einiger anderer Cre-definierter NJP-Neuronen abzielten, wie z. B. markierte darminnervierende Neuronen durch Ausdruck von Gpr65 oder Glp1r35. Diese Ergebnisse stützen außerdem ein Modell für die topografische Organisation im Hirnstamm36, bei dem Neuronen das Vorliegen einer Atemwegsinfektion räumlich begrenzt von zumindest einigen anderen interozeptiven Eingaben weiterleiten.

In der Peripherie wurden markierte GABRA1-Axone nur in wenigen inneren Organen beobachtet, von denen bekannt ist, dass sie vagale und glossopharyngeale Innervation erhalten. Wir beobachteten die dichteste Innervation im Nasopharynx und in der Mundhöhle, einschließlich der Geschmackspapillen, eine gewisse Innervation der Luftröhren- und Rachenmuskulatur und eine spärliche Innervation der Magenmuskulatur (Erweiterte Daten, Abb. 10b). In vielen anderen inneren Organen, einschließlich Herz, Speiseröhre, Aorta und Halsschlagader, wurde keine Innervation beobachtet. Der Nasopharynx ist ein geeigneter Ort für die Immunüberwachung, da er die Nasenhöhle mit dem Rest des Atmungssystems verbindet und eine frühe Linie der mukosalen Immunabwehr darstellt37. Eine Grippeinfektion erhöht den PGE2-Spiegel lokal im Nasopharynx38 und führt beim Menschen zu einer Entzündung der Nasopharynxmandeln39. Mäuse verfügen über ein orthologes System, das als Nasopharynx-assoziiertes Lymphgewebe bekannt ist40, daher haben wir getestet, ob sich GABRA1-Axone in der Nähe relevanter Immunmediatoren befinden. GABRA1-Axone wurden dorsal in den Epithel- und Subepithelschichten des Nasopharynx angereichert (Abb. 5b), und insbesondere wurde die Cyclooxygenase-2-Expression ebenfalls im dorsalen Epithel des Nasopharynx nachgewiesen (Abb. 5c). Darüber hinaus war die Cyclooxygenase-2-Expression im dorsalen Nasopharynx nach einer Influenza-Infektion bei Mäusen deutlich hochreguliert (Abb. 5c). Somit nehmen GABRA1-Neuronen eine strategische und privilegierte Position für die Erkennung der erhöhten PGE2-Spiegel ein, die während einer Virusinfektion auftreten.

Trotz saisonaler Impfungen und antiviraler Therapeutika bleibt die Influenza-A-Virusinfektion eine der schwerwiegendsten Bedrohungen für den Menschen und betrifft jedes Jahr Millionen Menschen weltweit. Cyclooxygenase-2-Hemmer gehören zu den am weitesten verbreiteten Medikamenten gegen Krankheiten und Schmerzen. Allein in den USA werden jährlich etwa 30 Milliarden Dosen nichtsteroidaler entzündungshemmender Medikamente (NSAIDs) konsumiert41. Die Blockade der PGE2-Produktion lindert Krankheiten, und es wurden mehrere Modelle dafür vorgeschlagen, wie das Gehirn über PGE2 Informationen über eine periphere Infektion erhält (Lit. 2). Hier beobachten wir, dass durch Influenza verursachtes Krankheitsverhalten in ähnlicher Weise abgeschwächt wurde durch 1) Ibuprofen-, Aspirin- und EP3-Rezeptor-Antagonismus, 2) Ptger3-zielgerichtetes Gen-Knockout unter Verwendung von Advillin-creER-, Phox2b-cre- und Gabra1-IRES-cre-Mäusen und direktes AAV -cre-Injektion in NJP-Ganglien, 3) Ablation von GABRA1 NJP-Neuronen und 4) und Durchtrennung des Nervus glossopharyngealis. Aus diesen kombinierten Ergebnissen schließen wir, dass eine kleine Gruppe Gabra1-exprimierender glossopharyngealer sensorischer Neuronen PGE2 erkennt und einen neuronal orchestrierten Krankheitszustand induziert, der mit einer Reihe von Verhaltensreaktionen auf respiratorische Virusinfektionen verbunden ist.

Prostaglandine und viele andere Zytokine können vagale und andere periphere Afferenzen in vitro aktivieren8,29,31, ihre physiologische Rolle bei naturalistischen Infektionen war jedoch schwer zu analysieren. Die Vagotomie blockiert in einigen Studien Krankheitsreaktionen auf Zytokine und Lipopolysaccharide, in anderen jedoch nicht42,43, und diese Variabilität kann auf den Ort oder die Dosis der Pyrogenverabreichung zurückzuführen sein. Unsere Ergebnisse deuten auf eine klare Rolle spärlicher glossopharyngealer sensorischer Neuronen hin, die anatomisch für die Erkennung von Influenza-induziertem PGE2 geeignet sind. PGE2 weist in vivo eine begrenzte Stabilität auf44, sodass periphere sensorische Neuronen, die PGE2 direkt an der Infektionsstelle erkennen, scheinbar einen schnellen und robusten Kanal für die Informationsübertragung an das Gehirn darstellen würden.

Krankheitsverhalten wurde vorgeschlagen, um Energie zu sparen und Infektionen abzuwehren1. Allerdings verringert die Eliminierung des Influenza-Erkennungswegs des Nervus glossopharyngeus nicht nur das Krankheitsverhalten, sondern fördert auch das Überleben. Das Knockout von EP3 aus einer kleinen Gruppe glossopharyngealer Neuronen reicht aus, um den tiefgreifenden Überlebensphänotyp nachzuahmen, der bei Ganzkörper-Knockouts beobachtet wird. Ein Modell besagt, dass durch Krankheitserreger verursachte Anorexie in einigen Infektionsmodellen vorteilhaft, in anderen jedoch schädlich ist. Beispielsweise ist die Blockierung der PGE2-Produktion während einer Mycobacterium-3-Infektion schädlich45, fördert jedoch das Überleben während einer Influenza-Infektion19,46. Darüber hinaus ist die Gabe von Glukose bei einer bakteriellen Sepsis schädlich, da der Blutzucker den Krankheitserregern direkt als Treibstoff dienen kann, während er bei einer Influenza-Infektion schützend wirkt47. Somit kann eine Störung der neuronalen Reaktionen auf eine Infektion die Sterblichkeit verringern, indem Änderungen im Ernährungsverhalten abgeschwächt werden. Darüber hinaus kann ein infektionsaktivierter, Anorexie fördernder Nervenweg bei bestimmten bakteriellen Infektionen einen Nettoüberlebensvorteil bieten und bleibt somit über die Evolution hinweg erhalten, ist aber bei einer Virusinfektion schädlich, wie hier beobachtet. Darüber hinaus kann das Krankheitsverhalten einen gesonderten Vorteil auf Bevölkerungsebene bieten, da kranke Tiere Isolation anstreben und dadurch die Übertragung von Krankheitserregern auf Verwandte begrenzen48.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das gezielte Ausschalten des EP3-Rezeptors in sensorischen Neuronen nicht nur das Krankheitsverhalten beeinflusst, sondern auch die Immunantwort und den Virusübergang vom oberen zum unteren Atemtrakt. Eine sparsame Interpretation dieser Ergebnisse ist, dass Petrosal-GABRA1-Neuronen beim Nachweis von PGE2 neuronale Schaltkreise aktivieren, die koordinierte Reaktionen hervorrufen, die Krankheitsverhalten sowie motorische Reflexe umfassen, die die Immunfunktion beeinflussen. Darüber hinaus können Änderungen im Fressverhalten sekundär die Immunfunktion beeinflussen47,48 und die Aktivierung petrosaler GABRA1-Neuronen kann die Spiegel anderer Zytokine als PGE2 beeinflussen (Extended Data Abb. 9c), was möglicherweise weiteres neuronales Feedback hervorrufen und das Krankheitsverhalten verstärken kann. Alle derartigen Reaktionen auf eine Infektion würden entscheidend vom EP3-Rezeptor in Petrosal-GABRA1-Neuronen abhängen, der eine wesentliche Rolle dabei spielt, das Vorliegen einer Infektion der oberen Atemwege zunächst an das Gehirn weiterzuleiten und letztendlich Krankheitsverhalten hervorzurufen.

Das durch Influenza-Infektionen verursachte Krankheitsverhalten wurde nach NSAID-Behandlung, gezieltem EP3-Rezeptor-Knockout, gezielter neuronaler Ablation und Durchtrennung des Nervus glossopharyngealis abgeschwächt, aber nicht beseitigt, was auf andere Krankheitswege hindeutet. Bemerkenswert ist, dass die Kinetik des restlichen Krankheitsverhaltens nach der Manipulation petrosaler GABRA1-Neuronen mit dem zeitlichen Verlauf der Virusakkumulation in der Lunge übereinstimmt, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich zwei Phasen grippeinduzierten Krankheitsverhaltens gibt. Die erste Phase tritt auf, wenn das Virus am häufigsten in den oberen Atemwegen vorkommt und die Krankheit hauptsächlich durch PGE2-erkennende sensorische Neuronen des Glossopharynx, die mit GABRA1 markiert sind und in den Nasopharynx projizieren, vermittelt wird. Die zweite Krankheitsphase tritt auf, wenn das Virus am häufigsten in den unteren Atemwegen auftritt und die Lunge hauptsächlich von vagalen und nicht von glossopharyngealen sensorischen Neuronen innerviert wird. Unsere Daten legen die Möglichkeit nahe, dass diese zweite Krankheitsphase einen anderen neuronalen Signalweg umfasst, der von PGE2, EP3 und glossopharyngealen sensorischen Neuronen unabhängig ist. Inhibitoren verbleibender neuro-immuner Interaktionswege könnten, sobald sie identifiziert sind, in Kombination mit NSAIDs potenziell eine verbesserte Linderung von grippebedingtem Unwohlsein bewirken. Wir stellen außerdem fest, dass PGE2-Rezeptoren in mehreren sensorischen NJP-Neuronentypen sowie im Gehirn und in den Spinalganglien exprimiert werden. Es ist wahrscheinlich, dass das Nervensystem mehrere sensorische Wege nutzt, um periphere Infektionen zu erkennen, wobei verschiedene Sensoren möglicherweise auf bestimmte Krankheitserregertypen oder Infektionsorte im Körper spezialisiert sind. Auf diese Weise könnten sensorische Neuronen des Darms und der Atemwege möglicherweise verschiedene neuronale Schaltkreise aktivieren, die beispielsweise zu Husten oder Übelkeit führen31,49. In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung reagieren verschiedene Krankheitswege unterschiedlich empfindlich auf eine pharmakologische Hemmung; Beispielsweise wird Darmbeschwerden klinisch mit Antagonisten des Serotoninrezeptors HTR3A50 behandelt. Das Verständnis der Vielfalt der sensorischen Wege zur Erkrankung und ihrer Beteiligung durch verschiedene Krankheitserreger wird einen wesentlichen Rahmen für die Entschlüsselung dieses komplexen und kaum verstandenen physiologischen Zustands bieten und möglicherweise verbesserte therapeutische Interventionen ermöglichen.

Alle Tierversuche folgten den ethischen Richtlinien, die im National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals dargelegt sind, und alle Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Harvard Medical School genehmigt. Die Mäuse wurden bei konstanter Temperatur (23 ± 1 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (46 ± 5 %) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Wildtyp C57BL/6J (000664), Nestin-cre (003771), Phox2b-cre (016223), Advillin-creER (032027), Trpv1-IRES-cre (017769), Pdyn-IRES-cre (027958), Piezo2 -EGFP-IRES-cre (027719), Oxtr-IRES-cre (031303), Agrp-cre (012899), lsl-DTR (007900), lsl-tdTomato (Ai14, 007914) wurden von Jackson Laboratories gekauft. Gabra1-IRES-cre-, lsl-L10-GFP- und Ptger3flox-Mäuse wurden zuvor erzeugt 14, 22, 51.

Influenza A/PR/8/34 (H1N1) wurde von Charles River Avian Vaccine Services (10100374) mit einem EID50 von 1012 ml−1 erworben. Das Virus wurde in steriler Kochsalzlösung für die verabreichte Dosierung verdünnt, die, sofern nicht anders angegeben, EID50 106 ml-1 betrug. Die Virusverabreichung wurde aus früheren Studien übernommen52. Wache Mäuse wurden manuell festgehalten und das Influenza-A-Virus wurde langsam mit einer P200-Pipette durch jedes Nasenloch (25 μl Gesamtvolumen) abgegeben, um ein Verschütten oder eine Abgabe in den Mund zu verhindern. Nach der Verabreichung wurden die Mäuse 10–15 Sekunden lang mit aufrechten Nasenlöchern gehalten und dann in ihren Käfig zurückgebracht.

Zur Analyse der durch eine Influenza-A-Virusinfektion verursachten Verhaltensänderungen wurden sechs bis acht Wochen alte Mäuse ohne Geschlechtsvorlieben einzeln gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Ausgangswerte wurden durch Messung der täglichen Nahrungsaufnahme, der täglichen Wasseraufnahme, des Körpergewichts und der Motilität drei Tage lang vor der Inokulation ermittelt. Nach der Virusinfektion wurden alle Messungen als prozentuale Veränderung gegenüber den Ausgangswerten ausgedrückt. Die Futter- und Wasseraufnahme wurde täglich berechnet, indem die Gewichtsveränderung des verbleibenden Futters und Wassers im Käfig gemessen wurde. Die Tierbewegungen wurden täglich 30 Minuten lang im Heimkäfig aufgezeichnet (C922x Pro Stream Webcam, Logitech) und die Motilität als zurückgelegte Gesamtstrecke ausgedrückt, bestimmt durch das in ImageJ verfügbare MTrack2-Plug-in (1.53q, NIH). Zur Messung der akuten Nahrungsaufnahme ließ man die Mäuse 24 Stunden lang fasten und erhielten bei Einbruch der Dunkelheit PGE2 oder Sulproston (EP3-Agonist, 14765, Cayman Chemical Company) über den Expositionsweg und die in den Abbildungslegenden angegebenen Dosen. Die Tiere wurden dann einzeln in sauberen Käfigen mit ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser gehalten und die Futtermenge, die eine Stunde lang aufgenommen wurde, wurde durch Messen des Futters im Käfig vor und nach der Testperiode bestimmt.

Die Körperkerntemperatur wurde durch eine rektale Sonde oder Radiotelemetrie überwacht. Rektale Sondenmessungen wurden stündlich jeden Tag von Mittag bis Mitternacht unter Verwendung einer Maus-Rektaltemperatursonde (Kent Scientific, RET-3, 0,16 mm Spitzendurchmesser) durchgeführt, die an ein Thermometer (Kent Scientific WD-20250-9) angeschlossen war. Die Sonden wurden sterilisiert (70 % Ethanol), geschmiert (Aquagel-Gleitgel, ParkerLabs, 57-05) und ca. 5–7 mm in das Rektum von körperlich fixierten Mäusen eingeführt, und die Temperatur wurde 30 s lang aufgezeichnet. Für die Radiotelemetrie wurde ein Radiotelemetriegerät, das die Körpertemperatur meldet (HD-X11, DSI), operativ in die Bauchhöhle implantiert. Die Operation wurde unter Anästhesie mit Avertin (200 mg kg−1, intraperitoneale Injektion) durchgeführt und der Bauchbereich wurde desinfiziert und rasiert. Es wurde ein Einschnitt von ca. 1 cm vorgenommen und das Bauchfell an der Linea alba vorsichtig freigelegt, um das sterile Radiotelemetriegerät einzuführen. Die Operationsstelle wurde mit VICRYL-Nähten (J392H, Ethicon) versiegelt. Die Tiere erhielten Buprenorphin SR (BupSR-LAB, ZooPharm, 20 mg kg−1 subkutan im Nacken) und durften sich mindestens eine Woche lang erholen. Körpertemperaturdaten wurden über 15-Minuten-Intervalle mit einem Empfänger (easyTEL, Emka Technologies) erfasst, der an einen Computer angeschlossen war, auf dem die iox-Software v.2.10.8 ausgeführt wurde. Alle Datenpunkte einer Maus an einem bestimmten Tag wurden gemittelt.

Ibuprofen (I4883) und Aspirin (Acetylsalicylsäure, A5376) wurden von Sigma erworben, und die PGE2-Rezeptorantagonisten SC-51322 (2791), PF-04418948 (4818), DG-041 (6240) und ONO-AE3-208 (3565). ) wurden von Tocris gekauft. Dem Trinkwasser wurde nach Belieben Ibuprofen (1 mg ml-1, Kochsalzlösung) zugesetzt und täglich Aspirin (20 mg kg-1, Kochsalzlösung) und PGE2-Rezeptorantagonisten (1 mg kg-1, Kochsalzlösung) injiziert (intraperitoneal). Die Verabreichung von Cyclooxygenase-2-Inhibitoren und PGE2-Rezeptorantagonisten begann 3 Tage vor der Virusimpfung und dauerte bis zum Ende des Überwachungszeitraums. Tamoxifen wurde mindestens eine Woche vor der Influenzavirusinfektion 5 Tage lang täglich verabreicht (intraperitoneale Injektion, 70 mg kg−1).

Den NJP-Ganglien wurden AAVs oder Diphtherietoxin wie zuvor beschrieben34 mit geringfügigen Modifikationen injiziert. Die Mäuse wurden anästhesiert (200 mg kg−1 Avertin, intraperitoneale Injektion), und die Tiefe der Anästhesie wurde während des gesamten Eingriffs durch das Fehlen einer Zehenklemmreaktion sichergestellt. NJP-Ganglien wurden freigelegt und seriell mit Kochsalzlösung (10 × 13,8 nl) injiziert, die entweder AAVs (Titer > 6,7 × 1012 vg ml–1) oder Diphtherietoxin (5 μg ml–1, Sigma), ergänzt mit 0,05 % Fast Green FCF-Farbstoff, enthielt (Sigma) unter Verwendung einer scharf gezogenen Glaspipette, die an einem Nanoject-Injektor (Drummond) befestigt ist. AAV-cre (AAV-Syn-Cre-GFP, SignaGen Laboratories, SL100892, AAV9), AAV-flex-tdTomato (AAV9.CAG.Flex.tdTomato.WPRE.BGH, Addgene, 51503, AAV9), AAV-GFP (pENN .AAV.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG, Addgene, 105542, AAV9) und AAV-flex-AP (AAV9.CAG.flex.PLAP.WPRE.bgH, benutzerdefinierter Virus, Boston Children's Hospital Viral Core, Boston, MA, AAV9) wurden erworben. Die erfolgreiche Injektion wurde durch den Fast Green FCF-Farbstoff bestätigt, der das gesamte Ganglion langsam und ohne Leckage füllte. Chirurgische Wunden wurden mit beschichtetem VICRYL-Nahtmaterial (J392H, Ethicon) verschlossen und die Tiere erhielten Buprenorphin SR (BupSR-LAB, ZooPharm, 20 mg kg–1 subkutan im Nacken) als Analgetikum. Die Tiere erholten sich für mindestens zwei Wochen zur Verhaltensanalyse bzw. vier Wochen zur histologischen Analyse.

Die Mäuse wurden anästhesiert (200 mg kg−1 Avertin, intraperitoneale Injektion), und die Tiefe der Anästhesie wurde während des gesamten Eingriffs durch das Fehlen einer Zehenklemmreaktion sichergestellt. Die NJP-Ganglien wurden chirurgisch freigelegt, der Nervus glossopharyngeus wurde identifiziert und unmittelbar neben den Ganglien mit einer Mikroschere durchtrennt. Scheinoperationen umfassten die Freilegung der NJP-Ganglien ohne Nervendurchtrennung. Chirurgische Wunden wurden mit beschichtetem VICRYL-Nahtmaterial (J392H, Ethicon) verschlossen und die Tiere erhielten 20 mg kg−1 Buprenorphin SR (BupSR-LAB, ZooPharm, subkutan im Nacken) als Analgetikum. Die Tiere erholten sich vor der Verhaltensanalyse mindestens zwei Wochen lang.

Immunhistochemie und Analyse der nativen Gewebefluoreszenz wurden nach intrakardialer Perfusion von Fixiermittel (10 ml PBS, dann 10 ml 4 % Paraformaldehyd in PBS) durchgeführt. Für die Ganzkörper-DTR-Immunfärbung wurden NJP-Ganglien gesammelt und 1 Woche lang bei 37 °C permeabilisiert (11,5 g Glycin, 400 ml PBS mit 0,2 % Triton X-100, 100 ml DMSO). Anschließend wurden die Ganglien in Blockierungspuffer (5 % normales Eselserum, 017-000-121, Jackson in 0,05 % Tween-20/PBS) blockiert (1 Stunde, Raumtemperatur) und mit 1:200 inkubiert (über Nacht, 4 °C). Anti-DTR (HB-EGF, Ziege, AF259NA, Fisher Scientific) in Blockierungspuffer. Die Proben wurden gewaschen (4 × 10 Minuten, 0,05 % Tween-20 in PBS, Raumtemperatur) und mit Anti-Ziegen-Alexa-488-Lösung (Jackson Immunoresearch, 705-545-147, 1:500 Zoll) inkubiert (2 Stunden, Raumtemperatur). PBS mit 0,05 % Tween-20). Die Gewebe wurden erneut gewaschen (4 × 10 Minuten, 0,05 % Tween-20 in PBS, Raumtemperatur), auf Objektträger (Fisher Scientific) aufgezogen (Fluoromount G-Medium, SouthernBiotech) und unter Verwendung eines konfokalen Leica SP5 II-Mikroskops sichtbar gemacht und mit analysiert BildJ (1,53q). Für die Cyclooxygenase-2-Immunfärbung wurde Nasopharynxgewebe kryogeschnitten (15 μm), mit Blockierungslösung (5 % normales Eselserum, PBS mit 0,01 % Triton X-100) blockiert (1 Stunde, Raumtemperatur) und inkubiert (über Nacht, 4 °C). C) mit Anti-COX2-Antikörper (Kaninchen, ab179800, Abcam, 1:500 in PBS mit 0,01 % Triton X-100). Die Schnitte wurden gewaschen (3 × 10 Minuten, Raumtemperatur, PBS mit 0,01 % Triton in PBS mit 0,01 % Triton X-100). Die Schnitte wurden erneut gewaschen (3 × 10 Minuten, Raumtemperatur, PBS mit 0,01 % Triton X-100), mit Fluoromount G-Medium montiert und unter Verwendung eines konfokalen Leica SP5 II-Mikroskops sichtbar gemacht. Um Hirnstammaxone sichtbar zu machen, wurden Hirnstamm-Kryoschnitte (20 μm) von AAV-injizierten Mäusen erhalten und wie oben für die Cyclooxygenase-2-Immunfärbung in Nasopharynxgewebe beschrieben verarbeitet, mit der Ausnahme, dass es sich bei den Antikörpern um 1:1.000 Anti-GFP (Huhn, GFP-1020, Aves Labs), 1:1.000 Anti-RFP (Kaninchen, 600-401-379, Rockland), Anti-Huhn Alexa 647 (Jackson Immunoresearch, 703-605-155, 1:300) und Anti-Kaninchen Cy3 (Jackson Immunoresearch, 111). -165-144, 1:300). Um Axone im Nasopharynx sichtbar zu machen, wurden fixierte nasopharyngeale (15 μm) Schnitte wie oben für die Cyclooxygenase-2-Immunfärbung gefärbt, jedoch mit Anti-RFP-Primärantikörper, gefolgt von Anti-Kaninchen-Cy3-Sekundärantikörper. Für die Innervation des GABRA1-Neurons in den Trachealis und die unteren Schlundschnürmuskeln wurden Gewebe frisch entnommen, entlang der ventralen Achse zur Sichtbarmachung im offenen Buch geschnitten und fixiert (4 % Paraformaldehyd/PBS, entweder 1 Stunde, Raumtemperatur oder über Nacht, 4 °C). und für tdTomato wie oben für die tdTomato-Visualisierung im Nasopharynx gefärbt, mit der Ausnahme, dass die primäre Antikörperinkubation (36 h, 4 °C) und die anschließenden Waschvorgänge (3 × 12 h, 4 °C) länger waren. Zur Visualisierung der alkalischen Phosphatase wurden die Tiere mit PBS perfundiert und die Gewebe gesammelt, fixiert (4 % Paraformaldehyd, 1 Stunde, Raumtemperatur) und in kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Gewebe in alkalischem Phosphatasepuffer (0,1 M Tris HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,1 % Tween-20, 5 mM Levamisol) inkubiert (70 °C, 2 h) und zweimal in alkalischem Phosphatasepuffer gewaschen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde mit NCT/BCIP-Lösung (34042, ThermoFisher Scientific) gemäß den Protokollen des Herstellers sichtbar gemacht. Gefärbte Proben wurden nachfixiert (4 % Paraformaldehyd, über Nacht, 4 °C), durch eine Reihe von Ethanolwäschen dehydriert und mit einer 1:2-Mischung aus Benzylalkohol (Sigma-Aldrich 402834-500ML) und Benzylbenzoat (Sigma) geklärt -Aldrich B6630-1L). Das Gewebe wurde dann zur Visualisierung im offenen Buch entlang der ventralen Achse geschnitten. Whole-Mount-Färbungen wurden mikroskopisch mit einem AxioZoom (Zeiss) erfasst und mit ImageJ (1,53q) analysiert.

DNA-basierte Hybridisierungskettenreaktions-Sonden (HCR) gegen Ptger3 (Chargen-Nr. PRH698) und Phox2b (Chargen-Nr. PRF341) wurden von Molecular Instruments erworben. Hybridisierungslösung (30 % Formamid, 5 × SSC, 9 mM Zitronensäure (pH 6), 0,1 % Tween-20, 50 μg ml−1 Heparin, 1 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat), Sondenwaschpuffer (30 % Formamid, 5× SSC, 9 mM Zitronensäure pH 6,0, 0,1 % Tween-20, 50 μg ml−1 Heparin), Amplifikationspuffer (5× SSC, 0,1 % Tween-20, 10 % Dextransulfat) und Fluorophor-markiert HCR-Verstärker wurden von Molecular Instruments gekauft. NJP-Ganglien wurden frisch gesammelt, im OCT (Sakura Finetek) montiert und kryogeschnitten (10 μm). Das Gewebe wurde nachfixiert (4 % PFA, PBS, Raumtemperatur, 20 Min.), gewaschen (3 × 10 Min., PBS, Raumtemperatur), mit 1 % Wasserstoffperoxid (PBS, Raumtemperatur, 20 Min.) behandelt und inkubiert mit Ptger3- und Phox2b-HCR-Sonden (0,4 pmol, Hybridisierungspuffer in einer befeuchteten Kammer, 37 °C, über Nacht). Anschließend wurde das Gewebe mit (1) 3:1-Sondenwaschpuffer: 5× SSCT (5× SSC, 0,1 % Tween-20), (2) 1:1-Sondenwaschpuffer: 5× gewaschen (15 Min., 37 °C). SSCT, (3) 1:3 Sondenwaschpuffer: 5× SSCT und (4) 5× SSCT. Das Gewebe wurde dann mit Amplifikationspuffer (30 Minuten, Raumtemperatur) und dann mit fluoreszierenden HCR-Verstärkern (6 pmol, Alexa594 für Ptger3-Sonde und Alexa 488 für Phox2b-Sonde) in Amplifikationspuffer (befeuchtete Kammer, Raumtemperatur, über Nacht) inkubiert. Anschließend wurde das Gewebe gewaschen (5 × SSCT, 2 × 30 Min., 1 × 5 Min., Raumtemperatur), in Fluoromount G-Medium montiert und mittels konfokaler Mikroskopie (Leica SP5 II) sichtbar gemacht.

Alle UMAP-Diagramme in diesem Manuskript wurden aus veröffentlichten Einzelzell-Transkriptomdaten (GEO-Zugangs-ID: GSE145216)22 mit Seurat (4.1.0) und R Studio (4.1.2) erstellt.

Die Konzentrationen von Maus-Ptger3, Gapdh-Transkript und dem Influenzavirus-Nukleoprotein (NP) wurden in cDNA gemessen, die aus Hypothalamus, NJP-Ganglien, Nasenspülung (für die Analyse der oberen Atemwege) und/oder BALF (für die Analyse der unteren Atemwege) gewonnen wurde. BALF wurde durch chirurgische Öffnung des Halses und Einführung eines 21G-Katheters in die Luftröhre gewonnen. Insgesamt wurden 3 × 1 ml PBS langsam in die Lunge injiziert, dann wurde die Lösung vorsichtig zurück in die Spritze abgesaugt und gesammelt. Das gesammelte BALF wurde zentrifugiert (7 Min., 400 g, 4 °C) und die Überstände wurden bis zur Analyse gelagert (–80 °C). Die Nasenspülung wurde durchgeführt, indem eine Nadel (26G) in einem Winkel zur Nase in die obere Luftröhre eingeführt wurde. Steriles PBS (1 ml) wurde über eine Kanülenspritze (PE20-Polyethylenkanüle, Innendurchmesser 0,38 mm) durch die Nadel verabreicht und nach dem Ausstoßen aus der Nase gesammelt. RNA wurde gesammelt und cDNA aus BALF, Nasenspülflüssigkeit und homogenisiertem Gewebe unter Verwendung von Trizol (15596026, ThermoFisher) und dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (4368813, ThermoFisher) gemäß den Protokollen des Herstellers synthetisiert. Die qPCR-Analyse wurde an cDNA unter Verwendung genspezifischer Primer, PowerTrack SYBR Green Master Mix (A46012, ThermoFisher) auf dem QuantStudio 7 qPCR-Instrument (ThermoFisher) durchgeführt. Gapdh-Primer waren GGGTGTGAACCACGAGAAATATG und TGTGAGGGAGATGCTCAGTGTTG; Ptger3-Primer waren CAACCTTTTCTTCGCCTCTG und TTTCTGCTTCTCCGTGTGTG; und Influenzavirus-Nukleoprotein-Primer waren GACGATGCAACGGCTGGTCTG und ACCATTGTTCCAACTCCTTT. Die Expressionsniveaus von Ptger3 und Nukleoprotein wurden auf Gapdh-Niveaus normalisiert. Die Normalisierung erfolgte mit der 2–ΔCT-Methode für erweiterte Daten, Abb. 4a, und der 2–ΔΔCT-Methode53 für erweiterte Daten, Abb. 9b, mit zusätzlicher Normalisierung unter Verwendung von Werten nicht infizierter Kontrollen.

Mäuse wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion mit dem Influenza-A-Virus eingeschläfert. Vollblut wurde durch Herzpunktion unter Verwendung einer mit 0,5 M EDTA beschichteten Nadel und Spritze gesammelt und sofort mit 0,5 M EDTA (50 μl) gemischt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation (3.000 U/min, 10 min, 4 °C) isoliert und der Überstand bis zur ELISA-Analyse gelagert (–80 °C). BALF wurde wie oben beschrieben gesammelt. Die PGE2- und Zytokinspiegel wurden im Plasma und/oder BALF mittels ELISA (R&D Systems, PGE2: KGE004B, TNF: DY410-5, IFNγ: DY485-05, IL-6: DY406-05) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

NJP-Ganglien wurden akut aus Gabra1-IRES-cre gesammelt; lsl-tdTomato-Mäuse und inkubiert (37 °C, 90 min, mit Rotation) in Dissoziationslösung (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit Liberase (55 mg ml−1, Roche, 05401135001), DNase (0,004 %, Worthington, LS002007). )). Die Zellen wurden dann pelletiert (3 Min., 300 g, 4 °C) und in 0,2 % Ovomucoid, 0,004 % DNase, DMEM, 200 μl resuspendiert. Mit einer P200-Pipette wurden die Zellen mindestens zehnmal verrieben, bis keine Klumpen mehr sichtbar waren, durch ein Zellsieb mit 40 μm Maschenweite filtriert und erneut pelletiert (3 Min., 300 g, 4 °C). Die Zellen wurden dann in Kulturmedium resuspendiert, das 5 μM Calbryte 520 AM (20651, AAT Bioquest) enthielt; Kulturmedium enthält 1× B27 (Gibco, 17504044), 1× N2 (Gibco, 17502048), 1× Penicillin und Streptomycin (Gibco, 15140122) in Neurobasal-Medien ohne Phenolrot (Gibco, 12348017). Die resuspendierten Zellen wurden dann auf mit Laminin beschichtetes Deckglas ausplattiert und in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert (37 °C, mindestens 30 Minuten vor der Bildgebung). Das Deckglas wurde dann in eine Kammer mit Einlass- und Auslassperfusion (Warner Instruments, RC-24N) mit kontinuierlichem Fluss von Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) überführt. Die Calciumreaktionen wurden dann durch Perfusion von Prostaglandin E2 (1 μM in HBSS, 2 Minuten) und KCl (150 mM, am Ende des Laufs) abgebildet (488 nm). GABRA1-positive Neuronen wurden durch tdTomato-Fluoreszenz (568 nm) identifiziert. Zellen wurden als reaktionsfähig identifiziert, wenn die mittlere Calbryte 520 AM-Fluoreszenz während des Stimulationszeitraums drei Standardabweichungen über dem Basismittelwert überschritt.

Die Faserphotometrie von AGRP-Neuronen wurde wie beschrieben54 mit PGE2 (intraperitoneale Injektion, 0,5 mg kg−1) oder PBS, das während einer kurzen manuellen Fixierung akut injiziert wurde, unter Verwendung der Synapses-Software (Build: 94-42329P, Tucker-Davis Technology) durchgeführt. Die Daten wurden mit Matlab (R2020a) analysiert.

Die Daten in den Diagrammen werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, wobei alle Stichprobengrößen und P-Werte in den Legenden der Abbildungen angegeben sind. Die statistische Analyse für Verhaltensexperimente umfasste die Mittelung der täglichen Änderungen der angegebenen Parameter pro Maus (Tage 1–10 nach der Infektion oder bis zum Überleben). Die statistische Signifikanz wurde mit der Software Prism 8.4.3 (GraphPad) berechnet und umfasste statistische Tests, die in Abbildungslegenden beschrieben sind. Die Probit-Analyse in Extended Data Abb. 5b wurde mit SPSS, 21 (IBM) durchgeführt. Die Stichprobengrößen wurden auf der Grundlage früherer Fachkenntnisse und Veröffentlichungen in unserem Fachgebiet26,55 ausgewählt und sind in den Legenden zu den Abbildungen offengelegt. Die Tiergruppen wurden nach dem Zufallsprinzip eingeteilt und die Kontrolltiere altersentsprechend den Versuchstieren zugeordnet. Derselbe Forscher führte die Genotypisierung und Analyse der Krankheitsreaktionen durch, sodass die Daten nicht blind für den Genotyp oder die Versuchsgruppe generiert wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Als Quelldaten werden alle Daten bereitgestellt, die zur Generierung der Zahlen verwendet werden, einschließlich der Verhaltensdatenpunkte jeder einzelnen Maus. Alle Reagenzien, die möglicherweise nicht im Handel erhältlich sind, einschließlich bestimmter transgener Mäuse und AAVs, werden auf begründete Anfrage frei verfügbar gemacht. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken C. Saper für Ptger3flox-Mäuse und Kommentare zum Manuskript. Cartoons wurden mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH (DP1 AT009497 und R01 HL132255) und der Chan Zuckerberg Initiative an SDL, ein Banting Postdoctoral Fellowship an N.-RB und ein Harvard Medical School Goldberg Fellowship an NHSLP unterstützt. Er war ein Warren Alperts Distinguished Scholar und SDL ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute.

Sarah L. Prescott

Aktuelle Adresse: Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Howard Hughes Medical Institute, Abteilung für Zellbiologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Na-Ryum Bin, Sarah L. Prescott, Nao Horio, Yandan Wang und Stephen D. Liberles

Abteilung für Immunologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Isaac M. Chiu

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Von N.-RB, SLP, NH, IMC und SDL konzipierte Experimente. N.-RB, NH, SLP und YW führten Experimente durch. N.-RB, SLP, NH, IMC und SDL analysierten Daten. N.-RB und SDL haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Stephen D. Liberles.

SDL ist ein Berater für Kallyope, Inc. Die anderen Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Nature dankt Alice McGovern, Ruslan Medzhitov und Kevin Tracey für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: Bei der statistischen Analyse von Verhaltensexperimenten wurden die täglichen Änderungen der pro Maus angegebenen Parameter (Tage 1–10 nach der Infektion oder bis zum Überleben) gemittelt, wie hier in Balkendiagrammen dargestellt. Die statistischen Werte sind identisch mit denen in Abb. 1a. b: Die PGE2-Spiegel im Plasma (links, Mitte) und BALF (rechts) wurden per ELISA zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber dem Influenza-A-Virus (rot, blau) oder der Vehikelkontrolle (schwarz) gemessen. Einige virusinfizierte Mäuse (blau) erhielten ab 3 Tagen vor der Infektion zusätzlich ad libitum Zugang zu Ibuprofen (1 mg/ml) im Trinkwasser (links) oder erhielten täglich Aspirin (IP, 20 mg/kg), Mittelwert ± sem, n: 3 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest mit Vergleichen zwischen roten und schwarzen Kurven (rote Sterne) oder roten und blauen Kurven (blaue Sterne). p-Werte in b sind für alle angegebenen Sterne <0,0001.

Quelldaten

a, Nahrungsaufnahme durch nüchterne Mäuse, denen PGE2 (links: IP, rechts: intranasal) in den angegebenen Dosen (mg/kg) verabreicht wurde und denen nach Belieben Zugang zu Nahrung gewährt wurde (1 Stunde), Mittelwert ± Standardabweichung, n: 9 (links) Mäuse pro Gruppe, 28 (Fahrzeug), 10 (0,0625, 0,125, 0,25), 20 (0,5) in (rechts), ***p < 0,0005, **p < 0,005, *p < 0,05, ns: nicht signifikant von Zweifaktorielle ANOVA Mehrfachvergleichstest von Tukey. b, Nahrungsaufnahme durch nüchterne Mäuse, denen der EP3-Rezeptoragonist Sulproston (links: IP, rechts: intranasal) in den angegebenen Dosen (mg/kg) verabreicht wurde und denen ad libitum Zugang zu Nahrung gegeben wurde (1 Stunde), Mittelwert ± Standardabweichung, n: 8 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005, *p < 0,05 durch Zwei-Wege-ANOVA Tukey-Mehrfachvergleichstest (links) oder zweiseitiger ungepaarter t-Test (rechts). c: Die GCaMP6s-Fluoreszenz (ΔF/F) wurde in AGRP-Neuronen des bogenförmigen Kerns durch Faserphotometrie vor und nach IP-Injektion von PGE2 (0,5 mg/kg in PBS) oder Vehikel allein (PBS) gemessen. (oben) Die Antworten werden als Mittelwert der in 10-Minuten-Zeitintervallen durchgeführten Messungen dargestellt (10 bezieht sich beispielsweise auf den Mittelwert der zwischen 0 und 10 Minuten durchgeführten Messungen), Mittelwert ± Standardabweichung, n: 12 Mäuse pro Gruppe, ** p < 0,01, ***p < 0,001 durch Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest, (unten) repräsentative Aufzeichnungsspuren mit rotem Balken, der den Zeitpunkt der Injektion anzeigt. p-Werte von links nach rechts in a: IP: <0,0001, 0,0005, <0,0001, intranasal: <0,0001, 0,0455, 0,0008, 0,6630; b, IP: <0,0001, 0,0312, 0,0187, intranasal: <0,0001; c: <0,0001, <0,0001, 0,0045.

Quelldaten

a, Kernkörpertemperatur in flox-Ptger3 und Gabra1-ires-Cre; flox-Ptger3-Mäuse wurden täglich nach Verabreichung von Influenzavirus (rot, blau) oder Kochsalzlösung (schwarz) mit einer rektalen Sonde (links) oder Radiotelemetrie (rechts) gemessen, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 6 (links) und 3 (rechts). Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch einfaktorielle ANOVA Dunnetts Mehrfachvergleichstest (links); ***p < 0,0005 durch zweiseitigen ungepaarten t-Test für rechts, wie in Abb. 1 für Verhaltens-/Physiologieanalysen (rechts), Vergleiche zwischen roten und schwarzen Kurven (rote Sterne) oder zwischen roten und blauen Kurven (blaue Sterne) detailliert beschrieben ). Für die Daten auf der rechten Seite starben zwei von drei Kontroll-flox-Ptger3-Mäusen am 5. Tag, daher werden nachfolgende Daten als gestrichelte Linie dargestellt und die statistische Analyse wurde nur für die Daten vom 1. bis 4. Tag durchgeführt. b: Den Mäusen wurden während des gesamten Paradigmas täglich Injektionen von Aspirin (IP, 20 mg/kg), rot oder Vehikel allein (schwarz) verabreicht. Nach drei Tagen wurden die Mäuse mit dem Influenza-A-Virus infiziert und anschließend wie angegeben überwacht, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 6 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch zweiseitigen ungepaarten t-Test, wie in Abb. 1 detailliert beschrieben, auf Verhalten /physiologische Analyse, *p < 0,05 durch einen Log-Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse. p-Werte in a, links: Rot <0,0001, Blau 0,0003, rechts: <0,0001; b, von links nach rechts: <0,0001, <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0243.

Quelldaten

a, qPCR-Analyse der Ptger3-Expression im Hypothalamus (links) oder NJP-Ganglien (rechts) von flox-Ptger3 (weiß), Nestin-Cre; flox-Ptger3 (rot) und Phox2b-Cre; flox-Ptger3 (blau) Mäuse. Phox2b-Cre-Mäuse zeigen eine Cre-Expression in nodose und petrosalen, aber nicht in jugulären Neuronen56. Ptger3-Transkriptniveaus wurden nach Normalisierung auf Gapdh-Expressionsniveaus exprimiert, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 6 Mäuse für flox-Ptger3 und 3 für andere Gruppen, ***p < 0,0005, ns: nicht signifikant durch einseitigen ANOVA-Dunnett-Mehrfachvergleichstest . b: flox-Ptger3-Kontrollmäuse wurden mit (rechts) oder ohne (links) Tamoxifen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen (IP, 70 mg/kg) behandelt, wie es für Advillin-CreER durchgeführt wurde; flox-Ptger3-Mäuse. Mindestens eine Woche später wurden die Mäuse entweder dem Influenza-A-Virus (rot) oder Kochsalzlösung (schwarz) ausgesetzt und wie angegeben überwacht, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 6 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch zweischwänzige ungepaarte t -Test wie in Abb. 1 beschrieben für die Verhaltens-/Physiologieanalyse, *p < 0,05 durch einen Log-Rank-Test (Mantel-Cox) für die Überlebensanalyse. p-Werte in a, links: <0,0001, 0,7506, rechts: 0,8680, <0,0001; b von oben nach unten, links: <0,0001, <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0179, rechts: <0,0001, 0,0003, <0,0001, 0,0179.

Quelldaten

a: Wildtyp-Mäuse wurden mit dem Influenza-A-Virus in den angegebenen Titern infiziert und das anschließende Überleben täglich überwacht, n: 10 pro Gruppe. b, eine Dosis-Wirkungs-Kurve des Virustiters (log10) vs. Überlebensraten mit nichtlinearer Anpassung von R2 = 0,926. c, Eine Tabelle mit den Überlebensraten bei verschiedenen Influenza-A-Virus-Impfdosen, wobei die geschätzte prozentuale Letalität durch Probit-Regressionsanalyse (Statistical Product and Service Solutions) ermittelt wurde. d, Advillin-CreER; Flox-Ptger3-Mäuse (rot, zuvor Tamoxifen injiziert) oder Flox-Ptger3-Mäuse (schwarz) wurden mit subletalen Dosen des Influenza-A-Virus infiziert (oben: 105 EID50 oder LD21, unten: 105,5 EID50 oder LD39) und wie angegeben täglich überwacht , Mittelwert ± Standardabweichung, n: 6 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch zweiseitigen ungepaarten t-Test, wie in Abb. 1 für Verhaltens-/Physiologieanalyse detailliert beschrieben, *p < 0,05, ns: nicht signifikant durch ein Protokoll -Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse. p-Werte von links nach rechts in d, oben: <0,0001, <0,0001, 0,0002, <0,0001, 0,4788; unten: <0,0001, <0,0001, 0,0004, 0,0004, 0,0078.

Quelldaten

a, Cartoon, der die bilaterale Injektion von AAV-Cre in NJP-Ganglien von Flox-Ptger3-Mäusen zeigt. b, Den NJP-Ganglien von Flox-Ptger3-Mäusen wurde bilateral AAV-Cre (unten) oder Kochsalzlösung (Kontrolle, oben) injiziert, und Kryoschnitte der NJP-Ganglien wurden anschließend durch zweifarbige RNA-In-situ-Hybridisierung untersucht, um Phox2b (grün) nachzuweisen. und Ptger3 (rot), Maßstabsbalken: 100 μm. Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Teil a erstellt mit BioRender.com.

Phox2b-Cre; Flox-Ptger3-Mäuse (rot) oder Flox-Ptger3-Mäuse (schwarz) wurden mit subletalen Dosen des Influenza-A-Virus infiziert (oben: 105 EID50 oder LD21, unten: 105,5 EID50 oder LD39) und täglich wie angegeben überwacht, Mittelwert ± Standardabweichung, n : 6 Mäuse pro Gruppe, **p < 0,005, ***p < 0,0005 durch zweiseitigen ungepaarten t-Test, wie in Abb. 1 für Verhaltens-/Physiologieanalyse detailliert beschrieben, *p < 0,05, ns: nicht signifikant durch ein Protokoll -Rank-Test (Mantel-Cox) zur Überlebensanalyse. p-Werte von oben nach unten links: <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0002, 0,4524; rechts: <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0002, 0,0155.

Quelldaten

a, Änderungen der Wasseraufnahme nach einer Grippeinfektion bei Mäusen aus Abb. 3, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 8 (Piezo2-ires-Cre), 6–8 (Phox2b-Cre; 8 Kontrolle und 6 Phox2b-Cre), 6 (Pdyn -ires-Cre), 6 (Oxtr-ires-Cre) und 10 (Gabra1-ires-Cre) Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005, ns: nicht signifikant durch zweiseitigen ungepaarten t-Test, wie in beschrieben Abb. 1 zur Verhaltens-/Physiologieanalyse. b: Ein UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection), abgeleitet aus veröffentlichten Einzelzell-Transkriptomdaten von sensorischen Vagus- und Glossopharyngealganglien22, was auf die Trpv1-Expression hinweist (rote Schattierung: natürliche logarithmische Skala). c, Trpv1-ires-Cre; flox-Ptger3-Mäuse (blau) oder flox-Ptger3-Mäuse (schwarz) wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert und wie angegeben täglich überwacht, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 6 Mäuse pro Gruppe, ns: nicht signifikant durch zweiseitigen ungepaarten t-Test wie in Abb. 1 für die Verhaltens-/Physiologieanalyse detailliert beschrieben, ns: nicht signifikant gemäß einem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) für die Überlebensanalyse. p-Werte von oben nach unten in a: 0,9101, 0,0004, 0,0534, 0,9544, <0,0001 und c: 0,2485, 0,0705, 0,0888, 0,1801, 0,8412.

Quelldaten

a, PGE2-Spiegel im Plasma (links) und BALF (rechts) wurden durch ELISA bei Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Exposition gegenüber dem Influenza-A-Virus oder der PBS-Kontrolle gemessen, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 5 Mäuse pro Gruppe, ns: nicht signifikant durch Zwei-Wege-ANOVA, einschließlich der Analyse von mit Influenzaviren infizierten Gruppen. b, qPCR-Analyse der Transkriptspiegel viraler Nukleoproteine ​​(NP) in den oberen und unteren Atemwegen von flox-Ptger3 und Gabra1-ires-Cre; flox-Ptger3-Mäuse nach Influenzavirus-Infektion, normalisiert auf Gapdh und nicht infizierte Kontrollen, Mittelwert ± Standardabweichung, n: 5 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest mit Vergleichen zwischen Rot und blaue Kurven (blaue Sterne) oder schwarze und grüne Kurven (grüne Sterne). c: Die Konzentrationen von IFNγ, TNFα und IL-6 in BALF wurden durch ELISA zu den angegebenen Zeitpunkten nach Exposition gegenüber dem Influenza-A-Virus in flox-Ptger3 (schwarz) oder Gabra1-ires-Cre gemessen; flox-Ptger3 (rot), Mittelwert ± Standardabweichung, n: 3 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,0005 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest mit Vergleichen zwischen roten und schwarzen Kurven (rote Sterne). p-Werte in a: 0,1591, 0,0662, b und c: <0,0001 für alle angegebenen Sterne.

Quelldaten

a: Native GFP-Fluoreszenzsignale in Wholemount-Präparaten von NJP-Ganglien aus Gabra1-ires-cre; lsl-L10 GFP, Maßstabsbalken: 200 μm. b: Den NJP-Ganglien von Gabra1-ires-Cre-Mäusen wurde beidseitig Cre-abhängiges AAV-flex-AP oder AAV-flex-tdTomato injiziert, und Axone wurden in fixierten Wholemount-Gewebepräparaten unter Verwendung eines kolorimetrischen alkalischen Phosphatasesubstrats (obere zwei Reihen, linke Bilder in den unteren beiden Reihen) oder tdTomato-Immunfärbung (rechte zwei Bilder in den unteren beiden Reihen). Maßstabsbalken (von links nach rechts), obere Reihe: 500, 1000, 1000 (Einschub: 250) μm; 2. Reihe: 500, 1000, 500 μm; 3. Reihe: 200, 50 μm; untere Reihe: 200, 100 μm. Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit GFP und tdTomato und zwei unabhängige Experimente mit alkalischer Phosphatase.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bin, NR., Prescott, SL, Horio, N. et al. Ein sensorischer Weg von den Atemwegen zum Gehirn vermittelt grippebedingte Krankheiten. Natur 615, 660–667 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

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Eingegangen: 13. April 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 08. März 2023

Ausgabedatum: 23. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

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