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Oct 20, 2023

Polydaktylie

npj Regenerative Medizin

npj Regenerative Medicine Band 7, Artikelnummer: 71 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Allogene Zelltherapien sind bei der Behandlung von Arthrose des Knies (OAK) nicht vollständig wirksam. Wir haben kürzlich berichtet, dass die Transplantation autologer Chondrozyten-Zellblätter zusammen mit der Open-Wedge-Osteotomie der hohen Tibia die Reparatur von hyalinem Knorpel beim Menschen förderte. Hier beschreiben wir unsere regenerative Therapie für OAK unter Verwendung von aus Polydaktylie abgeleiteten allogenen Chondrozyten-Zellblättern (PD-Blättern) und temperaturempfindlichen Kultureinsätzen. Zehn Patienten mit OAK und Knorpeldefekten, arthroskopisch als Outerbridge-Grad III oder IV eingestuft, erhielten die Therapie. Die Viskoelastizität und Dicke des Knorpels wurden vor und nach der Transplantation beurteilt. Arthroskopische Biopsien, die 12 Monate nach der Transplantation entnommen wurden, wurden histologisch analysiert. Die Genexpression wurde analysiert, um die PD-Blätter auszuwerten. In dieser kleinen anfänglichen Längsschnittserie war die PD-Blatttransplantation bei der Behandlung von OAK wirksam, was durch Veränderungen der Knorpeleigenschaften angezeigt wurde. Genmarkersätze in PD-Blättern können die Ergebnisse nach der Therapie vorhersagen und Marker für die Auswahl von Spenderzellen liefern. Diese kombinierte Operation könnte eine ideale regenerative Therapie mit krankheitsmodifizierender Wirkung bei OAK-Patienten sein.

Arthrose (OA) ist die häufigste Ursache für Mobilitätsverlust und weltweit die häufigste Form von Muskel-Skelett-Erkrankungen1,2. OA wirkt sich negativ auf die Lebensqualität, die Arbeitsproduktivität und die Kosten der Gesundheitsversorgung aus. Wir haben kürzlich über unsere klinische Forschung zu den Auswirkungen einer kombinierten Operation und einer autologen Chondrozyten-Zellblatttransplantation bei OA3 berichtet. Während der Behandlungs- und Nachbeobachtungszeit wurden keine schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse im Zusammenhang mit der kombinierten Operation beobachtet und eine hervorragende Regeneration der Gelenkoberfläche mit hyalinem Knorpel wurde in der arthroskopischen Second-Look-Operation bestätigt. Alle Biopsieproben von regeneriertem Knorpel zeigten eine starke Färbung für Safranin O und eine Expression von Typ-II-Kollagen (COL2). Der Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS) und der Lysholm Knee Score (LKS) verbesserten sich nach der Operation deutlich, und diese Verbesserungen hielten über mehr als drei Jahre an. Die autologe Zellblatttransplantation von Chondrozyten weist jedoch mehrere Einschränkungen auf. Beispielsweise ist vor der Transplantation eine arthroskopische Operation erforderlich, bei der Knorpel und Synovialgewebe entnommen werden müssen. Die geernteten Zellen und ihre Eigenschaften unterscheiden sich von Individuum zu Individuum und werden gelegentlich in unzureichender Anzahl geerntet, um Zellschichten herzustellen. Außerdem werden häufig Chromosomenanomalien in Zellen gefunden, die von älteren Patienten mit Arthrose des Knies (OAK) gewonnen wurden. Angesichts dieser Einschränkungen und der Tatsache, dass Gelenkknorpel immuntolerant ist, betrachten wir die Verwendung allogener Zellschichten als eine praktikable Option, um die Notwendigkeit einer Gewebeentnahme zu vermeiden.

Allogene mesenchymale Stammzellen (MSCs), aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen und Nabelschnurstammzellen werden häufig in klinischen Studien zur Behandlung von OAK verwendet. Bei den meisten dieser Methoden handelt es sich jedoch um Zelltherapien mittels intraartikulärer Injektion. Diese Therapien bewirken tendenziell eine vorübergehende Verbesserung der Symptome, nicht aber eine strukturelle Rekonstruktion oder die Produktion von nativem hyalinem Knorpel. Die jüngste Zunahme des Einsatzes zellbasierter Strategien zur Knorpelreparatur hat zu einem dringenden Bedarf an wirksamen und sicheren handelsüblichen Zellquellen geführt. Wir haben uns auf die Polydaktylie-Chirurgie konzentriert, um Gewebeproben als allogene Zellquellen zu gewinnen, und es ist uns gelungen, aus der Polydaktylie abgeleitete allogene Chondrozyten-Zellblätter (PD-Blätter) unter Verwendung temperaturempfindlicher Kultureinsätze herzustellen4,5. Kürzlich haben Kondo et al. berichteten über die präklinische Sicherheit und Wirksamkeit von aus Polydaktylie gewonnenen Chondrozytenschichten aus juvenilem Knorpel in vitro und in vivo unter Verwendung eines fokalen osteochondralen Defektmodells bei Ratten6. PD-Chondrozyten vermehren sich schnell, bilden eine Schichtstruktur mit einer ausreichenden extrazellulären Matrix und bilden Blätter, die leicht manipuliert werden können. Obwohl die Anzahl der herstellbaren autologen Chondrozytenschichten begrenzt ist4, können theoretisch mehr als 600 PD-Schichten aus Passage-2-Zellen (P2) und mehr als 3000 PD-Schichten aus P3-Zellen hergestellt werden. Hier beschreiben wir unseren Einsatz der PD-Sheet-Transplantation in Kombination mit einer hohen Tibia-Osteotomie (HTO) und schlagen vor, dass es sich um eine ideale Form der regenerativen Therapie für Patienten mit OAK handelt.

Wir haben eine Kombinationstherapie entwickelt (Abb. 1a), bei der auf die konventionelle chirurgische Behandlung von OAK, die in unserem Land von der staatlichen Krankenversicherung abgedeckt wird, die Entfernung von ungesundem Gewebe, die Stimulation des Knochenmarks und die Transplantation von Chondrozytenschichten folgten (die „ RMSC-Methode") zur Behandlung von Knorpeldefekten3. Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit der gesamten Behandlung zu bewerten, nicht jedoch die Zusatzeffekte jeder einzelnen Behandlung. HTO für Patienten mit OAK ist ein gelenkerhaltendes Verfahren, das weltweit Beachtung gefunden hat. Gelenkknorpel wird manchmal nach der Verbesserung der gesamten Beinausrichtung durch HTO regeneriert, dabei handelt es sich jedoch hauptsächlich um Faserknorpel, der andere Eigenschaften als hyaliner Knorpel aufweist7,8. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine PD-Sheet-Transplantation in Verbindung mit HTO die Regeneration von nativem Knorpel, wie z. B. hyalinem Knorpel, beschleunigen, die Symptome von OAK reduzieren und dazu beitragen kann, die biologischen Eigenschaften des Kniegelenks zu erhalten.

eine Kombination aus konventionellem chirurgischem Eingriff und Implantation von Chondrozytenschichten. Von Polydaktylie abgeleitete allogene Chondrozytenschichten (PD-Schichten) wurden aus Knorpelgewebe hergestellt, das bei Polydaktylie-Operationen gewonnen wurde. Im Zellverarbeitungszentrum wurden isolierte Chondrozyten einmal passagiert und bei –180 °C gelagert. Um PD-Blätter herzustellen, wurden die Zellen einmal aufgetaut und passagiert und dann auf temperaturempfindlichen Kultureinsätzen ausgesät. Die PD-Blätter wurden 14–16 Tage lang weiter kultiviert und transplantiert. OAK-Patienten wurden zunächst mit konventionellen chirurgischen Behandlungen (OWHTO) behandelt, gefolgt von der Entfernung von ungesundem Gewebe, der Knochenmarkstimulation und einer Chondrozytenblatttransplantation (RMSC-Methode). b Das Gesamtprotokoll für die klinische Studie. Die endgültige Entscheidung über die Aufnahme in die klinische Studie wurde im Rahmen der arthroskopischen Untersuchung getroffen. Bei Patienten, die die Einschlusskriterien erfüllten, wurde LIPA zur Beurteilung ihrer Knorpeldefekte eingesetzt. RMSC-Entfernung von ungesundem Gewebe, Markstimulation und Chondrozytenblatttransplantation, OWHTO-Open-Wedge-Osteotomie mit hoher Tibia, LIPA-Laser-induzierte Photoakustik, KOOS-Knieverletzungs- und Osteoarthritis-Outcome-Score, LKS-Lysholm-Knie-Score, MRT-Magnetresonanztomographie. c Das CONSORT-Flussdiagramm. CONSORT-Diagramm für eine einarmige, offene, unkontrollierte Vergleichsstudie (d. h. Einschreibung, Interventionszuordnung, Nachbeobachtung und Datenanalyse).

Temperaturempfindliche Kulturschalen oder -einsätze (CellSeed Inc., Tokio, Japan), über deren Verwendung erstmals Okano et al.9,10 berichteten, verfügen über eine spezielle intelligente Oberfläche. Mit diesen Einsätzen können Chondrozytenschichten hergestellt werden, indem die extrazelluläre Matrix aufrechterhalten und dann die Temperatur gesenkt wird, um die Schichten freizusetzen, ohne dass eine enzymatische Verdauung erforderlich ist.

Wir waren die ersten, die über die Anwendung geschichteter Chondrozytenschichten zur Gelenkknorpelreparatur berichteten11,12. Wir haben Beweise aus Tierversuchen vorgelegt, die auf das Potenzial dieser geschichteten Chondrozytenschichten bei der Behandlung von nichttraumatischer Arthritis bei Ratten13, einem Teildefekt im Gelenkknorpel von Kaninchen14 und osteochondralen Defekten im Knorpel von Ratten15,16, Kaninchen17,18,19 und Minischweinen20 hinweisen. Solche Mängel treten in der Regel bei Eichenholz auf. Wir haben auch die Wirkungsweise der geschichteten Chondrozytenschichten untersucht und vorgeschlagen, dass Chondrozytenschichten ihre anhaltende Regenerationswirkung im Gelenkknorpel durch die kontinuierliche Sekretion humoraler Faktoren wie Melanom-Hemmaktivität (MIA), transformierender Wachstumsfaktor β ( TGF-β) und Prostaglandin E2, die für die Knorpelregeneration wichtig sind21,22.

Zehn Patienten mit OAK- und Knorpeldefekten wurden in diese Studie aufgenommen und erhielten eine Therapie mit PD-Blättern. Ein strenges Bewertungsprotokoll (Abb. 1b) wurde entwickelt, um die Endpunkte Sicherheit und Wirksamkeit der Therapie zu bewerten und die klinischen und strukturellen Ergebnisse zu bewerten. Die Eigenschaften der transplantierten allogenen PD-Blätter wurden außerdem mithilfe einer Genexpressionsanalyse gründlich bewertet, um ihren potenziellen Nutzen für die Vorhersage der klinischen und strukturellen Ergebnisse der Therapie zu untersuchen. In dieser kleinen ersten Fallserie im Längsschnitt wollten wir feststellen, ob die Expression spezifischer Markergensätze in PD-Blättern potenzielle Marker für die Vorhersage der Ergebnisse dieser neuen regenerativen Therapie für OAK liefern könnte.

Abbildung 2 zeigt die Eigenschaften der in dieser Studie transplantierten PD-Blätter. Die PD-Platten können mit einer kreisförmigen weißen Trägermembran aus Polyvinylidendifluorid gehandhabt werden (Abb. 2a). Die mehrschichtigen Strukturen wurden durch histologische Färbung bestätigt (Abb. 2b). Die Immunfärbung zeigte, dass die Blätter stark Fibronektin (FN), COL1 und Aggrecan (ACAN) exprimierten. PD-Blätter zeigten fast keine COL2-Expression (Abb. 2b). Die Zellen in den PD-Schichten waren dedifferenziert und die Eigenschaften der Chondrozytenschichten unterschieden sich von denen des hyaliner Knorpels. Abbildung 2c–e zeigt die Verteilung der Eigenschaften der transplantierten PD-Blätter in Bezug auf Zellzahl, Lebensfähigkeit bzw. Dicke. Abbildung 2f zeigt die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse der dispergierten PD-Blätter. Fast alle Zellen aus PD-Blättern waren positiv für den Differenzierungscluster 81 (CD81) und die mesenchymalen Stammzellmarker CD90 (Thy-1), CD44 (Rezeptor für Hyaluronsäure) und CD105 (Endoglin). CD146 (Melanomzelladhäsionsmolekül)-positive und GD2 (Disialogangliosid GD2)-positive Zellen waren mit einer Häufigkeit von 20–70 % und CD49a (Integrin α1)-positive Zellen mit einer Häufigkeit von 5–25 % vorhanden. Fast alle Zellen waren negativ für die Blutlinienmarker CD31 (Plättchen-Endothelzelladhäsionsmolekül-1) und CD45 (Leukozyten-gemeinsames Antigen). Die Markerexpression ähnelte der von erwachsenen Knie-Chondrozytenblättern, die in einer früheren klinischen Studie mit autologen Zellen transplantiert wurden. Die Produktion des transformierenden Wachstumsfaktors β1 (TGF-β1) und zuvor identifizierter wirksamkeitsassoziierter Faktoren5, der Melanom-hemmenden Aktivität (MIA), des Dickkopf-WNT-Signalweg-Inhibitors 1 (DKK1), des endothelzellspezifischen Moleküls 1 (ESM1) und Gremlin 1 (GREM1) bestätigt durch Enzymimmunoassay (ELISA) (Abb. 2g). Die quantitative Polymerasekettenreaktionsanalyse (qPCR) der von den PD-Blättern exprimierten Gene ergab eine weitverbreitete Expression von Knorpel-bezogenen Genen von Interesse (Abb. 2h).

a PD-Blätter wurden mit einer kreisförmigen PVDF-Trägermembran gehandhabt. b Repräsentative Bilder des Querschnitts des PD-Blatts. Histologische Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (HE), immunhistochemische Färbung für Kollagen Typ I (COL1), Kollagen Typ II (COL2), Aggrecan (ACAN) und Fibronektin (FN). Maßstabsleiste; 50 μm. c–e Verteilung der transplantierten PD-Blattmerkmale von neun Chargen: Das Kästchen stellt den Interquartilbereich der Werte dar. Die Ober- und Unterseite der Whisker stellen die Maximal- und Minimalwerte dar. Die Linie innerhalb der Box stellt die Medianwerte dar. Zellzahl (c) und Zelllebensfähigkeit (d) wurden nach enzymatischer Verdauung einer Zellschicht bestimmt. Die Dicke der PD-Platte wurde anhand mikroskopischer Bilder von Querschnitten gemessen. f Durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenmarkern für die Zellen in den PD-Blättern. Die PD-Blätter wurden enzymatisch verdaut und durch einfarbige Färbung analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD des Prozentsatzes von Oberflächenmarker-exprimierenden Zellen aus neun Blattchargen ausgedrückt (ergänzende Abbildung 2). Die Zellen waren positiv für CD81, CD90, CD44 und CD105 und negativ für CD31 und CD45. Die Färbung von CD146, CD49a und GD2 unterschied sich zwischen den Chargen. g Konzentrationen humoraler Faktoren, die von PD-Blättern abgesondert werden. Jede Markierung weist auf viele Blätter hin. Einige Markierungen überschneiden sich. h Das Genexpressionsprofil der transplantierten Blätter wurde mithilfe von qPCR auf knorpelbezogene Gene analysiert und die Ergebnisse werden relativ zur Expression von GAPDH angegeben. Insgesamt wurden neun Chargen PD-Blätter aus kryokonservierten Zellen von drei Polydaktylie-Patientenspendern hergestellt. Drei Chargen stammten von Spender 1 und wurden zur Erstellung der Blätter 1-1, 1-2 und 1–3 in h verwendet. Vier Chargen stammten von Spender 2 und wurden zur Erstellung der Blätter 2-1, 2-2, 2-3 und 2–4 verwendet. Zwei Chargen stammten von Spender 3 und wurden zur Erstellung der Blätter 3-1 und 3-2 verwendet. Jede Charge wurde für einen Patienten verwendet, mit Ausnahme von Blatt 3-2, das zwei Patienten (Patienten 9 und 10) transplantiert wurde. Daten mit derselben Farbe stammten von derselben Charge von PD-Blättern in g, h.

Während der Nachbeobachtungszeit wurden keine schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse im Zusammenhang mit den kombinierten Operationen wie tiefe Infektionen oder Pseudarthrose beobachtet. Weitere unerwünschte Ereignisse wurden gemeldet und umfassten tiefe Venenthrombose bei einem Patienten, Schmerzen bei 10 Patienten, Leukozytose bei 10 Patienten und erhöhte C-reaktive Proteinspiegel bei 10 Patienten. Eine tiefe Venenthrombose konnte durch konservative Therapie geheilt werden. Es wurde angenommen, dass diese unerwünschten Ereignisse mit der Open-Wedge-High-Tibial-Osteotomie (OWHTO) in Zusammenhang standen. Wir glauben, dass es unwahrscheinlich ist, dass diese mit der Transplantation von PD-Blättern in Zusammenhang stehen.

Der LKS verbesserte sich signifikant von 40,1 ± 13,9 Punkten präoperativ auf 80,5 ± 15,7 Punkte bei der letzten Nachuntersuchung. Alle KOOS-Subskalen (Symptom, Schmerz, Funktion im täglichen Leben, Funktion in Sport und Freizeit sowie Lebensqualität) verbesserten sich ebenfalls deutlich (Abb. 3a, b und Ergänzungstabelle 1, 2).

Ein KOOS wurde verwendet, um die Auswirkungen auf kniebezogene Parameter zu bewerten. Die Patientendurchschnitte für die KOOS-Subskalen, Symptom, Schmerz, ADL und Lebensqualität verbesserten sich gegenüber dem Ausgangswert deutlich. *p < 0,05, **p < 0,01. ADL-Aktivitäten des täglichen Lebens, QOL-Lebensqualität. b Der Patientendurchschnitt für LKS verbesserte sich deutlich gegenüber dem Ausgangswert. Das Kästchen stellt den Interquartilbereich der Ergebnisse dar. Die Ober- und Unterseite der Whisker stellen die Höchst- und Mindestwerte dar, mit Ausnahme der Daten nach 12 Monaten, die den Ausreißer enthalten. Die Linie innerhalb der Box stellt den Medianwert dar. *p < 0,05, **p < 0,01. Mithilfe einer c–f-Korrelationsanalyse wurde ein Genmarkersatz ausgewählt, der die einzelnen Ergebnismaße vorhersagte. Das Streudiagramm zeigt die Korrelationen zwischen den Gen-Scores und dem KOOS-Schmerz nach 12 Monaten (c), LKS nach 12 Monaten (d) und OARSI (e) und ICRS II (f). Der Gen-Score wurde aus der Genexpression des prädiktiven Genmarkersatzes für KOOS-Schmerz (PTGS2, TGFB1, MIA und G0S2), des LKS (COL1A2, MATN2, SOX9 und TGFB1) und des histologischen OARSI-Scores (CCN2, COMP, ACKR4, ESM1 und GREM1) und ICRS II-Gesamtbewertung (COL2A1, COL27A1, ACKR4 und ESM1), wie im Abschnitt „Methoden“ (Ergänzungstabellen 4–7) beschrieben. Die jedem Symbol zugeordnete Nummer gibt den entsprechenden Patienten an. g Histologische Ergebnisse von Patientenbiopsien und Ergebnisse klinischer Bewertungen. C = Gelenkknorpel, B = subchondraler Knochen, gestrichelte Linie = Grenze zwischen Gelenkknorpelbereich und subchondralem Knochenbereich. 12 Monate nach der Operation wurden Biopsien des medialen Femurkondylus aus Bereichen mit regeneriertem Knorpel entnommen. Maßstabsbalken = 1 mm. Histologische Schnitte aller auf Safranin O gefärbten Patienten. Die Immunfärbung zeigte die Expression von Typ-II-Kollagen (COL2) bei allen Patienten.

Die Knorpeldefekte und -lokalisationen sind in Tabelle 1 beschrieben. Kurz gesagt betrug die mittlere Gesamtdefektfläche 15,9 cm2 bei einem Patienten und >20 cm2 bei vier Patienten. Zehn Patienten hatten Defekte des medialen Femurkondylus (MFC) (mittlere Fläche 10,7 cm2), sechs Patienten hatten Defekte des Trochlea (Tr) (mittlere Fläche 4,6 cm2) und fünf Patienten hatten Kissing-Defekte der Tibia (mittlere Fläche 4,0 cm2).

Der femorotibiale Winkel und der Prozentsatz der mechanischen Achse (%MA) veränderten sich signifikant von 179,4° ± 2,8° auf 168,9° ± 2,8° bzw. von 24,1 ± 10,8 auf 67,5 ± 9,2 von vor bis nach der Transplantation.

Die Magnetresonanztomographie (MRT) bestätigte die Regeneration des Knorpels in Bereichen, in denen präoperativ Knorpel fehlte (ergänzende Abbildung 1). Die Ergebnisse des Magnetic Resonance Observation of Cartilage Repair Tissue 2.0 (MOCART 2.0)-Scores verbesserten sich deutlich (Tabelle 1).

Die Ergebnisse der laserinduzierten photoakustischen (LIPA) Bewertung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die viskoelastischen Eigenschaften des regenerierten Knorpels werden als Verhältnis zu denen des normalen Knorpels im selben Gelenk ausgedrückt. Die Eigenschaften verbesserten sich nach der Transplantation und die mittlere Dicke des regenerierten Knorpels betrug 3,54 mm.

Alle Biopsien zeigten eine starke Färbung von Safranin O und eine Expression von COL2 (Abb. 3g). Obwohl der Grad der Regeneration von Patient zu Patient unterschiedlich war und einige Fälle ein Zeichen einer Degeneration darstellen, deuten diese Ergebnisse dennoch darauf hin, dass eine Regeneration des hyaliner Knorpels stattgefunden hat. Die Ergebnisse des histologischen Scores der Osteoarthritis Research Society International (OARSI), des Mankin-Scores und der Gesamtbewertung der International Cartilage Repair Society (ICRS II) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Qualität des regenerierten Knorpels war mit einem ICRS II-Durchschnitt sehr hoch Score von 80,8 (64–96, 0: faseriges Gewebe, 100: hyaliner Knorpel), wie in Tabelle 1 gezeigt, obwohl auch Faserknorpel vorhanden war.

Um PD-Blätter zu identifizieren, die bessere Ergebnisse förderten, wurden Genmarkersätze identifiziert, die die postoperativen klinischen und strukturellen Ergebnisse vorhersagen, basierend auf der Korrelationsanalyse zwischen dem Genexpressionsprofil und den Ergebnissen. Die Analysen wurden zuvor in der Studie zu autologen Zellblättern3 beschrieben. Potenzielle Markersätze wurden aus knorpelbezogenen Genen (Liste in Ergänzungstabelle 3) mit der höchsten Wahrscheinlichkeit des Auftretens in einer Matrix von 100 Sätzen von Pearson-Korrelationskoeffizienten unter Verwendung des Leave-Five-Out-Verfahrens ausgewählt.

Der Gen-Score wurde anhand der Genexpressionsdaten des Markersatzes berechnet, wie in Methoden (Ergänzungstabellen 4–7) beschrieben. Abbildung 3c–f zeigt die Streudiagramme, die die Gen-Scores der transplantierten PD-Blätter und die klinischen Ergebnisse für jeden einzelnen Fall angeben. Die Markersätze für jeden Ergebnisscore waren wie folgt: für KOOS (Abb. 3c) PTGS2, TGFB1, MIA und G0S2; für LKS (Abb. 3d) COL1A2, MATN2, SOX9 und TGFB1; und für den histologischen OARSI-Score (Abb. 3e) CCN2, COMP, ACKR4, ESM1 und GREM1; für die ICRS II-Gesamtbewertung (Abb. 3f) COL2A1, COL27A1, ACKR4 und ESM1.

Eine 51-jährige Frau unterzog sich wegen OAK des linken Knies einer PD-Sheet-Transplantation in Kombination mit OWHTO. Der Femorotibialwinkel und %MA änderten sich von 183° auf 167° bzw. 11,4 auf 68,9 (Abb. 4a). Subchondraler Knochen wurde großflächig im MFC (Abb. 4b) und im medialen Tibiaplateau (Abb. 4c) freigelegt. Nachdem wir LIPA zur Bewertung der viskoelastischen Eigenschaften des Restknorpels und des subchondralen Knochens verwendet hatten, führten wir eine Mikrofrakturierung (Abb. 4d) und eine Transplantation von PD-Blättern (Abb. 4e) durch. Ein Jahr nach der Transplantation wurde im MFC (Abb. 4f) und im medialen Tibiaplateau (Abb. 4g) regenerierter Knorpel beobachtet, der den Defektbereich vollständig bedeckte. Das präoperative MRT zeigte einen Knorpeldefekt in voller Dicke am MFC. Dieser Defektbereich schien mit PD-Blättern bedeckt zu sein und war nach 3 Monaten mit regenerativem Gewebe gefüllt, und das regenerative Gewebe war 12 Monate nach der Transplantation deutlich sichtbar und erhalten (Abb. 4h).

Röntgenaufnahmen (a), arthroskopische Bilder (b–g) und Magnetresonanztomographie (h). Eine präoperative Röntgenaufnahme des linken Knies bestätigte eine Varusdeformität und eine Verengung des medialen Gelenkraums. Eine Röntgenaufnahme 12 Monate postoperativ zeigte, dass die Ausrichtung nach der OWHTO erhalten blieb. 24 Monate nach der Operation (12 Monate nach Entfernung der Implantate) blieb die Ausrichtung erhalten und das Beta-Tricarciumphosphat-Transplantat wurde absorbiert. b, c Ein präoperativer Knorpeldefekt des medialen Femurkondylus und eine Kissing-Läsion des Tibiaplateaus führten zur Freilegung des subchondralen Knochens. d Intraoperative Bilder des medialen Femurkondylus nach Mikrofrakturierung. Die PD-Blätter wurden ohne Naht transplantiert. f, g Das Vorhandensein von regeneriertem Knorpel wurde bei der zweiten arthroskopischen Betrachtung (12 Monate nach der Operation) bestätigt. h Sagittale Ansicht des medialen Femorotibialgelenks. T2-gewichtete Bilder wurden mit einem 3,0-Tesla-MRT erhalten. Zeitverlauf vom präoperativen Knorpeldefekt bis zum regenerierten Knorpel nach der Operation. Das präoperative MRT-Bild zeigt einen großen Bereich des Knorpeldefekts im medialen Kondylus des Femurs, eine Kissing-Läsion im Schienbein und eine Ansammlung von Synovialflüssigkeit. Der regenerierte Knorpel wurde 3 Monate nach der Operation entdeckt und blieb über die Zeit erhalten. Der durch die Markstimulation verursachte unregelmäßige subchondrale Knochen wurde zunächst entdeckt und wurde nach 12 Monaten glatt.

Wir haben die Wirkungsweise, Sicherheit und Wirksamkeit von PD-Blättern in Experimenten mit dem xenogenen Modell4 und in anderen Studien19,21,23 bestätigt, bevor wir die klinische Studie durchgeführt haben.

In der aktuellen Studie spekulieren wir, dass die Wirkungsweise humoraler Faktoren der PD-Blätter der wahrscheinlichste Mechanismus war, da wir keine Immunsuppressiva verwendeten. In unserer früheren Forschung stellten wir eine Variabilität im therapeutischen Potenzial von PD-Blättern nach xenogener orthotopischer Transplantation fest und erkannten die Bedeutung der Spenderauswahl für zukünftige Studien5. Cavalli et al.24 berichteten, dass Polydaktylie-Chondrozyten in vitro expandiert werden können und eine schnelle und konstante Proliferationsrate für bis zu fünf Passagen aufrechterhalten, was ein wichtiges Merkmal einer handelsüblichen Zellquelle ist. Die ordnungsgemäße Passage von PD-Zellen ist auch in klinischen Studien von entscheidender Bedeutung. Um dieses Problem anzugehen, haben wir potenzielle Genmarkersätze zur Vorhersage des Ergebnisses einer PD-Blatttransplantation identifiziert (Abb. 3c – f). Die Markergene für jeden Ergebnisscore sind unterschiedlich. TGFB1 trat gemeinsam bei KOOS und LKS auf, die beide im Fragebogen zur Selbsteinschätzung der Symptome enthalten sind. ESM1 und ACKR4 tauchten im histologischen OARSI-Score und in der ICRS II-Gesamtbewertung auf, wobei beide Scores mit der Bewertung des Biopsiegewebes in Zusammenhang standen. Der Marker-Gensatz kann bei der Auswahl der allogenen Zellquelle für die Zellblattherstellung vor der klinischen Verwendung hilfreich sein.

Da wir die Expression knorpelbezogener Gene nur in einer kleinen anfänglichen Längsschnittserie analysiert haben, könnten andere Gene extrahiert worden sein, wenn ein anderer Gensatz für die Analyse verwendet worden wäre. Der aktuelle Markersatz an Genen kann verbessert werden, indem die Gene durch neu identifizierte Gene mit besserer Vorhersagekraft ersetzt werden.

Gelenkknorpel regeneriert sich manchmal nach einer Knochenmarkstimulation oder einer Abrasionsarthroplastik in Kombination mit HTO. Bei diesen regenerierten Geweben handelt es sich jedoch hauptsächlich um Faserknorpel, der sich vom nativen hyaliner Knorpel unterscheidet7,8,25,26,27 und nicht die gleichen langfristigen Belastungseffekte wie hyaliner Knorpel bietet. Zuvor haben wir die klinischen Ergebnisse zwischen Patienten verglichen, die sich einer OWHTO und einer Knieendoprothetik (TKA) unterzogen. Bei diesen Patienten war der KOOS bei Patienten, die sich einer OWHTO unterzogen, niedriger als bei denen, die TKA erhielten, und Restsymptome wie Knieknirschen, Klicken und Steifheit waren nach OWHTO schlimmer als nach TKA28. Zu diesem Punkt haben wir in der aktuellen Studie bestätigt, dass nach einer PD-Sheet-Transplantation in Kombination mit OWHTO eine Regeneration des hyaliner Knorpels stattgefunden hat. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass nach der Kombinationsbehandlung langfristige therapeutische Effekte zusammen mit einer Verbesserung der Ausrichtung der unteren Extremitäten zu erwarten sind.

Wir haben bereits über den Einsatz der autologen Chondrozytenblatttransplantation berichtet und die langfristigen klinischen Ergebnisse weiterhin beobachtet3. Für die vorherige Studie wurden wir vom japanischen Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales (MHLW) angewiesen, Zellschichten nur in Knie zu transplantieren, deren Defekte <4,2 cm2 groß sind, was der Größe einer Zellschicht entspricht. Für die aktuelle Studie konnten wir jedoch genügend PD-Blätter vorbereiten, um größere Defekte abzudecken, und wir haben die Patientenrekrutierung nicht aufgrund der Defektgröße eingeschränkt. In dieser klinischen Studie hatten einige Patienten Defekte mit einer Größe von >20 cm2. Im Allgemeinen sind die allgemeinen Ausschlusskriterien, die das „rote Knie“ definieren, Läsionen mit einer Größe von > 8 cm2, Fehlstellungen, Alter > 55 Jahre, Kissing-Läsionen und diffuse Knorpelverdünnung29, und einige Patienten mit rotem Knie wurden in diese aktuelle Studie aufgenommen. Obwohl nach der Transplantation der PD-Blätter keine schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse auftraten, müssen wir die klinischen Phase-III-Studien dennoch mit einer gut kontrollierten Vergleichsstudie abschließen, indem wir die Aufnahme auf Patienten ohne rotes Knie beschränken.

Die Anzahl der transplantierten PD-Blätter, die Defektorte und die Gesamtgröße der Defekte standen in keinem Zusammenhang mit den klinischen Ergebnissen und histologischen Ergebnissen. Diese Ergebnisse könnten jedoch durch die Tatsache beeinflusst worden sein, dass alle Patienten eine ausreichende Anzahl von PD-Blättern erhielten, um die Defekte vollständig abzudecken.

Unsere Studie weist drei Einschränkungen auf. Erstens umfasste die Studie nur 10 Patienten mit allgemeiner Arthrose, die sich einer OWHTO unterzogen. Diese damit verbundene Operation könnte die Ergebnisse der Therapie beeinflusst haben. Zweitens haben wir vielversprechende Ergebnisse für die Verwendung von PD-Blättern über einen Zeitraum von mindestens 1,5 Jahren beobachtet, es sind jedoch längerfristige Beobachtungen erforderlich, um diese neue Kombinationstherapie vollständig zu bewerten. Schließlich war unsere klinische Studie als einarmige, nicht randomisierte und unkontrollierte Studie konzipiert, und es sind weitere Studien mit mehr Patienten und Erkrankungen erforderlich.

Wir haben die Techniken zur Konservierung und zum Transport von Zellblättern in Vorbereitung auf die zukünftige Kommerzialisierung weiterentwickelt. Wir erforschen weiterhin die Vitrifikationsmethode, um die Kryokonservierung von Zellschichten zu erleichtern und gleichzeitig ihre Makro- und Mikrostrukturen beizubehalten, um eine hohe Lebensfähigkeit der einzelnen Zellen sicherzustellen30. Der zirkulierende Vitrifikationsbeutel und die Vitrifikations-Aufbewahrungsbox sind nützlich für die Langzeitkonservierung vitrifizierter Zellblätter, was die klinische Anwendung kryokonservierter Zellblätter noch einfacher macht31.

Wir haben die Sicherheit und Wirksamkeit der Transplantation von PD-Blättern bestätigt. Zehn Patienten erhielten eine PD-Sheet-Transplantation in Kombination mit OWHTO. Die Second-Look-Arthroskopie ein Jahr nach der Transplantation zeigte regenerierten Knorpel, der die Defektbereiche vollständig bedeckte. Die LIPA-Bewertung ergab, dass der regenerierte Knorpel normale mechanische Eigenschaften aufwies, und die histologische Analyse von Biopsieproben deutete auf hyaline ähnlichen Knorpel hin. Diese Kombinationsoperation kann eine ideale regenerative Therapie mit krankheitsmodifizierender Wirkung bei Patienten mit OAK darstellen.

Die Experimente wurden unter der Genehmigung und Anleitung des Clinical Research Review Committee der Tokai University School of Medicine durchgeführt. Wir haben diese präklinischen Forschungsdaten dem MHLW in Japan vorgelegt und einen Plan zur Bereitstellung regenerativer Medizin der Klasse I gemäß dem Gesetz zur Sicherheit regenerativer Medizin beantragt. Die Genehmigung wurde am 27. April 2016 erteilt und die klinische Forschung unter Verwendung von PD-Blättern konnte beginnen. In allen Fällen wurde die Einverständniserklärung der Eltern oder Erziehungsberechtigten der Spender eingeholt. Einige chirurgische Proben wurden irreversibel deidentifiziert. Alle Experimente mit menschlichen Zellen und Geweben wurden im Einklang mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Tierversuche wurden vom Institutionellen Tierversuchsausschuss der Tokai-Universität genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der institutionellen Verordnung für Tierversuche und der Grundrichtlinie für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen und verwandten Aktivitäten in akademischen Forschungseinrichtungen im Zuständigkeitsbereich von durchgeführt das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie für den Umgang und die Pflege von Tieren.

Unsere klinische Studie war als einarmige, nicht randomisierte, unkontrollierte Vergleichsstudie konzipiert. Diese Studie (UMIN Clinical Trials Registry, UMIN000015205 und Japan Registry of Clinical Trials, jRCTa030190242) wurde vom Institutional Review Board der Tokai University School of Medicine und vom MHLW Japans genehmigt. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das CONSORT-Flussdiagramm ist in Abb. 1c dargestellt.

Die Zellblätter für die Transplantation wurden aus Spenderzellen hergestellt, die die Fähigkeit zeigten, die Regeneration von hyalinem Knorpel nach einer xenogenen orthotopen Transplantation in ein japanisches weißes Kaninchenmodell mit Knorpeldefekt in voller Dicke einzuleiten5,19. Wir führten auch eine Array-vergleichende genomische Hybridisierung (Array-CGH) und eine Karyotypanalyse der P2-PD-Zellen durch, die zur Herstellung der Zellblätter und als langfristig kultivierte Zellen (P12-Zellen) verwendet wurden, um die genetische Stabilität der PD-Zellen während der In-vitro-Herstellung zu bewerten. Durch Array-CGH wurden keine Änderungen der Kopienzahl festgestellt, und in den als Zellquelle verwendeten Zellen wurden keine Karyotypanomalien gemäß den Richtlinien des Internationalen Systems für die zytogenetische Nomenklatur des Menschen festgestellt.

Knorpelgewebe wurde von drei Patienten (Durchschnittsalter: 12,3 Monate, Bereich: 10–15 Monate, ein Junge und zwei Mädchen) gewonnen, die sich am Tokai-Universitätskrankenhaus einer Polydaktylie-Operation unterzogen hatten. Eine Zusammenfassung des Herstellungsprozesses der PD-Platte ist in Abb. 1a dargestellt. Knorpelgewebe wurde mit einer Schere zerkleinert und dann in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/F12 (DMEM/F12; Gibco, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS; AusGeneX, Molendinar, Australien, oder SAFC Biosciences, Lenexa, KS, USA), 1 % Antibiotika-Antimykotika-Lösung (AB; Gibco) und 5 mg/ml Kollagenase Typ 1 (Worthington, Mannheim, Deutschland) für 1,5 Stunden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luft. Die Zellsuspension wurde gewaschen und durch ein 100 μm-Sieb (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) geleitet.

Die gesammelten Zellen wurden mit einer Dichte von 0,5 bis 1 × 104 Zellen/cm2 in Kulturplatten mit sechs Vertiefungen (Corning Inc., Corning, NY, USA) in DMEM/F12, ergänzt mit 20 % FBS und 1 % AB, ausgesät und inkubiert bei 37 °C. Nach 4 Tagen wurden dem Medium 100 μg/ml Ascorbinsäure (AA; Nissin Pharmaceutical, Yamagata, Japan) zugesetzt und das Medium alle 3 oder 4 Tage ausgetauscht. Die Zellen wurden mit STEM-CELLBANKER™ (ZENOAQ, Fukushima, Japan) kryokonserviert, als sie die Subkonfluenz erreichten. Die Zellen wurden aufgetaut und einmal mit einer Dichte von 0,5 bis 1 × 104 Zellen/cm2 in DMEM/F12, ergänzt mit 20 % FBS, 1 % AB und 100 μg/ml AA, ausgesät. Als die Zellen die Subkonfluenz erreichten, wurden sie mit TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, Tokio, Japan) abgelöst und auf temperaturempfindliche Kultureinsätze (CellSeed Inc., Tokio, Japan) mit 1 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage ausgetauscht. Nach 2 Wochen wurden die Kulturplatten 30 Minuten lang bei 25 °C gehalten, um die Ablösung der PD-Blätter von den Einsätzen zu fördern, und die PD-Blätter wurden geerntet. Um die Eigenschaften von PD-Blättern mithilfe von Echtzeit-qPCR, durchflusszytometrischer Analyse sowie histologischer und immunhistochemischer Färbung zu analysieren, wurden PD-Blätter am 13. Tag der Kultur geerntet.

PD-Blätter wurden in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS; Gibco) gewaschen. Anschließend wurden die Blätter 15 Minuten lang bei 37 °C in TripLE Express® (Gibco) inkubiert und 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Die Zellblätter wurden in 0,25 mg/ml Kollagenase P (Roche, Basel, Schweiz) bei 37 °C für bis zu 30 Minuten resuspendiert und dann bei 1500 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Die isolierten Zellen wurden schließlich in DMEM/F12 resuspendiert und die Zellzahl und Lebensfähigkeit mithilfe des Trypanblau-Ausschlusstests bestimmt.

Nachdem die Zellzahl ermittelt worden war, wurden isolierte Zellen mit DPBS gewaschen, das 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; Gibco) enthielt. Etwa 1,5 × 105 Zellen wurden in jedem Röhrchen mit den folgenden Antikörpern gemischt: hCD31–Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (1:10; IM1431U, Beckman & Coulter, Brea, CA, USA), CD44–FITC (1:10; 555478, BD Biosciences, Franklin, NJ, USA), hCD45–FITC (1:10; A07782, Beckman & Coulter), hCD81–Allophycocyanin (APC) (1:10; 551112, BD Biosciences), hCD90–APC (1:100; 559869, BD Biosciences), CD105–Phycoerythrin (PE) (1:5; A07414, B76299, Beckman & Coulter), CD146–PE (1:5; 5050-PE100T, BioCytex, Marseille, Frankreich), CD49-PE (1 :5; 559596, BD Biosciences) und GD2 (1:10; 554272, BD Biosciences). Die Zellen wurden 90 Minuten lang bei 4 °C inkubiert und dann mit DPBS gewaschen, das 0,2 % BSA und 1 mM EDTA enthielt. GD2 wurde durch Inkubation der Zellen mit dem Sekundärantikörper FITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG (1:20; 349031, BD Biosciences) für 10 Minuten bei 4 °C erkannt. Als Negativkontrolle wurde mit Fluorsonden markierter Maus-IgG1-Antikörper (1:10; Beckman & Coulter) verwendet. Gefärbte Zellen wurden mit einem FACSVerse™-Zellsortierer (BD Biosciences) analysiert (ergänzende Abbildung 2).

PD-Blätter wurden nach der Kultur geerntet und dann in einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (Sakura Finetek Japan, Tokio, Japan) eingebettet und eingefroren. 10 μm dicke Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardmethoden angefärbt (ergänzende Abbildung 3). 20 μm dicke Schnitte wurden mit Anti-Human-COL1 (1:200; 1310-01, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), COL2 (1:200; F-57, Kyowa Pharma Chemical, Toyama, Japan) und FN immungefärbt (1:1000; MA5-11981, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und ACAN (1:20; 967800, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) bei 4 °C über Nacht. Die Schnitte wurden gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper Alexa Fluor 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Ig (1:200; A-11017, Thermo Fisher Scientific) für COL2 und FN oder Alexa Fluor 546-konjugiertem Esel inkubiert Anti-Ziegen-Ig (1:400, A-11056, Thermo Fisher Scientific) für COL1 und ACAN. Nach der Immunfärbung wurden die Schnitte gewaschen und mit VECTASHIELD Antifade-Montagemedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) eingedeckt. Mikroskopische Bilder wurden unter einem BZ-X810-Mikroskop (Keyence, Osaka, Japan) aufgenommen.

Die PD-Blätter wurden in TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung eines SHAKE Master Neo-Geräts (Bio Medical Science, Tokio, Japan) aufgebrochen und die Gesamt-RNA wurde entsprechend unter Verwendung eines RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) isoliert Beachten Sie die Herstellerangaben. Die Menge und Qualität der RNA wurde mit einem Nanodrop One-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) und einem Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) bestimmt.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) in cDNA umgewandelt. Ein TaqMan PreAmp Master Mix Kit und TaqMan Genexpressionstests (beide von Thermo Fisher Scientific) (Ergänzungstabelle 3) wurden zur Voramplifikation der cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. TaqMan qPCR wurde mit einem 7500 qPCR System oder QuantiStudio 3 (beide von Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die relativen Expressionswerte für jedes Gen (–ΔCt-Werte) wurden unter Verwendung von GAPDH als interner Kontrolle berechnet.

Um die Überstände der hergestellten PD-Blätter zu sammeln, wurden die Blätter am 14. Tag der Kultur in 3 ml DMEM/F12, ergänzt mit 1 % FBS und 1 % AB, überführt und weitere 72 Stunden kultiviert. Die Überstände wurden gesammelt und 10 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Konzentrationen von TGF-β1 (R&D Systems), MIA (Roche), Dickkopf WNT-Signalweg-Inhibitor 1 (Thermo Fisher Scientific), Endothelzell-spezifischem Molekül 1 (ESM1; Abcam, Cambridge, UK) und Gremlin 1 (GREM1; Cloud-Clone Corp., Katy, TX, USA) wurden mit ELISA-Kits gemessen. Das für das Blindmedium mit 1 % FBS erkannte Signal wurde subtrahiert, um die in FBS enthaltenen Proteine ​​anzupassen.

Zehn Patienten (vier Männer und sechs Frauen) mit Knorpeldefekten, die arthroskopisch als Outerbridge-Grad III oder IV eingestuft wurden, wurden aufgenommen und erhielten die Therapie. Ihr Durchschnittsalter zum Zeitpunkt der Operation betrug 54 Jahre (Bereich 45–58) und ihr mittlerer Body-Mass-Index betrug 28,3 kg/m2 (Bereich 23,5–35,5). Die Kellgren- und Lawrence-Grade der Knieröntgenaufnahmen waren Grad 2 bei zwei Patienten, Grad 3 bei sechs und Grad 4 bei zwei (Tabelle 1). Beim ersten Patienten führten wir im Februar 2017 und beim letzten im Dezember 2019 eine PD-Sheet-Transplantation durch.

Die Einschlusskriterien für diese klinische Forschungsstudie waren das mediale Kompartiment OAK, das normalerweise für OWHTO indiziert ist (Tabelle 2). In anderen klinischen Forschungsstudien zur autologen Chondrozytenblatttransplantation wurde die Größe der beschädigten Knorpelläsion auf <4,2 cm2,3 festgelegt. Für diese klinische Forschungsstudie zur PD-Blatttransplantation gab es jedoch keine Größenvorgabe, da mehr als zehn PD-Blätter im Voraus vorbereitet werden konnten. Die Gesamtzahl der mit PD-Blättern zu transplantierenden Defekte betrug 21 (10 für MFC, 6 für Tr, 5 für Kissing-Läsionen); Die durchschnittlichen Defektgrößen betrugen 10,8, 4,6 bzw. 4,0 für MFC, Tr und Kissing. Die maximale Gesamtdefektgröße betrug bei einem Patienten 22,0 cm2 (Tabelle 1).

Wir haben eine Kombinationstherapie entwickelt, bei der auf die konventionelle chirurgische Behandlung von OAK, die in Japan von der staatlichen Krankenversicherung übernommen wird, die RMSC-Methode folgte (Abb. 1a). Kryokonservierte allogene Chondrozyten wurden aufgetaut und drei Wochen lang kultiviert, um vor der Transplantationsoperation PD-Blätter herzustellen. Insgesamt wurden neun Chargen hergestellt: drei Chargen von Spender 1, vier Chargen von Spender 2 und zwei Chargen von Spender 3. Jede Charge wurde für einen Patienten verwendet, mit Ausnahme der neunten Charge, die zwei Patienten transplantiert wurde. Wir führten OWHTO wie von Takeuchi et al.32 beschrieben durch und strebten an, einen postoperativen %MA von 62,5 zu erreichen. Nach der biplanen Osteotomie (schräger und proximaler Tuberositas) wurde künstlicher Knochen in den offenen Spalt transplantiert und an der Osteotomiestelle mit TomoFix® (DePuy Synthes, Bettlach, Schweiz) oder TriS® (Olympus Terumo Biomaterials, Tokio, Japan) fixiert.

Nach OWHTO wurde das Kniegelenk über den medialen parapatellaren Zugang etwa 5 cm geöffnet. Der MFC, das mediale Tibiaplateau und das Patellofemoralgelenk wurden beobachtet und eine RMSC durchgeführt (Zusatzfilm). Kurz gesagt, nach der Entfernung von ungesundem Gewebe und der Stimulation des Knochenmarks (Mikrofrakturierung bei sieben Patienten und Abrasionsarthroplastik bei drei) wurden PD-Folien transplantiert, um die gesamte Oberfläche des Knorpeldefekts abzudecken. PD-Blätter können aufgrund ihrer hervorragenden Klebeeigenschaften ohne Naht oder Periostpflaster transplantiert werden. Diese RMSC-Methode3 ist eine effiziente Methode zur Regeneration von hyalinem Knorpel, da sie aus dem Knochenmark stammende MSCs und verschiedene humorale Faktoren, die von PD-Blättern abgesondert werden, in den Knorpeldefektraum einfügt. Bei 10 Patienten wurden PD-Platten in das MFC, bei fünf in das mediale Tibiaplateau und bei sechs in das Patellofemoralgelenk transplantiert. Die durchschnittliche Anzahl transplantierter Blätter betrug 13 (9–15). Die Outerbridge-Grade sowie Lage und Größe der Knorpeldefekte sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Alle Patienten wurden unmittelbar nach der Operation mit einer Gipsschiene ruhiggestellt, die zwei Wochen lang bei 20° Kniebeugung gehalten wurde, um eine Störung der transplantierten Blätter zu vermeiden. Anschließend begannen die Patienten 2 Wochen nach der Operation mit Bewegungsübungen und teilweiser Belastung und 4 Wochen nach der Operation mit voller Belastung. Im Allgemeinen wurde mit Aktivitäten mit geringer Auswirkung im Alter von 6 Monaten begonnen und Aktivitäten mit großer Auswirkung wurden mit 8 Monaten erlaubt.

Wir haben die klinischen Ergebnisse präoperativ und 1, 3, 6 und 12 Monate postoperativ mithilfe der patientenorientierten KOOS- und LKS-Methoden ausgewertet33,34.

Die bildgebende Beurteilung erfolgte mittels Röntgenaufnahmen und MRT. Röntgenaufnahmen wurden auf die Ausrichtung des Knies, den Zustand des subchondralen Knochens und das Fortschreiten der OAK untersucht. Der Fortschritt wurde präoperativ und postoperativ anhand der Kellgren-Lawrence-Bewertungsskala bewertet. MRT-Untersuchungen wurden mit einem Achieva 3.0-T TX-Scanner (Philips Healthcare, Best, Niederlande) in einer Achtkanalspule TX SENSE Knee (Philips Healthcare) durchgeführt. Die Bilder wurden mit 10° Kniebeugung aufgenommen. Zur präoperativen und postoperativen Beurteilung der Knorpeldefektbereiche wurden sagittale und koronale MR-Bilder herangezogen.

Zur Bewertung der Therapie verwendeten wir die von Schreiner et al.35 beschriebene MOCART 2.0-Methode (Tabelle 1). Die arthroskopische Beurteilung der Knorpeldefekte umfasste deren Zustand, Größe und Outerbridge-Grad und wurde präoperativ und postoperativ durchgeführt. Die LIPA-Methode wurde verwendet, um die viskoelastischen Eigenschaften von Knorpel präoperativ und postoperativ zu bewerten (Zusatzfilm). Die Verwendung von LIPA wurde vom Institutional Review Board for Clinical Research der Tokai-Universität genehmigt und die Methode wurde klinisch angewendet, um die mechanischen Eigenschaften von Knorpel bei Patienten zu bewerten36. Die LIPA-Methode wurde arthroskopisch während der ersten Operation (PD-Sheet-Transplantation und OWHTO) und 12 Monate postoperativ (Second-Look und Entfernung von Implantaten) angewendet.

Die histologischen Ergebnisse wurden 12 Monate postoperativ anhand einer arthroskopisch durchgeführten Biopsie beurteilt, die nahe der Mitte des regenerierten Knorpels entnommen wurde. Die Proben wurden 9 Tage lang bei 4 °C mit 10 % EDTA-Lösung B (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) entkalkt. Anschließend wurden die Proben in Paraffinwachs eingebettet und 3-μm-Schnitte geschnitten, entparaffiniert, mit Safranin O gefärbt und mit zuvor beschriebenen Methoden auf COL1 und COL2 immungefärbt15. Die Gesamtbewertung des ICRS II37 und der histologische OARSI-Score wurden unabhängig voneinander von drei ausgebildeten orthopädischen Chirurgen beurteilt. Die mikroskopische Bewertung des Knorpels wurde mit der von Little et al.38 beschriebenen Methode ausgewertet, die für jede Bewertung repräsentative Bilder lieferte. Zwischen den drei Torschützen gab es nur minimale Unterschiede in der Wertung. Der Mankin-Score wurde auf ähnliche Weise ermittelt39,40 Strukturbeeinträchtigungen (0–6 Punkte), Verlust der Matrixfärbung (0–4 Punkte), Zellularitätsanomalien (0–3 Punkte) und Verletzung der Gezeitenmarkierungsintegrität (0 oder 1 Punkt) wurden bewertet Auf dieser Skala wird normaler Knorpel mit 0 von 14 Punkten bewertet.

Aus den 43 untersuchten Genen und Kontrollgenen (GAPDH und ACTB) (Ergänzungstabelle 3) wurden prädiktive Genmarkersätze ausgewählt, deren Expression mit dem KOOS-Schmerzscore und LKS, dem histologischen OARSI-Score und dem ICRS-Gesamtbeurteilungsscore 12 Monate nach der Operation korrelierte. Zunächst wurde festgestellt, dass 36 Gene (Ergänzungstabellen 4–7) mit normalisierten ΔCt-Werten von mehr als –10 Zyklen eine nachweisbare Genexpression aufweisen. Für jede Ergebnisbewertung wurden Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen dem Expressionsniveau jedes der Gene und den einzelnen Werten (KOOS, LKS, histologischer OARSI-Wert und ICRS-Gesamtbewertungswert) mithilfe des Leave-Five-Out-Verfahrens und den Genen berechnet Die Absolutwerte der Koeffizienten wurden vom höchsten zum niedrigsten Wert geordnet. Daraus wurde eine Matrix aus 100 Sätzen von Pearson-Korrelationskoeffizienten berechnet. Die repräsentativen Gene wurden unabhängig voneinander als prädiktive Marker für jedes der Ergebnismaße ausgewählt, indem für die Pearson-Korrelationskoeffizienten für die aufgelisteten Gene entsprechend ihrer Auftrittswahrscheinlichkeit ein Absolutwert von >0,5 ausgewählt wurde. Schließlich wurden vier oder fünf Gensätze mit der höchsten Auftrittswahrscheinlichkeit als prädiktive Marker ausgewählt. Der Gen-Score wurde als normalisierter Wert der Expression jedes Gens basierend auf linearen Funktionen berechnet: Gen-Score = Σ (–ΔCt-Wert) (Ergänzungstabellen 4–7).

Die Daten wurden mithilfe der Varianzanalyse mit wiederholten Messungen und des Post-hoc-Bonferroni-Tests analysiert, um Unterschiede zwischen den präoperativen und postoperativen Scores für klinische Ergebnisse (n = 10) für KOOS-Scores und Gesamt-LKS zu identifizieren. p-Werte < 0,05 waren signifikant.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Professor Rumiko Shimazawa (Tokai University School of Medicine) und Dr. Setsuko Hashimoto (CellSeed, Inc.) für ihre Beiträge zu diesem Projekt. Wir danken auch dem Support Center for Medical Research and Education der Tokai University für die technische Unterstützung bei der histologischen Analyse. Einer der Autoren erhielt Fördermittel aus den folgenden Quellen. Diese Forschung wurde durch das Forschungsprojekt für praktische Anwendungen der Regenerativen Medizin (Fördernummern JP15bk0104001, JP17bk0104063 und JP20bk0104101 für MS) der Japan Agency for Medical Research and Development unterstützt.

Abteilung für orthopädische Chirurgie, Chirurgische Wissenschaft, Tokai University School of Medicine, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japan

Kosuke Hamahashi, Eriko Toyoda, Genya Mitani, Tomonori Takagaki, Nagatoshi Kaneshiro, Miki Maehara, Takumi Takahashi, Eri Okada, Ayako Watanabe, Masahiko Watanabe und Masato Sato

Center for Musculoskeletal innovative Research and Advancement (C-MiRA), Tokai University Graduate School, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japan

Kosuke Hamahashi, Eriko Toyoda, Genya Mitani, Tomonori Takagaki, Nagatoshi Kaneshiro, Miki Maehara, Takumi Takahashi, Eri Okada, Ayako Watanabe, Masahiko Watanabe und Masato Sato

Abteilung für Medizintechnik, National Defense Medical College, 3-2 Namiki, Tokorozawa, Saitama, 359-8513, Japan

Miya Ishihara

Zellverarbeitungszentrum, Tokai-Universitätskrankenhaus, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japan

Yoshihiko Nakamura

Nationales Institut für Gesundheitswissenschaften, 25.03.26 Tonomachi, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanagawa, 210-9501, Japan

Reiko Kato

DNA Chip Research Inc., 1-15-1 Kaigan, Suzue Baydium 5F Minato-ku, Tokio, 105-0022, Japan

Ryo MatobaMehr

Nationales Zentrum für Kindergesundheit und Entwicklung, 2-10-1 Okura, Setagaya-ku, Tokio, 157-8535, Japan

Takehiko Takagi, Hidenori Akutsu und Akihiro Umezawa

Abteilung für klinische Pharmakologie, Tokai University School of Medicine, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japan

Hiroyuki Kobayashi

Abteilung für Plastische Chirurgie, Chirurgische Wissenschaft, Tokai University School of Medicine, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa, 259-1193, Japan

Tadashi Akamatsu

Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 8-1 Kawada-cho, Shinjuku, Tokio, 162-8666, Japan

Masayuki Yamato

Cell Sheet Tissue Engineering Center, Abteilung für Pharmazeutik und Pharmazeutische Chemie, University of Utah, 30 South 2000, East Salt Lake, UT, 84112, USA

Teruo Okano

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KH: Beiträge zum klinischen Studium und zum Verfassen von Manuskripten. ET: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. MI: Beiträge zu klinischen Studien, insbesondere zur Durchführung der laserinduzierten photoakustischen Arthroskopie-Methode und zur Manuskriptprüfung. GM: Beiträge zu klinischen Studien und Manuskriptprüfungen. T. Takagaki: Beiträge zu klinischen Studien und Manuskriptprüfungen. NK: Beiträge zu klinischen Studien und Manuskriptprüfungen. MM: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. T. Takahashi: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. EO: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. AW: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. YN: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. RK: Beiträge zu klinischen und grundlegenden Studien und zur Herstellung von Zellblättern. RM: Beiträge zu statistischen Analysen und Manuskriptprüfung. T. Takagi: Beiträge zu klinischen Studien und Manuskriptprüfungen. HA: Bereitstellung allogener Zellen und Beiträge zur Grundlagenforschung und Herstellung von Zellblättern. AU: Bereitstellung allogener Zellen und Beiträge zur Grundlagenforschung und Herstellung von Zellblättern. HK: Beiträge zu statistischen Analysen und Manuskriptprüfung. TA: Beiträge zu klinischen Studien und Manuskriptprüfungen. MY: Beiträge zum experimentellen Design, Anleitung zur Zellblatttechnologie und Manuskriptprüfung. TO: Beiträge zum experimentellen Design, Anleitung zur Zellblatttechnologie und Manuskriptprüfung. MW: Beiträge zu klinischen Studien und Manuskriptprüfungen. MS: Bürge, Beiträge zum klinischen Studiendesign, zum experimentellen Design, Leitung aller In-vitro-Elemente der experimentellen Arbeit, Bereitstellung von Finanzmitteln und Manuskripterstellung.

Korrespondenz mit Masato Sato.

Jeder Autor bestätigt, dass MS an den folgenden relevanten finanziellen Aktivitäten außerhalb dieser Arbeit und/oder anderen Beziehungen oder Aktivitäten beteiligt war, von denen die Leser wahrnehmen könnten, dass sie dieses Manuskript beeinflusst haben oder den Anschein erwecken, dass sie dieses Manuskript möglicherweise beeinflusst haben: Finanzierung durch CellSeed Inc. MS ist einer der Erfinder der Patente (PCT/JP2006/303759, PCT/JP2017/031136) der Antragsteller Tokai University und CellSeed Inc. für den Herstellungsprozess von Chondrozytenblättern. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hamahashi, K., Toyoda, E., Ishihara, M. et al. Polydaktylie-abgeleitete allogene Chondrozyten-Zellblatttransplantation mit hoher Tibia-Osteotomie als regenerative Therapie bei Knie-Arthrose. npj Regen Med 7, 71 (2022). https://doi.org/10.1038/s41536-022-00272-1

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Eingegangen: 04. November 2021

Angenommen: 05. Dezember 2022

Veröffentlicht: 16. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-022-00272-1

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