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Oct 20, 2023

Das Heterochromatin-Protein 1 ist ein Regulator der RNA-Spleißgenauigkeit, die bei Colitis ulcerosa mangelhaft ist

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6834 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Defekte beim RNA-Spleißen wurden mit Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht, sind bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) jedoch noch wenig erforscht. Hier berichten wir, dass die Expression des Chromatins und des alternativen Spleißregulators HP1γ bei Colitis ulcerosa (UC) verringert ist. Dementsprechend löst die Inaktivierung des HP1γ-Gens im Darmepithel der Maus IBD-ähnliche Merkmale aus, einschließlich Entzündungen und Dysbiose. Parallel dazu stellen wir fest, dass sein Funktionsverlust das Spleißrauschen im Großen und Ganzen erhöht, was die Verwendung kryptischer Spleißstellen bei zahlreichen Genen mit Funktionen in der Darmbiologie begünstigt. Dies führt zur Produktion von Progerin, einer toxischen Spleißvariante der Prälamin-A-mRNA, die für das Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom vorzeitiger Alterung verantwortlich ist. Spleißgeräusche werden auch häufig bei UC-Patienten im Zusammenhang mit Entzündungen festgestellt, wobei sich Progerin-Transkripte in der Dickdarmschleimhaut ansammeln. Wir schlagen vor, dass die Überwachung der HP1γ-Aktivität und der RNA-Spleißpräzision bei der Behandlung von IBD und allgemeiner bei beschleunigtem Altern hilfreich sein kann.

Entzündliche Darmerkrankungen (IBDs), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), sind chronisch entzündliche Darmerkrankungen, die durch eine unkontrollierte Entzündung gekennzeichnet sind, die zu Darmschäden führt. Während Anfälligkeitsgenorte identifiziert wurden, machen genetische Faktoren nur einen Teil der gesamten Krankheitsvarianz aus, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkungen zwischen Genen und Umwelt während der Entwicklung der Krankheiten besser untersucht werden müssen1. Die Epigenetik erfasst Umweltbelastungen und übersetzt sie in spezifische Genexpressionsmuster, was uns dazu veranlasst, Chromatin-Deregulierungen bei der Pathogenese von IBD zu untersuchen. In einer früheren Studie haben wir das Heterochromatin-Protein 1γ (HP1γ) als Regulator von Entzündungsgenen als Reaktion auf Enterobakterien identifiziert2. Mitglieder der HP1-Proteinfamilie, zu der auch HP1α und HP1β bei Mäusen und Menschen gehören, sind Leser der H3K9me2/3-Histonmodifikationen. Sie spielen eine Schlüsselrolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin und sind dadurch an der Stummschaltung transkriptioneller Gene beteiligt3. Parallel dazu zeigen HP1-Proteine ​​RNA-Bindungsaktivität, wie bei mehreren Arten beschrieben4, und bei Säugetieren haben In-vitro-Studien gezeigt, dass HP1γ intronische repetitive Motive von Prä-Messenger-RNA5 bindet, um die co-transkriptionelle Prä-mRNA-Verarbeitung und alternatives Spleißen zu fördern6,7 ,8. Hier zeigen wir, dass im Darmepithel eine HP1γ-vermittelte Regulierung sowohl der Transkription als auch des RNA-Metabolismus für die Darmhomöostase erforderlich und für das Verständnis von IBD wichtig ist.

Unsere zuvor berichteten Beobachtungen zum Einfluss von HP1γ auf die Kontrolle von Entzündungen im Darm als Reaktion auf eine bakterielle Infektion2 veranlassten uns, die Expression dieses Proteins im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen zu untersuchen. Zu diesem Zweck untersuchten wir eine verfügbare Kohorte von Dickdarmbiopsien in nicht entzündetem Gewebe von UC-Patienten und von gesunden Personen, die sich einer Screening-Koloskopie unterzogen (Abb. 1a und ergänzende Daten 1 für eine detaillierte Beschreibung der Population). Die quantitative Immunfluoreszenz (IF) zeigte eine stark verringerte Expression von HP1γ im Dickdarmepithel von UC-Patienten im Vergleich zu gesunden Personen (Kontrollpatienten) (Abb. 1a, b). Eine beeinträchtigte HP1γ-Expression im Zusammenhang mit UC wurde mithilfe des EXCY2-Mausmodells bestätigt, das eine Immundysfunktion (Il10-Mangel) und einen Epithel-NADPH-Oxidase-1-Mangel (Nox1) kombiniert9. In frühen Stadien zeigten diese Mäuse eine spontane chronische Kolitis, die sich zu einer Kolitis-assoziierten Dysplasie und Adenokarzinomen entwickelte. Im anfänglichen chronischen Entzündungsstadium (im Alter von 1–5 Monaten) herrschte eine verringerte HP1γ-Expression im Epithel vor, während im Krebsstadium die Expression wiederhergestellt wurde, was im Zusammenhang mit dem berichteten erhöhten Nachweis von Mitgliedern der Cbx-Proteinfamilie bei verschiedenen Krebsarten steht10, 11 (Abb. 1c, d).

a, b Die HP1γ-Expression wird bei Patienten mit Colitis ulcerosa (UC) beeinflusst: (a) Repräsentative Immunfluoreszenz in mit Anti-HP1γ-Antikörper (rot) und Dapi (blau) gefärbten Dickdarmgewebeschnitten (Maßstabsbalken: 50 μm) und in (b) ImageJ-Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz-HP1γ-Signalintensität/Abschnitt bei Kontroll- (n = 10) und UC-Patienten (n = 16), ausgedrückt als relativer Wert zu Kontrollpatienten (c, d) Biphasische Expression von HP1γ im IL10/ NOX1-KO-Mäusemodell, c Immunfärbung mit Anti-HP1γ-Antikörper (rot) und Dapi-Fluoreszenz (blau) und in (d) ImageJ-Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität. n = 6 Mäuse für jede Gruppe, Maßstab: 80 µm, (e) mRNA-Expression für Reg3b und Reg3g aus Zotten und Dickdarmepithelien von Ctrl- (Kontrolle) und Cbx3-KO-Mäusen (n = 3–6 Mäuse/Gruppe) (f) mRNA-Expression von Tnf, Il1b und II6 durch RT-qPCR aus dem Dickdarmepithel von Ctrl- (Kontrolle) und Cbx3-KO-Mäusen (n = 3–4 Mäuse/Gruppe) (g) Signifikante Anreicherung des Dickdarm-Cbx3-KO-Transkriptoms mit proinflammatorischer Signatur , Zweiseitige nominale P-Werte wurden von GSEA berechnet. (h) Zeitliche Entwicklung der Beta-Diversität in männlichen und weiblichen Villin-Cre Cbx3-Mäusen. Schema, das den zeitlichen Verlauf der Stuhlprobenentnahme vor (definiert Gruppe A) und nach Behandlungen (Vhc oder Tamox) (definiert Gruppen B–E) bei weiblichen (n = 8) und männlichen (n = 6) Mäusen veranschaulicht. Die statistische Analyse finden Sie in den Zusatzdaten 4. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. zweiseitiger Student-t-Test (b, d, e, f). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Diese Beobachtungen, die auf eine Rolle von HP1γ bei chronischen Entzündungen schließen lassen, veranlassten uns, ein Villin-creERT2:Cbx3-/--Mausmodell zu erstellen, das eine induzierbare Inaktivierung des Cbx3-Gens (das für das HP1γ-Protein kodiert) in der Epithellinie des Darms ermöglicht. Bei diesen Mäusen, die als Cbx3-KO-Mäuse bezeichnet werden, führte die Tamoxifen-Sonde zu einer vollständigen Erschöpfung des HP1γ-Proteins im Epithel der getesteten Gewebe, obwohl die Erschöpfung mit einer Hochregulierung der HP1α- und HP1β-Isoformen einherging (ergänzende Abbildung 1). ), wie bereits berichtet12. Die Beobachtung dieser Gewebe durch Immunfluoreszenzfärbung zeigte keine Veränderung der Markierungen von konstitutivem Heterochromatin, einschließlich H3K9me3 und H4K20me3, und die durch DAPI-Färbung sichtbar gemachten Chromozentren schienen unverändert (ergänzende Abbildungen 1, 2).

Die RNA-Sequenzierung der nächsten Generation an gereinigten Epithelzellen aus Krypten, Zotten und Dickdarm bei jungen erwachsenen Mäusen (8–10 Wochen alt) zeigte umfangreiche Veränderungen in der Transkriptomlandschaft im Cbx3-KO-Mausepithel mit erhöhten Signaturwerten in den beteiligten Signalwegen bei der Lipidoxidation, symptomatisch für oxidativen Schaden (Ergänzende Daten 2). Darüber hinaus stellten wir einen deutlichen Rückgang der Expression von mRNAs fest, die für antimikrobielle Peptide (AMPs) kodieren, einschließlich Defensinen, Cathelicidinen und AMPs vom Typ regenerierendes Gen (Reg) (Ergänzende Daten 3 und Abb. 1e). Im Dickdarm stellten wir außerdem einen erheblichen Anstieg der entzündlichen Genexpression fest, der durch Q-PCR bestätigt wurde (Abb. 1f, g und ergänzende Daten 2).

Da sowohl Entzündungen als auch Veränderungen der AMP-Produktion eine Dysbiose des Darmmikrobioms begünstigen13,14, haben wir die fäkalen Mikrobiome bei Mäusen (n = 6 Männer und n = 8 Frauen) durch Illumina-Sequenzierung der V3–V4-Region von bakteriellem 16 S weiter charakterisiert rRNA. In der anschließenden Analyse der UniFrac-Hauptkoordinaten gruppierten sich Cbx3-KO-Mäuse von den WTs entfernt, was auf eine Verschiebung in den mikrobiellen Gemeinschaften hinweist (Abb. 1h und ergänzende Daten 4 für statistische Details). Diese Verschiebung war bei Frauen (p-Wert = 0,006) im Vergleich zu Männern (p-Wert = 0,015) verstärkt, obwohl die Bakteriengemeinschaften bei beiden Geschlechtern vor der Cbx3-Inaktivierung ähnlich waren (Abb. 1h). Die Bakterienzusammensetzung blieb auch bei weiblichen Cbx3 fl/fl-Mäusen, die mit Tamoxifen in Abwesenheit der Cre-Rekombinase behandelt wurden, unverändert, was einen Effekt ausschließt, der ausschließlich durch die Verabreichung von Tamoxifen hervorgerufen wird (ergänzende Abbildung 3).

Da das Geschlecht die IBD-Risikofaktoren beeinflussen kann15, führten wir getrennte Analysen männlicher und weiblicher Mäuse durch. Bei weiblichen Mäusen wurden 110 Operational Taxonomic Units (OTUs) als Reaktion auf die HP1-Inaktivierung moduliert, während bei männlichen Mäusen nur 60 OTUs signifikant mit der HP1-Inaktivierung kovariierten (Supplementary Data 5). Insbesondere bei Frauen beobachteten wir eine Überrepräsentation von kolitogenen Bakterien wie E. coli und Alistipes und eine tiefgreifende Herunterregulierung entzündungshemmender Bakterienarten wie des Produzenten kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs) Ruminococcaceae (ergänzende Abbildung 4). , wobei beide Phänomene symptomatisch für eine dysbiotische Mikrobiota sind, über die bei IBD berichtet wurde16.

Somit ist UC mit einer verringerten Expression von HP1γ im Darmepithel verbunden, während die Inaktivierung des verwandten Gens im Darm der Maus zu Merkmalen führt, die typisch für einen Bruch der Darmhomöostase sind. Wir kamen zu dem Schluss, dass HP1 im Dickdarmepithel Schutzfunktionen ausübt und zur Entzündungshemmung und Mikrobiota-Homöostase beiträgt.

Als nächstes haben wir die homöostatischen Funktionen von HP1γ im Dünndarm beschrieben. Die Transkriptomanalyse deutete auf eine De-Stummschaltung der E2F-Zielgene bei Inaktivierung von Cbx3 hin (Supplementary Data 2), was mit seiner berichteten Rolle bei der Retinoblastom (Rb)-vermittelten Kontrolle der Zellteilung übereinstimmt17. In Übereinstimmung mit einer Auswirkung der Cbx3-Inaktivierung auf den Zellzyklus wurde der Proliferationsmarker Ki67 in den mutierten Mäusen ektopisch über das normale proliferative Kompartiment hinaus nachgewiesen und erstreckte sich entlang der Krypten und an der Basis der Zottenachsen (ergänzende Abbildung 5a). Darüber hinaus führte ein einstündiger Puls des Thyminanalogons 5-Brom-29-desoxyuridin (BrdU), der Zellen in der S-Phase markierte, nachweislich zu einer häufigen Markierung von Zellen im Darmstammzellkompartiment (ISC) von Cbx3-KO-Mäusen durch den signifikanten Anstieg der Erkennung von BrdU-positiven Zellen an 0 bis +4 Positionen der Krypta (Abb. 2a, b). Bei Kontrollmäusen (Ctrl) beschränkte sich diese Markierung überwiegend auf das unmittelbare ISC-Nachkommenkompartiment, d. Die Erweiterung der Stammzellnische in den Cbx3-KO-Mäusen wurde auch durch einen vergrößerten Nachweisbereich für den Olfm4-Stammmarker dokumentiert (ergänzende Abbildung 5b, c). Schließlich zeigten ex vivo enteroide 3D-Matrigelkulturen eine beschleunigte Knospenbildung, wenn Zellen von Cbx3-KO-Mäusen gesammelt wurden (ergänzende Abbildung 6a, b). Bei längerer Kultur sank jedoch das Verhältnis von Knospen zu Organoiden bei von Cbx3 KO abgeleiteten Organoiden drastisch, möglicherweise als Folge der Zellerschöpfung (ergänzende Abbildung 6a, b). In den Organoiden ergab der Nachweis von Zellen in der S-Phase durch EdU-Einbau auch abweichend positive Zellen entlang der Zottenachsen, wobei EdU-positive Zellen das Lumen der Organoide füllten (Abb. 2c und ergänzende Abb. 6c).

(a) Immunfärbung mit Anti-BrdU-Antikörper (rot) und Dapi (blau) von Krypta-Ileum-Abschnitten von Ctrl- und Cbx3-KO-Mäusen (Maßstabsbalken: 20 μm) und in (b) Quantifizierung der BrdU-positiven Zellen (rot) vs. Dapi (blau) am Stammzellfach (0 bis +4 Position) n = 3 Tiere Strg, n = 20 Schnitte; Cbx3 KO n = 15 Abschnitte), (c) Repräsentatives Bild der Co-Färbung von EdU (rot)/Dapi (blau) in Organoiden, die von Ctrl- und Cbx3 KO-Mäusen stammen (Maßstabsbalken: 100 μm) in n = 3 Mäusen/Gruppe und Die Quantifizierung ist in der ergänzenden Abbildung 6c (d) dargestellt. Signifikante Anreicherung des Cbx3-KO-Transkriptoms der Zotten mit der Lgr5+-Intestinalstammzellsignatur (ISC) (Munoz et al., 2012). Zweiseitige nominale P-Werte wurden von GSEA berechnet, ( e) mRNA-Expression von Olfm4 und Ascl2 durch RT-qPCR aus Zottenepithel von Ctrl- und Cbx3-KO-Mäusen (n = 3–4 Mäuse/Gruppe) (f) Repräsentative Immunfluoreszenz mit Nukleolin-Antikörper, n = 6 Mäuse/Gruppe (Maßstabsbalken: 100 μm, 25 μM im Einsatz) (g) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie (n = 3 Mäuse pro Bedingung), die die Kernstruktur im oberen Teil der Zotten charakterisiert: in (g-Links) wurde Heterochromatin (hc) beobachtet Der Kern von CTRL-Mäusen und in Cbx3-KO-Mäusen wurden kanonische Nukleolen (n) nachgewiesen, Maßstabsbalken = 5 µm, in (g-rechts): Vergrößerung, die den interessierenden Bereich mit einem kanonischen Nukleolus in der Cbx3-KO-Maus zeigt (g: körnig Komponente; fc: fibrilläres Zentrum; dfc; dichte fibrilläre Komponente) Maßstabsbalken = 2 µm, (h) rRNA 45 S- und 18 S-Expressionsniveaus sowohl in der Krypta als auch in den Zotten der Cbx3-KO-Mäuse (n = 3–4 Mäuse/Gruppe), (i) Repräsentative Immunfluoreszenz mit Anti-Lysozym Antikörper (rot) und Dapi (blau) an der Ileumkrypta (Maßstabsbalken: 20 μm) und (j) Quantifizierung des Lysozym-Expressionsbereichs. (n = 6 Mäuse/Gruppe, mit insgesamt n = 40 Feldern/Bedingungen) (k) mRNA-Expression von Sis (Sucrase-Isomaltase) im Zottenepithel (n = 4–8 Mäuse). Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt; zweiseitiger Student-t-Test (b, d, e, h, j, k). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zusammen mit dieser veränderten proliferativen Homöostase waren Zotten von mutierten Mäusen Reifungsdefekten ausgesetzt, wie eine GSEA-Analyse zeigt, die einen starken Zusammenhang zwischen Genen, die durch Cbx3-Inaktivierung dereguliert wurden, und Genen zeigte, die mit einer intestinalen Stammzellsignatur assoziiert sind, während RT-qPCR-Reaktionen ergaben erhöhte Expression der Stammmarker Ascl2 und Olfm4 in den mutierten Mäusen (Abb. 2d, e). Entlang des Zottenepithels der Cbx3-KO-Mäuse stellten wir auch die Expression von Nukleolin fest, einem Marker des Nukleolus, und elektronenmikroskopische Untersuchungen lieferten Hinweise auf das Vorhandensein kanonischer Nukleolarstrukturen im oberen Teil der Zotten, einschließlich der körnigen Komponente und des fibrillären Zentrums und dichte fibrilläre Komponente (Abb. 2f, g). Dies stand in scharfem Gegensatz zum erwarteten Rückgang der Nucleolin-Expression entlang der Krypta-Zotten-Achse (Abb. 2f, g), eine Folge der fortschreitenden Verdünnung der Ribosomen in den postmitotischen Zellpopulationen, die normalerweise auf Ribosomen gedeihen, die von den Vorläuferzellen geerbt wurden . Die ektopische Produktion nukleolarer Organellen wurde schließlich durch eine erhöhte 18-s-rRNA-Produktion dokumentiert, die sowohl in Krypten als auch in Zotten beobachtet wurde, in Verbindung mit einer Anreicherung von Genen, die an der ribosomalen Biogenese beteiligt sind (Abb. 2h und ergänzende Abb. 5d). Dadurch ging die homöostatische Unterdrückung der Kernorganellen während der Reifung der Epithelzellen verloren. Bemerkenswert ist, dass die Quantifizierung der Zuordnung von Lesevorgängen zu Retrotransposons in den RNA-seq-Experimenten dokumentierte, dass die Inaktivierung von HP1γ im Gegensatz zu früheren Berichten zur Inaktivierung der H3K9-Methyltransferase Setdb1 im Darmepithel nicht zu einer erhöhten Expression dieser normalerweise heterochromatinisierten DNA-Wiederholungen führte . Daher kam es bei Cbx3-KO-Mäusen nicht zu einer Deaktivierung der rDNA und einem Verlust der nukleolären Repression entlang der Zotten im Zusammenhang mit einer globalen Destabilisierung heterochromatischer Strukturen (ergänzende Abbildung 7).

Schließlich wurde die Produktion reifer Abstammungslinien in den Cbx3-KO-Mäusen sowohl auf absorbierenden als auch auf sekretorischen Abstammungslinien beeinflusst. Ebenso zeigte die GSEA-Analyse der RNA-seq-Daten aus beiden Kompartimenten Veränderungen in den Paneth- und Enterozyten-Genexpressionsprogrammen (ergänzende Abbildung 5e, f), und wir stellten einen deutlichen Defekt in der Expression von Lysozym, einem Paneth-Zellmarker, fest von Sucrase Isomaltase, einem absorbierenden Enterozyten-Differenzierungsmarker (Abb. 2i, k). Insgesamt deuteten diese Daten auf eine Deregulierung der Kontrolle der Zellproliferation und der Produktion reifer Abstammungslinien nach Erschöpfung von HP1γ hin.

Als nächstes versuchten wir, Funktionen von HP1γ für die RNA-Homöostase im Darmepithel zu definieren. Massenspektrometrie ergab, dass HP1γ-Interaktanten stark an Bestandteilen des Spleißosoms angereichert waren (Ergänzende Abbildungen 8a, b und Ergänzende Daten 6). Darunter identifizierten wir Mitglieder des katalytischen Schritt-2-Spleißosoms (auch als U2-Typ-Spleißosomkomplex C bezeichnet) und Spleißfaktoren, die für die Erkennung von Spleißstellen essentiell sind, wie z. B. Ser/Arg-reiche (SR) Proteine. Die Infragestellung einiger dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen mit RNAse ließ im Einklang mit früheren Berichten (ergänzende Abbildung 8c) nicht auf eine Auswirkung dazwischenliegender RNA-Moleküle schließen. Dies steht im Einklang mit Studien zur Rolle von HP1γ bei der Regulierung des Prä-mRNA-Spleißens6,22. Ebenso bestätigte die Analyse der RNA-seq-Daten mit der Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)-Pipeline, dass das Spleißen einen erheblichen Einfluss auf die HP1γ-Inaktivierung hatte. Zu den signifikanten Variationen beim Spleißen gehörte ein Trend zu einer erhöhten Intronretention im Dünndarm, jedoch nicht im Dickdarm, wobei ein erhöhter und verringerter Einschluss alternativer Exons beobachtet wurde (Abb. 3a und ergänzende Daten 7–9, signifikantes (FDR <0, 05) alternatives Spleißen Ereignisse in Krypta, Zotten und Dickdarmepithelien). Einige dieser Ereignisse wurden durch RT-qPCR validiert (ergänzende Abbildung 9).

(a) Arten und Menge der von rMATS im Dickdarm, in den Zotten und in den Kryptaepithelien festgestellten Spleißveränderungen. Arten von Spleißänderungen sind wie angegeben farblich gekennzeichnet. SE: übersprungene Exons, MXE: sich gegenseitig ausschließende Exons, A3'SS und A5'SS: alternative 3'/5'-Spleißstellen, RI: beibehaltene Introns. (b) Quantifizierung von De-novo-Verbindungen unter Kontrollbedingungen (Strg) und Cbx3-KO (KO) in Krypten, Zotten und Dickdarmepithelien nach Konsolidierung der 3 RNA-seq-Replikate von Strg- oder Cbx3-KO-Mäusen in jedem Gewebe. De-novo-Verbindungen wurden als Verbindungen definiert, die in der mm9-Version des Mausgenoms nicht annotiert waren und weder in WT- noch in Mutantenproben vorhanden waren. Der angegebene p-Wert wurde mit einem gepaarten zweiseitigen Student-t-Test berechnet, n = 3 (Krypten, Zotten und Dickdarm). Als Positivkontrolle wird die Quantifizierung von De-novo-Verbindungen in Maus-Purkinje-Neuronen gezeigt, die entweder WT-aktiviert oder für Rbm17 inaktiviert sind. (c) Konsolidierter maxEnt-Score der De-novo-Standorte, die mit dem in (b) beschriebenen Ansatz identifiziert wurden, verglichen mit dem Score, der mit annotierten Kreuzungen erhalten wurde, und mit denen, die mit zufällig ausgewählten Sequenzen erhalten wurden (schwarz bzw. blau). Die gezeigten Werte stammen von Cbx3 KO in Krypten, Zotten und Dickdarm (n = 3 Mäuse, p-Wert wurden mit gewöhnlicher Einweg-Anova berechnet). (d) De-novo-Junctions wurden an Genen quantifiziert, die transkriptionell weniger als zweifach von der Cbx3-KO-Inaktivierung betroffen waren. Für jede angegebene Erkrankung haben wir Gene gezählt, die eine De-novo-Verbindung um das Zweifache oder mehr erreichten (p-Wert <0,05). (e) De-novo-Verbindungen im Dickdarm (Pkm und Cdh1) oder Zotten (Lmna) wurden mit einem Genombrowser in der Nachbarschaft der angegebenen Gene visualisiert. Jeder Balken stellt ein „de novo“-Donor/Akzeptor-Paar dar, das sich von der 5′- bis zur 3′-Spleißstelle erstreckt. (f) Balkendiagramme zeigen die Anzahl der De-novo-Übergänge, die an den angegebenen Genen in Krypten, Zotten und Dickdarm erkannt wurden (n = 3 Mäuse für jede Bedingung, Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt; angegebene p-Werte wurden mit einer Zwei berechnet -seitiger Student-t-Test). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das Fehlen eines definierten Musters im Einfluss von HP1γ auf das Spleißen veranlasste uns zu untersuchen, ob diese zahlreichen Spleißereignisse auf lautes Spleißen zurückzuführen sind23, wie es bei Krebs und Neurodegeneration auftritt24,25,26,27. Zu diesem Zweck identifizierten wir für jedes Gewebe nicht kommentierte Spleißverbindungen, die nur unter einer der beiden Versuchsbedingungen (entweder WT oder Cbx3 KO) vorhanden waren. Die Häufigkeit dieser Verbindungen, die wir im Folgenden als „de novo“ bezeichnen, wurde durch die Inaktivierung von Cbx3 deutlich erhöht (Abb. 3b). Dieser Anstieg lag in einem ähnlichen Bereich wie der, der in Purkinje-Neuronen des Kleinhirns beobachtet wurde, denen Rbm17 fehlte, ein RNA-Bindungsprotein, von dem berichtet wird, dass es die Verwendung von kryptischem Spleißen unterdrückt (Abb. 3b). RT-PCR-Experimente dokumentierten außerdem eine erhöhte Nutzung kryptischer Spleißstellen am Exon oder Intron, die durch HP1γ-Inaktivierung induziert wurde (ergänzende Abbildung 10).

Die Bewertung der Qualität der Konsensus-Splicing-Donoren und -Akzeptoren mit einer speziellen Software ergab, dass die De-novo-Verbindungen im Durchschnitt schlechtere Ergebnisse erzielten als kommentierte Verbindungen, jedoch höher als Zufallssequenzen (Abb. 3c). Dies deutet darauf hin, dass die Inaktivierung von HP1γ die Nutzung von Spleißstellen mit schlechter Übereinstimmung fördert und möglicherweise den Bereich der Spleißmöglichkeiten erhöht. Bei der Untersuchung öffentlich verfügbarer Daten wurden mehrere molekulare Partner von HP1γ identifiziert, die bei Inaktivierung zu einem deutlichen Anstieg des Spleißgeräuschs führen. Zu diesen Partnern gehören PPL128, eine Peptidylprolylisomerase-ähnliche Spleißosomenkomponente, ZC3H13, ein Zinkfingerprotein, das RNA-Methyltransferasen rekrutiert, die an der Modifikation der N6-Adenosinmethylierung (m6A) beteiligt sind, und das Ser/Arg-reiche Protein SRSF531 (ergänzende Abb. 11).

Schließlich dokumentierte die Untersuchung des durch Cbx3-Inaktivierung induzierten Spleißrauschens auf Gen-pro-Gen-Basis weiter, dass bei der großen Mehrheit der Gene, die auf ihrer Expressionsebene nicht betroffen waren, die Anzahl der aktiven Spleißstellen signifikant erhöht war (Abb. 3d und ergänzende Daten). 10 für die Liste der Gene). Zu diesen Genen gehörten Regulatoren der Darmhomöostase. Insbesondere stellten wir fest, dass das Pkm-Gen, das durch alternatives Spleißen sowohl Pkm1- als auch Pkm2-mRNAs produziert, wobei letzteres vor Kolitis schützt32, einen starken Anstieg des De-novo-Spleißens im Dickdarm aufwies (Abb. 3e, f, linke Felder). Ebenso wurde das Cdh1-Gen, das für E-Cadherin kodiert, das für die epitheliale Barrierefunktion essentiell ist33 und einer vorzeitigen Beendigung durch alternatives Spleißen unterliegt34, durch die Cbx3-Inaktivierung sowohl in den Krypten als auch im Dickdarm beeinträchtigt (Abb. 3e, f mittlere Felder). Schließlich beobachteten wir einen besonders starken Einfluss auf das Lmna-Gen mit einem durchschnittlich 9-fachen Anstieg der De-novo-Verbindungen an den Zotten (Abb. 3e, f, rechtes Feld).

Die biologische Bedeutung des Spleißgeräuschs ist bei Säugetieren nur unzureichend untersucht, was uns dazu veranlasste zu untersuchen, ob die verstärkte Verwendung von De-novo-Spleißverbindungen am Lmna-Gen in Zotten, denen HP1γ fehlt, zur Produktion von Progerin führen könnte. Das LmnA-Gen umfasst 12 Exons und produziert durch alternatives Spleißen sowohl Lamin A- als auch Lamin C-mRNA. Gelegentlich führt ein seltenes Spleißereignis auch zur Produktion von Progerin, einer verkürzten Version von Lamin A, die als dominante negative Proteinisoform fungiert und für das Hutchinson-Gilford-Progeria-Syndrom (HGPS) verantwortlich ist35,36. Bei diesem Syndrom vorzeitiger Alterung wird die Produktion dieser Spleißvariante durch eine genomische Mutation erleichtert, die die Nutzung einer Progerin-Spleißstelle erhöht, die in normalen Zellen bei Verwendung einer Spleißstelle mit schlechtem Konsens in geringer Ausbeute genutzt wird37.

Wir verwendeten daher RT-PCR und quantitative Taqman-PCR zum Nachweis von Lamin A- und Progerin-Transkripten im Darmepithel der Maus (ergänzende Abbildungen 12a und Abbildungen 4a, b). Endpunkt-RT-PCR unter Verwendung von Primern, die auf Exon 9 und 12 für LmnA verschachtelt sind, zeigte Hinweise auf den Nachweis von Progerin-Transkripten in Cbx3-KO, jedoch nicht in Ctrl-Mäusen (ergänzende Abbildung 12a). Die quantitative Taqman-PCR dokumentierte außerdem ein signifikant erhöhtes Auftreten des Progerin-spezifischen Spleißereignisses bei Cbx3-Inaktivierung im Zottenepithel (Abb. 4b). Die Sequenzierung der PCR-Endprodukte bestätigte, dass dieses Spleißprodukt mit dem in G609G-HGPS-Mäusen nachgewiesenen identisch war (Abb. 4c). Die Häufigkeit des Spleißprodukts blieb jedoch deutlich geringer als im Dickdarm- oder Dünndarmepithel von Lmna G609G HGPS-Mäusen beobachtet, was mit der erhöhten Stärke des Progerin 5'SS durch die Mutation 37 zusammenhängt (Abb. 4b und ergänzende Abb. 12b). .

(a, b) Taqman-Assays Lamin A und Progerin in Strg (n = 4), Cbx3 KO (n = 8), WT und HGPS G609G (n = 4 Mäuse/Gruppe), Mann-Witney-U-Test (c) Beispiele für Sequenzierungsdaten der Taqman-PCR-Endprodukte in Zotten-Cbx3-KO-Proben, embryonaler Mausfibroblasten (MEF) aus G609G-Mäusen, die als Kontrolle verwendet wurden, (d) Immunoblot mit monoklonalem Anti-Progerin-Antikörper in Epithellysaten aus Ctrl-, Cbx3-KO-Mäusen usw interne Kontrolle, Cbx3 fl/fl exprimiert nicht die mit Tamoxifen behandelte Cre-Rekombinase. Das Experiment ist repräsentativ für 2 unabhängige Wiederholungen mit insgesamt n = 4 Mäusen/Gruppe (e) Repräsentative Immunfluoreszenz mit Anti-Progerin-Antikörper (rot) und Dapi (blau), Maßstabsbalken: 20 μm und in (f) Quantifizierung bereitgestellt durch der Prozentsatz (%) der Progerin-exprimierenden Zellen entsprechend der Position entlang der Ileum-Krypta-Achse (Cbx3 KO n = 23 Abschnitte, n = 3 Mäuse). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, (g) Immunfluoreszenz mit Anti-Lamin-B1-Antikörper (grün), der die Kernhülle markiert (Maßstabsbalken: 50 µm, Einfügung: 15 µm und in (h) Quantifizierung durch den Prozentsatz der Zellen mit deformierter Kern, n = 5–9 Mäuse in jeder Gruppe, gezählt in ctrl = 4757 Kern bzw. Cbx3 KO = 29753 Kern. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, zweiseitiger Student-t-Test dargestellt. Quelldaten werden als bereitgestellt Quelldatendatei.

Als nächstes verwendeten wir digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), um in jeder Bedingung den Percent Spliced ​​In (PSI)-Score des Progerin-spezifischen Spleißereignisses zu bewerten, der der Menge der Progerin-Isoform dividiert durch die Gesamtmenge an kanonischem (Lamin A) und Progerin entspricht Isoformen. In Strg-Krypten und Zotten konnten wir durchschnittlich 415 ± 166 Kopien/ul bzw. 0,16 ± 0,15 Kopien/ul kanonischer bzw. Progerin-spezifischer Spleißprodukte nachweisen, während diese Zahlen im Cbx3-KO auf 1566 ± 725 Kopien/ul anstiegen. ul für Lamin A und 2,8 ± 0,42 Kopien/ul für Progerin (ergänzende Abbildung 12c). Wie erwartet war der Progerin-Nachweis in cDNA, die aus gereinigten Krypta-Epithelzellen von HGPS-Mäusen stammte, mit 33,86 Kopien/µl und 11,8 Kopien/µl von Lamin A höher. Die Übersetzung in durchschnittliche PSIs zeigte einen Anstieg von 0,045 auf 0,21 nach Inaktivierung von Cbx3. Dies dokumentiert ein erhöhtes Auftreten des Progerin-spezifischen Spleißereignisses, das nicht auf die erhöhte Expression des Lmna-Gens in den mutierten Mäusen zurückzuführen ist (Ergänzende Abbildung 12d und Ergänzende Daten 11). Als nächstes untersuchten wir, ob die im Dünndarm der Cbx3-KO-Mäuse nachgewiesene Menge an Progerin-Transkript zur Produktion von Progerin führte. Unter Verwendung eines gut charakterisierten monoklonalen Anti-Progerin-Antikörpers (ergänzende Abbildung 13) konnten wir Progerin-Protein sowohl in Zotten- als auch in Kryptaepithelien leicht nachweisen, wie durch Immunoblot sichtbar gemacht wurde (Abb. 4d). Bemerkenswert ist, dass das Fehlen eines Progerinsignals in Cbx3 fl/fl, das keine induzierbare Cre-Rekombinase beherbergt, es ermöglichte, einen Effekt der Tamoxifen-Induktion auf die Progerinproduktion auszuschließen (Abb. 4d). Die Akkumulation von Progerinprotein in Krypten und Zotten wurde durch Immunzytochemie weiter dokumentiert (ergänzende Abbildung 14). Dieser Ansatz ergab, dass Progerin hauptsächlich an den unmittelbaren Nachkommen von ISC (über der Position + 4, Abb. 4e, f) nachgewiesen wurde, was auf einen Gradienten der Progerin-Expression entlang der Krypta-Zotten-Achse bei Cbx3-KO-Mäusen hinweist. In vitro Crispr/Cas9-vermittelter Cbx3-Knockout (KO) in enterozytären TC7-Zellen bestätigte die Produktion von Progerin-Transkripten und die Akkumulation von nukleozytoplasmatischem Progerin-Protein (ergänzende Abbildung 15a, b).

Die Ansammlung von Progerin stört hauptsächlich die Struktur der Kernschicht38. Wir untersuchten daher, ob bei der Inaktivierung von Cbx3 eine Toxizität für das Kernlamin A festgestellt wurde. Die Beobachtung des Dünndarms von Cbx3-KO-Mäusen ergab eine Fehlformung der Kernhülle in einem Teil der Epithelzellen bei LaminB1-Immunfärbung (Abb. 4g, h). Ähnliche Defekte wurden auch in vitro beim Crispr/Cas9-vermittelten Cbx3-Knockout (KO) in der enterozytischen Zelllinie TC7 beobachtet, was zu tiefen Einstülpungen der Kernmembran führte, die durch Elektronenmikroskopie erkennbar waren und einen Laminopathie-Phänotyp widerspiegelten (ergänzende Abbildung 15c, d). . Insgesamt zeigten diese Daten, dass der HP1γ-Defekt den Möglichkeitenbereich von Lamin-A-mRNA-Spleißvarianten vergrößerte und so zur Produktion von Progerin in Abwesenheit einer HGPS-Mutation im Darmepithel führte.

Die verringerten HP1γ-Spiegel im Zusammenhang mit UC (Abb. 1a, b) veranlassten uns, nach einem erhöhten Spleißgeräusch bei UC-Patienten zu suchen. Um dies zu untersuchen, haben wir RNA-seq-Daten von 206 jungen UC-Patienten und 20 passenden gesunden Spendern aus der großen multizentrischen, zu Beginn nicht vorbehandelten UC-Kohorte PROTECT39 analysiert. Dieser Datensatz wurde ausgewählt, weil er gut kontrolliert war und eine für die Spleißanalyse ausreichende Sequenzierungstiefe aufwies. Die Quantifizierung der De-novo-Übergänge ergab einen hochsignifikanten Anstieg (P-Wert = 10–59) des Spleißgeräuschs bei den UC-Patienten im Vergleich zu den gesunden Spendern (Abb. 5a). Der Vergleich von UC-Patienten mit De-novo-Junction-Werten im oberen Quartil mit solchen mit Werten im unteren Quartil (siehe Schema in Abb. 5b) ergab außerdem, dass ein hohes Spleißrauschen mit einer erhöhten Aktivität von Genen korreliert, die mit der Entzündungsreaktion und mit assoziiert sind verringerte Expression mitochondrialer Gene, die beide in der ersten Studie mit der Schwere der Erkrankung in Zusammenhang standen39 (Abb. 5b, c und ergänzende Daten 12, einschließlich Beschreibung des UC-Patienten und Analysen zur Anreicherung funktioneller Annotationen). In Übereinstimmung damit war der histologische Schweregrad höher (berechnet, p-Wert = 0,03). Das Spleißgeräusch schien auch einen prädiktiven Wert für die Schleimhautheilung nach 4 Wochen (4H) Medikamenteneinnahme (definiert als fäkales Calprotectin <250 µg/g) zu haben, da hohe 4H-Spiegel an fäkalem Calprotectin im oberen Quartil häufiger auftraten (80 % vs. 57). % im unteren Quartil) und es gab weniger Patienten in Remission (43 % vs. 67 % im unteren Quartil – ergänzende Abb. 16a, b). Wir untersuchen das Spleißgeräusch weiter pro Gen, wie bei den Cbx3-KO-Mäusen. Von den 2743 untersuchten Genen, die aufgrund ihrer Expression in den Biopsien (mindestens 10 RNA-seq-Reads pro Gen) und ihrer Unbeeinflusstheit durch UC (weniger als zweifache Änderung der Expression zwischen gesunden Spendern und UC-Patienten) ausgewählt wurden, wurden 415 Gene (15 %) angezeigt ein Anstieg der De-novo-Verbindungen um das >1,5-Fache (p-Val <0,01) bei UC-Patienten, während nur 11 Gene (0,4 %) reduzierte Mengen dieser Verbindungen aufwiesen (Abb. 5d und ergänzende Daten 13). Zu diesen Genen gehörte LMNA (Abb. 5e), was uns dazu veranlasste, die Produktion von Progerin in einer Kohorte von Dickdarmbiopsien zu untersuchen. Gesamt-RNAs wurden aus Dickdarmbiopsien von UC-Patienten (n = 19) extrahiert und mit gesunden Personen (n = 17) oder Patienten mit Morbus Crohn (CD) (n = 16) mit Dickdarmbeteiligung verglichen (Supplementary Data 14 für eine detaillierte Beschreibung). Bevölkerung). Die Lamin A- und Progerin-mRNA-Expressionsniveaus wurden dann durch Taqman-Assays bestimmt, einschließlich der Überprüfung der PCR-Endprodukte durch Sequenzierung. Bei UC-Patienten waren die Mengen an Progerin-spezifischen Spleißereignissen signifikant hochreguliert (p Val = 0,0002) (Abb. 5f, g), während die Produktion des Lamin-A-Spleißprodukts nicht der Fall war (Abb. 5h). Es wurde keine Korrelation zwischen der Progerin-mRNA-Expression und dem Alter des Patienten festgestellt (ergänzende Abbildung 16c). Umgekehrt blieb bei CD-Patienten das Progerin-spezifische Spleißen unbeeinflusst (Abb. 5f), während das Lamin A-spezifische Spleißprodukt hochreguliert war (p Val = 0,016) (Abb. 5h), wobei dieser Anstieg hauptsächlich die jüngeren CD-Patienten betraf <45 Jahre alt, wie durch lineare Regressionsanalyse gezeigt (ergänzende Abbildung 16d, e).

(a) Quantifizierung von De-novo-Verbindungen bei gesunden Spendern (Cont, n = 20) und bei UC-Patienten (n = 206) aus den RNA-seq-Daten der PROTECT UC-Kohorte (GSE109142). De-novo-Verbindungen wurden als Verbindungen definiert, die in der hg19-Version des menschlichen Genoms nicht annotiert waren und sowohl bei gesunden Spendern als auch bei UC-Patienten nicht vorhanden waren. Die angezeigten Werte wurden anhand der Gesamtzahl der Lesevorgänge in jedem RNA-Seq-Experiment normalisiert, um eventuellen Schwankungen in der Tiefe der Sequenzierung Rechnung zu tragen. Der P-Wert wurde mit einem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test berechnet. Die Mitte des Boxplots gibt den Median an, das (x) gibt den Mittelwert an, die Grenzen der Box geben das 1. und 3. Quartil an, die unteren und oberen Whisker definieren Minima und Maxima. Wenn Ausreißer vorhanden sind, erstrecken sich Whisker stattdessen um das 1,5-fache des Interquartilbereichs. Ausreißer werden als Punkt dargestellt. (b) String-Diagramm, das die normalisierte De-novo-Übergangszahl für jeden Spender darstellt (gesunde in blau, UC-Patienten in rot). Die eingerahmten Bereiche stellen ungefähr die Patienten dar, die in den angegebenen Quartilen enthalten sind. (c) Gene, die zwischen Patienten im unteren und oberen Quartil unterschiedlich exprimiert wurden (> 1,5-fach, P-Wert < 0,01), wurden mit Anmerkungen zur Genontologie verglichen. In der Kategorie „biologische Prozesse“ sind deutlich angereicherte Signalwege (P-Wert < 0,01) angegeben. (d) De-novo-Junctions wurden an Genen quantifiziert, die transkriptionell <1,5-fach zwischen gesunden Spendern und UC-Patienten betroffen waren. Für jede angegebene Erkrankung haben wir Gene gezählt, die eine De-novo-Verbindung um das 1,5-fache oder mehr erreichten (p Val < 0,01). (e) Spleißverbindungen bei einem repräsentativen gesunden Spender und einem repräsentativen UC-Patienten wurden mit einem Genombrowser in der Nachbarschaft des LMNA-Gens visualisiert (rot dargestellt). Jeder Balken stellt ein Donor/Akzeptor-Paar dar, das sich von der 5′- bis zur 3′-Spleißstelle erstreckt. Die Histogramme in den oberen Spuren stellen die lokale Lesedichte in den RNA-seq-Daten dar. Der UC-Patient wurde im oberen Quartil ausgewählt, weist jedoch nicht die höchste De-novo-Junction-Anzahl (f–h) auf. Taqman Assays Lamin A und Progerin in der Kontrolle (n = 17), Morbus Crohn (CD, n = 16) und Colitis ulcerosa (UC, n = 19) Populationen, cDNA wurde aus Dickdarmbiopsien extrahiert. Mann-Witney-U-Test. (h) Beispiel für Sequenzierungsdaten aus den Taqman-PCR-Endprodukten bei einem UC-Patienten. Menschlicher Fibroblasten eines HGPS-Patienten wurde als Positivkontrolle verwendet, UC = Colitis ulcerosa. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Somit weisen diese Beobachtungen auf eine weitreichende Deregulierung der Spleißpräzision bei UC hin. Das Progerin-Transkript erweist sich als potenzieller Marker für UC und dieses erhöhte Spleißgeräusch. Abschließend unterstreichen unsere Beobachtungen den prädiktiven Wert der Cbx3-KO-Maus bei der Modellierung dieser Krankheit.

Während die Rolle des RNA-Metabolismus bei neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankungen und Erkrankungen des vorzeitigen Alterns ausführlich beschrieben wurde40, war sie bei Darmerkrankungen weitgehend unerforscht. Die vorliegende Arbeit definiert HP1γ als ein Protein, das die Genauigkeit des RNA-Spleißes im Darmepithel sicherstellt und die Auswirkungen natürlich vorkommender nicht-kanonischer Spleißereignisse begrenzt. Nicht-kanonische Spleißaktivität wird häufig als „Spleißgeräusch“23 bezeichnet. Während in Nicht-Säugetier-Tiermodellen lautes Spleißen die Vielfalt der mRNA-Spleißvarianten mit möglichen physiologischen Funktionen fördern kann41,42, bleibt seine Bedeutung bei Säugetieren unklar. Im letzteren Fall kann die allgegenwärtige fehlerhafte Spleißaktivität ein Treiber der Genomentwicklung sein43, sie wurde aber auch mit menschlichen Pathologien in Verbindung gebracht, einschließlich Krebs und neurogenerativen Erkrankungen, die eine globale Aktivierung nichtkanonischer Spleißstellen beinhalten25,26,27,44. Es wurde gezeigt, dass nur wenige RNA-Bindungsproteine, darunter Rbm17, hnRNP und TP4326,27, kryptisches Spleißen weltweit dämpfen. Basierend auf der vorliegenden Studie kann HP1 nun zu dieser Liste hinzugefügt werden, da es eine grundlegende Rolle im Darmepithel spielt. Die Auswirkung des HP1γ-Mangels auf das Spleißen reichte aus, um die Produktion von Progerin zu induzieren, einer normalerweise unterdrückten Spleißvariante des Lmna-Gens in Abwesenheit einer HGPS-Mutation. Allgemeiner ausgedrückt waren die Auswirkungen der HP1γ-Inaktivierung auf das Spleißen auf eine scheinbar allgemeine Verringerung der Präzision des Spleißens zurückzuführen. Dies wurde durch die RNA-seq-Daten dokumentiert, in denen Junction-Reads zunehmend an nicht annotierten Spleißverbindungen und an Stellen mit sehr schlechten Donor- oder Akzeptor-Konsensussequenzen festgestellt wurden. Der Effekt war auch durch semiquantitative PCR beobachtbar und ergab einen komplexen Satz von Produkten in den mutierten Mäusen, wobei Primer eine einzelne Spezies aus den Wildtyp-Geweben produzierten. Während diese verringerte Stringenz bei der Auswahl der Spleißstellen mehrere Ursachen haben kann, einschließlich einer möglichen Entkopplung zwischen Transkription und Spleißen, stellen wir fest, dass unser proteomischer Ansatz für HP1γ-Molekülpartner zahlreiche Spleißfaktoren entdeckt hat, die die Verwendung nur echter Spleißstellen gewährleisten. Dazu gehörten Komponenten des Hauptspleißosoms (U2-abhängig) sowie Hilfsspleißfaktoren, die für die Spleißosomenerkennung von Konsensussequenzen wesentlich sind. Bei der Untersuchung der verfügbaren Knock-out-Daten für einige dieser Spleißfaktoren stellten wir fest, dass ihre Inaktivierung zu einem Spleißgeräusch führte, das dem ähnelte, das bei der Inaktivierung von Cbx3 beobachtet wurde. Zu den untersuchten Spleißfaktoren gehörten das Ser/Arg-reiche SRSF5, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es die Progerinproduktion reduziert, indem es das Spleißen in Richtung der Verwendung von Lamin A 5'SS umleitet37, 45, und PPL1, eine Peptidylprolylisomerase-ähnliche Spleißosomenkomponente, deren Inaktivierung bei fehlerhafter Verwendung zu Spleißveränderungen führt von schwachen Spleißstellen28 und auch ZC3H13, ein Zinkfingerprotein, das den Spiegel von RNA-N6-Methyladenosin reguliert29, eine Modifikation, die an verschiedenen Aspekten des RNA-Metabolismus beteiligt ist, einschließlich des RNA-Spleißens46,47,48. Wir schlagen daher ein Modell vor, in dem HP1γ das Spleißrauschen reduziert, indem es die Rekrutierung von Proteinen, die an der Präzision von Spleißentscheidungen beteiligt sind, in die Chromatin-Matrize begünstigt. Die Abhängigkeit von HP1γ von Hilfsregulatoren des Spleißens kann auch durch seinen regionalen Einfluss auf das Spleißen veranschaulicht werden, möglicherweise als Funktion der in jedem Gewebe oder Zelltyp verfügbaren Spleißregulatoren. Insbesondere stellten wir einen Gradienten der Progerinexpression entlang der Krypta-Zotten-Achse fest, wobei das ISC-Kompartiment außer Acht gelassen wurde. Letzteres lässt auf eine Modulation des Spleißens schließen, die möglicherweise mit dem zellulären Entwicklungszustand zusammenhängt, eine Annahme, die durch das HGPS-iPSCs-Modell weiter gestützt wird, bei dem Progerin nur bei Zellbindung beobachtet wurde. Während unsere Daten hauptsächlich auf einen Einfluss von HP1γ über die Rekrutierung von Spleißosomen hinweisen, kann auch eine Beteiligung von HP1γ am Abbau defekter Spleißprodukte in Betracht gezogen werden, wie durch die Beteiligung des Hefe-HP1-Homologs an der Begleitung perizentromerer Transkripte zur RNA-Zerfallsmaschinerie nahegelegt wird50.

Bevor die Rolle von HP1 mit dem Spleißen in Verbindung gebracht wurde, war dieses Protein hauptsächlich als Mediator der Heterochromatin-abhängigen Stummschaltung bekannt und unterdrückte die Transkription an wiederholten DNA-Sequenzen, einschließlich rDNA-Loci, und an einer Untergruppe von Genpromotoren2,17,51,52,53 . Unsere Inaktivierung von HP1γ im Mäusedarm zeigte deutlich, dass die HP1-abhängige Transkriptionsrepression für die Biologie des Darms von wesentlicher Bedeutung ist und an der Stummschaltung von Genen beteiligt ist, die Proliferation und Entzündung steuern. Diese Experimente zeigen auch, dass HP1γ an rDNA-Loci eine Rolle spielt und ribosomale Gene während der Reifung von Epithelzellen unterdrückt. Anders als zuvor bei der Inaktivierung der H3K9-Methyltransferase Setdb1 im Darm 20, 21 oder dem dreifachen Knock-out von HP1α, HP1β und HP1γ in der Leber 54 (ergänzende Abbildung 7) hatte die Inaktivierung von HP1γ jedoch keinen Einfluss auf die Stummschaltung endogener Proteine Retroviren (ERV) werden normalerweise durch eingestreute heterochromatische Strukturen in Schach gehalten. Ebenso blieb die Gesamtorganisation der Chromozentren bei der HP1γ-Inaktivierung erhalten. Allerdings kann die Möglichkeit einer Auswirkung eines HP1γ-Mangels auf die Integrität der Heterochromatinstrukturen ohne globalen Verlust des Heterochromatinzustands zum jetzigen Zeitpunkt nicht ausgeschlossen werden.

Zusammenfassend veranschaulichen unsere Beobachtungen die homöostatischen Funktionen von HP1γ, die an wesentlichen Aktivitäten sowohl in Euchromatin als auch in Heterochromatin beteiligt sind. Die zuvor beschriebene Rolle von HP1 für die Gewebelebensdauer aller Arten53,55 könnte weitgehend auf dieser Polyvalenz beruhen. Obwohl keine menschliche Krankheit eindeutig mit HP1-Genmutationen in Verbindung gebracht werden konnte, wurde über eine verringerte HP1-Expression bei Syndromen beschleunigten Alterns berichtet, darunter das Werner-Syndrom und HGPS56,57,58. Wir haben in ähnlicher Weise eine starke Verringerung der HP1-Expression bei UC-Patienten sowie in für diese Krankheit relevanten Mausmodellen festgestellt. Aus unserem Cbx3-KO-Mausmodell kamen wir zu dem Schluss, dass ein HP1γ-Mangel abweichende Signalwege unterstützen kann, die sowohl Entzündungen als auch Spleißdefekte an wichtigen homöostatischen Genen begünstigen. Ebenso veranlasst uns der erhöhte Nachweis von Progerin im UC-Dickdarmgewebe zu der Vermutung, dass, ähnlich wie bei den Cbx3-KO-Mäusen, die Lamin-A-Spleißvariante nur die „Spitze des Eisbergs“ ist, was auf eine umfassendere Störung der RNA hinweist Spleißpräzision, die von UC-Patienten ertragen wird und durch die PROTECT UC-Patientenkohorte deutlich veranschaulicht wird. Die Identifizierung von Mechanismen, die auf RNA-Spleißstörungen im chronisch entzündeten Darm beruhen und noch in den Kinderschuhen stecken,59,60,61 dürfte unser Verständnis des Funktionsabfalls im Darmepithel von IBD-Patienten verändern.

C57BL/6 Cbx3fl/fl-Mäuse (bereitgestellt von Dr. Florence Cammas, IRCM, Montpellier, Frankreich) wurden mit Villin-CreERT2-Mäusen (bereitgestellt von Dr. Cohen-Tannoudji, Institut Pasteur, Paris, Frankreich) gekreuzt, um die C57BL/6-Villin-Mäuse zu produzieren. creERT2:Cbx3-/- Mausmodell (diese Studie). C57BL/6 heterozygote LmnaG609G/G609G-Mäuse (hier als HGPS-Mäuse bezeichnet) wurden von Dr. Maria Eriksson (Karolinska Institutet, Schweden) bereitgestellt. Männliche und weibliche Mäuse wurden mit einem Nagetierfutter mit Standarddiät (SD) (2018 Teklad Global 18 % Protein Rodent Diet, Harlan) gefüttert, das zu 60 % aus Kohlenhydraten bestand und ad libitum gefüttert wurde. Die Tiere wurden bei einem Licht-Ein/Aus-Zyklus von 12 Stunden/12 Stunden (8 Uhr/20 Uhr), einer Temperatur von 22 °C ± 2 und einer Luftfeuchtigkeit zwischen 50–70 % gehalten. Tamoxifen (0,5 mg/g), verdünnt in 20 %iger ClinOleinsäure, wurde über eine orale Sonde verabreicht, in 3 Dosen alle 5 Tage, wie beschrieben62. Kontrollmäuse erhielten 20 % ClinOleinsäure allein durch orale Sondenernährung. Zusätzliche Kontrollen unter Verwendung von Cbx3fl/fl-Mäusen, die die Cre-Rekombinase nicht exprimieren, wurden identisch mit Tamoxifen behandelt. Alle Experimente unter Verwendung des Villin-creERT2:Cbx3-/--Mausmodells wurden mit männlichen oder weiblichen Mäusen im Alter von 2–3 Monaten durchgeführt. BrdU (Sigma) wurde 1 Stunde vor der Tötung mit 100 μg/g Tierkörpergewicht intraperitoneal (ip) injiziert. Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Universität Paris Descartes genehmigt (Zulassungsnummer 17-022).

Alle Patienten wurden in der Abteilung für Gastroenterologie (Hôpital Beaujon, Paris) beobachtet. Das Protokoll wurde von der örtlichen Ethikkommission (CPP-Ile de France IV Nr. 2009/17 und Nr. 2014-A01545-42) genehmigt und vor der Einschreibung wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Bei der endoskopischen Untersuchung in nicht entzündeten Bereichen wurde eine Pinch-Biopsie des Dickdarms durchgeführt, die die Extraktion der Epithelschicht ermöglichte, um einen Vergleich mit gesundem Gewebe in der Kontrollpopulation zu ermöglichen. Biopsien wurden im rechten oder linken Dickdarm oder bei Krebs mindestens 10 cm von der Krebsstelle entfernt durchgeführt. Für die immunhistologische Studie wurden 26 Patienten eingeschlossen, darunter 10 gesunde Kontrollpatienten und 16 CU-Patienten (detaillierte Angaben zur Population in den Zusatzdaten 1). Für die Transkriptionsstudie wurden 56 Patienten eingeschlossen, darunter 17 gesunde Kontrollpersonen, 19 UC- und 16 CD-Patienten mit Dickdarmbeteiligung (detaillierte Angaben zur Population finden Sie in den ergänzenden Daten 12). Die Gesamt-RNA wurde mit RNAble (Eurobio) aus menschlichen Biopsien extrahiert und unter Verwendung eines ND-1000 NanoDrop-Spektrophotometers (NanoDrop Technologies) quantifiziert. Die reverse Transkription der gesamten mRNA wurde unter Verwendung von M-MLV RT (Invitrogen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

Patienten mit menschlichen Hautfibroblasten, die die HGPS p.Gly608Gly-Mutation trugen, wurden aus dem Coriell Cell Repository bezogen. Caco2 (TC7-Zellen, authentifiziert durch ECACC) wurden zur Erzeugung der CRISPR/Cas9-vermittelten Cbx3-Zelllinie verwendet. Der pSpCas9(BB)−2A-GFP (PX458)-Vektor, der Cas9-Endonuklease exprimiert (Geschenk von Feng Zhang, Addgene-Plasmid Nr. 48138), wurde mit einer Single-Guide-RNA (sgRNA) verknüpft, die speziell für das Cbx3-Gen entwickelt wurde. Zwei Sequenzleitfäden (GAAGAAAATTTAGATTGTCC und GAATATTTCCTGAAGTGGAA) wurden mit der Software ZiFiT Targeter Version 4.2 definiert. Die Insertion des Sequenzleitfadens erfolgte in der BbsI-Restriktionsstelle des PX458-Vektors und die Überprüfung durch Sequenzierung. Die Transfektion in TC7-Zellen wurde mit Lipofectamine 2000 durchgeführt und einzelne Klone für jeden Sequenzleitfaden wurden durch FACS entsprechend dem GFP-Signal ausgewählt. Transfektionen in HEK293T wurden durch DNA-Calciumphosphat-Präzipitate unter Verwendung von 5 µg pLVX-Expressionsvektor für Flag-V5-markierte Tomate, SRp20, RBM39 oder TRA2β63 und mit 5 µg pSG5-HA64 durchgeführt.

Der Darm (Ileum oder Dickdarm) wurde gesammelt, mit PBS bei 4 °C gewaschen und in etwa 5 mm große Stücke geschnitten. Darmfragmente wurden über Nacht bei 4 °C mit Formalin fixiert. Nach der Fixierung wurden Darmfragmente in Paraffinblöcke eingeschlossen. Paraffinschnitte wurden in einem Mikrotom Leica RM2125 RTS mit einer Dicke von 4 μm durchgeführt. Anschließend erfolgte die Entparaffinierung und Rehydratisierung der Proben durch Eintauchen in Xylol (2 × 10 Min.), absolutes Ethanol 5 Min., 90 % Ethanol 5 Min., 70 % Ethanol 5 Min. und destilliertes Wasser (2 × 5 Min.). bei RT Schließlich wurde das Antigen unter Verwendung der EDTA-Kochtechnik für 30 Minuten bei 95 °C demaskiert, gefolgt von 20 Minuten bei RT. Alle Proben wurden nacheinander 15 Minuten lang mit 0,1 M Glycin in PBS und 30 Minuten lang mit 3 % BSA in PBS behandelt und 0,5 % Triton X-100 in PBS für 2 Stunden (Mausgewebe). Im Falle einer Nukleolinfärbung wurden Gewebeschnitte 1 Minute lang bei RT mit 0,05 mg/ml Proteinase K inkubiert und anschließend 15 Minuten lang bei RT mit 2 mg/ml Glycin gewaschen. Anschließend wurden sie über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert, mit 0,05 % Tween-20 in PBS gewaschen, 1 Stunde lang im spezifischen Sekundärantikörper, konjugiert mit Alexa 488 oder Cy3 (Jackson, USA), und 15 Minuten lang mit DAPI (1 μg) inkubiert /ml), in PBS gewaschen und mit dem Antifading-Medium VECTASHIELD® (Vector Laboratories) montiert. Anti-HP1γ (2MOD-IG6, Thermo Scientific), HP1β (1MOD-1A9, Thermo Scientific), HP1α (2H4E9, Novus Biologicals), Ki67 (ab16667, Abcam), Olmf4 (D6Y5A, Cell Signalling), BrdU (MA3-071 Als Primärantikörper wurden LaminB1 (ab65986, Abcam), Progerin (13A4DA, sc-81611, Santa Cruz), γTubulin (4D11, Thermo Scientific) und Nucleolin (ab22758, Abcam) verwendet. Die Kerne wurden mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 62248, Thermo Scientific) gefärbt.

Mikroskopiebilder wurden mit einem strukturierten Beleuchtungsmikroskop ZEISS Apotome.2 (Zeiss, Deutschland) unter Verwendung eines 63-fachen Ölobjektivs (1,4 NA) aufgenommen. Um überlappende Signale zu vermeiden, wurden Bilder durch sequentielle Anregung bei 488 und 543 nm erhalten, um A488 bzw. Cy3 nachzuweisen. Die Bilder wurden mit der ZEISS ZEN lite-Software verarbeitet. Die quantitative Analyse des Immunfluoreszenzsignals wurde mit ImageJ durchgeführt. Die Werte werden als mittlere Fluoreszenzintensität im Verhältnis zu Kontrollproben dargestellt.

Die Technik wurde von Nigro et al., 201965 übernommen. Dünndarm oder Dickdarm wurden gesammelt und mit PBS bei 4 °C gewaschen und in etwa 5 mm lange Stücke geschnitten. Zur Epithelisolierung wurden Darmfragmente 30 Minuten bei 4 °C in 10 mM EDTA inkubiert, anschließend auf 0,1 % BSA in PBS übertragen und 30–60 Sekunden lang verwirbelt. Die Überstände (die die Epithelzellen enthielten) wurden mit einem 70-μm-Zellsieb filtriert. Bei diesem Schritt passierten die Krypten das Zellsieb und die Zotten blieben darauf zurück. Krypta- und Zottenfraktionen wurden dann getrennt zentrifugiert und die Pellets bis zur Verarbeitung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Qualität der Trennung wurde durch die Expression der selektiven Expression von Stammmarkern in den Krypten, aber nicht in den Zotten bestimmt, was durch RNA-Sequenzierung bestätigt wurde. Für die Organoidproduktion wurde das Kryptapellet zerlegt und wie beschrieben in Matrigel kultiviert65. Die EdU-Färbung wurde mit dem Click-iT™ EdU Cell Proliferation Kit for Imaging (Thermo Fisher) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt.

In TC7-Zellen wurde die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durch Kryofixierung/Gefriersubstitution durchgeführt. Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C mit 3,7 % Paraformaldehyd, 1 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen pelletiert und mit Osmiumtetroxid (OsO4) und Uranylacetat kontrastiert. Anschließend wurden die Zellen für mindestens 3 Tage bei –80 °C in Gefriersubstitutionsmedium eingeschlossen, in steigenden Methanolkonzentrationen bei –20 °C dehydriert, bei –20 °C in Lowicryl K4 M eingebettet und mit ultravioletter Bestrahlung polymerisiert. Ultradünne Schnitte wurden auf Nickelgitter montiert, mit Bleicitrat und Uranylacetat gefärbt und mit einem JEOL 1011-Elektronenmikroskop untersucht.

Darmgewebefragmente von etwa 500 mm wurden über Nacht bei 4 °C mit 3,7 % Paraformaldehyd, 1 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer über Nacht bei 4 °C fixiert. Kleine Gewebefragmente wurden in 0,1 M Cacodylatpuffer gewaschen, in steigenden Methanolkonzentrationen bei –20 °C dehydriert, bei –20 °C in Lowicryl K4 M eingebettet und mit ultravioletter Bestrahlung polymerisiert. Es wurden ultradünne Abschnitte montiert.

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Trizol (TR-118, Molecular Research Center, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers und der DNAse-Behandlung extrahiert. RNA-Proben wurden mit einem Spektrophotometer (Nanodrop Technologies ND-1000) quantifiziert. Erststrang-cDNA wurde durch RT-PCR unter Verwendung eines RevertAIT H Minus Erststrang-cDNA-Synthesekits (Thermo Scientific) synthetisiert. qPCR wurde mit dem Mx3005P-System (Stratagene) mit Automatisierungsaufsatz durchgeführt. Für die semiquantitative Maus-Progerin- und Lamin-A-PCR wurden, wie berichtet, auf Exon 9 und 12 verschachtelte Primer verwendet (F: GTGGAAGGCGCAGAACACCT R: GTGAGGGGGGAGCAGGTG)66. Für die Echtzeit-PCR-Amplifikation wurde der TaqMan-Assay mit vorgefertigten Primern für Maus-GAPDH (Mm99999915_g1), Maus-Lamin A, das Progerin oder DNA nicht erkennt (Assay-ID: APGZJEM), Maus-Progerin (F: ACTGCAGCGGCTCGGGG R: GTTCTGGGAGCTCTGGGCT und Sonde: CGCTGAGTACAACCT). Diese Primer-Sonden-Paare wurden weiter für den TaqMan ddPCR-Assay an cDNA-Proben verwendet. Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) wurde an cDNA-Proben unter Verwendung des TaqMan-Sonden-basierten Assays durchgeführt, der zuvor für Maus-lmna und Progerin mit ddPCR Supermix für Sonden (Bio-Rad) beschrieben wurde. Aus der Reaktionsmischung wurden mit einem Tröpfchengenerator (Bio-Rad QX200) Tröpfchen erzeugt. Die PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: nach Enzymaktivierung bei 95 °C für 10 Minuten (1 Zyklus), 50 Zyklen mit zwei Schritten während 20 Sekunden bei 95 °C, 40 Sekunden bei 60 °C, gefolgt von Enzymdeaktivierung für 10 Minuten bei 98 °C C. PCR-Tröpfchen wurden im automatischen Tröpfchenlesegerät (Bio-Rad QX200) gemessen. Die Rohtranskriptzahl pro μl wurde mit der Quantasoft-Software (Bio-Rad) berechnet. Für jede Probe und jedes Transkript wurden mindestens zwei Wiederholungsexperimente durchgeführt.

Zum Nachweis von Lamin A und Progerin in menschlichen cDNAs waren die Primer-Sonden-Paare wie folgt: menschliches Lamin A (F: TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG R: AGTTCTGGGGGCTCTGGGT und Sonde ACTCGCAGCTACCG), menschliches Progerin (F: ACTGCAGCAGCTCGGGG R: TCTGGGGGCTCTGGGCTCCT und Sonde CGCTGAGTACAACCT), menschliches GAPDH (Hs00266705_g1). Für die auf SYBRGreen (Takara) basierende qPCR wurden die folgenden Primer verwendet: Maus Ascl2 (F: GGT GAC TCC TGG TGG ACC TA; R: TCC GGA AGA TGG AAG ATG TC) Maus Olfm4 (F: ATC AGC GCT CCT TCT GTG AT R: AGG GTT CTC TCT GGA TGC TG) Maus TNF-α (F: GATCTCAAAGACAACCAACATGTG R: CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG) Maus IL1-β (F:TACAGGCTCCGAGATGAACAAC R: TGCCGTCTTTCATTACACAGGA) Maus IL6 (F: ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTT R: CAGGTCTGTTGGGAGTGGTATC) Maus Sucras e Isomaltase (F: CGTGCAAATGGTGCCGAATA R: TCCTGGCCA TACCTCTCCAA) GAPDH (F: TGACCACAGTCCATGCCATC; R: GACGGACACATTGGGGGTAG) Maus 45 S (F: GAACGGTGGTGTGTCGTT; R: GCGTCTCGTCTCGTCTCACT). Maus 18 S: (F: GATGGTAGTCGCCGTGCC; R: CCAAAGGAAGGCAGCAGGC).

Zur Spleißvalidierung im Darmgewebe von Mäusen wurde das MAJIQ-Paket verwendet, um unterschiedlich gespleißte Gene zwischen Cbx3-KO- und Ctrl-Mäusen zu erkennen. Für jede Probe wurde die Anzahl der Lesevorgänge, die die angegebenen Verbindungsstellen abdeckten, verwendet, um den Anteil jeder Verbindungsstelle zu berechnen, an dem die Quell- und Ziel-Exons beteiligt waren, und als Histogramme des Prozentsatzes der angegebenen Variante dargestellt. Der Spleißindex (Δψ) wurde unter Verwendung der Formel Δψ = Variante1/(Variante1 + Variante2) berechnet und als Verhältnis oder Prozentsatz dargestellt, wie in den Abbildungen angegeben. Die 6 RNA-seq-Proben wurden zur Berechnung der Durchschnittswerte (±Abweichung) und des p-Werts mit dem Student-t-Test (zweiseitig) verwendet: P < 0,05 (*), P < 0,01(**), P < 0,001 ( ***). Die für Spleißvalidierungen verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 unter „Ergänzende Informationen“ beschrieben.

Die Gesamt-RNA wurde aus Kontroll- und Cbx3-KO-Epithelzellen aus dem Dünndarm (Krypten und Zotten) und Dickdarmepithelien (n = 3 für jede Gruppe von Mäusen, also insgesamt 6 × 3 = 18 RNA-Proben) durch Guanidiniumthiocyanat-Phenol-extrahiert. Chloroform-Extraktion und DNAse-Behandlung gemäß den Herstellerangaben. Die gesamte Vorbereitung und Sequenzierung der RNA-Bibliothek wurde von Novogene Co., Ltd als lncRNA-Sequenzierungsdienst durchgeführt, einschließlich der Vorbereitung der gerichteten lncRNA-Bibliothek mit rRNA-Depletion (Ribo-Zero Magnetic Kit), Quantifizierung, Pooling und PE 150-Sequenzierung (30 G-Rohdaten). auf der Illumina HiSeq 2500-Plattform. Durch das Filtern und Trimmen der RNA-Seq-Daten blieben etwa 230–300 Millionen Lesepaare/Probe übrig.

Die Genexpressionsanalyse und die Differential-Splicing-Analyse wurden von Novogene Co., Ltd unter Verwendung der Pakete DESeq2 (v1.18.1)67 und rMATS (v4.1.0)68 (Parameter: --libType fr-firststrand –novelSS) durchgeführt das mm10-Maus-Referenzgenom. Zur Bewertung kryptischer Spleißstellen wurden interne RNA-seq-Daten und öffentlich verfügbare Rbm17-KO-RNA-seq-Daten (GEO GSE79020) in der Maus-mm9-Annotationsdatei von Ensembl (Version 67) neu ausgerichtet. RNA-seq-Daten aus der PROTECT-Kohorte wurden mit der menschlichen GRCh37/hg19-Annotationsdatei von Ensembl abgeglichen. Die resultierenden BAM-Dateien wurden zum Generieren von Bigwig-Dateien verwendet, wobei bamCoverage (Parameter: --normalizeUsing CPM) von Deeptools (v3.1.3)69 verwendet wurde. Anschließend wurden die Koordinaten der mit Anmerkungen versehenen und nicht mit Anmerkungen versehenen Knotenpunkte aus den BAM-Dateien mithilfe von Regtools (https://github.com/griffithlab/regtools) abgerufen. Für jede der 6 Bedingungen wurden nicht kommentierte Verbindungsstellen aus den 3 Replikaten zusammengefasst, bevor die Verbindungsstellen, die sowohl unter WT- als auch unter KO-Bedingungen vorhanden waren, eliminiert wurden. Schließlich wurden Übergänge mit einer Größe von mehr als 20 kb als mögliche Artefakte des Alignments herausgefiltert. Die verbleibenden Verbindungen, die nie zwischen WT- und Mutantenproben geteilt wurden, wurden als de novo betrachtet. Um die Stärke der Spleißstellen zu quantifizieren, wurden DNA-Sequenzen, die die letzten 3 Nukleotide des Exons und die ersten 6 Nukleotide des Introns umfassten, für das 5'-Ende der Verbindung gewonnen. Für das 3'-Ende der Verbindung wurden die Sequenzen der letzten 20 Nukleotide des Introns und der ersten 3 Nukleotide des Exons gewonnen. Anschließend wurde die Stärke der Spleißstellen für jede Verbindungsstelle mithilfe des MaxEnt-Algorithmus69 berechnet. Der MaxEnt-Algorithmus wurde auch auf zufällige Kreuzungen angewendet, die durch Anwenden der „Shuffle“-Funktion der Bedtools-Suite (v.2.25.0)70 auf die Bettdateien mit De-novo-Verbindungen generiert wurden.

Zur Quantifizierung der LTR-Elemente wurden interne RNA-seq-Daten und HP1-Triple-KO-RNA-seq-Daten (GEO GSE119224) mit Ensembl-Annotation (Version 95) unter Verwendung von STAR (v2.6.0b)71 auf das mm10-Mausgenom abgebildet (Parameter: - -outFilterMismatchNmax 1 --outSAMmultNmax 1 --outFilterMultimapNmax 30). Die Lesequantifizierung in den verschiedenen LTR-Familien wurde mit featureCounts (v1.6.1)72 aus der Subread-Suite durchgeführt (Parameter: -s 2 für GSE119244 und Parameter: -p -B -C -s 2 für Colon, Crypt und Villi). LTR-Familien (ERK, ERV1, ERVL und ERL-MaLR) wurden aus dem UCSC mm10 RepeatMasker abgerufen.

Die GSEA-Analyse wurde (mit den Parametern -nperm 1000 -permute gene_set -collapse false) unter Verwendung derselben Expressionsmatrix (v2.2.2) durchgeführt und dabei Strg- und Cbx3-KO-Proben in Krypta, Zotten und Dickdarm verglichen. Die für die Analyse verwendeten Transkriptionssignaturen wurden aus der Literatur für die lgr5-ISC-Signatur73, Enterozyten- und Paneth-Zellsignaturen74 und GSEA-Datenbanken (MSigDB-Hallmark-Gen-Set) extrahiert.

Genomische DNA wurde aus Stuhlproben mit dem QIAamp Power Fecal DNA Kit (Qiagen) gewonnen und die DNA-Menge wurde mit einem TECAN Fluorometer (Qubit® dsDNA HS Assay Kit, Invitrogen) bestimmt. Die hypervariable V3-V4-Region des 16 S-rRNA-Gens wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: ein Vorwärts-43-Nukleotid-Fusionsprimer 5'CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC TAC GGR AGG CAG CAG3, bestehend aus den 28 nt Illumina Adapter (fette Schrift) und der 14-nt-Breitband-Bakterienprimer 343 F und eine umgekehrte 47-Nuklotid-Fusion 5′GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TTA CCA GGG TAT CTA ATC CT3′, bestehend aus dem 28-nt-Illuminata-Adapter ( Fettschrift) und dem 19-nt-Breitband-Bakterienprimer 784 R. Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 10 ng DNA, 0,5 µM Primern, 0,2 mM dNTP und 0,5 U der DNA-freien Taq-Polymerase MolTaq 16 S DNA durchgeführt Polymerase (Molzym). Die Amplifikationen wurden unter Verwendung des folgenden Profils durchgeführt: 1 Zyklus bei 94 °C für 60 s, gefolgt von 30 Zyklen bei 94 °C für 60 s, 65 °C für 60 s, 72 °C für 60 s und abschließend mit a Schritt bei 72 °C für 10 Min. Die PCR-Reaktionen wurden zur Sequenzierung mithilfe der Illumina Miseq-Technologie an die @Bridge-Plattform (INRAe, Jouy-en-Josas) gesendet. Das Einzelmultiplexing wurde unter Verwendung eines selbst erstellten 6-bp-Index durchgeführt, der während einer zweiten PCR mit 12 Zyklen unter Verwendung eines Vorwärtsprimers (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) und eines Rückwärtsprimers (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index GTGACTGGAGTTCAGACGTGT) zu R784 hinzugefügt wurde. Die resultierenden PCR-Produkte wurden gereinigt und gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Illumina MiSeq-Kartusche geladen. Die Qualität des Laufs wurde intern mit PhiX überprüft und anschließend wurden mit Hilfe des zuvor integrierten Index Sequenzen seiner Probe zugeordnet. Hochwertige gefilterte Lesevorgänge wurden mithilfe der FROGS-Pipeline (Find Rapidly OTU with Galaxy Solution) weiter zusammengestellt und verarbeitet, um dank der Galaxy-Instanz (https://migale.inra.fr/galaxy) OTUs und ihre jeweilige taxonomische Zuordnung zu erhalten. In jedem Datensatz wurden mehr als 97 % der Paired-End-Sequenzen unter Verwendung einer Überlappung von mindestens 10 bp zwischen den Vorwärts- und Rückwärtssequenzen zusammengesetzt. Die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfassten das Entrauschen und Clustering der Sequenzen in OTUs mithilfe von SWARM und die Entfernung von Chimären mithilfe von VSEARCh. Anschließend wurden die Clusterhäufigkeiten auf 0,005 % gefiltert. Einhundert Prozent der Cluster wurden mithilfe einer Silva138 16 S-Referenzdatenbank und dem taxonomischen Zuordnungsverfahren für Klassifikatoren des RDP (Ribosomal Database Project) der OTU zugeordnet. Reichtums- und Diversitätsindizes der Bakteriengemeinschaft sowie Clusterbildung und Ordinationen wurden mit dem Phyloseq-Paket (Version 1.19.1) in der RStudio-Software75 berechnet. Die Divergenz in der Gemeinschaftszusammensetzung zwischen den Proben wurde quantitativ durch Berechnung des β-Diversitätsindex (UniFrac und gewichtete UniFrac-Distanzmatrizen) bewertet. Für die Heatmap wurde ein negatives Binomialmodell an jede OTU angepasst, wobei DESeq267 mit Standardparametern verwendet wurde, um die Log-Fold-Änderungen (FCs) der Häufigkeit abzuschätzen. Die P-Werte wurden für mehrere Tests mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens korrigiert, um die Falscherkennungsrate zu kontrollieren, und signifikante OTUs wurden basierend auf der Effektgröße ausgewählt (FC > | 2 |, angepasster P-Wert < 0,05).

Immunpräzipitations-Eluate wurden nach einem leicht modifizierten FASP-Protokoll76 verdaut. Kurz gesagt, Proteine ​​wurden mit 100 mM DTT (Dithiothreitol) 1 Stunde lang bei 60 °C reduziert. Die Proteine ​​wurden 30 Minuten lang durch Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur mit 100 µL 50 mM Iodacetamid alkyliert. Die Proben wurden mit 2 µl modifiziertem Trypsin in Sequenzierungsqualität (Promega, WI, USA) 16 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Die Peptide wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 15.000 × g gesammelt, gefolgt von einem Waschen mit 50 mM Ammoniumbicarbonat und vakuumgetrocknet.

Die Peptide wurden vor der MS-Analyse in 21 µl 10 % ACN, 0,1 % TFA in Wasser in HPLC-Qualität resuspendiert. Für jeden Lauf wurden 5 µL in einen nanoRSLC-Q Exactive PLUS (RSLC Ultimate 3000) (Thermo Scientific, Waltham MA, USA) injiziert. Die Peptide wurden auf eine µ-Vorsäule (Acclaim PepMap 100 C18, Kartusche, 300 µm Innendurchmesser × 5 mm, 5 µm) (Thermo Scientific) geladen und auf einer 50 cm langen Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographiesäule (0,075 mm Innendurchmesser, Acclaim) aufgetrennt PepMap 100, C18, 2 µm) (Thermo Scientific). Chromatographielösungsmittel waren (A) 0,1 % Ameisensäure in Wasser und (B) 80 % Acetonitril, 0,08 % Ameisensäure. Peptide wurden mit dem folgenden Gradienten von der Säule eluiert: 5–40 % B (38 Min.), 40–80 % (1 Min.). Nach 39 Minuten blieb der Gradient 4 Minuten lang bei 80 % und nach 43 Minuten kehrte er auf 5 % zurück, um die Säule vor der nächsten Injektion 16 Minuten lang wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Zwischen jeder Serie wurden zwei Leerwerte gemessen, um eine Probenverschleppung zu verhindern. Aus der Säule eluierende Peptide wurden mittels datenabhängiger MS/MS unter Verwendung der Top-10-Erfassungsmethode analysiert. Peptide wurden mithilfe der Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (HCD) fragmentiert. Kurz gesagt waren die Geräteeinstellungen wie folgt: Die Auflösung wurde für MS-Scans auf 70.000 und für die datenabhängigen MS/MS-Scans auf 17.500 eingestellt, um die Geschwindigkeit zu erhöhen. Das MS AGC-Ziel wurde auf 3,106 Zählungen mit einer maximalen Injektionszeit von 200 ms eingestellt, während das MS/MS AGC-Ziel auf 1,105 mit einer maximalen Injektionszeit von 120 ms eingestellt wurde. Der MS-Scanbereich lag zwischen 400 und 2000 m/z.

Rohdateien, die den immunpräzipitierten Proteinen entsprechen, wurden mit der Software MaxQuant 1.5.5.1 anhand der Human Uniprot KB/Swiss-Prot-Datenbank 2016-0177 analysiert. Zur Suche nach Elternmasse und Fragmentionen legen wir eine Massenabweichung von 3 ppm bzw. 20 ppm fest, eine Übereinstimmung zwischen den Läufen ist nicht zulässig. Carbamidomethylierung (Cys) wurde als feste Modifikation festgelegt, während Oxidation (Met) und N-Term-Acetylierung als variable Modifikationen festgelegt wurden. Die Falscherkennungsraten (FDRs) auf Protein- und Peptidebene wurden auf 1 % festgelegt. Die Ergebnisse wurden mit MaxQuant wie zuvor beschrieben77 berechnet. Die Peptide wurden anhand der MaxQuant MS1-Signalintensitäten quantifiziert. Statistische und bioinformatische Analysen, einschließlich Vulkandiagramm, wurden mit der Perseus-Softwareversion 1.6.7.0 (frei verfügbar unter www.perseus-framework.org) durchgeführt. Zum statistischen Vergleich haben wir zwei Gruppen festgelegt, IP und Negativkontrolle, die jeweils 3 biologische Replikate enthalten. Wir behielten dann nur Proteine ​​bei, die in mindestens einer Gruppe dreimal quantifiziert wurden. Als nächstes wurden die Daten imputiert, um fehlende Datenpunkte zu füllen, indem eine Gaußsche Verteilung von Zufallszahlen mit einer Standardabweichung von 33 % relativ zur Standardabweichung der Messwerte und einer Herunterverschiebung des Mittelwerts um 3 Standardabweichungen erstellt wurde, um die Verteilung eines niedrigen Signals zu simulieren Werte. Wir haben einen T-Test durchgeführt und die Daten in einem Vulkandiagramm dargestellt (FDR < 0,05, S0 = 1).

HEK293T- (CRL-1573, ATCC) oder HeLa-Zellen (CCL-2, ATCC) wurden in TNEN300:0,1-Puffer (50 mM Tris pH 8, 300 mM NaCl, 0,1 % NP40, 1 U/µl RNasin (Promega), 1X) extrahiert Proteaseinhibitor (Roche)) für 30 Minuten auf Eis mit Resuspension durch eine Spritze. Das denaturierte Chromatin wurde durch Herauspipettieren entfernt. Die Extrakte wurden auf 150 mM NaCl verdünnt und zur Hälfte mit 0,2 µg/ml RNaseA (DNase-frei, Roche) oder 0,1 U/µL RNasin ergänzt. Ein Viertel der 10-cm-Schale wurde über Nacht bei 4 °C auf dem Rad mit 3 µg Anti-V5-Antikörpern für transfizierte HEK293-Zellen und mit 1,5 µg Anti-SRSF1-Antikörpern für HeLa-Zellen immunpräzipitiert. Die Komplexe wurden mit G-Protein-Dynabeads (Dynal) 2 Stunden lang bei 4 °C am Rad gewonnen. Die Perlen wurden 5 Mal in 1 ml TNEN150:0,1 7 Minuten lang bei 4 °C auf dem Rad gewaschen, bevor sie 10 Minuten lang in Ladepuffer bei 100 °C denaturiert wurden. Die Proteine ​​wurden nach dem SDS-PAGE-Kriterium 4–12 % (Bio-Rad) aufgelöst.

Von Mäusen gereinigte Darmepithelzellen (mindestens n = 3 separate Experimente) wurden bei 4 °C in einem Puffer lysiert, der 25 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 1 % NP-40, 10 enthielt % Glycerin, 150 mM NaCl, und dann durch Zentrifugation bei 14.000 U/min für 30 Minuten bei 4 °C gereinigt. Die Proteine ​​wurden auf SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und nach Standardverfahren auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: monoklonaler Maus-Anti-Progerin-Antikörper (13A4DA, sc-81611, Santa Cruz, Verdünnung 1/50), Anti-HP1α (2H4E9, Novus Biologicals, Verdünnung 1/100), HP1β (1MOD-1A9, Thermo Scientific, Verdünnung 1/100) und HP1γ (2MOD-IG6, Thermo Scientific, Verdünnung 1/100) und γ-Tubulin (4D11, Thermo Scientific, Verdünnung 1/2000). Anti-HA (12CA5, Sigma, Verdünnung 1/1000), Anti-Flag M2 (Sigma, Verdünnung 1/1000), Anti-V5 (Bethyl A190-120A, Verdünnung 1/1000), Anti-SRSF1 (Santa Cruz sc- 33652, Verdünnung 1/250) Antikörper, Anti-Kaninchen-IgG Bright700 (BioRad, Verdünnung 1/5000), Anti-Maus-IgG Bright700 (BioRad, Verdünnung 1/5000). Das Western-Blot-Signal wurde mit Chemidoc Imaging (Bio Rad) erfasst.

Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe eines zweiseitigen Student-t-Tests mit GraphPad Prism untersucht. In allen Fällen wurde davon ausgegangen, dass die experimentellen Daten die T-Test-Anforderungen erfüllen (Normalverteilung und ähnliche Varianz); In den Fällen, in denen die Annahme des t-Tests nicht gültig war, wurde eine nichtparametrische statistische Methode verwendet (Mann-Whitney-Test). Die Unterschiede zwischen drei oder mehr Gruppen wurden durch eine einfaktorielle ANOVA getestet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

RNA-seq-Daten, die abgeleiteten mm9.bigwig-Dateien und die in dieser Studie generierten De-novo-Junction.bed-Dateien wurden in der NCBI Gene Expression Omnibus-Datenbank hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE192800 zugänglich. Proteomics-Daten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatz-ID PXD031580 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die in dieser Studie generierten 16 S rRNA-Gensequenzierungsdaten sind über die BioProject-Zugangsnummern PRJNA803986 verfügbar.

RNA-seq-Roh-Fastq-Dateien von GSE109142 (UC PROTECT-Kohorte), GSE145309 (Maus-ES Crispr KO Zc3h13) und GSE119244 (dreifaches Knockout von HP1α-, HP1β- und HP1γ-Mausleber) wurden aus der GEO-Datenbank von NCBI bezogen. PRJNA669300 (Ppil1A99T/A99T KI E14.5-Gehirne) und PRJNA708182 (SRSF5 KO-Mausherz) wurden aus der Datenbank von BioProject bezogen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Florence Cammas für die Bereitstellung der Cbx3fl/fl-Mäuse. Wir danken Dr. Zhou Zhongjun (Abteilung für Biochemie, Li Ka Shing-Fakultät für Medizin der Universität Hongkong) für die Bereitstellung von MEF von HGPS-Mäusen. Wir danken Dr. Cohen-Tannoudji für die Bereitstellung der Villin-CreERT2-Mäuse (Institut Pasteur, Paris, Frankreich). Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der „Agence National de la Recherche“ (ANR) (EPI-CURE, R16154KK von LA) und REVIVE (von CM), ein „Laboratoire d'Excellence“-Programm der ANR (2011–2021), unterstützt.

Universität Paris Cité, INSERM, CNRS, Necker-Institut für kranke Kinder, F-75015, Paris, Frankreich

Jorge Mata-Garrido, Yao Xiang, Yunhua Chang-Marchand, Caroline Reisacher, Elisabeth Ageron und Laurence Arbibe

Proteomics-Plattform Necker, Universität Paris Cité-Federative Research Structure Necker, INSERM US24/CNRS UAR3633, 75015, Paris, Frankreich

Ida Chiara Guerrera

Die Nanomedizin-Gruppe, Institut Valdecilla-IDIVAL, 39011, Santander, Spanien

Iñigo Casafont

Abteilung für Anatomie und Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Kantabrien, 39011, Santander, Spanien

Iñigo Casafont

Micalis Institute, Nationales Forschungsinstitut für Landwirtschaft, Ernährung und Umwelt (INRAE), AgroParisTech, Universität Paris-Saclay, UMR1319, F-78350, Jouy-en-Josas, Frankreich

Aurelia Bruneau & Claire Cherbuy

Pariser Zentrum für Mikrobiommedizin (PaCeMM) FHU, AP-HP, F-75571, Paris, Frankreich

Aurelia Bruneau & Claire Cherbuy

UMR-S 1149, Universität Paris Cité, Inserm, Forschungszentrum für Entzündungen, Team für Darmentzündungen, F-75018, Paris, Frankreich

Xavier Treton, Anne Dumay und Eric Ogier-Denis

IBD-Zentrum Paris, Privatklinikum Ambroise Pare-Hartmann, Neuilly, Frankreich

Xavier Treton

INSERM 1242 und Centre Eugene Marquis, Rennes, Frankreich

Eric Ogier-Denis

Sorbonne Université, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), CNRS-Abteilung für biologische Anpassung und Alterung (B2A), Epigenetik und RNA-Metabolismus bei menschlichen Krankheiten, 75005, Paris, Frankreich

Eric Batsché, Mickael Costallat und Christian Muchardt

Abteilung für Biowissenschaften und Ernährung, Zentrum für innovative Medizin, Karolinska Institutet, SE-141 57, Huddinge, Schweden

Gwladys Revêchon & Maria Eriksson

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JM-G. entwarf und führte die meisten Experimente durch und beteiligte sich am Schreiben der Arbeit; YX führte Experimente zum Spleißen und YC-M durch. auf HGPS-Mäusen; CR führte QPCR-Experimente an Mäusen mit Cbx3-KO- und IBD-Patienten durch; EA führte Immunfluoreszenzstudien durch; ICG führte eine Proteomanalyse durch; IC erstellte EM-Daten, AB führte DNA-Extraktion und PCR zur Mikrobiota-Analyse durch; CC führte eine Mikrobiota-Analyse anhand der 16-S-Sequenzierung durch; XT, EOD stellte medizinische Berichte und klinische Proben zur Verfügung und AD stellte den Patienten cDNA- und QPCR-Daten zur Verfügung; EB entwarf, führte und interpretierte Experimente zum Spleißen und zur ddPCR und beteiligte sich am Verfassen der Arbeit; MC führte den größten Teil der Bioinformatik an den RNA-seq-Daten des Mausmodells und der UC-Patienten durch; GR und ME stellten HGPS-Mäuse bereit; CM entwarf und beteiligte sich an der bioinformatischen Untersuchung des Spleißens und am Verfassen der Arbeit. LA konzipierte das Projekt, überwachte die Studie, schrieb und redigierte die Arbeit.

Korrespondenz mit Laurence Arbibe.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mata-Garrido, J., Xiang, Y., Chang-Marchand, Y. et al. Das Heterochromatin-Protein 1 ist ein Regulator der RNA-Spleißgenauigkeit, die bei Colitis ulcerosa mangelhaft ist. Nat Commun 13, 6834 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

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Eingegangen: 24. Januar 2022

Angenommen: 27. Oktober 2022

Veröffentlicht: 18. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

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