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Oct 21, 2023

Uropathogene Escherichia coli-Infektion

Nature Microbiology Band 8,

Nature Microbiology Band 8, Seiten 875–888 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Frühere Harnwegsinfektionen (HWI) können die Anfälligkeit für zukünftige Infektionen erhöhen. Allerdings sind die zugrunde liegenden Mechanismen, die das Wiederauftreten beeinflussen, kaum verstanden. Wir haben zuvor herausgefunden, dass Harnwegsinfekte bei Mäusen je nach Krankheitsverlauf einen unterschiedlichen Umbau des Blasenepithels (Urothel) verursachen, der sich auf die Anfälligkeit für wiederkehrende Harnwegsinfekte auswirkt. Hier verglichen wir urotheliale Stammzelllinien (USC), die aus Mäusen isoliert wurden, bei denen in der Vergangenheit entweder eine ausgeheilte oder eine chronische uropathogene Escherichia coli (UPEC)-Infektion aufgetreten war, und lieferten Hinweise auf molekulare Prägungen, die epigenetische Veränderungen mit sich brachten, darunter Unterschiede in der Zugänglichkeit des Chromatins, der DNA-Methylierung und der Histonmodifikation . Epigenetische Markierungen in USCs von chronisch infizierten Mäusen verstärkten den Caspase-1-vermittelten Zelltod nach einer UPEC-Infektion und förderten die bakterielle Clearance. Es trat auch eine erhöhte Ptgs2os2-Expression auf, die möglicherweise zu einer anhaltenden Cyclooxygenase-2-Expression, Blasenentzündung und Schleimhautverletzungen beitrug – Reaktionen, die mit schwerer wiederkehrender Zystitis verbunden sind. Somit wirkt eine UPEC-Infektion als Epi-Mutagen, das das Urothel-Epigenom neu programmiert, was zu einer urothelialen Umgestaltung und Schulung der angeborenen Reaktion auf eine nachfolgende Infektion führt.

Harnwegsinfektionen (HWI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen weltweit und sind eine wesentliche Ursache für Morbidität bei ansonsten gesunden Frauen1,2. Die hohe Rezidivrate bei anfälligen Personen macht die Behandlung zu einer Herausforderung3, wobei einer der stärksten Risikofaktoren für die Entwicklung einer Harnwegsinfektion eine frühere Harnwegsinfektion2 ist. Die biologischen Grundlagen für wiederkehrende Harnwegsinfektionen (rUTI) sind kaum bekannt.

Ohne Antibiotikabehandlung lösen sich akute Harnwegsinfekte beim Menschen entweder von selbst auf oder entwickeln sich zu lang anhaltenden chronischen Infektionen4. Die Infektion von C3H/HeN-Mäusen mit uropathogenem Escherichia coli (UPEC) fasst diese beiden Ergebnisse zusammen. Chronische Zystitis bei diesen Mäusen wird als anhaltende Bakteriurie mit hohem Titer (Bakterien im Urin), begleitet von chronischer Entzündung (sensibilisierte Mäuse), definiert, während das Abklingen der Infektion bei Mäusen als abgeheilt gilt5. Die Analyse der Blasen von aufgelösten und sensibilisierten Mäusen zeigt, dass eine Infektion zu einer unterschiedlichen Umgestaltung der Blase führt, die sich auf die Anfälligkeit für rUTI auswirkt. Aufgelöste Mäuse sind resistent gegen rUTI, teilweise weil sie eine beschleunigte, vorübergehende TNFα/Cyclooxygenase-2 (Cox-2)-Reaktion in der Blase haben, die eine schnelle Eliminierung der Infektion und Schleimhautheilung fördert6,7,8. Sensibilisierte Mäuse sind bei Belastung sehr anfällig für rUTIs, wobei eine starke, anhaltende TNFα- und Cox-2-Expression in der Blase eine Neutrophilentransmigration durch das Blasenepithel (Urothel) und Schleimhautverletzungen verursacht, die schwere wiederkehrende bakterielle Infektionen begünstigen6,7,8. Abhängig von der Krankheitsgeschichte wird das Blasengewebe also unterschiedlich umgestaltet, sodass die Anfälligkeit für rUTI entweder zunimmt oder abnimmt.

Diese Phänotypen führten zu unserer Hypothese, dass die Umgestaltung der Blasenschleimhaut teilweise durch epigenetische Veränderungen in Urothelstammzellen (USCs) vermittelt wird, die die Abwehr der Blasenschleimhaut gegen nachfolgende Infektionen beeinflussen6,7. Daher isolierten wir Epithelzellen aus den Blasen von Mäusen mit unterschiedlichen Krankheitsverläufen, etablierten primäre USC-Linien, vermehrten sie in Zellkulturen und bildeten in vitro polarisiertes und vollständig differenziertes Urothel, das morphologische Phänotypen aufwies, die den in vivo beobachteten Urothel-Remodelling-Phänotypen ähnelten6 . Wir identifizierten Unterschiede in der Zugänglichkeit des Chromatins, der DNA-Methylierung und den Histonmodifikationen in den USC-Linien, die mit Unterschieden in den Transkriptionsreaktionen, die den programmierten Zelltod beeinflussen, und Cyclooxygenase-2 (Cox-2)-regulierten Entzündungsreaktionen, die sich auf die Anfälligkeit für rUTI auswirken, korrespondierten. Insgesamt liefert unsere Studie epigenetische Beweise für eine epitheliale, trainierte Immunität, die durch eine bakterielle Schleimhautinfektion verursacht wird und die Reaktion der Blasenschleimhaut auf nachfolgende Infektionen abhängig vom ursprünglichen Krankheitsverlauf verändert. Dieser Befund könnte die hohe Prävalenz von rUTI erklären und wichtige therapeutische Implikationen für chronische/wiederkehrende bakterielle Infektionen im Allgemeinen haben.

Um urotheliale Veränderungen zu untersuchen, die aus einer früheren Infektion resultieren, haben wir eine Methode zur In-vitro-Vermehrung primärer intestinaler Epithelstammzellen in einer dreidimensionalen (3D) Kultur9,10 angepasst, um primäre USCs zu kultivieren, die aus 8 Wochen alten, naiven Tieren isoliert wurden C3H/HeN-Mäuse (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 1a). Die Genexpression von p63, das für das transformationsbezogene Protein 63 (p63) kodiert, wurde gemessen, da es für die Proliferationsfähigkeit der Stammzellen11 essentiell ist, während die Expression von Axin2, einem Wnt-Zielgen10, zur Beurteilung von Wnt gemessen wurde Signalaktivität in der 3D-Kultur. Gemeinsam können wir den Pluripotenzstatus der Stammzellen bewerten, indem wir die Expression dieser Gene mit RT-qPCR überwachen (Extended Data Abb. 1b, c). Die p63- und Axin2-Genexpression blieb während der ersten drei Tage der 3D-Kultur in 50 % konditioniertem Medium (CM) hoch, was zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz erforderlich ist. Die Expression von p63 und Axin2 nahm dann 5 bis 7 Tage nach der Infektion ab, unabhängig davon, ob die Zellen am Tag 3 nach der Infektion in 50 % oder 5 % CM inkubiert wurden, was zeigt, dass entweder eine erweiterte Kultur oder ein niedrigerer CM-Prozentsatz die Wnt-Signalisierung reduzieren kann . Allerdings war Uroplakin 3a (Upk3a), ein Oberflächenprotein, das von differenzierten Urothelzellen exprimiert wird, nur in Zellen, die in 5 % CM gezüchtet wurden, signifikant erhöht, nicht jedoch in 50 % CM, wie 7 Tage nach der Infektion bestimmt wurde (Extended Data Abb. 1d). . Nach der Vermehrung von USCs in 50 % CM über mehrere Passagen und weiterer Kultivierung in 50 % CM über 5 Tage zeigten alle Zellen eine positive Färbung für den Epithelzellmarker E-Cadherin und den Basalurothelzellmarker Keratin 5 (K5), es fehlte jedoch die Upk3a-Expression ( Erweiterte Daten Abb. 1e). Im Gegensatz dazu führte die Kultivierung in 0 % CM in 3D-Kultur für 5 Tage nach der anfänglichen Vermehrung zur Entwicklung einer Epithelpolarität mit der Bildung eines zentralen Hohlraums (Extended Data, Abb. 1e). Innerhalb der resultierenden Zysten differenzierten sich der Höhle zugewandte Zellen in oberflächliche, facettenartige Zellen (Upk3a+, K5–), wohingegen Zellen am Rand, die in Kontakt mit der Matrigelmatrix standen, basalzellartig waren (Upk3a–, K5+).

a: USCs, die aus 8 Wochen alten C3H/HeN-Mäusen isoliert wurden, wurden durch sphäroidale Kultur in Matrigel mit 50 % L-WRN-konditioniertem Medium (CM) expandiert, einschließlich Y-27632, einem ROCK-Inhibitor, und SB431542, einem TGF-β-Typ-1-Inhibitor . Nach 3 Tagen Sphäroidkultur wurden die Zellen in eine Einzelzellsuspension dissoziiert und 3–4 × 105 Zellen wurden auf Transwell-Membranen ausgesät. Die Zellen wurden 3–5 Tage lang in 50 % CM kultiviert und dann 2–3 Wochen lang in 5 % CM kultiviert, bis sie vollständig differenziert waren. b: Anschließend wurden Zellkulturen mit einem TER-Wert >4.000 Ohm × cm2 analysiert (5 Transwells, kultiviert aus einer juvenilen C3H/HeN-Zelllinie). Aus Gründen der Konsistenz wurde die TER 1 Tag nach dem Medienwechsel gemessen. c,d: Differenzierte Urothelien auf den Transwells wurden fixiert und mittels (c) konfokaler Mikroskopie und (d) SEM abgebildet, um eine Ansicht des Urothels von oben nach unten bei 500-facher (oberes Feld) und 10.000-facher (unteres Feld) Vergrößerung zu zeigen. In c wurden die Proben auf F-Actin, den terminalen Differenzierungsmarker K20 und Kerne (DAPI) gefärbt. e–h, Die Urothelien wurden ebenfalls in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) (e) gefärbt und auf K20, Ecad und DAPI (f), Upk3a, p63 und DAPI (g) oder K5, K14 und immungefärbt DAPI (h). Es werden repräsentative Bilder angezeigt. Die Daten stammen aus 2–3 unabhängigen Experimenten mit USCs von 5 verschiedenen jungen C3H/HeN-Mäusen.

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Als nächstes haben wir ein Transwell-Kultursystem eingerichtet, um USCs juveniler C3H/HeN-Mäuse in polarisierte, geschichtete Urothelbarrieren zu differenzieren (Abb. 1a). Als Kontrolle wurde die menschliche Blasenkarzinomzelllinie 5637 (ATCC HTB-9) verwendet, die häufig für die In-vitro-Untersuchung von UPEC-Wechselwirkungen mit Blasenzellen verwendet wird und aus basalen Blasenkrebszellen12 stammt. Da sowohl 5637-Zellen als auch unsere primären USCs aus Basalzellen stammen, haben wir sie zwei bis drei Wochen lang auf Transwells ausgesät und kultiviert, um die Phänotypen der Zelldifferenzierung zu vergleichen. Die Bildung von intaktem differenziertem Urothel, hier als differenziertes Urothel (oder Urothel) bezeichnet, durch die primären USCs wurde durch robusten transepithelialen elektrischen Widerstand (TER) (Abb. 1b) und starke konfokale Färbung großer hexagonaler oberflächlicher Facettenzellen für die terminale Differenzierung bestätigt Marker K20 (Abb. 1c) und das Vorhandensein von Zellverbindungen und Uroplakin-Plaques auf der Gewebeoberfläche (Abb. 1d), ähnlich wie oberflächliche Facettenzellen auf der Oberfläche von intaktem Blasengewebe erscheinen6. Die mikroskopische Analyse differenzierter Urothelschnitte ergab eine mehrschichtige polarisierte Epithelgewebeschicht (Ecad+) (Abb. 1e–h) mit p63-, K5- und K14-Expression in den Basalschichtzellen oberhalb der Matrigelmembran (hauptsächlich K5+/K14+, einige K5+/ K14−), p63 und schwache Upk3a-Expression in einigen Mittelschichtzellen, was auf Zwischenzellen hinweist, und starke K20- und Upk3a-Färbung auf der Oberfläche der apikalen Schichtzellen, was auf terminal differenzierte oberflächliche Facettenzellen hinweist. Insgesamt stimmt die Verteilung dieser Differenzierungsmerkmale in den basalen, mittleren und oberflächlichen Urothelschichten mit der im Blasengewebe von Mäusen und Menschen beobachteten überein13. Im Gegensatz dazu wurde keines dieser Merkmale in 5637-Zell-Transwell-Kulturen beobachtet, in denen die Zellen lose in Schichten mit einer Tiefe von 4–6 Zellen zusammengepackt waren, es jedoch keine Hinweise auf Polarisation oder Zellverbindungsbildung gab (Extended Data Abb. 2a–d). Daher bieten primäre USCs gegenüber einer Tumorzelllinie wichtige Vorteile für die Untersuchung des Urothels.

Anhand unseres Mausmodells von rUTI5,6 haben wir gezeigt, dass ein anfängliches Harnwegsinfektionsereignis zu einer lang anhaltenden Blasenumgestaltung führt, einschließlich struktureller und proteomischer Veränderungen am Urothel, die sich auf die Anfälligkeit für rUTI14 auswirken. Um die Rolle von USCs beim Blasenumbau zu untersuchen, isolierten wir Blasen-USCs von rekonvaleszenten Mäusen (4 Wochen nach Beginn der Antibiotikatherapie), sowohl von solchen mit selbstheilender Infektion (abgeheilt) als auch von solchen, die eine chronische Infektion entwickelten (sensibilisiert). ab altersentsprechenden naiven Mäusen als Kontrollen und etablierten USC-Linien (n = 4 pro Infektionsgeschichte) (Abb. 2a, b). Wir haben jede dieser USC-Linien zwischen 15 und 30 Passagen vermehrt, sie dann auf Transwells differenziert und jede Zelllinie nach 2–3 Wochen Kultur mikroskopisch charakterisiert. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass das Urothel, das aus sensibilisierten USCs stammte, viele der zuvor in vivo6 beobachteten morphologischen Unterschiede auch nach vielen Passagen rekapitulierte, einschließlich kleinerer Oberflächenzellen und einer verminderten Expression der terminalen Differenzierungsmarker Upk3a und K20 im Vergleich zu differenziertem Urothel, das aus naiven und naiven USCs stammte aufgelöste USCs (Abb. 2c – e). Die automatisierte Messung der Oberflächenzellgrößen zeigte, dass die apikalen Zellen der sensibilisierten differenzierten Urothelien deutlich kleiner sind als die der naiven differenzierten Urothelien, wohingegen die aufgelösten Urothelien einen intermediären Phänotyp aufweisen, der mit In-vivo-Daten übereinstimmt (Abb. 2f – g)6. Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass die Transwell-Kultur von USCs die in vivo beobachteten morphologischen Remodellierungsphänotypen des Blasenepithels rekapitulieren kann.

a, Zeitverlauf der Erstinfektion mit 108 cfu UTI89 KanR und Rekonvaleszenzzeit bei C3H/HeN-Mäusen. b, Repräsentativer Urin-Bakterientiter-Zeitverlauf über 4 wpi. Die horizontale Linie stellt den Grenzwert für eine ausgeprägte Bakteriurie dar: 104 KBE ml−1. Naive, aufgelöste und sensibilisierte Mäuse wurden als N1-4, R1-4 und S1-4 bezeichnet. c,d: Aus diesen Mäusen isolierte USCs wurden in differenzierten Urothelien auf Transwells kultiviert, fixiert und mittels konfokaler Mikroskopie (c) und REM (d) abgebildet. In c wurden die Urothelien auf K20, F-Aktin (Phalloidin) und Kerne (DAPI) gefärbt. e, Transwells wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Upk3a, E-Cadherin und Kerne immungefärbt. Weiße Pfeile zeigen Zellverbindungen und geben die Größe der Oberflächenzellen an. f,g, Feste Objektträger, die aus 44 Transwells von naiven, aufgelösten und sensibilisierten Mäusen (n = 16, 12 bzw. 16 Transwells von n = 4, 3, 4 Mäusen) verarbeitet wurden, wurden auf K20, E-Cadherin und markierte Kerne gefärbt und doppelblind abgebildet. Dann wurden die oberflächlichen Zellgrößen automatisch mit dem Fiji ImageJ-Makroprogramm gemessen und als durchschnittliche Zellgröße pro Transwell (f) und individuelle Zellgröße (g) dargestellt, dargestellt als Median mit 95 % KI. Zur Bestimmung der Signifikanz wurde der zweiseitige Student-T-Test verwendet, und P-Werte werden angegeben, wenn sie signifikant sind.

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Unsere Daten deuten darauf hin, dass eine frühere Infektion zu USC-intrinsischen Veränderungen führt, die über viele Zellkulturgenerationen hinweg vererbbar sind. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass diese Veränderungen durch unterschiedliche epigenetische Modifikationen in den USCs vermittelt werden, die mit Folgendem verbunden sind: (1) der Krankheitsgeschichte und (2) genomweiten Unterschieden in der Zugänglichkeit von Chromatin. Die Zugänglichkeit von Chromatin wurde mit Omni-ATAC-seq gemessen, einer Technik zur Sequenzierung von Regionen des Kernchromatins, die für eine Transposase durch Sequenzierung zugänglich sind15. Wir identifizierten insgesamt 59.801, 63.195 und 82.030 hoch reproduzierbare zugängliche Chromatinregionen in jeweils zwei biologischen Replikaten der naiven, aufgelösten und sensibilisierten USC-Linien. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) dieser USC-Linien trennt sensibilisierte USCs von anderen Gruppen (Abb. 3a). Unter den 2.880 differenziell zugänglichen Regionen (DARs) des Chromatins, die zwischen sensibilisierten und aufgelösten USCs identifiziert wurden, sind 925 Regionen sensibilisiert-zugängliche DARs (zugänglicher in sensibilisiert als in aufgelöst) und 1.955 Regionen sind aufgelöst-zugängliche DARs (in aufgelösten besser zugänglich als in sensibilisiert). (Abb. 3b).

Omni-ATAC-seq wurde unter Verwendung von USCs von naiven, aufgelösten und sensibilisierten Mäusen (Zelllinien N1, N3, R1, R4, S1 und S2, jeweils von einer einzelnen Maus) durchgeführt. a, PCA-Diagramm der DARs über die USC-Linien. b, Wärmekarte deutlich unterschiedlicher Peaks (FDR < 0,05) im Vergleich sensibilisierter und aufgelöster USCs. Von allen 2.880 DARs sind 925 Regionen sensibilisiert zugängliche DARs und 1.955 Regionen sind aufgelöst zugängliche DARs. c: Die 15 wichtigsten angereicherten GO-Begriffe für sensibilisiert zugängliche DARs (n = 747, fache Änderung > 1,5, FDR < 0,05) wurden mit GREAT analysiert. Die Signifikanz wurde mithilfe des Binomialtests ermittelt. d,e, Unterschiede in der Zugänglichkeit des Chromatins, der DNA-Methylierung und den aktiven Histonmodifikationen H3K27Ac und H3K4Me3 in verschiedenen USCs wurden durch ATAC-seq, Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms (WGBS) und CUT&RUN bewertet. d: Sensibilisierte spezifische DMRs (n = 189) unter naiven, aufgelösten und sensibilisierten USCs werden als eine Reihe von Heatmaps visualisiert, die die epigenetische Landschaft überlappend mit jedem DMR für DNA-Methylierung, ATAC und aktive Histonmodifikationen H3K27Ac und H3K4Me3 darstellen. e: Durchschnittliche Signale 5 kb stromaufwärts und 5 kb stromabwärts von sensibilisierten spezifischen Hypo-DMRs (n = 183) für WGBS, ATAC, H3K27Ac und H3K4Me3 werden für jede Zelllinie visualisiert. Die durchschnittliche Länge von DMRs beträgt 362 Basenpaare. DMRs werden hinsichtlich ihrer Größe mit „Anfang“ und „Ende“ der DMRs skaliert, die als graue Balken angezeigt werden. f: Sensibilisierte spezifische Hypo-DMRs wurden entsprechend ihrer vorhergesagten Positionen im Genom annotiert (n = 183). g: Ein PCA-Diagramm aller DMR-Vergleiche, das die Clusterbildung der verschiedenen Zelllinien zeigt. h, Die 15 wichtigsten angereicherten GO-Begriffe für sensibilisierte Hypo-DMRs wurden mit GREAT analysiert (n = 183).

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Die Analyse des Gene Ontology (GO)-Signalwegs an DARs mithilfe von GREAT16 ergab, dass Gene, die mit sensibilisierten, zugänglichen DARs assoziiert sind, für viele biologische Prozesse stark angereichert sind, einschließlich solcher, die programmierten Zelltod (PCD), oxidativen Stress und Immunantwort beinhalten (Abb. 3c). Viele dieser DARs befanden sich in der Nähe von PCD-Signalweg-assoziierten Genen, einschließlich Casp1 und Gsdmc2/3 (Ergänzungstabelle 1), von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie sowohl in RNA-Seq-Vergleichen der gesamten Blase als auch in Ex-vivo-Urothel-Proteomvergleichen von sensibilisierten und aufgelösten Genen angereichert sind Mäuse6,8. Bei der Motiventdeckungsanalyse mit HOMER17 haben wir herausgefunden, dass aufgelöst zugängliche DARs stark mit Transkriptionsfaktor (TF)-Bindungsmotiven der Mitglieder der AP-1-Familie angereichert sind, die bekannte Mediatoren von Stressreaktionen sind, oft stromabwärts der Zytokinsignalisierung (Extended Data Abb . 3a). Im Gegensatz dazu sind sensibilisiert zugängliche DARs nicht nur mit TF-Bindungsmotiven der AP-1-Familie angereichert, sondern auch mit solchen, die das Schicksal von Stammzellen sowie die Gewebedifferenzierung und -entwicklung regulieren, einschließlich der Mitglieder der SOX-Familie EHF, Klf5 und RUNX2 (Extended Data Abb . 3b).

Die Umgestaltung des Chromatins erfolgt durch zwei Hauptmechanismen: DNA-Methylierung und Histonmodifikationen. Wir führten ein genomweites Profiling der DNA-Methylierung und Histonmodifikation in unseren USC-Linien unter Verwendung von WGBS18 bzw. CUT&RUN19 durch. Für CUT&RUN haben wir Antikörper gegen Histonmodifikationsmarkierungen ausgewählt: H3-Lysin-4-Trimethylierung (H3K4Me3), H3-Lysin-27-Acetylierung (H3K27Ac) und H3-Lysin-27-Trimethylierung (H3K27Me3), die mit aktiven Promotoren, aktiven Promotoren/Enhancern und Polycomb-Repression assoziiert sind. jeweils20. Die meisten der differentiell methylierten Regionen (DMRs) wurden beim Vergleich sensibilisierter USCs mit entweder (1) naiven oder (2) aufgelösten USCs identifiziert. Wir haben keine globalen Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen naiven, aufgelösten und sensibilisierten Gruppen beobachtet (Extended Data Abb. 4a, b). Sensibilisierte spezifische DMRs werden als Heatmap zusammen mit den ATAC-seq- und CUT&RUN-Peaks angezeigt, um die epigenetische Landschaft über diese DMRs hinweg zu visualisieren (Abb. 3d). Wir fanden heraus, dass sensibilisierte spezifische DMRs im Vergleich zu naiven und aufgelösten USCs tendenziell hypomethyliert (Hypo-DMR) sind (Abb. 3d). DNA-Methylierung kann die Genexpression verringern, indem sie die Bindung des Transkriptionsfaktors hemmt und möglicherweise die Nukleosomenbelegung beeinflusst, was zusammen zu einem schlechter zugänglichen Chromatin führt21. Übereinstimmend stellten wir fest, dass Hypo-DMRs in sensibilisierten USCs entsprechend erhöhte ATAC-seq-, H3K4Me3- und H3K27Ac-Signale aufweisen (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass diese Regionen mit Markierungen für aktive Promotoren und Enhancer angereichert sind. Bei der Betrachtung der durchschnittlichen Signale in den Genomregionen (+/– 5 kb), die sensibilisierte spezifische Hypo-DMRs umgeben, sahen wir ähnliche Muster der Hypomethylierung, einer erhöhten Zugänglichkeit von Chromatin und einer Zunahme aktiver Histonmarkierungen im Vergleich zu naiven und aufgelösten USCs (Abb. 3e). Die repressive Histonmodifikation H3K27Me3 korrelierte jedoch nicht mit sensibilisierten spezifischen DMRs (Extended Data Abb. 5a, b). Die sensibilisierten spezifischen Hypo-DMRs sind eher mit genetischen Merkmalen wie Promotoren, Exons und Introns verbunden (Abb. 3f). Ein PCA-Diagramm aller DMRs trennte sensibilisierte USCs von naiven und aufgelösten USCs (Abb. 3g). Die GO-Signalweganalyse sensibilisiert-spezifischer Hypo-DMRs zeigte eine Anreicherung der Immunantwort und der Signalwege im Zusammenhang mit der Zell-Zell-Adhäsion (Abb. 3h). Somit bewahren USCs epigenetische Erinnerungen an eine frühere UPEC-Infektion, die sich je nach anfänglichem Infektionsergebnis unterscheiden und durch unterschiedliche DNA-Methylierung und aktive Histonmodifikationen vermittelt werden.

Anschließend führten wir eine RNA-Sequenzierung naiver, aufgelöster und sensibilisierter USCs durch, um zu untersuchen, ob ihre veränderten Epigenome zu einer unterschiedlichen Genexpression führen. Wir haben jugendliche naive USCs (Abb. 1) als Vergleichswerte für Altersunterschiede einbezogen. Auch hier trennt die PCA aller DEGs sensibilisierte USCs entlang der Hauptkomponente (PC) 1 von anderen Gruppen (Abb. 4a). Sensibilisierte USCs hatten im Vergleich zu naiven und aufgelösten USCs 108 bzw. 73 differentiell exprimierte Gene (DEGs) (Extended Data Abb. 6a, b), von denen 40 Gene beiden Vergleichen gemeinsam waren (Abb. 4b). Zu den Top 15 DEGs gehörten die Glutathiontransferase-Gene Mgst1 und Mgst3 (Abb. 4b). Zu den angereicherten Signalwegen in sensibilisierten USCs im Vergleich zu naiven und aufgelösten USCs gehören diejenigen, die mit dem Schutz vor reaktiven oxidativen Spezies (ROS), der Signalübertragung von Kernrezeptoren und der Pluripotenz von Stammzellen zusammenhängen (Erweiterte Daten, Abb. 6c, d). Im Gegensatz dazu wurden zwischen aufgelösten und naiven USCs keine Gene unterschiedlich exprimiert. Juvenile naive USCs trennten sich von den erwachsenen naiven USCs hauptsächlich entlang PC2 (Abb. 4a), dieser Vergleich ergab jedoch nur 8 signifikante DEGs (Extended Data Abb. 7a). Ein PCA-Biplot zeigt, dass Gene wie Znfx1 und Ly6e PC1 stark beeinflussten, während Gene wie Kank1 und Krt1 PC2 stark beeinflussten (Extended Data Abb. 7b).

RNAs wurden aus (a,b) undifferenzierten juvenilen naiven, erwachsenen naiven, aufgelösten und sensibilisierten USCs (Zelllinien von n = 3, n = 4, n = 4, n = 3 aus 14 Mäusen) oder (c–f) isoliert. differenzierte Urothelien von naiven, aufgelösten und sensibilisierten Zellen (verschiedene Kulturen aus N3, R3 und S3) mit oder ohne UPEC-Infektion, dann analysiert durch RNA-seq und durch Differenzialanalyse. a: Eine PCA der USC-RNA-Seq durch signifikant unterschiedlich exprimierte Gene zeigt, dass die Proben nach Zelllinien geclustert sind (früheres Infektionsergebnis). b: Vierzig differentiell exprimierte Gene (DEGs) überlappten zwischen sensibilisierten vs. naiven und sensibilisierten vs. aufgelösten USCs. Die 15 am häufigsten überlappenden DEGs sind in der Tabelle aufgeführt. c: Eine PCA der differenzierten Urothel-RNA-Seq zeigt eine Clusterbildung nach Zelllinien (vorheriges Infektionsergebnis) und sekundärem Infektionszustand. d, Ein Vulkandiagramm, das scheininfizierte sensibilisierte mit aufgelösten differenzierten Urothelien vergleicht. DEGs mit FC >0,5, Padj <0,05 werden als rote Punkte angezeigt. e: Die Pathway-Analyse wurde verwendet, um die biologischen Pathways zu bewerten, die mit differenziell exprimierten Genen in scheininfizierten sensibilisierten im Vergleich zu aufgelösten differenzierten Urothelien angereichert sind. Die Signifikanz wurde mithilfe eines exakten rechtsseitigen Fisher-Tests bestimmt, wobei Padj < 0,05 als signifikant angereicherte Signalwege angesehen wurden. Dargestellt sind ausgewählte Pfade mit einem Z-Score >2 und –log(P-Wert) >4,2 aus den spezifisch angereicherten Pfaden durch IPA. Überlappende Signalwege zwischen scheininfizierten und UPEC-infizierten differenzierten Urothelien (erweiterte Daten Abb. 8d) sind unterstrichen. f, Eine Wärmekarte, die mit dem programmierten Zelltod assoziierte Gene zeigt, die in scheininfizierten naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien unterschiedlich exprimiert werden. Die Signifikanz der DEGs wurde mithilfe des Wald-Tests bestimmt, gefolgt von einer mehrfachen Testkorrektur mithilfe des Benjamini-Hochberg-FDR für den angepassten P-Wert.

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Trotz der großen Anzahl epigenetischer Veränderungen, die in sensibilisierten USCs gefunden wurden, wurden nur wenige DEGs beobachtet, wenn USCs unter stammzellfördernden Bedingungen kultiviert wurden, was darauf hindeutet, dass die von uns gefundenen epigenetischen Veränderungen einen größeren Einfluss auf die Genexpression bei der Zelldifferenzierung haben könnten. Daher führten wir eine RNA-Sequenzierung differenzierter Urothelien mit oder ohne UPEC-Infektion durch. Die PCA aller DEGs zeigte, dass die Transkriptionsprofile von scheininfizierten differenzierten Urothelien nach der Infektionsgeschichte getrennt waren (Abb. 4c), was auf intrinsische Unterschiede in den differenzierten Urothelien aufgrund der früheren Infektionsgeschichte hinweist. Die Infektion verursachte größtenteils eine gleichmäßige Verschiebung im PCA-Diagramm für jede Zelllinie (Abb. 4c), was wahrscheinlich eine konservierte Transkriptionsreaktion auf die UPEC-Infektion in jedem Rekonvaleszenzzustand widerspiegelt (Erweiterte Daten, Abb. 8a). Bemerkenswert ist, dass die Expression des Cox-2-kodierenden Gens Ptgs2 bei der Infektion sensibilisierter und aufgelöster Urothelien im Vergleich zu naiven Urothelien stärker induziert wurde (Extended Data Abb. 8b), in Übereinstimmung mit einer kürzlich durchgeführten In-vivo-Studie7. Die unterschiedliche Genexpression zwischen scheininfizierten sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien wurde in einem Vulkandiagramm visualisiert (Abb. 4d) und eine Signalweganalyse der DEGs wurde durchgeführt (Abb. 4e). Sensibilisierte differenzierte Urothelien zeigten im Vergleich zu aufgelösten differenzierten Urothelien eine Aktivierung der PTEN-Signal-, PPARɑ/RXRɑ- und Glutathion-vermittelten Entgiftungswege, unabhängig von einer UPEC-Infektion (Abb. 4e und erweiterte Daten Abb. 8c, d). Bei mehreren der DEGs handelte es sich um TF-Gene, darunter Klf4 und Klf5 (Extended Data Abb. 9), was darauf hindeutet, dass diese eine Rolle bei der Förderung und Aufrechterhaltung einzigartiger epigenetischer Veränderungen in sensibilisierten Urothelzellen im Vergleich zu den anderen Zelltypen spielen könnten.

Basierend auf unseren GO-Pathway-Analysedaten, die PCD-Pathways in sensibilisierten DARs implizieren (Abb. 3c), und unseren In-vivo-Beobachtungen, dass das umgestaltete sensibilisierte Urothel durch starke Exfoliation und Cox-2-entzündungsbedingte Schleimhautverletzungen während einer UPEC-Infektion gekennzeichnet ist6, haben wir speziell befragte DEGs, die an PCD-Pfaden beteiligt sind. Eine Wärmekarte der Genexpression zeigt, dass viele mit PCD-Signalwegen assoziierte Gene in sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien im Vergleich zueinander und zu erwachsenen naiven differenzierten Urothelien unterschiedlich exprimiert wurden (Abb. 4f). Während Casp1 (das beim Vergleich von scheininfizierten sensibilisierten Urothelien mit aufgelösten (Ergänzungstabelle 2) das am stärksten hochregulierte Gen war) und andere Pyroptose-bezogene Gene (einschließlich Aim2, Gsdmc2 und Gsdmc3) in sensibilisierten differenzierten Urothelien hochreguliert waren, waren andere Pyroptose-bedingte Gene hochreguliert Gene (wie die Naips) sowie Apoptose- und Nekroptose-bezogene Gene wurden in aufgelösten differenzierten Urothelien hochreguliert, was darauf hindeutet, dass aufgelöste und sensibilisierte Zellen während einer UPEC-Infektion für unterschiedliche PCD-Mechanismen prädisponiert sind.

Als nächstes untersuchten wir, ob DNA-Methylierungsunterschiede in den USCs mit Veränderungen der RNA-seq-Faltung in den differenzierten Urothelien zwischen sensibilisierten und aufgelösten USCs korrelierten, wobei wir uns auf DMRs an Promotorstellen konzentrierten (Abb. 5a). Die meisten Gene, einschließlich Casp1 und Ptgs2os2 (ein positiver Regulator der Cox-2-Expression in cis und proinflammatorischer Reaktionsregulator in trans), zeigten eine negative Korrelation zwischen der relativen Genexpression und dem Grad der DNA-Methylierung an der Promotorstelle dieses Gens (Abb. 5a). Mit dem WashU Epigenome Browser wurden Chromatinzugänglichkeit, DNA-Methylierung und Histonmodifikationsmarkierungen an den Casp1- und Ptgs2os2-Loci visualisiert (Abb. 5b, c). Die Casp1- und Ptgs2os2-Promotorloci sensibilisierter USCs sind jeweils relativ hypomethyliert und gleichzeitig im Vergleich zu naiven und aufgelösten USCs mit den aktiven Histonmarkierungen H3K4Me3 und H3K27Ac angereichert (Abb. 5b, c und erweiterte Daten Abb. 10a). Mehrere TFs, die mit sensibilisierten, zugänglichen DARs angereichert waren (Extended Data Abb. 3a), wie etwa Mitglieder der Sox- und AP-1-Familien (Klf5, ETS und RUNX2), haben vorhergesagte Bindungsstellen in der Nähe des Casp1-Promotors, wie im Epigenom angegeben Browserkarte (Extended Data Abb. 10b). Die Casp1-Expression durch RT-qPCR war in sensibilisierten differenzierten Urothelien etwa 1.000-fach höher als in aufgelösten oder naiven USCs, unabhängig von der UPEC-Infektion (Abb. 5d). Übereinstimmend zeigte die Immunblot-Färbung nachweisbare Caspase-1 nur in sensibilisierten differenzierten Urothelien (Abb. 5e), in Übereinstimmung mit unserer früheren Ex-vivo-Proteomik von rekonvaleszenten sensibilisierten Maus-Urothelien8.

a: Für die DMRs, die innerhalb von 1 kb der Promotorregionen gefunden wurden, wurden RNA-seq-Faltenänderungen im Vergleich zu sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien entweder mit (y-Achse, dunkelviolette Punkte) oder ohne Infektion (y-Achse, graue Punkte) gegen die DNA-Methylierung aufgetragen Unterschiede (x-Achse) zwischen sensibilisierten und aufgelösten USCs. b,c: Unterschiede in der Zugänglichkeit des Chromatins (ATAC-seq), der DNA-Methylierung (WGBS) und den aktiven Histonmodifikationen (H3K4me3 und H3K27ac) an den Loci Casp1 (b) und Ptgs2os2 (c) in verschiedenen USC-Linien wurden als kombinierte Spuren mit visualisiert die WashU Epigenome Browser-Karte. In den WGBS-Daten ist die durchschnittliche prozentuale Methylierung an den Casp1- und Ptgs2os2-Promotorstellen (rotes Kästchen) angegeben; Farbbalken stellen die Methylierung in % dar, graue Hintergründe stellen CpGs dar und schwarze Linien zeigen die Sequenzierungstiefe an. CpGs innerhalb der Casp1- und Ptgs2os2-Promotorregionen weisen eine 8–25-fache bzw. 18–23-fache Leseabdeckung auf. d, Die Genexpression von Casp1 in differenzierten Urothelien wurde durch RT-qPCR gemessen (Daten aus n = 4, 4, 4, 5, 4, 4 Proben, die aus erwachsenen naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien erzeugt wurden, die dann entweder mit PBS oder infiziert wurden UTI89 werden jeweils als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. e: Die Proteinexpression von Caspase-1 unter Verwendung zweier verschiedener Zelllinien (N2, R2, S2 und N3, R3, S3) wurde durch Western Blot bewertet, und N3, R3 und S3 sind dargestellt. f: Der Zelltod differenzierter Urothelien 4 Stunden nach der UTI89-Infektion wurde mittels LDH-Assay gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, erhalten aus n = 7, 10, 14, 8, 10, 4, 6 Proben aus erwachsenen naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien, 2–3 biologisch unabhängigen Zelllinien, pro Bedingung, die dann vorliegen entweder mit PBS oder UTI89 infiziert; Die Signifikanz wurde mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt. g,h, Naive, aufgelöste und sensibilisierte Mäuse wurden mit 107 KBE WT UTI89 (HlyA+) oder UTI89ΔhlyA herausgefordert. Die Daten werden aus 2–3 unabhängigen Experimenten kombiniert. g: Bakterienbelastung der Blase bei 6 hpi (n = 10, 7, 19, 8, 14, 11 erwachsene naive, aufgelöste und sensibilisierte Mäuse, die jeweils mit 107 KBE UTI89 oder UTI89ΔhlyA herausgefordert wurden), untersucht über 2–3 unabhängige Experimente. Balken geben Medianwerte an und zur Bestimmung der Signifikanz wurde ein zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test verwendet. h, Inzidenz chronischer Zystitis bei 28 dpi. Zweiseitiger exakter Fisher-Test; P-Werte werden angegeben, wenn sie signifikant sind.

Quelldaten

In unseren früheren Studien haben wir herausgefunden, dass das sekretierte porenbildende Bakterientoxin α-Hämolysin (HlyA), das üblicherweise von UPEC produziert wird, Caspase-1- und Caspase-11-abhängige Pyroptose (Caspase-4 beim Menschen) im Urothel von Menschen und Mäusen induziert Zellen – eine Schutzreaktion, die zur Ablösung infizierter Zellen führt22. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine erhöhte Caspase-1-Expression im sensibilisierten differenzierten Urothel zu einer robusteren pyroptotischen Zelltodreaktion bei einer UPEC-Infektion mit Wildtyp (WT) (HlyA+) in vitro führen würde. Ein Laktatdehydrogenase (LDH)-Zytotoxizitätstest zeigte, dass eine UPEC-Infektion den Zelltod in naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien induzierte (Abb. 5f), der Zelltod war jedoch in sensibilisierten differenzierten Urothelien signifikant höher. Bei Challenge-Infektionen mit WT-Stämmen UTI89 und UTI89ΔhlyA bei naiven, aufgelösten und sensibilisierten Mäusen beobachteten wir, dass eine ΔhlyA-Infektion, die den Caspase-1-vermittelten pyroptotischen Zelltod nicht aktiviert, bei sensibilisierten Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen eine signifikant erhöhte Bakterienbelastung aufwies Bei naiven und aufgelösten Mäusen wurden keine Unterschiede beobachtet (Abb. 5g). Darüber hinaus war die Inzidenz wiederkehrender chronischer Zystitis 28 Tage nach der Infektion bei sensibilisierten Mäusen bei Infektion mit ΔhlyA im Vergleich zu WT signifikant erhöht (Abb. 5h), was darauf hinweist, dass die Überexpression von Caspase-1 in sensibilisierten Urothelzellen eine schützende Reaktion ist, die dazu beiträgt Lösen Sie die UPEC-Infektionsherausforderung.

Frühere Studien haben gezeigt, dass es als Reaktion auf eine UPEC-Infektion zu einer lang anhaltenden Umgestaltung des Blasengewebes kommt. Diese Umgestaltung geht mit Veränderungen in der Anfälligkeit für nachfolgende Infektionen einher, abhängig von den Ergebnissen früherer Infektionen5,6,7. Wir stellten die Hypothese auf, dass diese veränderte Anfälligkeit zumindest teilweise durch die Entwicklung einer trainierten Immunität an der Blasenepithelschleimhaut vermittelt wird. Im Gegensatz zur adaptiven Immunität, die antigenspezifische Reaktionen von T- und B-Lymphozyten umfasst, ist die „trainierte Immunität“ durch eine Antigen-unspezifische Gewebeanpassung an akute und chronische Entzündungen, manchmal als Reaktion auf eine Infektion, gekennzeichnet und wurde überwiegend in der Praxis untersucht angeborene Immunzellen wie Makrophagen, Monozyten, dendritische Zellen und natürliche Killerzellen23,24,25. Hier verwendeten wir ein primäres Epithelzellkultursystem10, um den urothelialen intrinsischen Beitrag zur Umgestaltung der Blasenschleimhaut als Folge einer früheren Infektion aufzuklären und fanden Hinweise auf eine epigenetische Neuprogrammierung der urothelialen Stammzellen als Mechanismus der trainierten Immunität gegen nachfolgende Harnwegsinfektionen.

Es ist bekannt, dass das Blasenurothelium zuvor infizierter Mäuse im Vergleich zu altersentsprechenden naiven Mäusen resistent gegen intrazelluläre Besiedlung ist6,7. Der Mechanismus dieser intrazellulären Kolonisierungsresistenz unterscheidet sich jedoch zwischen aufgelösten und sensibilisierten Mäusen. Bei aufgelösten Mäusen bilden UPEC zunächst intrazelluläre Bakteriengemeinschaften in den oberflächlichen Facettenzellen, ähnlich wie bei erwachsenen naiven Mäusen, werden jedoch innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Infektion durch eine verstärkte TNFα-vermittelte Entzündung schnell ausgeschieden7. Im Gegensatz dazu bilden sich in sensibilisiertem Urothel in vivo überhaupt keine intrazellulären Bakteriengemeinschaften, was wahrscheinlich auf die geringe Zellgröße und das Actin-Gating der unvollständig differenzierten Oberflächenzellen zurückzuführen ist6,26. In dieser Arbeit haben wir einen weiteren Aspekt der Blasenkolonisierungsresistenz in sensibilisiertem Urothel aufgeklärt, wobei HlyA-vermittelter Urothelzelltod und Exfoliation die frühe Blasenkolonisierung weiter reduzieren. Dieser Effekt ist wahrscheinlich eine Folge der erhöhten Grundlinienexpression von Caspase-1 und möglicherweise anderer Inflammasom-assoziierter Faktoren wie Gasdermine C2 und C3, die als terminale Effektoren der Lyse entzündlicher Zellen fungieren können27, die hier in vitro beobachtet und zuvor beschrieben wurden In-vivo-Proteomikstudien an Maus-Urothelien8. Aim2, das einen zytosolischen angeborenen Immunsensor kodiert, der das Caspase-1-Inflammasom aktivieren kann, wurde auch in sensibilisierten differenzierten Urothelien stärker exprimiert. In der Haut von Mäusen ermöglicht Imiquimod und die daraus resultierende Entzündung der Haut eine schnellere Aim2-vermittelte Reaktion auf einen sekundären Entzündungsschub28, was darauf hindeutet, dass die epigenetische Neuprogrammierung von Inflammasomkomponenten ein häufiger Mechanismus zur Vorbereitung von Entzündungssensoren zur Vorbereitung auf eine sekundäre Exposition sein könnte an Stellen im Barrieregewebe. Darüber hinaus kann bei Mäusen mütterliches Interleukin-6 (IL-6), das als Reaktion auf eine Infektion produziert wird, epigenetische Veränderungen in fötalen intestinalen Epithelstammzellen in der Gebärmutter auslösen29. Im Gegensatz zu diesen früheren Studien zeigt unsere Arbeit, dass eine bakterielle Schleimhautinfektion eine direkte Rolle bei der Auslösung spezifischer epigenetischer Veränderungen an Schleimhautepithelstammzellen spielt, die den Ausgang nachfolgender Infektionen verändern.

Die schützende Caspase-1-vermittelte trainierte Immunität in der sensibilisierten Blase wird häufig durch eine Cox-2-abhängige Entzündung überwunden, die als Reaktion auf eine hohe Bakterienbelastung während der ersten 24 Stunden einer akuten rUTI auftritt6,8. Die Cox-2-Expression findet hauptsächlich auf der Ebene der basalen Urothelzellen statt, ihre Aktivität kann jedoch durch übermäßige Rekrutierung von Neutrophilen Schleimhautverletzungen hervorrufen und dadurch die Kolonisierungslandschaft zugunsten der extrazellulären Kolonisierung und des Wachstums der Bakterien verändern. Daher weisen sensibilisierte Mäuse konkurrierende Schutz- und Sensibilisierungsreaktionen auf eine Infektion auf, die sich typischerweise in einer extremen bimodalen Verteilung der Infektionslasten bis 24 Stunden nach der Infektion manifestieren5. Obwohl sowohl gelöste als auch sensibilisierte Blasen in vivo die frühen Cox-2-Reaktionen verstärken, bleibt die Entzündungsreaktion der Blase 24 Stunden nach der Infektion nur bei sensibilisierten Mäusen bestehen7 und die Cox-2-Hemmung schützt sensibilisierte Mäuse vor schwerer wiederkehrender Zystitis6,8. In ähnlicher Weise war die infektionsinduzierte Expression des Ptgs2-Gens (kodierend für Cox-2) sowohl in sensibilisierten als auch in aufgelösten differenzierten Urothelien im Vergleich zu naiven Urothelien erhöht. Allerdings unterschied sich die Expression des Ptgs2os2-Gens, das für LincRNA-Cox-2 kodiert, einen positiven Regulator der Ptgs2-Expression und der allgemeinen Entzündung30, zwischen diesen Zelllinien und war bei sensibilisierten Urothelien im Vergleich zu aufgelösten differenzierten Urothelien erhöht. Dementsprechend fanden wir unterschiedliche epigenomische Markierungen, die mit einer erhöhten Zugänglichkeit des Ptgs2os2-Locus in den sensibilisierten USCs verbunden waren, was darauf hindeutet, dass die Ptgs2os2-Expression in differenzierten Urothelien durch epigenetische Veränderungen in den USCs verändert wird. Somit könnten epigenetische Veränderungen am Ptgs2os2-Locus eine Rolle bei der Förderung der anhaltenden proinflammatorischen Reaktionen der sensibilisierten Blase spielen und so die Schutzfunktion einer erhöhten Casp1-Expression überwinden.

Veränderungen in der Expression von DNA-Methyltransferasen, die CpG-Stellen der DNA methylieren, wurden als Mechanismus für die Umgestaltung des Epigenoms als Reaktion auf eine akute UPEC-Infektion in Betracht gezogen31, was möglicherweise erklärt, wie eine frühere Infektion, ob selbstheilend oder chronisch, das USC-Epigenom verändern könnte . Allerdings ist die chronische Entzündung selbst auch ein starker Auslöser des epigenetischen Gedächtnisses, was die Unterschiede in der epigenetischen Markierung zwischen aufgelösten und sensibilisierten USCs erklären könnte. Ein Modell für diese Umschreibung des Epigenoms ist das Vorhandensein sogenannter „Gedächtnisdomänen“, in denen „Pionier“-TF, die als Reaktion auf Reize an Nukleosomen binden, Chromatin in auf Stress reagierenden Orten öffnet und es epigenetischen Autoren ermöglicht, das Chromatin umzugestalten, um dies zu ermöglichen offen bleiben, nachdem die Reize entfernt wurden32. Klf4, das in sensibilisierten differenzierten Urothelien im Vergleich zu aufgelösten Urothelien hochreguliert war, ist ein bekannter Pionier von TF33. Darüber hinaus stützen unsere Motiventdeckungsanalysen die Hypothese, dass der epigenetische Umbau in den USCs hauptsächlich bei AP-1-assoziierten DARs als Reaktion auf eine selbstlimitierende akute Infektion (aufgelöst-zugängliche DARs) auftritt, dass jedoch eine schwere akute Infektion zu einer chronischen Infektion führt und Entzündungen (sensibilisiert-zugängliche DARs) induzieren epigenetische Remodellierung nicht nur an AP-1-assoziierten DARs, sondern auch an weiteren TF-assoziierten DARs, wie beispielsweise solchen mit Motivstellen der Klf- und Sox-Familie.

Unsere Entdeckung der epigenetischen Neuprogrammierung epithelialer Stammzellen bei einer UPEC-Infektion hat Auswirkungen auf das Verständnis des Mechanismus der epithelialen, trainierten Immunität nicht nur gegen Harnwegsinfekte, sondern auch gegen andere Arten von Infektionen oder entzündlichen Erkrankungen. Weitere mechanistische Studien könnten zu neuen Therapien für eine Reihe wiederkehrender Infektionen und entzündlicher Erkrankungen führen. Beispielsweise führt der therapeutische Einsatz eines Inhibitors der Histondemethylase LSD1, die bei Hautepithelkrebs überexprimiert wird, zu einem deutlichen Anstieg der H3K4-Methylierung in den Zellen, was sowohl zu einer vorzeitigen epidermalen Differenzierung als auch zur Unterdrückung von Plattenepithelkarzinomen führt34. Daher würden weitere Untersuchungen zur Identifizierung, welche epigenetischen Faktoren, TFs oder Entzündungsmediatoren direkt für die Etablierung und Aufrechterhaltung dieser spezifischen epigenetischen Erinnerungen in vivo verantwortlich sind, tiefere mechanistische Einblicke liefern und Aufschluss über potenzielle therapeutische Ziele zur Vorbeugung von rUTIs und/oder zur Umkehrung der epigenetischen Prägung geben führt zu einer erhöhten Anfälligkeit für wiederkehrende Erkrankungen.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health für die Unterbringung und Pflege von Labortieren durchgeführt. Alle Experimente wurden gemäß den institutionellen Vorschriften nach Prüfung und Genehmigung durch das Animal Studies Committee der Washington University School of Medicine in St. Louis, Missouri, durchgeführt.

Die in dieser Studie verwendeten UPEC-Stämme waren das menschliche Zystitis-Isolat UTI89 und dessen Derivat: UTI89 attHK022::COM-GFP (UTI89-KanR)35, UTI89 pANT4 und UTI89 hlyA::KD13 (UTI89 ΔhlyA-KanR)22. Sowohl für Maus- als auch für In-vitro-Infektionen wurden UTI89-Stämme statisch in Lysogenie-Brühe (LB) bei 37 °C über Nacht kultiviert, 1:1.000 in frische Medien subkultiviert und 18 Stunden lang statisch bei 37 °C kultiviert.

Weibliche C3H/HeN-Mäuse (Envigo) waren zum Zeitpunkt der Erstinfektion 7–8 Wochen alt („jung“). Insgesamt 108 KBE UTI89 wurden durch transurethrale Katheterisierung in die Blase von C3H/HeN-Mäusen inokuliert5,36. C3H/HeN-Mäuse entwickeln eine chronische Zystitis in einer von der Infektionsdosis abhängigen Weise und dieses Inokulum führt bei etwa 50 % der Mäuse zu einer chronischen Zystitis6. Zur Überwachung des Infektionsverlaufs wurde Urin gesammelt. Eine persistierende Bakteriurie (104 KBE ml−1) ist als spezifischer und empfindlicher Grenzwert für die Erkennung einer chronischen Zystitis definiert5. Chronische Zystitis während der Erstinfektion wurde als anhaltend hohe Bakteriurie (>104 KBE ml-1 Urin) zu jedem Zeitpunkt der Urinsammlung (1, 3, 7, 10, 14, 21 und 28 Tage nach der Infektion) bei gleichzeitiger Auflösung der Zystitis definiert wurde als Urinbakterientiter definiert, der zu mindestens einem Zeitpunkt unter diesen Grenzwert fiel.

4 Wochen nach der Infektion wurden alle Mäuse 10 Tage lang mit Trimethoprim und Sulfamethoxazol im Trinkwasser behandelt (54 bzw. 270 μg ml Wasser)6. Wöchentlich wurde Urin gesammelt, um die Beseitigung der Bakteriurie zu bestätigen. Vier Wochen nach Beginn der Antibiotikagabe wurden naive, aufgelöste und sensibilisierte Mäuse zur Isolierung primärer USCs oder für Sekundärinfektionstests verwendet. Für die Sekundärinfektion wurden Mäuse mit 107 KBE Bakterien in die Blase geimpft und dann 6 Stunden nach der Infektion auf humane Weise eingeschläfert, und die Bakterienbelastung wurde bestimmt, um den akuten Ausgang zu beurteilen.

Menschliche Blasenkarzinom-Epithelzellen, bezeichnet als 5637-Zellen (ATCC HTB-9), wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 kultiviert.

Blasengewebe von juvenilen, rekonvaleszenten naiven, aufgelösten und sensibilisierten Mäusen wurde isoliert, halbiert und über Nacht bei 4 °C in Stripping-Lösung inkubiert. Die Urothelzellen wurden vom Blasengewebe abgekratzt, 5 Minuten lang bei 4 °C und 300 g zentrifugiert, in frischer Kollagenase-IV-Lösung resuspendiert und unter Schütteln 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch vorsichtiges Pipettieren aufgelöst, mit einem 100-μm-Sieb filtriert und dann mit Waschmedium gewaschen. Die Zellen wurden in Matrigel (BD Biosciences) mit 50 % L-WRN CM, enthaltend 10 mM Y-27632 und 10 mM SB431542 (R&D System)9, kultiviert. Die Medien wurden alle 2 Tage gewechselt und die Zellen wurden alle 3 Tage passagiert (Aufteilung 1:2–3). USCs wurden für Experimente nach 10 Passagen verwendet, um alle verbleibenden Nicht-Stamm-Urothelzellen zu entfernen.

USCs wurden in PBS mit 0,5 mM EDTA gewaschen, 1 Minute lang bei 37 °C in 0,05 % Trypsin und 0,5 mM EDTA trypsiniert, durch kräftiges Pipettieren dissoziiert, durch ein 40 μm-Zellsieb filtriert und in Waschmedien resuspendiert. Transwells (Corning Costar, 3413) wurden 30 Minuten lang bei 37 °C in PBS mit 1:40 Matrigel beschichtet. Anschließend wurden 3–4 × 104 USCs auf dem Transwell-Einsatz ausgesät und 100 μl bzw. 600 μl 50 % CM mit 10 mM Y-27632 in die apikalen bzw. basolateralen Kompartimente des Transwells gegeben.

Der Widerstand der Urothel-Mehrfachschichten wurde durch TER-Messung unter Verwendung eines Epithel-Volt-Ohm-Meters (World Precision Instruments) bewertet. Der Durchschnittswert der Dreifachmessungen wurde mit der Fläche der Transwell-Membran (0,33 cm2) multipliziert, um einen Endwert in Ohm × cm2 zu erhalten (Ref. 37).

Als das Urothel vollständig differenziert war (TER-Wert > 4.000 Ohm × cm2), wurden die Kulturen dreimal in warmem DMEM/F12-Medium gewaschen und mit UPEC-Stämmen bei einer Infektionsmultiplizität von 10 infiziert. Die Transwells wurden dann 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und gewechselt zu Medien mit 100 μg ml−1 Gentamicin, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen und über einen längeren Zeitraum zu kultivieren. Nach der Infektion wurden apikale und basolaterale Medien 5 Minuten lang bei 4 °C und 2.000 g zentrifugiert und für den LDH-Assay verwendet (TaKaRa, MK401). Transwells wurden mit sterilem PBS gewaschen und dann für verschiedene Analysen verwendet.

Differenzierte Urothelien auf Transwells wurden gewaschen und in PBS mit 4 % Paraformaldehyd 15 Minuten lang fixiert und dreimal mit PBS gespült. Anschließend wurden 100 μl 0,2 % Triton Die Proben wurden mit primärem Antikörper, monoklonalem Maus-Anti-Keratin 20 (Abcam, ab854, 1:200) und sekundärem Antikörper, Alexa Fluor 647 Esel-Anti-Maus-IgG (Invitrogen, A-31571, 1:1.000), gefärbt und anschließend weiter gefärbt mit Alexa Fluor 555 Phalloidin (ThermoFisher, A34055, 1:200) und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (ThermoFisher, D1306, 1:1.000). Für die konfokale Mikroskopie wurde das Laser-Scanning-Mikroskop ZEISS LSM880 mit Airyscan verwendet. Fiji ImageJ und das Makroprogramm wurden verwendet, um die Oberfläche der Urothelzellen in Z-gestapelten konfokalen Bildern automatisch zu berechnen.

USCs oder differenzierte Urothelien wurden über Nacht in 10 % Formaldehyd bei 4 °C fixiert. Nach dem Waschen in PBS wurden die fixierten Proben in 2 % Agar voreingebettet, vertikal geschnitten, mit der Seite nach oben in Transwells gelegt, erneut in Paraffinblöcke eingebettet und geschnitten. Die Objektträger wurden auf H&E und auf ausgewählte Antikörper immungefärbt. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden die Objektträger entparaffiniert, hydratisiert, mit 10 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum (HIHS) und 0,3 % Triton X-100 in PBS blockiert, mit Primärantikörper in 1 % HIHS und PBS über Nacht bei 4 °C und Sekundärantikörper inkubiert in PBS für 30–60 Minuten bei Raumtemperatur6. Die verwendeten primären Antikörper waren monoklonaler Maus-Anti-Keratin 20 (Abcam, ab854, 1:200), polyklonaler Ziegen-Anti-E-Cadherin (R&D Systems, AF748, 1:500), polyklonaler Ziegen-Anti-Uroplakin 3a (Santa Cruz, sc -15186, 1:500), monoklonales Maus-Anti-Uroplakin 3a (Fitzgerald, 10R-U103a, 1:50), polyklonales Kaninchen-Anti-p63 (GeneTex, GTX102425, 1:1.000), monoklonales Kaninchen-Anti-K5 (Abcam, ab150074). , 1:100) und monoklonales Maus-Anti-Keratin 14 (Santa Cruz, sc-53253, 1:50). Sekundärantikörper von Alexa Fluor und DAPI wurden in einer Verdünnung von 1:1.000 verwendet. Weitere Informationen zu Antikörpern finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. Die Proben wurden auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axio Imager M2 Plus sichtbar gemacht.

Differenzierte Urothelien wurden dreimal in PBS gewaschen, in EM-Fixiermittel (2 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd in 1 × PBS) 1 Stunde lang auf Eis fixiert und dreimal in PBS gewaschen. Die Proben wurden dann in 1,0 % Osmiumtetroxid nachfixiert, in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol dehydriert und dann 16 Minuten lang bei 31,1 °C und 1.072 psi in einem kritischen Punkttrockner6 dehydriert. Die Proben wurden auf mit Kohlenstoffband beschichteten Stümpfen montiert und unter Argon6 mit Gold/Palladium sputterbeschichtet und dann auf einem Zeiss Crossbeam 540 FIB-SEM abgebildet.

RNAs wurden aus USCs oder differenzierten Urothelien mit dem RNAeasy Plus Mini Kit (Qiagen) extrahiert und mit iScript Reverse Transcription Supermix (BioRad) revers transkribiert. Wir verwendeten 1 μl 12,5 ng μl−1 komplementäre DNA mit intronübergreifenden Primern, die für jedes Gen spezifisch sind, und iQ SYBR Green Supermix wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (BioRad) verwendet. Die Sequenzen der in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Die Expressionswerte wurden auf 18S normalisiert und die relative Expression im Vergleich zur Kontrolle wurde mit der Zyklusschwellenmethode (ΔΔCt) bestimmt38. Jede Probe wurde dreifach untersucht und die durchschnittlichen Ct-Werte wurden berechnet.

Illumina-cDNA-Bibliotheken wurden mithilfe einer modifizierten Version des RNAtag-seq-Protokolls39 generiert. Kurz gesagt, 1 μg Gesamt-RNA wurde fragmentiert, von genomischer DNA befreit, dephosphoryliert und an DNA-Adapter ligiert, die 5'-AN8-3'-Barcodes bekannter Sequenz mit einer 5'-Phosphat- und einer 3'-Blockierungsgruppe tragen. Barcodedierte RNAs wurden gepoolt und mit dem Ribo-Zero rRNA Depletion Kit (Illumina) von ribosomaler RNA befreit. cDNA-Bibliotheken wurden durch Hinzufügen eines zweiten Adapters durch Template-Wechsel und PCR-Amplifikation mit Primern, die Illumina P5- oder P7-Sequenzen trugen, generiert, dann wurden die Bibliotheken auf dem Illumina HiSeq 2500 sequenziert. Paired-End-Sequenzierungsablesungen in einem Pool wurden auf der Grundlage ihrer demultiplext zugehörige Barcode-Sequenz mithilfe benutzerdefinierter Skripte (https://github.com/broadinstitute/split_merge_pl). Die Lesevorgänge wurden dann mit Cutadapt v1.6 getrimmt und die getrimmten Lesevorgänge wurden mit tophat2 v2.0.11 und bowtie2 v2.2.2 auf das Mus musculus mm10-Genom ausgerichtet. Die Genzählungen wurden mit HTSeq v0.6.0 durchgeführt und die Lesezahlen wurden mit Salmon v0.8.27 annotierten Transkripten zugewiesen.

Lesenormalisierung und differenzielle Expression wurden mit DESeq2 v1.14.040 durchgeführt. Für PCA-Diagramme wurden rlog-Transformationen von DESeq-normalisierten Lesevorgängen verwendet. Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million zugeordneter Lesevorgänge (FPKM) Die Normalisierung von DEseq2-Lesevorgängen wurde für Z-Score-Heatmaps verwendet. Die TF-Expression wurde mithilfe von DESeq2 FPKM-normalisierten Werten und einer Liste von Maus-TFs (n = 453) aus HOCOMOCO v1141, einer TF-Datenbank validierter TF-Motive, bestimmt. Es wurde ein angepasster P-Wert-Grenzwert von 0,05 verwendet und der TF-Kandidatenausdruck wurde mithilfe von Z-Score-Heatmaps visualisiert. Statistisch signifikante Unterschiede in der Genexpression wurden mit dem Wald-Test bewertet, gefolgt von einer mehrfachen Testkorrektur unter Verwendung der Benjamini-Hochberg-False-Discovery-Rate (FDR), wobei ein angepasstes P < 0,05 als signifikant angesehen wurde. Pathway-Analysen wurden mit der Ingenuity Pathway Analysis (IPA) durchgeführt. Die Signifikanz wurde durch einen exakten rechtsseitigen Fisher-Test bestimmt, wobei Padj < 0,05 als signifikant angereicherte Signalwege galten.

Zur Kernpräparation wurden einzelne Zellen (1–2 × 105) naiver, aufgelöster und sensibilisierter USCs verwendet, 50.000 Kerne wurden gezählt und in 25 μl 2 × TD-Puffer überführt. Das Omni-ATAC-seq-Reaktionsgemisch (25 μl) einschließlich des TDE1-Enzyms wurde zu 25 μl von 50.000 Kernen in 2 × TD-Puffer gegeben, dann wurden die Proben 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert (während der Inkubation in a alle 10 Minuten geklopft). Wärmeblock). Transponierte DNA-Fragmente wurden sofort mit einem MinElute PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. ATAC-seq-Bibliotheken wurden durch PCR-Amplifikation (10–12 Zyklen) mit einer anfänglichen 5-minütigen Verlängerung bei 72 °C amplifiziert und unter Verwendung von AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter) gereinigt. Die gereinigten Bibliotheken wurden mit 20 μl nukleasefreiem Wasser eluiert, mit dem Qubit dsDNA HS-Assay-Kit (ThermoFisher) quantifiziert und ihre Größenverteilung mit einer 4200 TapeStation (High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents) überprüft. Paired-End-ATAC-seq-Bibliotheken wurden auf einem Illumina NextSeq 500 sequenziert (~350 Millionen Lesevorgänge).

Bei der ATAC-seq-Analyse42 wurden die folgenden Tools und Versionen verwendet: Fastqc v0.11.5, Cutadapt v1.11, Samtools v1.5, Bowtie2 v2.3.0, picard v2.10.0, Macs2 v2.1.1.20160309 und bedtools v2.26.0. Sequenzierungsablesungen wurden unter Verwendung probenspezifischer Indexsequenzen demultiplext, mit fastqc auf Qualität überprüft, mit Cutadapt gekürzt und mit Bowtie243 an einem Referenzmausgenom (mm10) ausgerichtet. Anschließend wurde Picard verwendet, um das sekundäre Alignment zu entfernen, zugeordnete Lesevorgänge zu multiplizieren und PCR-duplizierte Lesevorgänge durchzuführen, und das Peak-Calling erfolgte mit MACS244. Die Analyse der irreproduzierbaren Entdeckungsrate (IDR) mit zwei Replikaten wurde gemäß den ENCODE-Richtlinien45 durchgeführt, und ATAC-Peaks mit IDR < 0,05 wurden als hoch reproduzierbare zugängliche Chromatinregionen für die weitere Analyse ausgewählt. Die ATAC-seq-Signale wurden im WashU Epigenome Browser46 als Fold Change (FC) über dem Hintergrund mithilfe von bedGraph-Tracks visualisiert, die mit der MACS2-bdgcmp-Funktion generiert wurden.

Um DARs zu identifizieren, wurde Diffbind v2.10.0 für ATAC-Peaks mit IDR < 0,05 verwendet, und Benjamini-Hochberg FDR mit einem Cut-off < 0,05 wurde für die statistische Signifikanz verwendet. Signifikante DARs (FDR < 0,05) wurden zur Erstellung von Vulkandiagrammen und Wärmekarten verwendet. GREAT16 (Basal-Plus-Erweiterungsparameter) wurde für die GO-Signalweganalyse verwendet. GREAT ordnet die Ergebnisse mithilfe eines Binomialtests nach dem binomialen P-Wert. Sensibilisierte (FC > 1,5) und aufgelöste spezifische DARs (FC < –1,5) wurden getrennt analysiert und die 15 am häufigsten angereicherten Pfade sind in Abb. 3e – f dargestellt.

Einzelne Zellen (1–2 × 105) von USCs wurden mit DNase I behandelt, um Spuren von DNA-Kontaminationen aus dem Matrigel zu entfernen. Aus den Zellen wurde genomische DNA (gDNA) mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, 69504) hergestellt. Unter Verwendung von 200 ng gDNA und 0,4 ng Lambda wurde die DNA mit dem EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo, D5020) mit Bisulfit behandelt und mit dem xGen Methyl-Seq Library Prep Kit (IDT, 10009824) verarbeitet, um Illumina-kompatible WGBS-Bibliotheken zu generieren. Die Bibliotheken wurden auf einem NovaSeq S4 300XP (~300 Millionen Lesevorgänge) vom MGI-Institut sequenziert.

WGBS-Analysebefehle mit spezifischen Parametern werden im Abschnitt „Codeverfügbarkeit“ ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, fastqQC v0.11.8 wurde verwendet, um die Qualität der Rohdaten zu bewerten. Anschließend wurden die Paired-End-Lesevorgänge mit Cutadapt v1.18 gekürzt, um Adaptersequenzen und Lesevorgänge mit geringer Qualität zu entfernen, und mit FastqQC neu bewertet. Das Maus-Referenzgenom mm10 wurde zunächst mit Bismark v0.20.0 bisulfitkonvertiert. Die Paired-End-Reads wurden mit dem mm10-Bisulfit-konvertierten Genom abgeglichen und mit „deduplicate_bismark“ dedupliziert. Die DNA-Methylierungsgrade wurden mit „bismark_methylation_extractor“ berechnet und im WashU Epigenome Browser46 im MethylC-Format angezeigt. Die Bisulfit-Umwandlung wurde anhand der Umwandlungsrate von Cytosin zu Thymin im Lambda-Referenzgenom geschätzt.

DMRs wurden mit DSS v2.43.247 mithilfe eines Zweigruppenvergleichs für biologische Replikate identifiziert und mithilfe von „DMLtest“ und „callDMR“ aufgerufen. Mit Deeptools v3.3.0 wurde ein PCA-Diagramm der CpG-Methylierung innerhalb von DMRs erstellt. Biologische Replikate wurden kombiniert, indem Fastq-Dateien zwischen Replikaten zusammengeführt und mithilfe der zuvor beschriebenen Schritte erneut verarbeitet wurden. Die CpG-Dichte wurde mithilfe eines 5-fachen Abdeckungs-Cutoffs und ggplot2 v3.3.6 visualisiert.

Sensibilisierte spezifische DMRs wurden als die überlappenden Bereiche zwischen naiven und sensibilisierten und aufgelösten und sensibilisierten DMRs definiert. Die prozentuale Methylierung für sensibilisierte spezifische DMRs wurde mithilfe des R-Pakets „ComplexHeatmap“ visualisiert. Die DNA-Methylierung über sensibilisierte spezifische Hypo-DMRs wurde mit Deeptools aufgezeichnet und mit ggplot2 visualisiert. Überlappende Regionen zwischen DMRs wurden mithilfe von Intervene48 „Venn“ mit Standardparametern identifiziert und visualisiert. Die GREAT16-Analyse an sensibilisierten Hypo-DMRs wurde wie in der ATAC-Analyse beschrieben durchgeführt. Die sensibilisierten Hypo-DMRs wurden auch mit UCSC (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables) auf genomische Annotation analysiert, um GENCODE M25 (https://www.gencodegenes.org/mouse/release_M25.html) herunterzuladen ). Der Promotor wurde als 1 kb stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle definiert. Die Priorität der genomischen Annotation wurde in der folgenden Reihenfolge zugewiesen: Promotor, kodierendes Exon, 5'-UTR, 3'-UTR, Intron und intergen. DMRs wurden der Annotation zugewiesen, wenn die DMR 20 % der Annotation überlappte, wobei BEDTools v2.27.1 verwendet wurde, und sie wurden unter Verwendung der prozentualen Änderung der DNA-Methylierung zwischen sensibilisiert und aufgelöst gegen den log2(FC) assoziierter Gene zwischen sensibilisierter und aufgelöster differenzierter Urothel mit oder ohne aufgetragen Infektion.

Einzelne Zellen (0,2 × 106) von USCs wurden in 0,1 % Formaldehyd leicht vernetzt und fixierte Zellpellets wurden vor der Verwendung bei –80 °C gelagert. H3K4Me3, H3K27Ac und H3K27Me3 CUT&RUN wurde mit einigen Modifikationen mit dem CUT&RUN-Assay-Kit (Cell Signaling, 86652) durchgeführt. Kurz gesagt, für jedes Experiment wurden Zellen an Concanavalin-A-Kügelchen befestigt. Die Zellen wurden mit Digitonin im Antikörperbindungspuffer, der Spermidin und Proteaseinhibitoren enthielt, permeabilisiert und dann mit Primärantikörpern gegen H3K4Me3 (Cell Signaling, 9751, 1:50), H3K27Ac (Cell Signaling, 8173, 1:100) oder H3K27Me3 (Cell Signaling) inkubiert , 9733, 1:50) bei 4 °C über Nacht auf einem Rotator. Die Perlen-Zellen-Mischung wurde dreimal mit Digitonin-Puffer gewaschen, in 50 µl pAG-MNase resuspendiert und 1 Stunde lang bei 4 °C auf einem Rotator inkubiert. Die Proben wurden in PCR-Röhrchen mit 150 µl kaltem Digitonin-Puffer und 3 µl CaCl2 bei 4 °C 30 Minuten lang in einem Thermocycler verdaut. Anschließend wurden die Perlen zurück in die Mikrozentrifugenröhrchen überführt, 150 µl 1× STOP-Puffer hinzugefügt und die Röhrchen 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Röhrchen wurden auf ein magnetisches Gestell gestellt und die Überstände wurden in einem neuen Röhrchen gesammelt. Die Vernetzungen wurden durch Zugabe von 3 µl 10 % SDS-Lösung und 2 µl 20 mg ml-1 Proteinase K rückgängig gemacht, dann wurden die Proben 2 Stunden lang bei 65 °C inkubiert. DNA aus angereicherten Chromatinproben wurde mithilfe von DNA-Spin-Säulen (Zymo, D4013) gereinigt. Die Sequenzierungsbibliothek wurde mit dem Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB, E7645) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet, wobei jedoch die Anneal- und Verlängerungszeit während der PCR-Anreicherung von adaptorligierter DNA auf 10 s verkürzt wurde.

Eine detaillierte Liste der Befehle und Parameter finden Sie unter Codeverfügbarkeit. Kurz gesagt, fastqQC v0.11.9 wurde verwendet, um die Lesequalität zu bewerten. Anschließend wurden die Paired-End-Lesevorgänge mit Cutadapt v1.9 gekürzt und mit fastqQC neu bewertet. Die Lesevorgänge wurden dann mit Bowtie2 v2.3.4.149 ausgerichtet. Mitochondriale Lesevorgänge wurden mit samtools v1.9 entfernt und mit Picard v2.8.1 MarkDuplicates dedupliziert. Eindeutig zugeordnete Lesevorgänge wurden mithilfe der Samtools-Ansicht extrahiert. Peaks wurden mit MACS2 v2.1.1.20160309 „callpeak“ aufgerufen: „-q 0.01“ für die schmalen Peaks H3K4Me3 und H3K27Ac und „-q 0.05 --broad“ für H3K27Me3. Durch den Code definierte Regionen auf der schwarzen Liste wurden entfernt. Für jede Histonmodifikation wurde eine Konsens-Peak-Liste verwendet, um den Anteil der Reads in Peaks (FRIP) zu berechnen. Anschließend wurden die Lesevorgänge mit Deeptools in das BigWig-Format konvertiert und mithilfe der Leseabdeckung und des FRIP-Scores normalisiert. Die normalisierten biologischen Replikate wurden mit ucsc-bigwigmerge v377 kombiniert und unter Verwendung von kentUCS v334 und mm10-Chromosomengrößen von UCSC (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes) von bedGraph in bigWigs konvertiert ). Um sensibilisierte spezifische DMR-Regionen für andere epigenetische Modifikationen zu profilieren, wurden die sensibilisierten Hypo-DMRs mit schmalen MASC2-Peaks für ATAC, H3K4Me3 und H3K27Ac und breiten Peaks für H3K27Me3 überlappt. Der entsprechende Spitzenwert wurde mithilfe der FRIP-Werte normalisiert und mithilfe des R-Pakets „ComplexHeatmap“ aufgezeichnet. Unter Verwendung der normalisierten BigWig-Tracks wurden mithilfe von Deeptools ATAC-, H3K4Me3-, H3K27Ac- und H3K27Me3-Signale über den sensibilisierten spezifischen Hypo-DMRs aufgetragen. Die normalisierten bigWig-Signale wurden für die casp1-Heatmap verwendet.

Die Zellen wurden mit Zelllysepuffer (Cell Signaling, 9803S) gemäß den Anweisungen des Herstellers lysiert. Zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen im Zelllysat wurde das Rapid Gold BCA Protein Assay-Kit verwendet. Gleiche Proteinmengen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membranen wurden über Nacht mit primären Antikörpern gegen Caspase-1 (AdipoGen, AG-20B-0042-C100, 1:5.000) und β-Actin (MA5-15739, Invitrogen, 1:10.000) inkubiert. HRP-gebundener Sekundärantikörper (Cell Signaling, 7076S, 1:3.000) und ECL-Reagenz (Amersham, RPN2209) wurden zur Visualisierung von Proteinbanden verwendet.

Zur Darstellung von Bildern der Konfokal-, Immunfluoreszenz- und SEM-Färbung wurden 3–4 verschiedene Zelllinien (unter J1-5, N1-4, R1-4 und S1-4) gefärbt und abgebildet. Für Western-Blot-Bilder wurden zwei verschiedene Zelllinien getestet. Statistiken für Diagramme/Grafiken wurden in GraphPad Prism v8.4.3 analysiert. Exakte P-Werte werden angezeigt, wenn sie signifikant sind (P < 0,05) (GraphPad Prism lieferte keinen genauen P-Wert, wenn P < 0,0001).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier, seinen Zusatzinformationen oder Quelldaten verfügbar. RNA-seq-, ATAC-seq-, WGBS- und CUT&RUN-Daten wurden beim NCBI unter der BioProject-ID-Nr. hinterlegt. PRJNA705407. Die WashU Epigenome Browser-Karte zur Visualisierung von ATAC-seq-, WGBS-seq- und CUT&RUN- sowie RNA-seq-Daten (Vorwärtsstrang: grün und Rückstrang: orange) ist über die folgenden Links zugänglich:

Kombinierte Replikate:

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_combined.json

Kombinierte und einzelne Replikate:

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_all.jsonQuellendaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Allgemeine ATAC-seq-Pipeline:

https://www.encodeproject.org/documents/c008d7bd-5d60-4a23-a833-67c5dfab006a/@@download/attachment/ATACSeqPipeline.pdf

Allgemeine CUT&RUN-Pipeline:

https://github.com/Yonghao-Holden/tricks/blob/main/cuttag_pipe_v1.sh

Allgemeine WGBS-Pipeline:

https://github.com/hyungjoo-lee/wgbs

Der benutzerdefinierte Code für ATAC-seq, GUT&RUN, WGBS und Figuren:

https://github.com/jharrison0123/Uropathogenic-Escherichia-coli-infection-induzierte-trained-immunity-affects-urinary-tract-disease

Der Code für die Vulkanplots: https://github.com/bsolson/Volcano_plot

EnhancedVolcano-Code: https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI), das von der Washington University School of Medicine, dem Children's Discovery Institute der Washington University und dem St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505) und der Foundation for Barnes unterstützt wird -Jüdisches Krankenhaus (3770) zur Vorbereitung und Abbildung von Rasterelektronenmikroskopieproben. Wir danken M. Shih für die Entwicklung des Fiji ImageJ-Makrocodes zur automatischen Zellgrößenmessung konfokaler Bilder und K. Dodson für die redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (U01 AI095542 an SJH und MC; U19AI110818 an JL) unterstützt; ein Young Investigator Award des National Institutes of Health Mucosal Immunology Studies Team Konsortiums (U01 AI095776 an TJH); das Rheumatic Diseases Research Resource-based Center der Washington University (P30 AR073752, EDOR); ein McDonnell International Scholars Academy Fellowship an der Washington University in St. Louis (an SKR); und ein Graduiertenforschungsstipendium der National Science Foundation (#DGE –114395 an VPO). Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Zentrum für Fraueninfektionskrankheitsforschung, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Seongmi K. Russell, Benjamin S. Olson, Valerie P. O'Brien, Lu Yu, Rajdeep Bomjan, Thomas J. Hannan und Scott J. Hultgren

Abteilung für Genetik, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Jessica K. Harrison, Hyung Joo Lee, Xiaoyun Xing, Elisha DO Roberson, Changxu Fan, Marina Sha und Ting Wang

Edison Family Center für Genomwissenschaften und Systembiologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Jessica K. Harrison, Hyung Joo Lee, Xiaoyun Xing, Changxu Fan, Marina Sha und Ting Wang

Fred Hutchinson Cancer Center, Abteilung für Humanbiologie, Seattle, WA, USA

Valerie P. O'Brien

Programm für Infektionskrankheiten und Mikrobiome, The Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology und Harvard, Cambridge, MA, USA

Jonathan Livny

Medizinische Abteilung, Abteilung für Rheumatologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Elisha DO Roberson

Abteilung für mikrobielle Infektion und Immunität, Institut für Infektionskrankheiten, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Shady Estfanous & Amal O. Amer

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Fakultät für Pharmazie der Helwan-Universität, Kairo, Ägypten

Der zwielichtige Estfanous

Abteilung für Pathologie und Immunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Marco Colonna & Thomas J. Hannan

Abteilung für Entzündung und Immunität, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA

Thaddeus S. Stappenbeck

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SKR, MC, TJH und SJH konzipierten das Projekt. SKR, TSS, TW, TJH und SJH haben die Methodik entwickelt. SKR,. HJL, VPO, XX, JL, RB und TJH führten die Untersuchungen durch. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO, LY, EDOR und MS führten eine formale Analyse durch. SKR hat den Originalentwurf geschrieben. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO, RB, SE, AOA, TW, TJH und SJH haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO und CF führten eine Visualisierung durch. TW, TJH, MC und SJH haben Fördermittel eingeworben. TW, TJH und SJH betreuten das Projekt.

Korrespondenz mit Ting Wang, Thomas J. Hannan oder Scott J. Hultgren.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.̈

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(A) Für die Zellexpansion wurden dissoziierte Zellaggregate in frisches Matrigel eingebettet und dann zu neuen Sphäroiden entwickelt. Urothelsphäroide können je nach Zelldichte alle 3 Tage mit Verdünnungen von 1:2–1:3 passagiert werden. (BD) Primäre USCs stammten von 8 Wochen alten C3H/HeN-Mäusen und wurden in Matrigel mit 50 % CM kultiviert. Nach 3 Tagen Kultur in 50 % CM wurden die Medien am 3., 5. und 7. Tag gegen frisches 50 % CM oder 5 % CM ausgetauscht, dann wurden die RNAs an den Tagen 1, 2, 3 (gelb), 5 (grün) isoliert. und 7 Tage (orange) (USC-Kultur n = 12, 9, 13, 12, 12, 11 bzw. 11). (B) Die Genexpression von p63, (C) Axin2, einem Wnt-Signalmarker, und (D) Upk3a, einem Differenzierungsmarker für Urothelzellen, wurde mittels qRT-PCR gemessen und die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten (zweiseitigen) t-Test bestimmt. (E) Um Blasenorganoide in Matrigel zu kultivieren, wurden USCs 3 Tage lang in 50 % CM vorkultiviert, vorsichtig dissoziiert und dann 5 Tage lang zur Kultur in 50 % CM oder 0 % CM in frisches Matrigel geleitet, während die Medien jeweils gewechselt wurden 2 Tage. Nach einer 5-tägigen Kultur wurden die USC-Sphäroide mit 10 % neutral gepuffertem Formaldehyd (NBF) fixiert und für die Paraffineinbettung vorbereitet. Der Objektträger mit Paraffinschnitten wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und auf Upk3a (rot), E-Cadherin (gelb) und DAPI (blau) oder K20 (rot), K5 (gelb) und DAPI (blau) immungefärbt. .

Quelldaten

(A) Primäre C3H/HeN-Urothelzellen und 5637-Zellen wurden 2–3 Wochen lang in Transwells kultiviert und der transepitheliale elektrische Widerstand (TER) von Transwells wurde alle 2 Tage vor dem Medienwechsel gemessen. Die von jeder Zelllinie gesammelten Daten (jeweils n = 3) werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (B) Das gesamte Urothel beider Zelltypen wurde für die konfokale Mikroskopieanalyse fixiert und gefärbt; F-Aktin (grün) und DAPI (blau). (C) Die Oberflächenzellgröße von primären C3H/HeN-Urothelzellen und 5637-Zellen wurde mithilfe konfokaler Bilder gemessen (jeweils n = 10). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten (zweiseitigen) t-Test (p-Wert <0,001) bestimmt. (D) Die Transwell-Kulturen von C3H/HeN- und 5637-Zellen wurden fixiert, in Scheiben geschnitten und dann zur Paraffineinbettung verarbeitet. Histologische Schnitte wurden geschnitten und mit H&E gefärbt oder auf Upk3a, K20, Ecad, K5, p63 und DAPI immungefärbt.

Quelldaten

(AB) Die HOMER-Motivanalyse unter Verwendung von USC ATAC-seq-Daten (Abb. 4a) generierte Listen angereicherter TF-Bindungsmotive in sensibilisiert zugänglichen DARs (A) und aufgelöst zugänglichen DARs (B) mit ihren p-Werten. HOMER durchsuchte die DAR-Sequenzen nach bekannten Motiven und berechnete den p-Wert des Anreicherungsscores mithilfe des Binomialtests. HOMER entdeckte auch De-novo-Motive mit ihren besten Übereinstimmungen mit einem bekannten Motiv in DARs. Die Top 10 der bekannten und de novo-Motive, die mit sensibilisierten (A) und aufgelösten USCs (B) angereichert sind, werden mit ihrem Sequenzlogo und ihrem p-Wert angezeigt.

(A) Venn-Diagramm aller DMR-Vergleiche mit den Nummern der einzelnen Vergleiche. Die Sensibilisierungs-spezifischen DMRs werden in der Überschneidung zwischen den Vergleichen zwischen naiven und sensibilisierten und sensibilisierten und aufgelösten DMRs angezeigt. (B) Die Dichte der CpG-Methylierung zeigt eine bimodale Verteilung ohne globale Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen den drei Gruppen (naive, aufgelöste und sensibilisierte USCs), wobei die CpG-Methylierung den Anteil der gesamten Lesevorgänge darstellt, die pro CpG-Stelle methyliert werden.

Quelldaten

(A) Sensibilisierte spezifische DMRs zwischen naiven, aufgelösten und sensibilisierten USCs werden als eine Reihe von Heatmaps visualisiert, die DNA-Methylierung, ATAC und Histonmodifikationen anzeigen: H3K27Ac (aktiver Promotor/Enhancer), HeK4Me3 (Promotor) und H3K27Me3 (Polycomb-Repression). ). (B) Durchschnittliche Signale 5 kb stromaufwärts und 5 kb stromabwärts von Sensibilisierten-spezifischen Hypo-DMRs für H3K27Me3 (Polycomb-Repression) werden für jede Zelllinie visualisiert.

RNAs wurden aus naiven, aufgelösten und sensibilisierten USCs isoliert, dann mittels RNA-Seq analysiert und eine Differenzialanalyse durchgeführt. Die Signifikanz wurde durch den Wald-Test bestimmt, gefolgt von einer mehrfachen Testkorrektur mit Benjamini-Hochberg FDR für den angepassten p-Wert.108 und 73 Gene wurden in sensibilisierten USCs im Vergleich zu (A) naiven und (B) aufgelösten USCs signifikant unterschiedlich exprimiert (P-adj < 0,05). Angereicherte Signalwege in sensibilisierten USCs im Vergleich zu (C) naiven und (D) aufgelösten USCs sind hier aufgeführt. Überlappende Pfade in beiden Analysen sind unterstrichen. IPA bestimmt die Signifikanz mithilfe eines exakten rechtsseitigen Fisher-Tests, wobei P-adjustierte <0,05 als signifikant angereicherte Pfade gelten.

Quelldaten

RNA wurde aus juvenilen naiven, erwachsenen naiven, aufgelösten und sensibilisierten USCs isoliert (Zelllinien von n = 3, n = 4, n = 4, n = 3 von 14 Mäusen). Anschließend wurde eine RNA-seq-Analyse wie in Abb. 4a beschrieben durchgeführt. Die Signifikanz wurde durch den Wald-Test bestimmt, gefolgt von einer mehrfachen Testkorrektur mit Benjamini-Hochberg FDR für den angepassten p-Wert. (A) Ein Vulkandiagramm differentiell exprimierter Gene (DEGs), das juvenile naive vs. adult naive USCs vergleicht, identifiziert 8 signifikante DEGs (FDR-Grenzwert 0,1). (B) Der in Abb. 4a gezeigte PCA-Biplot für die PCA zeigt an, wie stark jedes Gen die Hauptkomponenten (PC) beeinflusst. Gene wie Znfx1 und Ly6e beeinflussen PC1 (Dim1) stark, während Gene wie Kank1 und Krt1 PC2 (Dim2) stark beeinflussen.

Quelldaten

RNA-seq-Daten von UTI89-infizierten und scheininfizierten differenzierten Urothelien (Abb. 4c) wurden zur Durchführung einer Differentialanalyse verwendet. (A) Vulkandiagramme zum Vergleich von UPEC-infizierten mit scheininfizierten naiven, gelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien (UPEC-Infektionsreaktion). (B) Die differenzielle Genexpression von Ptgs2 zwischen naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien mit oder ohne UTI89-Infektion wird als Heatmap visualisiert. (C) Es wurde ein Vulkandiagramm durchgeführt, in dem UTI89-infizierte sensibilisierte mit aufgelösten differenzierten Urothelien verglichen wurden. (D) Die Pathway-Analyse wurde verwendet, um die biologischen Pathways, die mit unterschiedlich exprimierten Genen in UPEC-infizierten sensibilisierten differenzierten Urothelien angereichert sind, im Vergleich zu aufgelösten differenzierten Urothelien zu bewerten, und die Signifikanz wurde durch einen genauen Fisher-Test mit rechtsseitigem Ende bestimmt, wobei P-bereinigt <0,05 als signifikant angesehen wurde bereicherte Wege. Dargestellt sind ausgewählte Pfade mit Z-Score > 2 und –log(p-Wert) > 2 aus den spezifischen angereicherten Pfaden durch IPA.

Quelldaten

(AB) Die HOMER-Motivanalyse der ATAC-seq-Daten in Abb. 4 wurde durchgeführt, um die unterschiedliche TF-Bindungsmotivanreicherung in den DARs zu zeigen, die in sensibilisierten und aufgelösten USCs gefunden wurden. Unter Verwendung einer Liste der jeweils 10 wichtigsten bekannten und de novo-Motive von sensibilisiert zugänglichen DARs (A) und gelöst zugänglichen DARs (B) (Extended Data Abb. 3a, b) wurden unterschiedliche Genexpressionen dieser Motivbindungs-TFs in Naive, Resolved ermittelt und sensibilisierte differenzierte Urothelien werden als Heatmaps visualisiert. Gene, die nicht in den RNA-seq-Daten gefunden werden, werden von der Heatmap ausgeschlossen. (C) Die Top 10 der differenziell ausgedrückten TFs zwischen sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien werden als Heatmap mit Angabe von Log2(FC) und P-adj visualisiert. Die Signifikanz der DEGs wurde durch den Wald-Test bestimmt, gefolgt von einer mehrfachen Testkorrektur unter Verwendung des Benjamini-Hochberg-FDR für den angepassten p-Wert.

(A) Unterschiede in der Zugänglichkeit des Chromatins, der DNA-Methylierung und den Histonmodifikationen H3K4Me3 und H3K27Ac in verschiedenen USCs wurden durch ATAC-seq, Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms (WGBS) und CUT&RUN bewertet. Relative DNA-Methylierung, Chromatinzugänglichkeit und Histonmodifikationen an der Casp1-Promotorstelle im Vergleich zu naiven, aufgelösten und sensibilisierten USCs werden als Heatmap angezeigt, indem das normalisierte Signal unter Verwendung der Leseabdeckung und des Anteils der Lesevorgänge unter Konsenspeaks angezeigt wird. (B) Potenzielle TF-Bindungsstellen in der Nähe des Casp1-Promotors werden auf der Epigenom-Browserkarte visualisiert.

Tabelle 1. Liste von 2.880 signifikant unterschiedlich zugänglichen Regionen (DARs) zwischen sensibilisierten und aufgelösten USCs und ihren proximalen Gennamen, die Abb. 3a, b unterstützen. Tabelle 2. Die wichtigsten differenziell exprimierten Gene (DEGs) von IPA im Vergleich zwischen scheininfizierten sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien. „Exp-Log-Verhältnis“ gibt die log2-fache Änderung des Ausdrucks an. Tabelle 3. Informationen zu Antikörpern. Tabelle 4. Liste der qRT-PCR-Primer.

Tab 1 (Abb. 1b). Messung der TER an den angegebenen Tagen während 21 Tagen der Kultur/Differenzierung von #1–5 unabhängigen juvenilen C3H/HeN in Transwells.

Tab 1 (Abb. 2b). Zeitlicher Verlauf des Urinbakterientiters über 4 wpi während der Erstinfektion mit 108 cfu UTI89 KanR in 8 Wochen bei weiblichen C3H/HeN-Mäusen. Tab 2 (Abb. 2f). Durchschnittliche Zellgröße pro Transwell, dargestellt als Median mit 95 % KI. Tab 3 (Abb. 3g). Die individuelle Zellgröße wird als Median mit 95 %-KI dargestellt.

Tab 1 (Abb. 3c). Sensibilisiert-zugängliche DARs (Vergleich sensibilisiert vs. aufgelöst, n = 747 DARs, Faltungsänderung >1,5, FDR < 0,05), die für die GREAT GO-Termanalyse verwendet werden. Tab 2 (Abb. 3d–h). Liste von 189 sensibilisiert-spezifischen differentiell methylierten Regionen (DMRs) aus naiven vs. sensibilisierten und aufgelösten vs. sensibilisierten Vergleichen.

Tab 1 (Abb. 4b-1). DEG-Vergleich zwischen sensibilisierten und aufgelösten USCs, was auch ED Abb. 6b unterstützt. Tab 2 (Abb. 4b-2). DEG-Vergleich zwischen sensibilisierten und naiven USCs, was auch ED Abb. 6a unterstützt. Tab 3 (Abb. 4d). DEG-Vergleich zwischen scheininfizierten sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien, die für die Vulkandarstellung verwendet wurden. Tab 4 (Abb. 4e). IPA-Signalweganalyse von scheininfizierten sensibilisierten im Vergleich zu aufgelösten differenzierten Urothelien. Tab 5 (Abb. 4f). Eine Heatmap-Visualisierung der differentiellen Genexpression in naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien mit oder ohne Infektion, die auch Extended Data Abbs unterstützt. 8b und 9.

Tab 1 (Abb. 5d). Die Genexpression von Casp1 in naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien mit oder ohne UTI89-Infektion wurde mittels qRT-PCR gemessen (n = 4, 4, 4, 5, 4, 4). Tab 2 (Abb. 5f). LDH-Messung von naiven, aufgelösten und sensibilisierten differenzierten Urothelien nach einer UTI89-Infektion bei 4 hpi. Daten erhalten aus n = 7, 10, 14, 8, 10, 4, 6. Tab. 3 (Abb. 5g). Naive, aufgelöste und sensibilisierte Mäuse wurden mit 107 cfu WT UTI89 (HlyA+) oder UTI89ΔhlyA herausgefordert. Die Daten wurden aus zwei bis drei unabhängigen Experimenten kombiniert. Die bakterielle Belastung der Blase bei 6 hpi, gemessen an n = 10, 7, 19, 8, 14 bzw. 11 Mäusen, wurde in 2–3 unabhängigen Experimenten untersucht. Tab 4 (Abb. 5h). Inzidenz chronischer Zystitis im Vergleich zur Auflösung bei 28 dpi für naive, gelöste und sensibilisierte Mäuse nach einer Provokationsinfektion.

Abb. 5e. Unbeschnittene Gel- und Blotbilder von N3-, R3- und S3-differenzierten Urothelien. a: Ganzes Gel, beladen mit zwei Sätzen von 6 Proben (PBS-scheininfizierte N3-, R3- und S3-Urothelzellen und UTI89-infizierte N3-, R3- und S3-Urothelzellen) mit 4–20 % Tris-Glycin-Beladungsfarbstoff. Sowohl nicht infizierte als auch infizierte sensibilisierte Urothelzellen wiesen eine Caspase-1-Färbung auf. Für die Arbeit wurden nur scheininfizierte N3-, R3- und S3-Daten verwendet, da sensibilisierte Zellen unabhängig vom Infektionszustand Caspase-1 exprimierten. b, Membranbild (1–6-Spur-Schnitt wurde für die β-Actin-Färbung und 7–14-Spur-Schnitt für die Caspase-1-Färbung verwendet). c: Die Filmentwicklung erfolgte getrennt, da die β-Actin- und Caspase-1-Färbung unterschiedliche Belichtungszeiten erforderte (1 Minute bzw. 3 Minuten). Die Expression von β-Actin (~48 kDa) war in allen Proben ähnlich, während nur sensibilisierte Zellen eine Färbung an den Stellen P45-Pro-Caspase-1 (~45 kDa) und P35-Caspase-1 (~35 kDa) aufwiesen. Für Abb. 5e im Manuskript (d) wurde für eine sauberere Bandentrennung ein 20-sekündiges Belichtungsbild anstelle einer 1-minütigen Belichtung für β-Actin verwendet.

Tab 1 (ED Abb. 1b). p63-Expression gemessen durch qRT-PCR aus C3H/HeN-Primärzellen, die unter den in ED Abb. 1b–d angegebenen Bedingungen kultiviert wurden. Jede Bedingung zu den Messzeitpunkten ist n = 12, 9, 13, 12, 12, 11 bzw. 11. Tab 2 (ED Abb. 1c). Messung der Axin2-Expression unter Verwendung desselben Probensatzes. Tab 3 (ED Abb. 1d). Messung des Upk3a-Ausdrucks unter Verwendung desselben Probensatzes.

Tab 1 (ED Abb. 2a). Vergleich des transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) zwischen primären C3H/HeN-USCs und 5637-Zellen für eine 2–3-wöchige Kultur im Differenzierungszustand. Tab 2 (ED Abb. 2b). Vergleich der Oberflächenzellgröße zwischen primären C3H/HeN-Urothelzellen und 5637-Zellen (jeweils n = 10).

Tab 1 (ED Abb. 4a-1). Naive vs. sensibilisierte DMRs. Tab 2 (ED Abb. 4a-2). Naive vs. gelöste DMRs. Tab 3 (ED Abb. 4a-3). Aufgelöste vs. sensibilisierte DMRs.

Tab 1 (ED Abb. 6c). IPA-Signalweganalyse von sensibilisierten vs. naiven USCs. Tab 2 (ED Abb. 6d). IPA-Signalweganalyse von sensibilisierten vs. aufgelösten USCs.

Tab 1 (ED Abb. 7a). DEGs vergleichen jugendliche naive mit erwachsenen naiven USCs, die für den Vulkanplot verwendet wurden.

Tab 1 (ED Abb. 8a-1). DEG-Vergleich zwischen UTI89-infizierten und scheininfizierten naiven differenzierten Urothelien, verwendet für die Vulkandarstellung. Tab 2 (ED Abb. 8a-2). DEG-Vergleich zwischen UTI89-infizierten und scheininfizierten aufgelösten differenzierten Urothelien, verwendet für die Vulkandarstellung. Tab 3 (ED Abb. 8a-3). DEG-Vergleich zwischen UTI89-infizierten und scheininfizierten sensibilisierten differenzierten Urothelien, verwendet für die Vulkandarstellung. Tab 4 (ED Abb. 8b). DEG-Vergleich zwischen UTI89-infizierten sensibilisierten und aufgelösten differenzierten Urothelien, verwendet für die Vulkandarstellung. Tab 5 (ED Abb. 8c). IPA-Signalweganalyse von UTI89-infizierten sensibilisierten vs. aufgelösten differenzierten Urothelien.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Russell, SK, Harrison, JK, Olson, BS et al. Eine durch eine uropathogene Escherichia-coli-Infektion hervorgerufene epitheliale Immunität beeinflusst den Verlauf von Harnwegserkrankungen. Nat Microbiol 8, 875–888 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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Eingegangen: 23. Dezember 2022

Angenommen: 20. Februar 2023

Veröffentlicht: 10. April 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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