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Oct 18, 2023

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BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 161 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die objektive Ansprechrate von Patienten mit metastasiertem Darmkrebs (mCRC) mit hoher Mikrosatelliteninstabilität (MSI-H) und einer Erstlinien-Monotherapie mit anti-programmiertem Zelltodprotein 1 (PD-1) beträgt nur 40–45 %. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglicht eine unvoreingenommene Analyse der gesamten Zellvielfalt, aus der die Tumormikroumgebung besteht. Daher verwendeten wir scRNA-seq, um Unterschiede zwischen Mikroumgebungskomponenten zwischen therapieresistenten und therapieempfindlichen Gruppen bei mCRC mit MSI-H/Mismatch-Repair-Defizienz (dMMR) zu bewerten. Resistenzbezogene Zelltypen und Gene, die durch diese Analyse identifiziert wurden, wurden anschließend in klinischen Proben und Mausmodellen verifiziert, um den molekularen Mechanismus der Anti-PD-1-Resistenz in MSI-H- oder dMMR-mCRC weiter aufzudecken.

Das Ansprechen primärer und metastatischer Läsionen auf eine Erstlinien-Anti-PD-1-Monotherapie wurde radiologisch beurteilt. Zellen aus primären Läsionen von Patienten mit MSI-H/dMMR-mCRC wurden mithilfe von scRNA-seq analysiert. Um die Markergene in jedem Cluster zu identifizieren, wurden unterschiedliche Zellcluster identifiziert und einer Subcluster-Analyse unterzogen. Anschließend wurde ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk aufgebaut, um Schlüsselgene zu identifizieren. Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden eingesetzt, um Schlüsselgene und Zellmarkermoleküle in klinischen Proben zu verifizieren. Zur Untersuchung der Expression von IL-1β und MMP9 wurden Immunhistochemie, quantitative Echtzeit-PCR und Western Blot durchgeführt. Darüber hinaus wurde eine quantitative Analyse und Sortierung von myeloiden Suppressorzellen (MDSCs) und CD8+ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt.

Die Tumorreaktionen bei 23 Patienten mit MSI-H/dMMR-mCRC wurden radiologisch untersucht. Die objektive Ansprechrate betrug 43,48 % und die Krankheitskontrollrate lag bei 69,57 %. Die ScRNA-seq-Analyse zeigte, dass die behandlungsempfindliche Gruppe im Vergleich zur behandlungsresistenten Gruppe mehr CD8+-T-Zellen akkumulierte. Experimente sowohl mit klinischen Proben als auch mit Mäusen zeigten, dass die Infiltration von IL-1β-gesteuerten MDSCs und die Inaktivierung von CD8+ T-Zellen zur Anti-PD-1-Resistenz bei MSI-H/dMMR-CRC beitragen.

CD8+ T-Zellen und IL-1β wurden als Zelltyp bzw. Gen mit der höchsten Korrelation zur Anti-PD-1-Resistenz identifiziert. Die Infiltration von IL-1β-gesteuerten MDSCs war ein wesentlicher Faktor für die Anti-PD-1-Resistenz bei CRC. Es wird erwartet, dass IL-1β-Antagonisten als neue Behandlung für die Resistenz gegen Anti-PD-1-Inhibitoren entwickelt werden.

Peer-Review-Berichte

Darmkrebs (CRC) ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren des Verdauungstrakts und weist die zweithöchste Sterblichkeitsrate und die dritthöchste Inzidenzrate unter allen bösartigen Tumoren auf [1]. Obwohl sich Diagnose- und Behandlungsstrategien für Darmkrebs in den letzten Jahren rasant verbessert haben, ist die Prognose für viele Darmkrebspatienten ungünstig. Bei vielen Patienten erfolgt die Diagnose erst im fortgeschrittenen Krankheitsstadium, was ein erhebliches Hindernis für eine wirksame Behandlung darstellt.

Die Expression von Proteinen im Zusammenhang mit Mismatch-Repair-Defizienz (dMMR) und Mikrosatelliten-Instabilität-hoch (MSI-H)-Status wurde weithin als wertvoll für die Vorhersage der Wirksamkeit der Immuntherapie bei CRC-Patienten anerkannt. Im Vergleich zu herkömmlichen Krebstherapien hat die Immuntherapie die objektive Ansprechrate (ORR) von MSI-H-mCRC in gewissem Maße verbessert [2, 3]. Allerdings betrug die ORR von Patienten mit MSI-H/dMMR-mCRC mit einer Erstlinien-Monotherapie mit anti-programmiertem Zelltodprotein-1 (PD-1) nur 43,8 % [4]. Somit profitiert mehr als die Hälfte der Patienten aufgrund des MSI-H-Phänotyps nicht von einer Immuntherapie oder Chemotherapie ± gezielter Therapie [5]. Vor diesem Hintergrund zielt diese Studie darauf ab, den Mechanismus der Anti-PD-1-Resistenz bei Patienten mit MSI-H mCRC zu untersuchen.

ScRNA-seq hat zu einem besseren Verständnis der Immunlandschaft bei MSI-H-Patienten beigetragen, was wiederum neue Einblicke in die Mechanismen der Immuntherapie ermöglichte. Frühere Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf den Mechanismus der Immunresistenz bei mikrosatellitenstabilem (MSS) mCRC. Mehrere Studien haben den molekularen Mechanismus der CD40- und CD73-Antagonisten-Therapie auf Einzelzellebene aufgeklärt und eine mögliche theoretische Grundlage für ihre kombinierte Behandlung mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren bei MSS-mCRC bereitgestellt [6,7,8]. Der Mechanismus der PD-1-Resistenz bei Patienten mit MSI-H-mCRC ist jedoch noch unklar. Daher könnte der Vergleich der Immunmikroumgebung zwischen Anti-PD-1-resistenten und Anti-PD-1-sensitiven Gruppen mittels scRNA-seq dazu beitragen, die Mechanismen aufzuklären, die der Immuntherapieresistenz bei MSI-H-mCRC-Patienten zugrunde liegen.

In der vorliegenden Studie wurden während der Koloskopie Gewebeproben von behandlungsempfindlichen und -resistenten Gruppen von MSI-H-mCRC entnommen, die mit einem PD-1-Blocker (Tislelizumab) behandelt wurden. Als nächstes analysierten wir umfassend die Zellsubtypen und Schlüsselgene der beiden Gruppen mithilfe von scRNA-seq. Nachfolgende Experimente wurden mit klinischen Proben und Mausmodellen durchgeführt, um den möglichen Mechanismus der Anti-PD-1-Resistenz zu verifizieren, die durch die durch scRNA-seq angegebenen Schlüsselzelltypen oder Gene induziert wird.

23 MSI-H/dMMR-mCRC-Patienten wurden zwischen dem 1. August 2020 und dem 31. Mai 2022 im Yunnan Cancer Hospital (dem dritten angegliederten Krankenhaus der Kunming Medical University) mit einer Anti-PD-1-Monotherapie behandelt. Ein PD-1-Blocker (200 mg, Tislelizumab, Bei Gene Ltd., China) wurde am 1. Tag jedes 21-tägigen Zyklus intravenös injiziert. Die Wirksamkeit wurde nach jedem dritten Behandlungszyklus radiologisch beurteilt. Patienten galten als empfindlich gegenüber einer Anti-PD-1-Behandlung, wenn sie ein vollständiges Ansprechen (CR) oder ein teilweises Ansprechen (PR) zeigten, und Patienten galten als resistent gegenüber einer Anti-PD-1-Behandlung, wenn sie eine fortschreitende Erkrankung (PD) oder eine stabile Erkrankung hatten (SD). Bei der Koloskopie wurde frisches Darmtumorgewebe (2–4 mm) entnommen. Gewebeproben von insgesamt 23 Patienten (10 empfindliche und 13 resistente) wurden mittels Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF) analysiert. Sechs Patienten (3 PR und 3 PD) wurden zufällig für scRNA-seq ausgewählt. Alle Teilnehmer gaben vor Beginn der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Darüber hinaus genehmigte die Ethikkommission des Yunnan Cancer Hospital alle Studienprotokolle, an denen menschliche Probanden beteiligt waren, gemäß den in der Helsinki-Erklärung beschriebenen ethischen Grundsätzen. Die Einschlusskriterien waren wie folgt: primäres kolorektales Adenokarzinom, bestätigt durch Koloskopiebiopsie und Fernmetastasierung, bestätigt durch CT/MR; MSI-H/dMMR-Status durch Multiplex-qPCR oder IHC bestätigt; sich einer Erstlinien-Anti-PD-1-Monotherapie unterziehen. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn wir aufgrund von Kontraindikationen keine Probe durch Koloskopie erhalten konnten oder aufgrund unzureichender Zellaktivität oder -menge keine Einzelzellsequenzierung durchführen konnten.

Für das einfache und verbesserte Scannen wurde ein 128-Schicht-Spiral-CT von Siemens (SOMATOM Definition AS +) verwendet. Die Patienten waren nüchtern und hatten die Darmvorbereitung wie angewiesen durchgeführt. Der Scanbereich umfasste die gesamte Bauchhöhle. Die Abtastschicht war 1,0 mm dick und hatte einen Abstand von 0,6 mm. Als Kontrastmittel wurde Iohexol (300 mg/ml, 100 ml) verwendet. Die Verzögerungszeit des arteriellen Phasenscans betrug 35–40 s und die des venösen Phasenscans 70–80 s. Die MRT wurde mit einem Philips Elision 3.0 T durchgeführt und die Scansequenz umfasste transversales T1WI_Tse, sagittales und koronales T2WI_Tse, hochauflösendes T2WI_Tse, diffusionsgewichtete Bildgebung und mehrphasige dynamische Verstärkung. Als Kontrastmittel wurde Gadoliniumdiamin verwendet. Die Koloskopie wurde mit dem Olympus CV-290 durchgeführt und die Gewebeentnahme erfolgte durch Ärzte mit mindestens fünfjähriger Erfahrung.

Frisches Tumorgewebe von CRC-Patienten wurde sofort mit Verdauungsenzymen in MACS-C-Röhrchen (Miltenyi Biotec) überführt. Anschließend wurde der Aufschluss mit einem gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) durchgeführt (30 Minuten bei 37 °C). Einzelne Zellen wurden mit Chromium Controller (10X Genomics) gemäß dem Protokoll des Herstellers verarbeitet. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit 20 ml RPMI 1640 (Gibco) gewaschen, durch ein 70-μm-Nylonsieb (BD Falcon) filtriert, durch Zentrifugation (330 × g, 10 min, 4 °C) gesammelt und in einer basischen Lösung resuspendiert enthält 0,2 % fötales Rinderserum (FBS; Gibco).

Ein 10 × Chromium-System (10 × Genomics) und eine Bibliotheksvorbereitung von LC Sciences wurden verwendet, um die Einzelzellen gemäß dem empfohlenen Protokoll für das Chromium Single Cell 30 Reagent Kit (v2 Chemistry) zu betreiben. Für die Sequenzierung wurde der Illumina HiSeq4000 verwendet, und für die Nachbearbeitung und Qualitätskontrolle der Bibliotheken wurde ein 10 × Cell Ranger-Paket (v1.2.0; 10 × Genomics) verwendet.

Alle Einzelzellsequenzierungsdaten wurden mit Cell Ranger V6.1.1 analysiert. Die Ergebnisse sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt. CRC-Proben von drei resistenten Patienten (genannt R1, R2, R3) und drei empfindlichen Patienten (genannt S1, S2, S3) enthielten insgesamt 56.092 Zellen; die Anzahl der in jeder Probe nachgewiesenen Gene lag zwischen 17.564 und 18.093; die mittlere Anzahl zellulärer eindeutiger molekularer Identifikatoren lag zwischen 3.403 und 6.915; und die Sequenzierungssättigung lag zwischen 47 und 63 %. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sequenzierungsqualität insgesamt für die Verwendung in der anschließenden Korrelationsanalyse ausreichend war.

Insgesamt umfasste diese Analyse 56.092 Zellen aus der empfindlichen Gruppe und der resistenten Gruppe. Zur Analyse und Qualitätskontrolle wurde das Seurat-Paket in R (Version 4.0.5) verwendet [9]. Zellen von geringer Qualität (n = 3.071) wurden entfernt, wenn Gene nur in < 3 Zellen nachgewiesen wurden oder wenn insgesamt < 200 Gene durch Gen-Zell-Matrizen nachgewiesen wurden. Als nächstes wurde die globale Skalierungsmethode LogNormalize durchgeführt, um die Genexpressionswerte für die verbleibenden 53.021 Zellen zu normalisieren. Anschließend wurde die Funktion FindVariableFeatures in Kombination mit der vst-Methode in R Studio verwendet, um die variabelsten Gene zu identifizieren, die zur Dimensionsreduzierung verwendet wurden. Nach der Hauptkomponentenanalyse wurden 2000 hochvariable Gene identifiziert. Die Funktionen Jackstraw und ScoreJackStraw wurden angewendet, um die wichtigsten Hauptkomponenten zu bestimmen. Schließlich wurde ein graphbasiertes unbeaufsichtigtes Clustering durchgeführt und mithilfe eines nichtlinearen t-verteilten stochastischen Nachbareinbettungsdiagramms (t-SNE) visualisiert, das durch die Funktionen FindNeighbors und FindClusters definiert wurde.

Die Identitäten der Zelltypen wurden mithilfe des Pakets SingleR (V1.6.1) basierend auf der Celldex-Datenbank charakterisiert. Die FindMarkers-Funktion im R-Paket Seurat wurde verwendet, um die Marker jedes Zellclusters mit min.pct = 0,5, logfc.threshold = 1, min.diff.pct = 0,3 und P <0,05 aufzulisten. Die in dieser Pipeline verwendeten Marker sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S2 aufgeführt.

Um die molekularen Mechanismen jedes Zellsubtyps, des biologischen Prozesses (BP), der Zellzusammensetzung (CC) und der molekularen Funktion (MF) zu untersuchen, wurden eine GO-Anreicherungsanalyse und eine KEGG-Signalweganalyse mit dem R-Paket „clusterProfiler“ (Version 3.14.3) durchgeführt. wobei der Signifikanzschwellenwert auf angepasstes (adj.) P < 0,05 eingestellt ist.

Die ersten 2000 hochvariablen Gene wurden mithilfe der FindVariableFeatures-Funktion in Kombination mit der vst-Methode gescreent. Die FindMarkers-Funktion im R-Paket Seurat wurde nicht nur verwendet, um die Markergene für verschiedene Zellsubtypen zu finden (mit Screening-Parameterschwellenwerten von min.pct = 0,5, logfc.threshold = 1, min.diff.pct = 0,3, P <0,05). ), sondern auch zur Identifizierung von DEGs jedes Zellsubtyps zwischen Anti-PD-1-empfindlichen und Anti-PD-1-resistenten Proben (wobei der Schwellenwert auf |avg_log2FC|≥ 0,5, P ≤ 0,05 eingestellt ist). Die überlappenden Gene zwischen pseudozeitbezogenen Genen und PD-1-Resistenz-bezogenen DEGs wurden als mögliche Schlüsselgene angesehen.

Um Unterschiede bei Immunzellen in den empfindlichen und resistenten Gruppen aufzudecken, wurde die Monocle-Software (Version 2.20.0) [10] verwendet, um Probentrajektorien zu analysieren und den Differenzierungsprozess zu untersuchen. Zunächst wurde eine ausgefeiltere Methode (dpFeature) erstellt, die auf der Grundlage von Cluster- und benutzerdefinierten Entwicklungsmarkergenen von Monocle basiert. Die Signaturgene mit einem hohen Grad an Streuung (q <0,01) wurden unter den durch dpFeature ausgewählten Zellsubtypen identifiziert. Als nächstes wurde DDRTree zur Dimensionsreduzierung und pseudotemporalen Ausrichtung von Zellen entlang der Trajektorie angewendet und schließlich wurden die Trajektorien als 2D-t-SNE-Karten visualisiert. Pseudozeitbezogene Gene wurden basierend auf q < 0,05 der oben genannten Signaturgene identifiziert.

Das Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING; http://string.embl.de/) wurde verwendet, um eine Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) an Kandidaten-Schlüsselgenen durchzuführen. Mithilfe der STRING-Datenbank können die direkten (physikalischen) und indirekten (funktionalen) Assoziationen von Proteinen beurteilt werden [11]. Cytoscape 3.6.1 wurde verwendet, um ein Netzwerkmodell der PPI-Analyseergebnisse zu erstellen. Basierend auf dem STRING-Online-Tool wurde das PPI-Netzwerk der Kandidaten-Schlüsselgene mit mittlerer Konfidenz = 0,4 erstellt. Die vier besten Gene wurden in dieser Studie basierend auf der Konnektivität (Grad) jedes Knotens im PPI-Netzwerk als Schlüsselgene ausgewählt.

Für diese Studie wurde die Darmkrebszelllinie CT26 ausgewählt. Das zur Zelltransfektion verwendete Plasmid wurde von der Ono Company synthetisiert. Achtzehn bis vierundzwanzig Stunden vor der Lentivirus-Infektion wurden 3 × 105/Well anhaftende Zellen in 6-Well-Platten verteilt. Die Anzahl der mit Lentivirus transfizierten Zellen betrug etwa 6 × 105/Well. Wenn die Zellen an den Vertiefungen hafteten und zu 70 % konfluent waren, wurde das ursprüngliche Kulturmedium durch 2 ml frisches Kulturmedium mit 8 μg/ml Polyzoan und einer geeigneten Menge Virussuspension ersetzt. Anschließend wurden die Zellen 8 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, wonach das virushaltige Medium durch frisches Medium ersetzt wurde. Bei erfolgreicher Transfektion war das fluoreszierende Protein nach 48–72 Stunden sichtbar. Wenn keine Fluoreszenz beobachtet wurde, wurde das Infektionsprotokoll wiederholt. Puromycin wurde einen Monat lang zum Screening auf Lentivirus-Überexpression hinzugefügt.

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Medizinischen Universität Kunming genehmigt. Im experimentellen Betrieb halten wir uns strikt an die ARRIVE-Richtlinien. Während des gesamten Experiments wussten die Forscher nicht, welcher Gruppe die aus dem Käfig entnommenen Tiere zugeordnet werden würden, Tiermanager und Forscher, die das Experiment durchführten, kannten die Zuordnungsreihenfolge nicht und Forscher, die die Ergebnisse des Experiments auswerteten, testeten oder quantifizierten, wussten nicht, welche Gruppe sie waren kennen die Interventionsmöglichkeiten.

BALB/c-Mäuse (männlich, 6–8 Wochen alt, 20–30 g) wurden von Beijing Sipeifu Biotechnology Co., Ltd. gekauft. Alle Mäuse wurden in einem SPF-Raum in den Tierhaltungseinrichtungen der Kunming Medical University gehalten Nahrung und Wasser werden nach Belieben bereitgestellt. Das Experiment wurde nach einer Woche adaptiver Fütterung durchgeführt. Basierend auf dem von Mead vorgeschlagenen Freiheitsgrad (E) der Varianzanalyse haben wir die Stichprobengröße der benötigten Versuchstiere geschätzt [12]. Die Gesamtstichprobengröße der Mäuse in dieser Studie betrug 25 und sie wurden zufällig in 5 Gruppen mit 5 Mäusen in jeder Gruppe aufgeteilt. Alle Mäuse wurden mithilfe einer einfachen Zufallsstichprobenmethode zufällig in 5 Gruppen eingeteilt, definiert als OE-NC, OE-IL-1β, OE-IL-1β + Diacerein, OE-IL-1β + Nivolumab und OE-IL-1β + Diacerein- und Nivolumab-Gruppen. Für das Kontrollgruppenmodell (OE-NC-Gruppe) wurden 1 × 106 leere vektorstabilisierte Zellen in 100 μl PBS subkutan in die Flanke von Mäusen injiziert. Für das Behandlungsmodell wurden 1 × 106 überexprimierte, stabil transfizierte IL-1β-Zellen in 100 μl PBS subkutan in die gleiche Stelle von Mäusen injiziert. Als das Tumorvolumen 40 mm3 erreichte (d. h. am 7. Tag), begann die OE-IL-1β + Diacerein-Gruppe mit der intraperitonealen (ip) Injektion des IL-1β-Antagonisten (Diacerein, 0,07 mg/kg), OE-IL-1β + Nivolumab Die Gruppe erhielt eine ip-Injektion eines Anti-PD-1-Antikörpers (Nivolumab, 2 mg/kg); Die OE-IL-1β + Diacerein + Nivolumab-Gruppe wurde mit einer Kombination aus Diacerein und Nivolumab intraperitoneal behandelt. Den Mäusen in der OE-NC-Gruppe und der OE-IL-1β-Gruppe wurde das gleiche Volumen PBS verabreicht. Diacerein und Nivolumab wurden ab dem 7. Tag der Tumorzellinokulation alle 3 Tage intraperitoneal injiziert.

Das Gewicht der Mäuse und das Tumorvolumen wurden in jeder Gruppe am Tag 0, 7, 10, 12, 14 und 16 Tage gemessen. Das Tumorvolumen wurde als ½ (Länge × Breite2) berechnet. Am 16. Tag nach der Inokulation der Tumorzellen wurden alle Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (200 mg/kg) getötet. Bestimmen Sie den Tod von Mäusen anhand des Verschwindens des Hornhautreflexes und der Pupillenemission. Das Tumorgewebe wurde entnommen und gewogen und anschließend wurden molekularbiologische Experimente durchgeführt. Die Auswahl von 16d als experimenteller Endpunkt basiert auf den Ergebnissen vor dem Experiment. Die Auswahl von 16d als experimenteller Endpunkt basiert auf den Ergebnissen vor dem Experiment. Während des gesamten Experiments sollte die Länge des Tumors 20 mm nicht überschreiten und das Tumorgewicht sollte 10 % des Mäusegewichts nicht überschreiten [13].

Die Gesamt-RNA wurde aus der kultivierten Zelllinie CT26 oder Geweben mit TRIzol-Reagenz (Ambion) extrahiert und mit dem SureScript-Erststrang-cDNA-Synthesekit (Servicebio) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. 2xUniversal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (Servicebio) und CFX96-Sequenzerkennungssystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) wurden für qPCR verwendet, und die folgenden Primer wurden verwendet: IL-1β (menschlich), vorwärts: 5'- AATCTCCGACCACCACTACA-3' und umgekehrt: 5'-GACAAATCGCTTTTCCATCT-3'; MMP9 (menschlich), vorwärts: 5'-ATGAGCCTCTGGCAGCCCCTGGTCC-3' und rückwärts: 5'-GGACCAGGGGCTGCCAGAGGCTCAT-3'; GAPDH (menschlich), vorwärts: 5'-CCCATCACCATCTTCCAGG-3' und rückwärts: 5'-CATCACGCCACAGTTTCCC-3'; IL-1β (Maus), vorwärts: 5'- CCTATGTCTTGCCCGTGG-3' und rückwärts: 5'- GTGGGTGTGCCGTCTTTC-3'; MMP9 (Maus), vorwärts: 5'-GTGTGTTCCCGTTCATCTTT-3' und rückwärts: 5'- GCCGTCTATGTCGTCTTTAT-3'; GAPDH (Maus), vorwärts: 5'-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3' und rückwärts: 5'-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'. GAPDH wurde als standardisierte endogene Kontrolle verwendet und 2−△△CT wurde zur Berechnung der relativen mRNA-Expression verwendet.

Proteinproben wurden aus Geweben oder Zellen unter Verwendung von RIPA-Lysepuffer (Servicebio, Wuhan, China) isoliert, der 1 % Protease- und Phosphataseinhibitoren (PMSF; Servicebio) enthielt. Zur Proteinquantifizierung wurde ein BCA-Protein-Assay-Kit (Biyuntian Biotechnology) verwendet. Zur Trennung von Proteinen unterschiedlichen Molekulargewichts wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese angewendet, und die Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (Servicebio) übertragen. Die Membran wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilch blockiert und anschließend mit Primärantikörpern (Proteintech; IL-1β 1:1000; MMP9 1:1000; β-Actin 1:25.000) über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von der Inkubation durch Inkubation mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern für 2 Stunden bei Raumtemperatur.

Paraffinschnitte von Geweben wurden entparaffiniert und rehydriert. Dann wurde Natriumcitratpuffer verwendet, um die nachzuweisenden Antigene zu extrahieren, und die Antigengewinnung wurde durch Hitzeinduktion abgeschlossen. Die geschnittenen Gewebe wurden 15 Minuten lang mit 3 % H2O2 inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren (IF wurde ohne diesen Schritt durchgeführt) und dann 30 Minuten lang mit PBS, das 5 % fötales Rinderserum enthielt, blockiert. Die Gewebe wurden mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation im Dunkeln mit den konjugierten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur für weitere 2 Stunden. DAB wurde als nuklearer Marker für IHC verwendet. DAPI (EX:330-380 nm, Em:420 nm) wurde zur Färbung der Zellkerne (blau) verwendet, Alexa Fluor 488 (EX:495 nm, Em:519 nm) wurde zur Färbung von CD11b (grün) und Alexa Fluor verwendet 555 (EX:555 nm, Em:565 nm) wurde zum Färben von CD14, CD15 und CD8 (rot) verwendet, Alexa Fluor 594 (EX:590 nm, Em:617 nm) wurde zum Färben von CD33 (orange) verwendet.

Polymorphkernige (PMN)-MDSCs/monozytische (M)-MDSCs wurden mit CD11b-FITC (Biolegend, 101.205, USA), Ly-6G-PE (Biolegend, 127.607, USA) und Ly-6C-APC (Biolegend, 128.016) gefärbt , USA) und CD8+ T-Zellen wurden mit CD3-FITC (Biolegend, 100.203, USA) und CD8-PE (Biolegend, 100.707, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Die Proben wurden auf einem Guava easyCyte 8HT-Durchflusszytometer (Millipore) analysiert. Vorwärts- und seitliches Scatter-Gating wurden mit FlowJo_V10 durchgeführt.

Bioinformatische Analysen wurden mit R-Software durchgeführt. Das Online-Tool varElect wurde verwendet, um die Korrelation zwischen Genen im PPI-Netzwerk und CRC zu analysieren. Eine hohe Punktzahl deutete auf eine starke Korrelation hin, mit einer Signifikanzschwelle von P < 0,05, sofern nicht anders angegeben. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler (SE) unabhängiger Experimente dargestellt. Es wurde eine zweiseitige einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit mehrfacher Vergleichs-Post-hoc-Analyse verwendet und P-Werte < 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***) und P < 0,0001 (****) werden als signifikant angegeben. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.0 durchgeführt.

Zwischen dem 1. August 2020 und dem 31. Mai 2022 wurden insgesamt 23 MSI-H/dMMR-mCRC-Patienten mit einer Erstlinien-Anti-PD-1-Monotherapie behandelt. Das Ansprechen auf die Behandlung wurde durch eine radiologische Untersuchung alle 3 PD-1-Zyklen bewertet Inhibitor. PR wurde für sieben Patienten aufgezeichnet, CR wurde für drei Patienten aufgezeichnet, SD wurde für sechs Patienten aufgezeichnet und PD wurde für sieben Patienten aufgezeichnet. Die ORR betrug 43,48 % (10/23) und die Krankheitskontrollrate (DCR) betrug 69,57 % (16/23) (Abb. 1A). Die radiologischen Befunde für primäre und metastatische Läsionen bei sechs Patienten vor und nach der Immuntherapie sind in Abb. 1B und C dargestellt. Abbildung 1B zeigt die Veränderungen bei primären und metastatischen Läsionen bei drei Patienten in der Resistenzgruppe (R1, R2 und R3). ) nach Anti-PD-1-Behandlung. Die Länge der primären Läsionen von R1 erhöhte sich von 2,1 cm auf 3,2 cm, während die der metastatischen Läsionen von 1,6 cm auf 2,7 cm zunahm; die primären und metastatischen Läsionen von R2 nahmen von 0,5 cm auf 1,9 cm bzw. von 0,3 cm auf 0,8 cm zu; Die Länge der primären Läsionen von R3 stieg von 1,5 cm auf 1,9 cm und die Anzahl der metastatischen Läsionen stieg von 3 auf über 20. Die Reaktionen von R1, R2 und R3 wurden als PD bewertet. In ähnlicher Weise zeigt Abb. 1C die Veränderungen der primären und metastatischen Läsionen bei drei Patienten in der empfindlichen Gruppe (S1, S2 und S3) nach einer Anti-PD-1-Monotherapie. Die Länge des Primärtumors von S1 verringerte sich von 2,0 cm auf 1,5 cm und die des metastatischen Tumors verringerte sich von 2,1 cm auf 1,2 cm; die Längen der primären und metastatischen Läsionen von S2 verringerten sich von 1,2 cm auf 0,7 cm bzw. von 5,3 cm auf 4,4 cm; und die Längen der primären und metastatischen Läsionen von S3 verringerten sich von 1,3 cm auf 0,8 cm bzw. von 2,1 cm auf 0,5 cm. Die Antworten von S1, S2 und S3 wurden als PR gewertet.

Wirksamkeitsbewertung von MSI-H-mCRC nach Erstlinien-PD-1-Monotherapie. Ein Flussdiagramm für das Screening von 23 Patienten, die eine Erstlinien-PD-1-Monotherapie erhielten. Bilder von primären und metastatischen Läsionen vor und nach der Immuntherapie werden für (B) drei resistente Patienten und (C) drei empfindliche Patienten gezeigt

Insgesamt sechs Patienten (drei PR und drei PD) wurden zufällig für scRNA-seq ausgewählt. 10 × Genomics-scRNA-Sequenzierungsdatensätze wurden aus frischen CRC-Geweben von drei resistenten (mit R1, R2, R3 bezeichneten) und drei empfindlichen (mit S1, S2, S3 bezeichneten) Patienten gewonnen. Nach der Entfernung von 3071 Zellen geringer Qualität wurden in der Endanalyse insgesamt 53.021 Zellen verwendet (Abb. 2A); Konkret gab es 7679 Zellen aus R1, 10.797 Zellen aus R2, 9020 Zellen aus R3, 7880 Zellen aus S1, 9369 Zellen aus S2 und 8276 Zellen aus S3. Abbildung 2B zeigt die 2000 am stärksten variierenden Gene, wobei die zehn variabelsten Gene markiert sind. PCA der 2000 hochvariablen Gene zeigte in CRC-Zellen keine signifikante Trennung zwischen resistenten und empfindlichen Gruppen (Abb. 2C). Zwanzig Hauptkomponenten wurden auf der Grundlage einer linearen Dimensionsreduktionsanalyse ausgewählt (Abb. 2D). Die nichtlineare Dimensionsreduktion der Daten entsprechend dem Dimensionswert 20 in Kombination mit der RunMap-Funktion ergab eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen in jeder Probe (Abb. 2E). Anschließend wurden diese Zellen anhand der Genexpressionsniveaus durch t-SNE in 23 Zellcluster eingeteilt, und es wurde festgestellt, dass die Verteilung dieser Zelltaxa in den empfindlichen und resistenten Gruppen nahezu identisch ist (Abb. 2F).

Zellcluster in sechs CRC-Proben wurden durch scRNA-Sequenzierung identifiziert. Eine Anzahl von Zellen in verschiedenen Proben. B Anzeige der Top-2000-Variantengene. C PCA der Top-2000-Variantengene. D Lineare Dimensionsreduktionsanalyse der Hauptkomponenten. E Analyse von Zellverteilungen durch nichtlineare Dimensionsreduktion kombiniert mit der RunMap-Funktion. F Analyse der Zellclusterverteilungen in den empfindlichen und resistenten Gruppen durch t-SNE

Unter Verwendung der R-Pakete SingleR und celldex wurden 23 Zellcluster in neun Zellsubtypen annotiert: CD8 + T-Zellen, Epithelzellen, B-Zellen, dendritische Zellen (DCs), hämatopoetische Stammzellen, Monozyten, Fibroblasten, Myozyten und Endothelzellen (Abb . 3A). In Kombination mit Abb. 2F war die Aggregation von CD8+ T-Zellen und Monozyten in der empfindlichen Gruppe deutlich höher als in der resistenten Gruppe. Die Anzahl der Zellen jedes zellulären Subtyps in jeder Probe ist in der Zusatzdatei 3: Tabelle S3 aufgeführt. Insgesamt wurden 679 Markergene für die neun Zellsubtypen erhalten (Zusatzdatei 2: Tabelle S2): Es gab 176 Marker für Fibroblasten, 143 Marker für Endothelzellen, 131 Marker für Myozyten, 67 Marker für DCs, 65 Marker für Monozyten. 40 Marker für hämatopoetische Stammzellen, 27 Marker für Epithelzellen, 17 Marker für CD8+ T-Zellen und 13 Marker für B-Zellen (Abb. 3B). Das oberste Gen für jeden Zellsubtyp ist in Abb. 3C dargestellt. Die Heatmap dieser Gene zeigte, dass jeder Cluster unterschiedliche Genexpressionsmerkmale aufwies (Abb. 3D).

Annotation von Zellsubtypen und funktionelle Anreicherungsanalyse von Markergenen. Eine Annotation von Zellsubtypen gemäß dem R-Paket SingleR und celldex. B Anzahl der Markergene für jeden Zellsubtyp. C Streudiagramm, das den obersten Genmarker für jeden Subtyp zeigt. D Heatmap, die den Top-Genhersteller für jeden Subtyp zeigt

Die GO-Analyse zeigte, dass diese Markergene hauptsächlich bei immunbezogenen biologischen Prozessen wie der Differenzierung von Lymphozyten und Monozyten und der positiven Regulierung von Leukozyten angereichert waren. Darüber hinaus waren sie auch signifikant mit dem „Zytokin-vermittelten Signalweg“ assoziiert (Zusatzdatei 4: Abbildung S1A-C). Die KEGG-Anreicherungsanalyse (zusätzliche Datei 4: Abbildung S1D) zeigte, dass die Markergene signifikant mit Immun-/Entzündungsreaktionen korrelierten (z. B. „Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Wechselwirkung“, „Fc-epsilon-RI-Signalweg“, „AGE-RAGE-Signalweg“, „Zelladhäsionsmoleküle“). Auch krebsbezogene Signalwege, darunter „PI3K-Akt-Signalweg“ und „Proteoglykane bei Krebs“, wurden deutlich angereichert.

Für die neun Zellsubtypen wurden Entwicklungsverläufe simuliert, und es wurde festgestellt, dass 1623 Merkmalsgene in den Zellsubpopulationen unterschiedlich exprimiert werden (Zusatzdatei 5: Tabelle S4). Abbildung 4A veranschaulicht die relativ hohe Streuung dieser Merkmalsgene. Anschließend wurden einzelne Zellen anhand dieser Merkmalsgene mithilfe des R-Pakets Monocle klassifiziert und eine Baumstruktur des gesamten Spektrums der Differenzierungstrajektorien erstellt (Abb. 4B). Aus Sicht der Zelltypisierung war der vorgeschlagene zeitliche Entwicklungstrend der Zellsubtypen insgesamt ein allmählicher Übergang von Epithelzellen zu Zwischenzellen (z. B. Fibroblasten, hämatopoetische Stammzellen, Monozyten, B-Zellen) und schließlich zu CD8+-T-Zellen (Abb. 4C). Aus den 1623 Merkmalsgenen wurden insgesamt 1454 pseudozeitbezogene Gene identifiziert (P <0, 05; Zusatzdatei 6: Tabelle S5). Die KEGG-Analyse (zusätzliche Datei 7: Abbildung S2A) ergab, dass diese Gene an der „Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion“, der „viralen Protein-Interaktion mit Zytokin und Zytokin-Rezeptor“ und dem „Zellzyklus“ beteiligt waren; Sie waren auch untrennbar mit den tumorassoziierten Signalwegen „NF-kappa B-Signalweg“, „p53-Signalweg“ und „PPAR-Signalweg“ verbunden. Die GO-BP-Analyse ergab, dass diese pseudozeitbezogenen Gene mit der Immunantwort, der Entzündungsreaktion, der Differenzierung, Proliferation, Migration und Chemotaxis von Immunzellen zusammenhängen (zusätzliche Datei 7: Abbildung S2B). Darüber hinaus führten diese Gene auch molekulare Funktionen wie „Antigenbindung“, „Immunglobulinrezeptorbindung“ und „extrazellulärer Matrixstrukturbestandteil“ (Zusatzdatei 7: Abbildung S2C) in Zellfraktionen wie „Immunglobulinkomplex“ und „externe Seite von“ aus Plasmamembran“ und „Immunglobulinkomplex, zirkulierend“ (Zusatzdatei 7: Abbildung S2D).

Konstruktion von Zellclustern, Entwicklungsverläufen und Identifizierung von Schlüsselgenen. Eine relative Streuung der Merkmalsgene. B Konstruktion der Baumstruktur des Differenzierungstrajektorienspektrums. C Zeitlicher Evolutionstrend von Zellsubtypen. D Identifizierung gemeinsamer Gene durch Überlappungsanalyse. EA PPI-Netzwerk basierend auf 130 gemeinsamen Genen

Um Unterschiede in der Genexpression für jeden Zellsubtyp zwischen der empfindlichen und der resistenten Gruppe zu beobachten, führten wir eine Differenzanalyse mit der FindMarkers-Funktion im Seurat-Paket durch. Insgesamt wurden 155 DEGs erhalten; 97 wurden hochreguliert und 98 wurden herunterreguliert (Zusatzdatei 8: Tabelle S6). Die Analyse der funktionellen Anreicherung zeigte, dass diese Gene mit Immun- und Entzündungsreaktionen zusammenhängen. DEGs im CD8+-T-Zell-Subtyp waren hauptsächlich an der IFN-bezogenen Reaktion und dem Sauerstofftransport beteiligt, während DEGs im DC- und Fibroblasten-Subtyp mit der Chemokin-bezogenen Reaktion und der Neutrophilenmigration assoziiert waren (Zusatzdatei 9: Abbildung S3A und B) . Die Anreicherungsergebnisse für GO-CC und GO-MF sind in der Zusatzdatei 9 dargestellt: Abbildung S3B und C. Die KEGG-Anreicherungsanalyse zeigte, dass DEGs in den B-Zell- und Monozyten-Subtypen an ähnlichen Signalwegen beteiligt waren und an der Antigenverarbeitung und -präsentation angereichert waren; DEGs der DC- und Fibroblasten-Subtypen waren an krebsbedingten Signalwegen beteiligt, einschließlich der Chemokin- und IL-17-Signalübertragung (zusätzliche Datei 9: Abbildung S3D).

Durch Überlappungsanalyse wurden 130 gemeinsame Gene unter 1454 Pseudozeit-bezogenen Genen und 155 (deduplizierten) PD-1-Resistenz-bezogenen Genen identifiziert (Abb. 4D; Zusatzdatei 10: Tabelle S7). Basierend auf den 130 gemeinsamen Genen wurde mithilfe der STRING-Datenbank ein PPI-Netzwerk mit 109 Knoten und 435 Kanten gezeichnet (Abb. 4E). Die VarElect-Analyse der 130 gemeinsamen Gene identifizierte die beiden Gene mit der höchsten Konnektivität im PPI-Netzwerk als IL-1β (Score = 17,72) und MMP9 (Score = 13,45), was darauf hinweist, dass diese beiden Gene am engsten mit CRC assoziiert sind (zusätzliche Datei). 11: Tabelle S8; Zusatzdatei 12: Abbildung S4). Die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse dieser beiden Schlüsselgene zeigte, dass sie an der Zytokin-Zytokinrezeptor-Interaktion (IL-1β) und den MAPK- und PI3K-Akt-Signalwegen (IL-1β und MMP9) beteiligt sind. Die spezifischen Signalwegkarten sind in der Zusatzdatei 12 dargestellt: Abbildung S5.

IL-1β und MMP9 wurden durch scRNA-seq als die beiden wichtigsten Gene mit der höchsten Korrelation mit der Anti-PD-1-Resistenz identifiziert. Wir verwendeten IHC, um die Expression von IL-1β und MMP9 in 10 empfindlichen und 13 resistenten Tumorgeweben von MSI-H/dMMR-Patienten nachzuweisen. Der IHC-Grad von IL-1β in IL-1β-positiven Geweben war signifikant höher als der in IL-1β-negativen Tumorgeweben (P < 0,001; Abb. 5A). Anschließend wurden alle 23 Patienten basierend auf dem IHC-Grad von IL-1β in IL-1β-negative oder IL-1β-positive Gruppen eingeteilt. Von den 13 Geweben resistenter Patienten wiesen elf Gewebe eine hohe Expression von IL-1β auf; Von den 10 Geweben empfindlicher Patienten wies nur ein Gewebe eine hohe Expression auf (Abb. 5B). Ein ähnlicher Expressionstrend wurde für ein anderes Schlüsselgen, MMP9, beobachtet (P <0,0001; Abb. 5C). Die MMP9-Expression korrelierte positiv mit der IL-1β-Expression (R = 0,6945, P <0,0001; Abb. 5D).

Beziehung zwischen IL-1β und MDSCs oder CD8+ T-Zellen bei MSI-H/dMMR-CRC-Patienten. Eine IHC-Färbung für IL-1β in CRC-Geweben. B Anteil an IL-1β-positivem und IL-1β-negativem Gewebe in der empfindlichen und resistenten Gruppe. C IHC-Färbung für MMP9 in IL-1β-positiven und -negativen Gruppen. D Korrelation zwischen MMP9 und IL-1β gemäß IHC-Scores. IF-Untersuchung und Quantifizierung von (E) PMN-MDSCs, (F) M-MDSCs und (G) CD8+ T-Zellen in den IL-1β-negativen und -positiven Gruppen. Pearson-Korrelationsanalyse der IF-Scores zwischen IL-1β und (H) PMN-MDSCs, (I) M-MDSCs und (J) CD8.+ T-Zellen. ****P < 0,0001

MDSCs sind heterogene Zellen aus dem Knochenmark, die zur Inaktivierung von CD8+ T-Zellen und zur Immunresistenz führen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass IL-1β eine entscheidende Rolle bei der Aggregation und Differenzierung von MDSCs spielen könnte. Wir haben die Beziehung zwischen der IL-1β-Expression und MDSCs mithilfe von IF weiter untersucht. Die Fluoreszenzintensität von Makern in PMN-MDSCs und M-MDSCs in den Geweben von IL-1β-positiven Patienten war signifikant höher als die von IL-1β-negativen Patienten (P <0,0001; Abb. 5E-F). CD8+ T-Zellen wurden durch scRNA-seq als einer der am deutlichsten unterschiedlichen Zellcluster zwischen der empfindlichen Gruppe und der resistenten Gruppe identifiziert. CD8+ T-Zellen in der Tumormikroumgebung (TME) sind für die Antitumorwirkung der Immuntherapie essentiell. Wir verwendeten IF, um die Expression des CD8+-T-Zellmarkers in Geweben nachzuweisen und die Korrelation zwischen IL-1β und CD8+-T-Zellen zu bewerten. Die Fluoreszenzintensität von CD8 in IL-1β-positivem Gewebe war signifikant niedriger als die in IL-1β-negativem Gewebe (P < 0,0001; Abb. 5G). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen IL-1β und PMN-MDSCs (R = 0,8168, P < 0,0001; Abb. 5H), M-MDSCs (R = 0,7604, P < 0,0001; Abb. 5I) oder CD8+ T-Zellen (R = 0,7684, P < 0,0001; Abb. 5J).

Um den Einfluss von IL-1β auf die PD-1-Resistenz bei Darmkrebs weiter zu demonstrieren, wurde ein In-vivo-Xenotransplantatmodell verwendet. Das menschliche IL-1β-Gen wurde stabil in CT26-Zelllinien transfiziert, um die Expression von IL-1β zu erhöhen, wie durch qPCR und Western Blot bestätigt (zusätzliche Datei 12: Abbildung S6). IL-1β-überexprimierende oder nicht transfizierte Kontroll-CT26-Zellen wurden dann männlichen BALB/c-Mäusen subkutan injiziert (n = 5 pro Gruppe; Abb. 6A und B). Nach 7 Tagen Tumorzellinokulation wurde ein fortschreitendes Tumorwachstum beobachtet. Wie in Abb. 6C-D gezeigt, führte die Hochregulierung von IL-1β zu einem erheblichen Anstieg des Tumorvolumens, und es gab keinen signifikanten Unterschied im Mausgewicht zwischen den fünf Gruppen. Wir behandelten die drei Gruppen mit Diacerein, Nivolumab oder beiden und beobachteten das Wachstum von Tumoren, um festzustellen, ob der IL-1β-Antagonist mit dem Immunagens zusammenarbeitet, um das Wachstum von Tumoren zu hemmen. Die durch IL-1β induzierte Erhöhung des CRC-Tumorvolumens (745,74 ± 188,34) und des Gewichts (0,73 ± 0,16) wurde durch Diacerein (619,59 ± 127,03, 0,49 ± 0,09) oder Nivolumab (540,47 ± 90,92, 0,49 ± 0,10, P < 0,05) stark abgeschwächt ) und die Behandlung mit beiden Medikamenten führte zur größten Abschwächung des Tumorwachstums (355,49 ± 39,89, 0,32 ± 0,08, P < 0,001). Diacerein und Nivolumab zeigten deutliche synergistische Wirkungen. Tumorschnitte der inokulierten Mäuse sind in Abb. 6E dargestellt.

IL-1β-Antagonist und PD-1-Inhibitor haben eine synergistische Antitumorwirkung. Ein Diagramm der experimentellen Zeitleiste. B Xenotransplantattumoren von BALB/c-Mäusen 16 Tage nach der Inokulation mit CT26-Zellen, die einen leeren Vektor oder einen IL-1β-Überexpressionsvektor enthalten (n = 5). C Tumorgewicht (n = 5). D Durchschnittliches Körpergewicht und durchschnittliches Tumorvolumen von BALB/c-Mäusen in jeder Behandlungsgruppe (n = 5). E Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Tumoren inokulierter BALB/c-Mäuse (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001

Um zu untersuchen, ob die Wirksamkeit der Diacerein-Behandlung gegen IL-1β-induzierte Nivolumab-Resistenz durch MDSCs vermittelt wurde, wurde eine Durchflusszytometrie unter Verwendung von Biomarkern für PMN-MDSCs, M-MDSCs und CD8+ T-Zellen durchgeführt. Wie in Abb. 7 gezeigt, führte IL-1β zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl der PMN-MDSCs (17,62 ± 5,56 vs. 4,64 ± 0,84, P < 0,0001) und M-MDSCs (5,61 ± 1,35 vs. 1,26 ± 0,33, P < 0,0001) im TME verringerte den Anteil an CD8+ T-Zellen (2,94 ± 1,17 vs. 4,35 ± 1,37, P < 0,01) im Tumorgewebe von Mäusen und verstärkte die Immunsuppression. Als nächstes untersuchten wir weiter, ob Diacerein und Nivolumab ähnliche synergistische Wirkungen bei der Umkehrung des IL-1β-vermittelten Effekts in PMN-MDSCs, M-MDSCs und CD8+ T-Zellen zeigten. Eine Monotherapie mit entweder Diacerein oder Nivolumab unterdrückte die Differenzierung von PMN-MDSCs (11,15 ± 2,90 vs. 17,621 ± 5,561, 12,0 ± 1,88 vs. 17,621 ± 5,561, P < 0,01) und M-MDSCs (3,21 ± 0,77 vs. 1,26 ± 0,33). 4,09 ± 0,90 vs. 1,26 ± 0,33, P < 0,01) und erhöhte die Anzahl der CD8+ T-Zellen (4,16 ± 0,76 vs. 2,94 ± 1,17, 4,81 ± 1,07 vs. 2,94 ± 1,17, P < 0,01). Abbildung 7B und C legen nahe, dass die kombinierte Behandlung im Vergleich zu Nivolumab allein die Anzahl der PMN-MDSCs (8,79 ± 2,98 vs. 12,0 ± 1,89, P < 0,01) und M-MDSCs (2,26 ± 0,72 vs. 4,09 ± 0,90, P < 0,001). Abbildung 7D zeigt, dass der Grad der CD8+-T-Zell-Aggregation in den Monotherapiegruppen mit Nivolumab (4,81 ± 1,07 vs. 5,695 ± 0,90, P < 0,05) im Vergleich zu dem in der Kombinationstherapiegruppe erheblich reduziert war.

IL-1β stimuliert die Aggregation von MDSCs und hemmt die Proliferation von CD8+ T-Zellen in Tumoren. Eine Durchflusszytometrie wurde durchgeführt, um PMN-MDSCs, M-MDSCs und CD8 + T-Zellen (n = 5) zu erkennen. Quantitatives statistisches Diagramm für die Expression von (B) PMN-MDSCs, (C) M-MDSCs, (D) CD8.+ T-Zellen in jeder Gruppe (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001

Als eines der Schlüsselgene im Zusammenhang mit Resistenzen, die durch Einzelzellsequenzierung identifiziert wurden, wird MMP9 eine starke antivaskuläre und immunsuppressive Funktion zugeschrieben. Die Korrelation zwischen MMP9 und IL-1β bleibt jedoch unklar. MMP9 wurde in Maus-CRC-Gewebe mithilfe von qPCR, Western Blot und IHC nachgewiesen. Wie in Abb. 8 gezeigt, erhöhte die IL-1β-Behandlung die MMP9-Expression in Maustumorgeweben signifikant, basierend auf den Ergebnissen von qPCR (9,57 ± 0,26 vs. 1,08 ± 0,44, P < 0,0001) und Western Blot (1,13 ± 0,07 vs. 0,21 ± 0,04, P < 0,0001). Als nächstes untersuchten wir, ob Diacerein mit Nivolumab zusammenarbeiten könnte, um die Expression von MMP9 zu reduzieren. Eine Monotherapie mit entweder Diacerein (4,21 ± 0,60 vs. 9,57 ± 0,26, P < 0,01) oder Nivolumab (6,36 ± 1,10 vs. 9,57 ± 0,26, P < 0,01) schwächte die IL-1β-induzierte Hochregulierung von MMP9 durch qPCR-Analyse ab. Die Kombinationstherapie reduzierte die MMP9-Expression stärker als die Monotherapie mit Diacerein (1,62 ± 0,59 vs. 4,21 ± 0,60, P < 0,0001) oder Nivolumab (1,62 ± 0,59 vs. 6,36 ± 1,10, P < 0,0001). Die Expression von MMP9 im Tumorgewebe korrelierte nahezu positiv mit der von IL-1β (der Wert von R2 ist in Abb. 8I dargestellt).

Korrelation zwischen IL-1β und MMP9 im Maus-Xenotransplantatmodell. qPCR der (A) IL-1β- und (B) MMP9-mRNA-Expression in jeder Behandlungsgruppe (n = 3). C Western-Blot-Analyse (n = 3). Graustufenanalyse von (D) IL-1β und (E) MMP9-Protein (n = 3). IHC-Färbung und Scores der (F, G) IL-1β- und (H, I) MMP9-Expression (n = 5). (J) Pearson-Korrelationsanalyse der MMP9- und IL-1β-Expression (n = 5). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001

Im Vergleich zur herkömmlichen Chemotherapie oder gezielten Therapie verfügt die Immuntherapie über einen einzigartigen molekularen Mechanismus, durch den sie Tumore schrumpfen lässt. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass Immun-Checkpoint-Inhibitoren die allgemeine Immunität des Körpers verbessern, indem sie die Aktivierung von T-Zellen induzieren und „die Immunbremse“ im TME lösen [14, 15]. In einer früheren Studie unseres Zentrums erhielten 29 Patienten mit lokal fortgeschrittenem MSI-H/dMMR-Darmkrebs eine neoadjuvante Immuntherapie mit einem PD-1-Inhibitor als Einzelwirkstoff, und die ORR betrug 100 % (29/29), was mit den Ergebnissen von übereinstimmt die NICHE-Studie [16, 17]. In der vorliegenden Studie erhielten 23 Patienten mit MSI-H/dMMR-mCRC eine Erstlinientherapie mit PD-1-Inhibitoren, die ORR betrug jedoch nur 43,5 % (10/23). Diese unterschiedlichen Reaktionen von MSI-H-mCRC auf eine Anti-PD-1-Monotherapie werden wahrscheinlich durch Unterschiede in der TME-Zusammensetzung verursacht [18,19,20].

Vor diesem Hintergrund haben wir mithilfe von scRNA-seq verschiedene zelluläre Subtypen definiert, Schlüsselgene gescreent und die TME-Signalwege aufgedeckt, die sich zwischen den Anti-PD-1-behandlungsempfindlichen und -resistenten Gruppen unterscheiden. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Anteile der CD8+-T-Zell-Untergruppen in der empfindlichen Gruppe deutlich höher waren als in der resistenten Gruppe [21,22,23,24]. Mehrere CD8+-T-Zell-Untergruppen im TME können die Ansprechrate neuer Therapien beeinflussen, die auf das Immunsystem abzielen [21, 22]. MDSCs sind heterogene Zellen aus dem Knochenmark, die die Angiogenese und Immunsuppression fördern [25]. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass eine Verringerung der Aggregation von MDSCs im TME die Infiltration von CD8+ T-Zellen deutlich steigern und die Antitumorwirkung der PD-1-Hemmung verstärken kann [26, 27]. Die immunsuppressive Wirkung von MDSCs könnte mit der Sekretion verschiedener Zytokine wie der induzierbaren Stickoxidsynthase, Arginase 1, Interleukin-6 und des transformierenden Wachstumsfaktors β zusammenhängen [28].

In dieser Studie belegte IL-1β hinsichtlich der Konnektivität bei der Überlappung von Pseudozeit-bezogenen Genen und PD-1-Resistenz-bezogenen Genen den ersten Platz. Von Monozyten abgeleitete Makrophagen sind eine Hauptquelle der IL-1β-Produktion während der Immunantwort auf eine Pathogeninfektion [29, 30]. Frühere Studien haben gezeigt, dass IL-1β die Invasion und das Wachstum menschlicher Dickdarmkrebszellen fördern könnte [31] und IL-1β-Polymorphismen mit dem Wiederauftreten von CRC verbunden sind [32]. Es wurde gezeigt, dass die IL-1β-Blockade die Immunsuppression umkehrt und eine Synergie mit PD-1-Inhibitoren aufweist, um die Eliminierung mehrerer Tumorarten zu fördern, darunter Brust- [32], Bauchspeicheldrüsen- [18] und Nierentumoren [33]. Dennoch muss die genaue Rolle von IL-1β bei der CRC-Immuntherapie noch geklärt werden. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass IL-1β die Infiltration von MDSCs induzieren kann, indem es den Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor, verschiedene CXC-Chemokine und vaskuläre Adhäsionsmoleküle produziert [34]. Die Rolle der IL-1β-vermittelten MDSC-Aggregation bei der CRC-Immuntherapie bleibt jedoch unklar.

MMP9 ist eine Matrix-Metalloproteinase, die als Bestandteil des angiogenen Schalters während der Karzinogenese identifiziert wurde [35, 36]. MMP9 vermittelt Tumorinvasion, Metastasierung und Immunflucht über einen proonkogenen Signalweg [37,38,39] und ist bei Patienten mit Darmkrebs mit einem Rückfall und einer schlechten Prognose verbunden [40]. Die Kombination der MMP9-Hemmung mit der Immun-Checkpoint-Hemmung steigerte die Wirksamkeit der Immuntherapie in Mausmodellen für Melanome (41) und Brustkrebs (42). MMP9 hat sich auch bei der Stratifizierung der Prognose und der Reaktionsfähigkeit der Immun-Checkpoint-Behandlung bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom als vielversprechend erwiesen [43]. Die vorliegenden KEGG-Analyseergebnisse für 130 Schlüsselgene zeigten, dass IL-1β und MMP9 stark mit den MAPK- und PI3K-Akt-Signalwegen korrelierten. Neuere Studien haben auch darauf hingewiesen, dass IL-1β die MMP9-Expression über verschiedene Signalwege bei verschiedenen Krankheiten hochreguliert [44,45,46]. Die Infiltration von MDSCs könnte die Sekretion von MMP9 weiter stimulieren [47], und die IL-1β-gesteuerte Akkumulation von MDSCs könnte eine der Hauptquellen von MMP9 sein. Die Funktion der durch IL-1β vermittelten MMP9-Hochregulierung bei der CRC-Immuntherapie muss jedoch weiter untersucht werden.

In der vorliegenden Studie haben wir die zelluläre Landschaft immuntherapieresistenter und immuntherapieempfindlicher Gruppen auf Einzelzellebene beschrieben. Der Aggregationsgrad von CD8+ T-Zellen und Monozyten war in der empfindlichen Gruppe deutlich höher als in der resistenten Gruppe. IL-1β und MMP9 wurden als die beiden Gene mit der höchsten Korrelation mit der Anti-PD-1-Resistenz identifiziert. Darüber hinaus verstärkte die IL-1β-gesteuerte Infiltration von MDSCs die Anti-PD-1-Resistenz bei MSI-H/dMMR-CRC.

In der vorliegenden Studie betrugen die ORR und DCR von MSI-H/dMMR-mCRC, die mit einer Erstlinien-PD-1-Monotherapie behandelt wurden, 43,75 % (7/16) bzw. 68,75 % (11/16). Es wurde festgestellt, dass IL-1β- und CD8+-T-Zellen unter den Genen bzw. Zelltypen die höchste Korrelation mit der Anti-PD-1-Resistenz aufweisen. Mausexperimente zeigten, dass die IL-1β-gesteuerte MDSC-Infiltration die Akkumulation von CD8+ T-Zellen unterdrückte, was die Anti-PD-1-Resistenz von MSI-H/dMMR-CRC verstärkte. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass sich IL-1β-Antagonisten als vielversprechende neue Medikamente zur Umkehrung der Resistenz gegen PD-1-Inhibitoren erweisen könnten.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten scRNA-seq-Datensätze sind im NCBI-Repository verfügbar [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA932556].

Biologischer Prozess

Zellzusammensetzung

Vollständige Antwort

Darmkrebs

Krankheitskontrollrate

Dendritische Zellen

Differenziell exprimierte Gene

Mangelhafte Reparatur von Fehlanpassungen

Immunhistochemie

Immunfluoreszenz

Von Myeloiden abgeleitete Suppressorzellen

Metastasierter Darmkrebs

Von monozytären myeloischen Suppressorzellen abgeleitete Zellen

Mikrosatelliten-Instabilität – hoch

Mikrosatellitenstabil

Objektive Rücklaufquote

Progressive Krankheit

Programmiertes Zelltodprotein-1

Polymorphkernige myeloische Suppressorzellen

Teilweise Antwort

Führen Sie eine Protein-Protein-Interaktion durch

Molekulare Funktion

Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Stabile Krankheit

Suchtool zum Auffinden interagierender Gene

Tumor-Mikroumgebung

T-verteilte stochastische Nachbareinbettung

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Unzutreffend.

Dieses Fach wurde durch Zuschüsse des Province Innovation Team Technology Project von Yunnan (Nr. 2019HC009), des Provincial Colorectal Cancer Center Construction Project von Yunnan (Nr. 2020YZ001), des Wissenschaftlichen Forschungsfonds der Bildungsabteilung der Provinz Yunnan (Nr. 2022J0227) und der Provinz finanziert Wissenschafts- und Technologieplanungsprojekt von Yunnan (Nr. 202201AY070001-149).

Tao Wu, Xuan Zhang und Xinxing Liu sind Co-Erstautoren und haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für kolorektale Chirurgie, Yunnan Cancer Hospital, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University, No. 519, Kunzhou Road, Xishan District, Kunming, 650118, China

Tao Wu, Xuan Zhang, Xinxing Liu, Xinyi Cai, Tao Shen, Dingguo Pan, Ruixi Hu, Jianhua Dong, Shilei Gen, Zhaoyu Yang und YunFeng Li

Hochschule für Bioingenieurwesen, Universität Chongqing, Chongqing, China

Rui Liang

Abteilung für minimalinvasive Intervention, Yunnan Cancer Hospital, das dritte angegliederte Krankenhaus der Kunming Medical University, Kunming, China

Rong Ding

Abteilung für Gastroenteroskopie, Yunnan Cancer Hospital, Drittes angegliedertes Krankenhaus der Medizinischen Universität Kunming, Kunming, China

Furong Li & Jinsha Li

Abteilung für Onkologie, Yunnan Cancer Hospital, das dritte angegliederte Krankenhaus der Kunming Medical University, Kunming, China

Lin Xie

Abteilung für Radiologie, Yunnan Cancer Hospital, das dritte angegliederte Krankenhaus der Kunming Medical University, Kunming, China

Chunlong Wang

Abteilung für Dermatologie, Kunming-Kinderkrankenhaus, Kunming, China

Lu Xing

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YL und LX2 haben den Artikel entworfen. TW, XZ und XL verfassten das Manuskript und waren für die Analyse der scRNA-seq-Daten verantwortlich. XC war für den Tierversuch verantwortlich. DP und RD waren für die Patientenrekrutierung und Probenentnahme verantwortlich. RL und TS führten Immunhistochemie und Immunfluoreszenz durch. RH und JD haben das Manuskript geändert. FL und JL führten die Koloskopie durch. CW führte die radiologische Untersuchung durch. LX1 und SG führten die statistische Analyse durch. ZY führte die qPCR und das Western Blot durch. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Lu Xing oder Yun Feng Li.

Alle Teilnehmer hatten vor der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung. Darüber hinaus genehmigte die Ethikkommission des Yunnan Cancer Hospital Studienprotokolle, die auf der Grundlage der ethischen Grundsätze der Helsinki-Erklärung für medizinische Forschung an menschlichen Probanden entwickelt wurden (Genehmigungsnummer: KYLX202127). Die in dieser Studie verwendeten Mäuse stammen alle aus der Abteilung für Versuchstiere der Medizinischen Universität Kunming, und das Versuchsschema wurde von der Ethikkommission für Versuchstiere der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (Genehmigungsnummer: kmmu20221065).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass keine potenziellen Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Tabelle S1. Einzelzellsequenzierungsdaten klinischer Proben von 6 Patienten mit MSI-H/dMMR.

Tabelle S2. Marker, die in der Pipeline zur Analyse von Zellsubtypen verwendet werden.

Anzahl der Zellen von 9 Zellsubtypen in jeder Probe.

Abbildung S1. GO- und KEGG-Analyse von Markergenen.

Tabelle S4. 1623 unterschiedlich exprimierte Gene in 9 Zelluntergruppen.

Tabelle S5. Aus 1623 Merkmalsgenen wurden 1454 pseudozeitbezogene Gene identifiziert.

Abbildung S2. KEGG- und GO-Analyse pseudozeitbezogener Gene.

Tabelle S6. 155 Grad in der Genexpression jedes Zellsubtyps zwischen der empfindlichen Gruppe und der resistenten Gruppe.

Abbildung S3. GO- und KEGG-Analyse von PD-1-Resistenz-bezogenen DEGs.

Tabelle S7. 130 gemeinsame Gene unter 454 pseudozeitbezogenen Genen und 155 (Deduplikations-) PD-1-Resistenz-bezogenen Genen.

Tabelle S8. VarElect-Analyse von 130 gemeinsamen Genen.

Abbildung S4. VarElect-Analyseergebnisse von 130 gemeinsamen Genen in 454 pseudozeitbezogenen Genen und 155 (Deduplikation) PD-1-Resistenz-bezogenen DEGs. Abbildung S5. (A) Die Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion und (B) die MAPK- und PI3K-Akt-Signalwegkarten von IL-1β und MMP9. Abbildung S6. Konstruktion einer stabilen CT26-Zelllinie, die IL-1β überexprimiert. (A) Die in diesem Experiment verwendete Darmkrebszelllinie CT26. (B) Plasmidkarte des IL-1β-Überexpressionsvektors. (C) Screening positiver Kolonien durch Ampicillin nach Plasmidtransformation. (D) Gelkarte der Plasmidelektrophorese. (E) Western Blot wurde angewendet, um die Expression von IL-1β in stabil transformierten Zelllinien nachzuweisen. (F) qPCR wurde verwendet, um die Expression von IL-1β in stabil transformierten Zelllinien nachzuweisen.

Bilder der Original-Blots.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, T., Zhang, X., Liu, X. et al. Die Einzelzellsequenzierung enthüllt die Immun-Mikroumgebungslandschaft im Zusammenhang mit der Anti-PD-1-Resistenz bei metastasiertem Darmkrebs mit hoher Mikrosatelliteninstabilität. BMC Med 21, 161 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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Eingegangen: 08. Dezember 2022

Angenommen: 14. April 2023

Veröffentlicht: 27. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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