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Oct 18, 2023

Impfung mit einem HIV-T

npj Biofilme und Mikrobiome

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 104 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Darmmikrobiota entwickelt sich zu einem entscheidenden Faktor, der die Impfreaktionen moduliert. Allerdings haben nur wenige Studien untersucht, ob Impfstoffe wiederum die Mikrobiota verändern können und inwieweit solche Veränderungen die Wirksamkeit des Impfstoffs verbessern können. Um die Wirkung der T-Zell-Impfung auf das Darmmikrobiom zu verstehen, verabreichten wir C57Bl/6-Mäusen nach einem heterologen Prime-Boost-Schema ein HIV-1-T-Zell-Immunogen (HTI-Arm) oder PBS (Kontrolle, Mock-Arm). Die Längsdynamik der Darmmikrobiota von Mäusen wurde durch 16 S-ribosomale RNA-Sequenzierung in Stuhlproben aus Käfigen sowie aus drei Darmabschnitten (Blinddarm, Dünn- und Dickdarm) charakterisiert. Zum letzten Zeitpunkt der Studie wurden Serum- und Milzzellen entnommen, um Immunkorrelate mithilfe von IFNγ-ELISPOT- und Zytokin-Luminex®-Assays zu bewerten. Im Vergleich zu Mock waren HTI-geimpfte Mäuse mit Clostridiales-Gattungen (Eubacterium xylanophilum-Gruppe, Roseburia und Ruminococcus) angereichert, die als Hauptlieferanten entzündungshemmender Metaboliten wie kurzkettiger Fettsäuren bekannt sind. Eine solche Verschiebung wurde nach der ersten HTI-Dosis beobachtet und blieb während der gesamten Nachbeobachtungszeit der Studie (18 Wochen) bestehen. Die angereicherten Clostridiales-Gattungen unterschieden sich jedoch zwischen Kot und Darmabschnitten. Die in geimpften Tieren angereicherte Bakterienhäufigkeit korrelierte positiv mit HTI-spezifischen T-Zell-Reaktionen und einer Reihe entzündungsfördernder Zytokine wie IL-6. Diese Längsschnittanalyse weist darauf hin, dass die T-Zell-Impfung bei Mäusen eine Zunahme von Darmbakterien fördern kann, von denen bekannt ist, dass sie entzündungshemmende Moleküle produzieren, die wiederum mit proinflammatorischen Zytokinen korrelieren, was auf eine Anpassung des mikrobiellen Milieus im Darm an T-Zell-induzierte Moleküle schließen lässt systemische Entzündung.

Es ist gut erwiesen, dass die residente gastrointestinale Mikrobiota eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Regulierung sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunantwort spielt1. Von den verschiedenen Determinanten der adaptiven Immunantwort könnte die Polarisation der T-Zell-Antwort besonders durch die Zusammensetzung der Darmbakterien beeinflusst werden2. Tatsächlich wurde das Fehlen spezifischer Bakterien mit einer verringerten Häufigkeit von Treg-Zellen im Darm3 oder fehlregulierten Th17-Zellreaktionen bei keimfreien und mit Antibiotika behandelten Mäusen in Verbindung gebracht4. Abnormale Verhältnisse dieser T-Zell-Subpopulationen (Th17 und Treg) wurden häufig mit Stoffwechsel- oder Immunerkrankungen in Verbindung gebracht5.

Angesichts der engen Wechselwirkung und Koevolution von Darmmikrobiota und Immunsystem6 deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass bestimmte Bakterientaxa auch durch Impfung induzierte Immunreaktionen modulieren könnten7, indem sie lokale oder systemische Wirkungen ausüben8. In den letzten Jahren haben mehrere klinische und tierexperimentelle Studien gezeigt, dass die Zusammensetzung und Funktionen der Darmmikrobiota entscheidende Faktoren für die Immunogenität und Wirksamkeit oraler und injizierbarer Impfstoffe sind9,10. Bisher konzentrierten sich die meisten Arbeiten in diesem Bereich auf die Rolle der Mikrobiota bei der Modulation impfstoffinduzierter Antikörperreaktionen7. Bemerkenswert ist, dass die Bedeutung der T-Zell-vermittelten Immunität zunehmend erkannt wird, wenn es um den Schutz geht, der durch verschiedene Immunisierungsstrategien hervorgerufen wird, darunter solche gegen Krankheitserreger wie HIV-111 oder SARS-CoV-212. Dennoch hat eine begrenzte Anzahl von Studien den Zusammenhang zwischen der bereits vorhandenen Darmmikrobiota und den T-Zell-Reaktionen auf die Impfung direkt untersucht13.

Die Auswirkungen der Impfstoffverabreichung auf die Darmmikrobiota haben noch weniger Aufmerksamkeit erregt. Frühere Arbeiten, die die Auswirkungen von HIV-114-,15- und oralen Typhus-16-Impfstoffen auf die menschliche Darmmikrobiota untersuchten, berichteten über keine erkennbaren Störungen der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur, die durch die Impfung hervorgerufen wurden. Im Gegensatz dazu wurde im rektalen Mikrobiom nichtmenschlicher Primaten ein Anstieg des Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnisses nach der HIV-1-DNA/Protein-Immunisierung beobachtet17. Außerdem wurden in einer kürzlich durchgeführten Studie, in der zwei Impfstrategien gegen SARS-CoV-2 verglichen wurden, Veränderungen in der menschlichen Darmmikrobiota einen Monat nach der Impfung festgestellt, die durch eine geringere Alpha-Diversität und eine erhöhte Häufigkeit einer bestimmten Bakterienart wie Bacteroides caccae gekennzeichnet waren18. Insgesamt liefert dies zumindest einen Indizienbeweis dafür, dass eine Impfung die ansässige Mikrobiota beeinflussen kann. Daher kann das Verständnis, wie Impfstoffe Veränderungen im intestinalen Immunmilieu des Wirts fördern und die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft verändern, wichtige Einblicke in dieses Zusammenspiel und damit in die Identifizierung spezifischer Bakterien liefern, die den Impferfolg positiv beeinflussen.

In der vorliegenden Studie wurden HIV-1-T-Zell-Immunogen (HTI) exprimierende Vektoren19,20 verwendet, um impfstoffinduzierte Veränderungen in der Darmmikrobiota zu bewerten und mögliche Korrelationen mit der immunologischen Reaktion auf die Impfung in einem Mausmodell zu identifizieren. Die HTI-Immunogenität wurde sowohl an Mäusen21,22 als auch an Menschen23 unter Verwendung verschiedener Impfstoffvektoren (wie DNA, Schimpansen-Adenovirus, ChAdOx1; modifiziertes Impfstoffvirus Ankara, MVA und Bacillus Calmette-Guérin, BCG) getestet. Basierend auf diesen früheren Erkenntnissen wurden der Mausstamm C57Bl/6 und ein Drei-DNA-Prime gefolgt von einem ChAdOx.1-MVA-Boost ausgewählt, um maximale Immunogenität zu erreichen. Die 16 S-rRNA-Gensequenzierung wurde verwendet, um longitudinale Profile des fäkalen Mikrobioms und des Darminhalts bei Mäusen zu charakterisieren, die ein Prime-Boost-HTI-Immunisierungsschema oder PBS (Kontrollgruppe) erhielten. Es wurden auch Korrelationen zwischen den mikrobiellen Signaturen im Darm, der T-Zell-Impfstoffreaktion und den Zytokinen nach vollständiger Immunisierung untersucht.

Um die Auswirkungen der HTI-Impfung auf die Darmmikrobiota zu untersuchen, wurden zwei Versuchsgruppen verglichen, die das HTI-Immunogen (immunisiert, n = 20) oder PBS (Mock, n = 20) erhielten (Abb. 1). Zur Profilierung des Darmmikrobioms wurden Stuhlproben in Längsrichtung aus Käfigen und aus drei Darmabschnitten entnommen; Am Ende der Studie wurden Serum und Splenozyten entnommen, um die Immunogenität des Impfstoffs bzw. die Zytokinprofile zu beurteilen (ergänzende Abbildung 1). Zwei Wochen vor der Impfung wurde die Darmmikrobiota der Mäuse durch Antibiotika-Konditionierung homogenisiert, gefolgt von einem fäkalen Mikrobiota-Transfer (FMT) von Maus zu Maus, um die Basisvariabilität zu verringern, wie im Ergänzungstext und in der ergänzenden Abbildung 2 beschrieben. Basiseigenschaften der Maus bei der Ankunft des Tieres ( -3w; Ergänzungstabellen 1 und 2) und vor der Impfung (0w; Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 3) werden angegeben.

Weibliche und männliche Mäuse wurden mit einem HIV-T-Zell-Impfstoff (drei DNA.HTI-Prime, gefolgt von einem ChAd.HTI- und MVA.HTI-Booster; n = 20) oder einem Scheinimpfstoff (PBS; n = 20) immunisiert. Vor der Impfung wurde eine Antibiotikakonditionierung mit anschließendem Mikrobiomtransfer im Stuhl durchgeführt, um den Darminhalt bei allen Tieren zu homogenisieren. Die Sammlung der Proben, einschließlich Stuhl, Lumeninhalt, Serum und Milz, wurde zu den angegebenen Zeitpunkten abgeschlossen. Abkürzungen: FMT fäkaler Mikrobiota-Transfer, Atb-Antibiotikum, PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Die Abbildung wurde teilweise mit Servier Medical Art erstellt, bereitgestellt von Servier, lizenziert unter einer Creative Commons Attribution 3.0 Unported-Lizenz.

Schein- und immunisierte Längsschnittproben wiesen keine Unterschiede in der Anzahl qualitativ hochwertiger gefilterter Lesevorgänge auf, mit einem Median von 52.092 bzw. 46.584 Lesevorgängen (ergänzende Abbildung 3a und Tabelle S4). Negative Extraktions- (n = 12) und No-Template-PCR-Kontrollen (n = 11) wiesen im Vergleich zu den Versuchsgruppen eine signifikant geringere Anzahl an Lesevorgängen auf (5966 bzw. 1444 mittlere Lesezahlen) (ergänzende Abbildung 3a). Obwohl die Sequenzierungstiefe in Charge 1 höher war (ergänzende Abbildung 3b), wurden nach der Beurteilung der Unterschiede zwischen den beiden Chargen (ergänzende Abbildung 4) keine wesentlichen Auswirkungen auf die Datenstruktur beobachtet (die Charge wurde als Kovariate in die Prüfung auf gepoolten Stuhl einbezogen). Proben aus Käfigen).

Vor der Impfung zeigten die Proben eine ähnliche Bakterienzusammensetzung (0 Woche, ergänzende Abbildung 2) und nur die Gattung A2 war in der Scheingruppe erhöht (ergänzende Abbildung 5a). Nach der Geschlechtertrennung zeigten weibliche Mäuse vor der Impfung eine höhere Häufigkeit von Lactobacillus und Muribaculum (ergänzende Abbildung 5b).

Auf Familienebene war die Gesamtzusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Schein- und Immunisierungsgruppen im Verlauf des Experiments ähnlich (Abb. 2a). In den Proben sowohl des Stuhl- als auch des Lumengehalts dominierten Muribaculaceae (49,8 % und 57,9 %), Lachnospiraceae (14,2 % und 11,4 %), Bacteroidaceae (9,4 % und 4,8 %) und Bifidobacteriaceae (7,1 % und 6,2 %) (Abb. 2a und). Ergänzende Abbildung 6a), mit Ausnahme des Dünndarms (Ergänzende Abbildung 6b). In diesem Darmabschnitt ging die Verringerung der Lachnospiraceae NK4A136-Gruppe (0,2 %) und der Bacteroides (0,05 %) mit einem Gesamtanstieg von Lactobacillus (7,7 %) und Ligilactobacillus (3,7 %) einher (ergänzende Abbildung 6c, d). Trotz allgemeiner Ähnlichkeiten in der Zusammensetzung während der Impfstoffverabreichung (0. Woche–15. Woche, Abb. 2a und ergänzende Abb. 6e) gruppierten sich die Proben getrennt nach Versuchsgruppe (p = 0,022), jedoch nicht nach Zeitpunkt innerhalb jeder Gruppe (p = 0,594) ( Abb. 2b), wie sowohl aus univariaten als auch aus multivariaten Analysen hervorgeht (Ergänzungstabelle 5). Käfig- und Geschlechtskovariaten zeigten ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Mikrobiota-Zusammensetzung (Ergänzungstabelle 5). Trotz des fehlenden Beitrags auf individueller Ebene in unseren Bewertungen wurde ein Trend zu einer höheren Bray-Curtis-Unähnlichkeit bei den Immunisierten im Vergleich zur Scheingruppe beobachtet (ergänzende Abbildung 6f), was möglicherweise auf einen starken Einfluss auf die Darmmikrobiota geimpfter Mäuse hinweist. Außerdem wurden während der Impfung keine Unterschiede in der Alpha-Diversität (Shannon-Index) zwischen den Gruppen beobachtet (ergänzende Abbildung 6g). Zum letzten Zeitpunkt der Studie wurde auch eine Häufung nach Versuchsgruppe (p = 0,021) und Darmabschnitt (p = 0,001) beobachtet, wobei es sich um Proben aus dem Dünndarm handelte, die von denen aus Blinddarm und Dickdarm getrennt waren (Abb. 2c). Darüber hinaus zeigten Proben aus dem Dünndarm sowohl in der Schein- als auch in der Immunisierungsgruppe eine geringere Alpha-Diversität im Vergleich zu Blinddarm- und Dickdarmproben, obwohl keine Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen festgestellt wurden (Abb. 2d).

Ein gestapeltes Balkendiagramm, das die relative Häufigkeit der Bakterienfamilien (die 15 am häufigsten vorkommenden) zu verschiedenen Zeitpunkten in HTI-geimpften (immunisierten) oder PBS-geimpften (Mock) Mäusen zeigt. Auf der X-Achse sind die Käfig-ID (gepoolter Kot) und die einzelnen Proben für jeden Käfig (Darminhalt) angegeben. PCoA-Biplot basierend auf der ersten und zweiten Komponente (Bray-Curtis-Abstände auf Gattungsebene) von (b) Stuhlproben aus Käfigen (c) und aus Darmabschnitten (Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm). Biplots melden Gattungen mit den fünf größten Auswirkungen auf die Zusammensetzung der Gemeinschaft, wobei die Vektorposition die Richtung des Effekts angibt. Um die Interpretation der Figur zu erleichtern, wurden willkürliche Ellipsen gezeichnet. PERMANOVA r-Quadrat- und p-Werte werden angezeigt. d Alpha-Diversität basierend auf dem Shannon-Entropieindex (ASV-Wert) einzelner Stuhlproben, die zum letzten Zeitpunkt der Studie aus Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm entnommen wurden. Boxplots werden von der Versuchsgruppe eingefärbt. Medianwerte und Interquartilbereiche werden in Boxplots dargestellt. Es werden p-Werte aus vorzeichenbehafteten Wilcoxon-Rangtests angegeben.

Die longitudinale Diskriminanzanalyse zeigte, dass sich die Häufigkeit spezifischer Bakterien nach der Impfung veränderte. Während zu Beginn nur die Gattung A2 zwischen den Versuchsgruppen unterschiedlich häufig vorkam (ergänzende Abbildung 5a), zeigte die immunisierte Gruppe nach der Impfung eine Anreicherung einer Reihe von Clostridiales-Gattungen (Abb. 3). Die bemerkenswerteste Beobachtung war eine Anreicherung von Ruminococcus in Stuhlproben aus Käfigen (Woche 3–15) und Roseburia in Darmabschnitten (Caecum und Dickdarm), während die Eubacterium xylanophilum-Gruppe in Stuhlproben aus Käfigen und Darmabschnitten nach Woche 3 konstant höher blieb Auch Ligilactobacillus war in Proben aus dem Dünndarm spezifisch erhöht (Abb. 3). Die Längsschnittbewertung dieser Gattungshäufigkeit zeigte einen zunehmenden Trend ab der Impfung in der immunisierten Gruppe (ergänzende Abbildung 7). Umgekehrt waren in der Mock-Gruppe im Laufe der Zeit keine bestimmten Gattungen durchweg höher.

LEfSe-Analyse zum Vergleich der relativen Häufigkeit von Bakteriengattungen zwischen immunisierten und Scheingruppen während der Impfstoffverabreichung (gepoolte Stuhlproben nach 3 Wochen, 9 Wochen, 6 Wochen und 15 Wochen) und am Ende der Studie in Woche 15 für einzelne Stuhlproben aus dem Dünndarm. Blinddarm und Dickdarm. Horizontale Balken stellen die Effektgröße für jede diskriminante Gattung dar (p < 0,05 und LDA-Scores > 2,0). Die Balkenlänge stellt den log10-transformierten LDA-Score dar, angezeigt durch vertikale Linien.

Um die HTI-Immunogenität zu untersuchen, wurde ein IFNγ-Assay durchgeführt, der das Ausmaß und die Breite der spezifischen T-Zell-Reaktion gegen HTI-Peptide an Splenozyten durchführte, die zum letzten Zeitpunkt der Studie gesammelt wurden. Es wurden keine Unterschiede in den Hintergrund-IFNγ-produzierenden Splenozyten zwischen Scheinmäusen und immunisierten Mäusen festgestellt, was darauf hindeutet, dass das Impfschema keine merkliche unspezifische T-Zell-Aktivierung induzierte (ergänzende Abbildung 8a). Nach spezifischer Restimulation mit Peptidpools, die die HTI-Sequenz abdecken, zeigte die Mock-Gruppe keine IFNγ-Reaktion oberhalb der Schwellenwerte. Im Gegensatz dazu zeigten immunisierte Mäuse starke Reaktionen, sowohl in der Größe (Median = 1560 IFN-γ SFC/Million Splenozyten, p = 0,00031, ergänzende Abbildung 8b) als auch in der Breite (Median = 8,0 von 17 positiven Pools, p = 0,00028, ergänzend). Abb. 8c) im Vergleich zu Mock.

Nach der Beurteilung der Serumspiegel von 22 Zytokinen in der Schein- und der immunisierten Gruppe (ergänzende Abbildung 9a) war IL-6 das einzige Zytokin, das in der immunisierten Gruppe nach der Geschlechtertrennung einen zunehmenden Trend zeigte (p = 0,052) (ergänzende Abbildung 9b). obwohl die Signifikanz die mehrfache Testkorrektur nicht bestanden hat (BH-bereinigter p = 0,69). Insbesondere zeigten Frauen aus der immunisierten Gruppe niedrigere IL-6-Spiegel als Männer sowohl in der immunisierten als auch in der Scheingruppe (ergänzende Abbildung 9b). Als nächstes untersuchten wir mögliche Zusammenhänge zwischen HTI-spezifischen Reaktionen, Serumzytokinspiegeln und diskriminierenden Bakteriengattungen. Eubacterium xylanophilum-Gruppe und Roseburia aus den drei Darmabschnitten korrelierten positiv mit der impfstoffinduzierten HTI-spezifischen T-Zell-Reaktion (Abb. 4), gemessen in Größe und Breite. Darüber hinaus zeigten die meisten der getesteten Zytokine positive Korrelationen mit der Eubacterium xylanophilum-Gruppe, Roseburia und Ruminococcus, obwohl es einige Ausnahmen gab (z. B. IL-33). Ein entgegengesetzter Trend wurde für Ligilactobacillus beobachtet, der insgesamt negative Assoziationen mit den Serumzytokinspiegeln aufwies (Abb. 4). Bemerkenswert ist, dass IL-6 positiv mit der Eubacterium xylanophilum-Gruppe, Ruminococcus und insbesondere Roseburia im Dickdarm assoziiert war. Darüber hinaus zeigte Roseburia positive Korrelationen mit anderen Zytokinen, einschließlich GM-CSF, IL-2, IFNγ, IL-17A und IL-25 (Dünndarm), IL-27 (Blinddarm und Dickdarm) und IL-22 (Dickdarm). . Signifikante Korrelationen wurden durch einzelne Streudiagramme bestätigt (ergänzende Abbildung 10). Darüber hinaus gruppierten sich die Gruppen Eubacterium xylanophilum, Roseburia und Ruminococcus aus den drei Darmkompartimenten in einer hierarchischen Gruppierung in der Nähe der HTI-spezifischen Reaktionen (Größe und Breite) und zeigten ebenfalls positive Assoziationen mit einer Gruppe von Zytokinen (ergänzende Abbildung 11).

Spearman ordnet Korrelationen zwischen Bakteriengattungen (es wurden nur in HTI-immunisierten Mäusen in Längsrichtung angereicherte Bakterien bewertet), der HTI-Immunogenität (Größe und Breite der Reaktion) und den Serumzytokinspiegeln ein. Die Zusammenhänge werden für jeden Darmabschnitt (Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm) bewertet. Die Zytokine für jeden Darmabschnitt werden auf der Grundlage einer unbeaufsichtigten hierarchischen Clusterbildung geordnet. Farbe und Größe des Quadrats stellen die Größe der Korrelation dar. Die Signifikanz wird durch weiße Sternchen angezeigt (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 nach Benjamini-Hochberg-Anpassung für mehrere Vergleiche).

Bisher wurde in begrenzten Studien untersucht, wie die Verabreichung von Impfstoffen die mikrobiellen Gemeinschaften im Darm verändern kann. Hier verwendeten wir ein Prime-Boost-Regime, bei dem das HTI-Insert in verschiedenen Impfstoffvektoren kombiniert wurde, um starke HTI-spezifische Reaktionen auszulösen und deren Auswirkungen auf die Mikrobiota zu untersuchen. Diese Ergebnisse zeigten bei Mäusen einen Anstieg der Clostridiales-Bakterien nach einer HIV-T-Zell-Immunisierung, die wiederum mit proinflammatorischen Zytokinen assoziiert sind. Mit Ausnahme der Eubacterium xylanophilum-Gruppe unterschieden sich die im Kot gefundenen Clostridiales-Gattungen von denen in den drei Darmabschnitten der immunisierten Gruppe. Solche Unterschiede könnten mit dem Vorhandensein unterschiedlicher Arten im Darmepithel im Vergleich zum Lumen24 und dem Vorhandensein von 50–60 % sporenbildenden Bakterien wie Ruminococcaceae und Lachnospiraceae zusammenhängen, die höchstwahrscheinlich im Kot vorkommen25. Bemerkenswerterweise variierten die Zusammenhänge zwischen angereicherten Bakterien und Serumzytokinen in den drei Darmabschnitten und waren repräsentativ für unterschiedliche Sauerstoffanforderungen und eine unterschiedliche Wechselwirkung zwischen Schleimhautzellen und koexistierenden mikrobiellen Gemeinschaften26. Der auffälligste Unterschied wurde im Dünndarm beobachtet, der im Vergleich zum Blinddarm und Dickdarm, wie bereits berichtet, an obligat anaeroben Bakterien wie Ruminococcacae und Lachnospiraceae dezimiert war27.

Zur Unterstützung unserer Ergebnisse zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie an Rhesusaffen, dass die Impfung mit drei HIV-1-Env-exprimierenden DNA-Plasmid-Impfstoffen, gefolgt von einem gp140-Protein-Booster, Veränderungen in der rektalen Mikrobiota hervorrief, was zu einem erhöhten Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis sowie Assoziationen rektaler Antiviren führte -HIV-1-IgG-Impfreaktionen mit erhöhtem Clostridium IV und reduziertem Prevotella17. Eine Anreicherung von Ruminococcus in der Darmmikrobiota von Ferkeln wurde auch nach der Immunisierung mit Lawsonia intrazelluläris-Impfstoff28 berichtet. Parallel dazu wurden nach der Verabreichung des Mtb-Impfstoffs (mit ESAT6-Adjuvans mit TLR8-Agonisten) an Mäuse eine erhöhte Häufigkeit von Bacteroides sowie Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur festgestellt29. Ebenso wurde bei Covid-19-Impflingen über eine Anreicherung von Bacteroides caccae und eine Verringerung von Clostridienarten wie Coprococcus cames, Dorea longicatena und Ruminococcus obeum berichtet18. Solche scheinbar widersprüchlichen Trends weisen darauf hin, dass ein gründlicheres Verständnis erforderlich ist, um spezifische mikrobielle Veränderungen zu entschlüsseln, die durch unterschiedliche Immunisierungsstrategien hervorgerufen werden.

Unsere Daten zeigten, dass nach der HTI-Impfung eine Zunahme der Bakterien (Eubacterium xylanophilum-Gruppe, Roseburia und Ruminococcus) in den drei verschiedenen Darmabschnitten zu verzeichnen war, die positiv mit der HTI-spezifischen T-Zell-Reaktion und einer Gruppe von Serumzytokinen korrelierten. Insbesondere die Gattung Roseburia, die als Butyrat produzierendes Bakterium30 im Blinddarm und Dickdarm bekannt ist, korrelierte positiv mit dem Ausmaß und der Breite der HTI-spezifischen T-Zell-Reaktion in Milzzellen. Auf Serumebene korrelierte Roseburia mit IL-27, das von Antigen-präsentierenden Zellen produziert wird und B- und T-Zellen reguliert31. Interessanterweise teilt IL-27 trotz seiner unterschiedlichen Effektorfunktion die gp130-Rezeptoruntereinheit mit IL-632 und sowohl Zytokine als auch IL-22 waren mit dem Gehalt an Roseburia im Dickdarm verbunden. Obwohl die Roseburia-Spiegel im Dünndarm nicht mit HTI-spezifischen T-Zell-Reaktionen korrelierten, wurden starke Korrelationen mit entzündlichen Zytokinen (IL-6, GM-CSF), zwei Th1-Polarisationszytokinen (IFNγ und IL-2) und Th17 beobachtet Polarisationszytokine (IL-17A und IL-22). Allerdings wurde keines dieser Zytokine in der Schein- und der Immunisierten Gruppe unterschiedlich produziert und nur IL-6 zeigte eine marginale Signifikanz, die die mehrfache Vergleichskorrektur nicht bestand. Wir gehen davon aus, dass die Häufigkeit von Roseburia aufgrund der Stimulierung des T-Zell-Impfstoffs zunehmen könnte und mit Th1-Reaktionen zusammenhängt, was durch eine positive Korrelation mit IFNγ und IL-2 im Plasma, aber am bemerkenswertesten mit den HTI-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Milzzellen angezeigt wird. Der Anstieg der Roseburie könnte auch mit dem Vorhandensein von Entzündungsmediatoren wie IL-633, das wahrscheinlich nach der Impfung produziert wird, und Th17-Zytokinen (IL-17A und IL-22) im Serum zusammenhängen, die die Immunantwort der Schleimhaut im Darm beeinflussen könnten. Zusätzliche butyratproduzierende Clostridiales-Gattungen34, die in geimpften Tieren angereichert wurden, zeigten positive Korrelationen mit den HTI-spezifischen T-Zell-Antworten (Eubacterium xylanophilum-Gruppe im Dünndarm und Blinddarm) und den Serumspiegeln von IL-6 (Ruminococcus und Eubacterium xylanophilum-Gruppe im Dickdarm). Auch wenn Ligilactibacillus nicht mit T-Zell-Reaktionen assoziiert war, könnten Korrelationen mit Zytokinen, die Vertreter der Th17- und Treg-Population (IL-10 und IL17A) sind und als Biomarker für Darmentzündungen bekannt sind35, auf spezifische Veränderungen in der Zusammensetzung der Mikrobiota hinweisen. Während der genaue Mechanismus, durch den die HTI-Immunisierung Veränderungen im Darmmilieu hervorrufen und eine Zunahme spezifischer Bakterien fördern würde, unklar bleibt, ist die Zytokinsignalisierung nach angeborener Immunität und T-Zell-Aktivierung durch Impfung eine plausible Hypothese. Tatsächlich kann die intramuskuläre Verabreichung des Impfstoffs einen lokalen „Depot“-Effekt hervorrufen. Dies besteht in einer verlängerten Antigenfreisetzung an der Injektionsstelle, die eine anhaltende Stimulation des Immunsystems und die Rekrutierung von Makrophagen induziert, die wiederum die Aktivierung von Entzündungsmediatoren auslösen36. Bemerkenswert ist, dass die Verabreichung von viralen Impfstoffvektoren, die reich an Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMP) sind, wie sie in dieser Studie verwendet werden, auch die Aktivierung von Pathogen Recognition Receptors (PRRs) auslösen kann, was die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie IL- stimuliert. 1 und TNF-α durch dendritische Zellen und Makrophagen37. Entzündungsmediatoren können dann durch den Blutkreislauf und die Lymphgefäße wandern, um das Darmgewebe zu erreichen und lokale Veränderungen in der Immunantwort zu fördern und wiederum die damit verbundene Mikrobiota-Struktur zu verändern38. Darüber hinaus können Immunzellen wie dendritische Zellen oder regulatorische T-Zellen, die an der Infektionsstelle aktiviert werden, Entzündungssignale an die Lymphknoten, einschließlich mesenterialer Lymphknoten oder der Peyer-Plaques, vermitteln39.

Insbesondere Bakterien, die in unserer Studie mit proinflammatorischen Zytokinen (wie IL-6, IL-27 und IFNγ) korrelieren (Roseburia, Ruminococcus und Eubacterium), sind als Hauptverursacher entzündungshemmender Metaboliten, hauptsächlich kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs), bekannt ), im Darm40. Dieser Befund scheint im Widerspruch zu früheren Erkenntnissen zu stehen, beispielsweise bei entzündlichen Darmerkrankungen, bei denen SCFAs die Produktion entzündungsfördernder Zytokine hemmen41; Allerdings wurden an anderer Stelle mehrere Mechanismen diskutiert, durch die sich Kommensalbakterien an die entzündete Darmumgebung anpassen können42. Beispielsweise sind bestimmte Bestandteile der Darmmikrobiota an der Produktion pleiotroper Zytokine durch angeborene Immunzellen wie IL-6 und der anschließenden Expansion von Th17-Zellen43 beteiligt, die für impfstoffinduzierte Gedächtnisimmunreaktionen von entscheidender Bedeutung sind44. Außerdem können Flagellin und Peptidoglykane, die von Darmbakterien wie Ruminococcus spp.45 produziert werden, von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) erkannt werden, die von T- und B-Zellen exprimiert werden, und als natürliche Adjuvantien für Impfstoffe fungieren7. Tatsächlich können größere Mengen an Bakterien mit Geißeln und Fimbrien, einschließlich butyratproduzierender Bakterien wie Roseburia und Eubacterium, die Immunogenität des Impfstoffs steigern und durch immunmodulatorische TLR-Agonisten als Adjuvantien dienen46.

Insbesondere Mitglieder dieser Bakteriengruppen, wie Roseburia intestinalis und Eubacterium hallii, wurden von der International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics47 als probiotische Kandidaten aufgeführt. Tatsächlich wurde gezeigt, dass einige Butyrat-produzierende Bakterien, einschließlich der in dieser Studie identifizierten, das luminale Metabolom des Dickdarms modulieren, T-Zell-Reaktionen regulieren und regulatorische T-Zell-Funktionen verbessern48. Insgesamt führten diese Daten zu der Hypothese, dass sich Bakterien, die entzündungshemmende Moleküle produzieren, an die nach der Impfung verstärkte lokale Entzündung anpassen, das Darmmilieu besiedeln und darin gedeihen und dadurch die Entzündungsprozesse modulieren und unterdrücken könnten. Allerdings bedarf es noch weiterer Forschung, um zu verstehen, wie eine impfstoffinduzierte Entzündung eine Zunahme entzündungshemmender Bakterien im Darm fördert. In diesem Zusammenhang sind das Th17/Treg-Zellgleichgewicht, T-Zell-Polarisations- und Aktivierungsprofile, ILC-Reaktionen und das Kyn/Trp-Verhältnis49 im Darmgewebe vielversprechende Kandidaten für zukünftige Validierungen. Darüber hinaus würden zusätzliche Omics-Ansätze, einschließlich Metaboliten- und gezielter SCFA-Messungen, dabei helfen, potenzielle entzündungshemmende Signalwege zu identifizieren, die nach der HTI-Impfung induziert werden. Wir sind uns der Begrenztheit der geringen Stichprobengröße und des fehlenden Beitrags auf individueller Ebene in dieser Studie voll und ganz bewusst. Das Fehlen einer longitudinalen Zytokinmessung ermöglichte es uns außerdem nicht, zeitliche Schwankungen der Immunkorrelate mit spezifischen bakteriellen Signaturen in jeder Phase des Impfschemas zu identifizieren. Obwohl eine Gruppe von Bakterien starke Korrelationen mit HTI-spezifischen T-Zell-Antworten aufwies, bestand eine weitere Einschränkung darin, dass das experimentelle Design keine Differenzierung zuließ, inwieweit impfstoffinduzierte Mikrobiota-Veränderungen auf eine Adjuvanswirkung der Vektoren oder auf insertspezifische Veränderungen zurückzuführen waren Antworten. Zukünftige Experimente, einschließlich eines Kontrollarms mit leeren Vektoren, werden dabei helfen, den direkten Beitrag des Impfstoffinserts zu Veränderungen der Darmmikrobiota zu unterscheiden. Darüber hinaus bestand eine weitere intrinsische Einschränkung darin, dass die 16 S-rRNA-Gensequenzierung nicht in der Lage war, lebende Organismen von der Besiedlung mit vorübergehenden Mikroorganismen zu unterscheiden50. Schließlich kann die Wirtsspezifität der Kernmikrobiota des Darms die mögliche Extrapolation dieser Ergebnisse aus einem Mausmodell auf den Menschen einschränken. Daher sind klinische Studien einschließlich der Charakterisierung der Mikrobiota erforderlich, um solche Ergebnisse in der menschlichen Darmmikrobiota zu validieren.

Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass sich Darmbakterien an durch Impfungen verursachte Entzündungen anpassen können. Darüber hinaus schaffen sie einen Rahmen für zukünftige Studien, um die Dynamik mikrobieller Veränderungen bei der T-Zell-Impfung vollständig zu erfassen und letztendlich neue potenzielle Ziele für die Optimierung der Impfstoffwirksamkeit bereitzustellen.

Sechs Wochen alte C57BL/6JOlaHsd-Mäuse (n = 40, 20 Weibchen und 20 Männchen), die in derselben Zuchtanlage gezüchtet wurden, wurden von Envigo gekauft und unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im Center for Comparative Medicine gehalten Bioimage (CMCiB) Tierhaltung am IGTP in Badalona, ​​Spanien. Mäuse wurden zufällig nach einer Kombination aus Geschlecht (weiblich/männlich) und Behandlungsgruppe (Schein/immunisiert) in Käfige eingeteilt, mit maximal 5 Tieren pro Käfig (ergänzende Abbildung 1) und konnten sich vor dem ersten Mal eine Woche lang akklimatisieren Behandlung.

Um mögliche Ausgangsunterschiede in der Mikrobiota-Zusammensetzung zu verringern, wurde die Darmmikrobiota der Mäuse durch Antibiotika-Konditionierung und anschließende Maus-zu-Maus-FMT homogenisiert (1 Woche nach der Ankunft und 2 Wochen vor der Impfung). Die Antibiotikabehandlung bestand aus einer Kombination von Ampicillin, Amikacin, Metronidazol und Vancomycin (10 mg/ml jedes Antibiotikum), die 5 Tage vor der FMT über eine orale Sonde (200 µl/Tier) verabreicht wurde. Bei allen Tieren der Studie wurden gemischte Stühle von fünf männlichen und fünf weiblichen Spendermäusen (Käfige MF1 und MM1, ergänzende Abbildung 1) für die FMT verwendet. Kurz gesagt, der Kot von Spendern wurde gesammelt, gepoolt, aliquotiert (350-mg-Fläschchen) und bis zur Verwendung bei –80 °C aufbewahrt. Am Tag des Stuhltransfers wurden aufgetaute Fäkalien in sterilem physiologischem Kochsalzserum (2,3 ml pro Fläschchen) resuspendiert, homogenisiert, zentrifugiert (500 × g, 1 Minute) und der Überstand per oraler Sondenernährung verabreicht (100 µl/Tier). Die Bakterienbelastung bei FMT wurde mit dem LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability and Counting Kit (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) gemessen.

Die Tiere wurden mit dem HIV-T-Zell-Immunogen (HTI) geimpft, einem synthetischen Protein, das als Fusion verschiedener HIV-1-Proteinfragmente konzipiert ist und mit der T-Zell-Kontrolle der HIV-Infektion in Zusammenhang steht20. Kurz gesagt, die HTI-Sequenz kodiert für ein 529 Aminosäuren langes Immunogen, das als Verkettung von 16 konsensualen HIV-Gag-, Pol-, Vif- und Nef-Proteinfragmenten der Gruppe B konzipiert ist, die bevorzugt von Menschen angegriffen wurden, die eine natürliche Kontrolle der HIV-Infektion zeigten, verbunden durch Alanin-Tripletts . Die Aminosäuresequenz wurde in Nukleotide zurückübersetzt, die Codon-Verwendung für die Expression im Menschen optimiert und der resultierende offene Leserahmen (ORF) synthetisiert, um in verschiedene Vektoren eingefügt zu werden22. Konkret wurde es in eine Plasmid-DNA unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (DNA.HTI, D) und in zwei virale Vektoren eingefügt: Chimpanzee Adenovirus Ox1 (ChAdOx1.HTI, C) und Modified Vaccinia Ankara (MVA.HTI, M). 22. Die Immunogenität des HTI-Impfstoffs wurde bereits im C57BL/6-Mausmodell und bei nichtmenschlichen Primaten22 sowie beim Menschen23 getestet. In dieser Studie wurden zwanzig Mäuse (10 Weibchen und 10 Männchen) intramuskulär (kaudaler Oberschenkelmuskel) mit einem heterologen Prime-Boost-Regime immunisiert, das aus drei verschiedenen Impfstoffvektoren bestand, die HTI exprimierten: (i) drei DNA.HTI-Primes (100 μg/Tier). ), (ii) ein Boost mit ChAd.HTI (1 × 109 VP/Tier) und (iii) ein zweiter Boost mit MVA.HTI (1 × 106 pfu/Tier). DNA.HTI-Impfungen wurden in den Wochen 0, 3 und 6 verabreicht, gefolgt von ChAd.HTI und MVA.HTI, getrennt durch ein 6-wöchiges Intervall (Woche 9 bzw. 15) (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). . Mäuse in der Scheingruppe (n = 20, 10 Weibchen und 10 Männchen) wurden als Kontrollgruppe nach dem gleichen Impfplan mit PBS geimpft.

Mikrobiota-Daten wurden in zwei Chargen generiert (Proben wurden 2019 und 2020 entnommen und sequenziert), wie in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 1 und 2. Die erste Sequenzierungscharge umfasste gepoolte Fäkalienproben, die in Längsrichtung aus Käfigen entnommen wurden, während die zweite Charge Längsfäkalienpools aus Käfigen und einzelne Fäkalienproben umfasste, die zum letzten Zeitpunkt der Studie aus verschiedenen Abschnitten des Darmtrakts entnommen wurden. Bei der Ankunft des Tieres (Woche 3), nach der antibiotischen Konditionierung vor der FMT (Woche 2) und vor jeder Impfung (Woche 0, 3, 6, 9 und 15) wurden längsgerichtete Kotproben entnommen (ein Pool pro Käfig, n = 5). ). Es wurde auch eine Stuhlprobe aus dem Spenderpool (Woche 1) gesammelt und in Charge 1 sequenziert. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung (Woche 18) wurden die Mäuse eingeschläfert und der Lumeninhalt aus drei Darmabschnitten (Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm) mit Vollblut ausgeblutet und Milz wurden entnommen. Das Serum wurde durch Zentrifugation (10.000 × g, 5 min) in Serumgel-S/1.1-Röhrchen (Sarstedt) vom Vollblut getrennt und bis zur Verwendung bei –80 °C eingefroren. Splenozyten wurden durch mechanisches Aufbrechen isoliert und mit einem 5-ml-Spritzengummikolben durch ein Zellsieb (Falcon) gedrückt. Nach der Lyse der roten Blutkörperchen wurden die Splenozyten gewaschen, in R10 (RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin) resuspendiert und bis zur Verwendung in flüssigem N2 kryokonserviert.

Genomische DNA aus Stuhlproben und Darminhalt wurde mit dem QIAamp DNA Stool Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und bis zur Sequenzierung bei –80 °C gelagert. Die Amplifikation der hypervariablen Region V3–V4 des 16 S-rRNA-Gens wurde unter Verwendung von Universalprimern durchgeführt, die von standardmäßigen Vorwärts- und Rückwärtsadaptern flankiert wurden (16S_F 5′-TCG TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG- 3′; 16S_R 5′-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3′), beschrieben im Illumina MiSeq rRNA Amplicon Sequencing Protocol (San Diego, CA, USA). Die PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 25 μl durchgeführt, das 2,5 μl DNA-Matrize, 12,5 μl KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase, Puffer, MgCl2 und dNTPs, KAPA Biosystems Inc., Wilmington, MA, USA) enthielt 5 μL jedes Primers bei 1 μM. Die Thermocycling-Bedingungen waren wie folgt: anfänglicher Denaturierungsschritt bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Tempern bei 55 °C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden und a Letzter Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten. Sobald die erwartete Amplikongröße durch eine 1,0 %ige Agarosegelelektrophorese (~460 Basenpaare) bestätigt wurde, wurden die PCR-Produkte bis zur Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek bei –30 °C gelagert. Negative Extraktions- und PCR-Kontrollen (Leerkontrollen mit DNA-freiem Wasser als Vorlage) wurden geladen, um mögliche Kontaminationen festzustellen, und unter den gleichen Bedingungen wie jede andere Probe verarbeitet. Amplifizierte DNA-Vorlagen wurden mit AMPure XP-Reagenz (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, USA) auf Nicht-DNA-Moleküle gereinigt und Illumina-Sequenzierungsadapter und Doppelindizes wurden unter Verwendung des Nextera XT Index Kit (Illumina Inc.) angebracht, gefolgt von einem entsprechenden PCR-Amplifikationsprogramm wie im MiSeq 16 S rRNA Amplicon Sequencing Protocol (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) beschrieben. Nach der zweiten Bereinigungsrunde wurden die Amplikonbibliotheken mit einem Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) quantifiziert und zur weiteren Zusammenfassung in äquimolaren Konzentrationen (4 nM) verdünnt. Gepoolte Bibliotheken wurden auf einer Illumina MiSeqTM-Plattform (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) in der Genomik-Kerneinrichtung auf dem deutschen Forschungscampus Trias i Pujol (Badalona, ​​Spanien) unter Verwendung eines Paired-End-Protokolls mit einer Länge von 300 Basen sequenziert.

Die Qualität der Rohsequenzierungsdaten wurde mithilfe von FastQC51 geschätzt und die Analyse von 16 S-rRNA-Sequenzen wurde mithilfe der DADA2-Pipeline (v1.10.1)52 durchgeführt. Die Pipeline wurde gemäß den Standardparametern mit maxEE = 4.10 im Filterschritt ausgeführt. Nach der Entfernung chimärer Lesevorgänge wurde den eindeutigen Amplikonsequenzvarianten (ASV) eine Taxonomie zugewiesen und mit der SILVA-rRNA-Gendatenbank abgeglichen53. Downstream-Analysen wurden in der R-Umgebung (v3.5.2)54 unter Verwendung mehrerer Pakete durchgeführt, darunter Phyloseq (v1.26.1)55, vegan (v2.5-5)56 ade4 (v1.7-13)57 und ggplot2 (v3). 2,0)58. Die ASV-Zahlen wurden normalisiert und mithilfe der Phyloseq-Funktion transform_sample_counts (100 × (x/sum(x))) in die relative Häufigkeit umgewandelt. Die Alpha-Diversität (Shannon-Entropieindex) wurde mithilfe der Schätzung_Richness für verdünnte ASV-Zählungen bewertet. Die Beta-Diversität wurde auf der Grundlage der Bray-Curtis-Abstände (normalisierte Daten) und der Distanzmatrix berechnet, die zur Durchführung einer Ordinations-Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) verwendet wurde.

ELISPOT-Assays wurden unter Verwendung des Maus-IFNγ-ELISPOT-Kits (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Kurz gesagt, die Splenozyten wurden aufgetaut, gewaschen, gezählt (NucleoCounter® NC-3000, Chemometec), die Zelldichte mit R10 auf 4 × 105 Zellen/Well eingestellt und zuvor in Polyvinylidenplatten mit 96 Wells (Millipore Corp., Bedford, MA) ausplattiert beschichtet mit IFNγ-Fängerantikörper (Klon AN-18). Die Zellen wurden mit 17 HTI-spezifischen Peptidpools (14 μg/ml Endkonzentration für jedes Peptid) 16 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 stimuliert. Ein Satz von 147 überlappenden Peptiden (OLP) mit einer Länge von 15 Aminosäuren, die sich um 11 Aminosäuren überlappen und die gesamte HTI-Sequenz abdecken, wurde unter Verwendung des PeptGen-Algorithmus (Los Alamos HIV-Datenbank) entworfen und synthetisiert (Synepeptide). Um die Reaktionen auf HTI zu beurteilen, wurden OLP in 17 getrennte Peptidpools zusammengestellt, bestehend aus 7 Pools für Gag (8–11 Peptide/Pool), 7 für Pol (11 oder 5 Peptide/Pool), 2 für Vif (8 und 6 Peptide/Pool). Pool) und 1 für Nef (2 Peptide/Pool). Als Positivkontrolle wurde Concanavalin A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO) in einer Konzentration von 5 µg/ml und als Negativkontrolle R10 in dreifacher Ausfertigung verwendet. Nach der Stimulation wurden fleckbildende Zellen (SFC) durch Zugabe eines biotinylierten IFNγ-Nachweisantikörpers (Klon R4-6A2), mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertem Streptavidin und einem AP Conjugate Substrate Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA). SFC pro Vertiefung wurden unter Verwendung eines automatisierten ELISPOT-Lesesystems (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH) zusammen mit der ImmunoSpot-Software gezählt und die Stärke der Reaktionen als SFC pro 106 Splenozyten ausgedrückt. Der Schwellenwert für positive Reaktionen wurde als Reaktionen definiert, die mindestens 50 SFC/106 Milzzellen, den mittleren SFC/106 Milzzellen in den Vertiefungen der Negativkontrolle plus 3 Standardabweichungen der Vertiefungen der Negativkontrolle oder das Dreifache des Mittelwerts der Vertiefungen der Negativkontrolle betrugen. je nachdem, was höher war. Die Ergebnisse wurden als Gesamtgröße (kumulierte Reaktion auf alle Pools; SFC/106 PBMCs) und Breite (Anzahl positiver Pools) angegeben.

Konzentrationen von CD40-Ligand (CD154), GM-CSF, IFN γ, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, IL-33, TNFα, TNFß am Ende der Studie ( Woche 21 wpi) wurden gleichzeitig in Mäuseseren in einer einzigen Charge gemessen. Kurz gesagt, Serumproben wurden aufgetaut, vortexiert und 10 Minuten lang bei 10.000 xg zentrifugiert, bevor 25 µl Serum für weitere Tests gesammelt wurden. Die Serumkonzentration der 22 Zytokine wurde gleichzeitig unter Verwendung von Probenduplikaten in einem maßgeschneiderten Maus-Th17-Magnetbead-Panel-Kit (Milliplex) und einem Luminex® 200 (Luminex Corp)-Lesegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Unterschiede in der Alpha-Diversität und der Taxa-Häufigkeit zwischen Versuchsgruppen wurden mithilfe des Wilcoxon-Signed-Rank- und Kruskal-Wallis-Tests (zweiseitig) bewertet. Für die Beta-Diversität wurde die statistische Signifikanz mithilfe des Tests der paarweisen permutationellen multivariaten Varianzanalyse (PERMANOVA, Adonis) bewertet. Die lineare Diskriminanzanalyse-Effektgröße (LEfSe)59 wurde durchgeführt, um diskriminante Bakteriensignaturen zwischen Schein- und immunisierten Gruppen zu identifizieren (α = 0,05 und LDA-Score > 2,0). Zusammenhänge zwischen Zytokinen, Immunantwort und Bakterien wurden auf der Grundlage von Spearman-Korrelationskoeffizienten in Kombination mit der Benjamini-Hochberg-Mehrfachtestkorrektur unter Verwendung der rcorr-Funktion im R/hmisc-Paket berechnet. Statistische Analysen wurden in der R-Umgebung durchgeführt und ein zweiseitiges Signifikanzniveau von 5 % (p-Wert ≤ 0,05) wurde als signifikant angesehen, sofern nicht anders angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie verwendeten rohen 16 S rRNA-Sequenzierungs-Reads wurden im Sequence Read Archive (SRA)-Repository (Bioprojekt-Nr. PRJEB52963) hinterlegt.

R-Analyseskripte und Daten zu diesem Artikel sind unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7017193 verfügbar.

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Das Projekt erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 847943 (MISTRAL) und wurde teilweise von Grifols gesponsert.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Alessandra Borgognone, Aleix Elizalde-Torrent.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Alex Olvera, Roger Paredes.

IrsiCaixa AIDS-Forschungsinstitut, Badalona, ​​​​Spanien

Alessandra Borgognone, Aleix Elizalde-Torrent, Maria Casadellà, Luis Romero, Tuixent Escribà, Mariona Parera, Francesc Català-Moll, Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera und Roger Paredes

Autonome Universität Barcelona (UAB), Barcelona, ​​​​Katalonien, Spanien

Luis Romero und Roger Paredes

Universität Vic-Central University of Catalonia (UVic-UCC), Vic, Spanien

Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera und Roger Paredes

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Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera und Roger Paredes

Katalanisches Institut für Forschung und fortgeschrittene Studien (ICREA), Barcelona, ​​​​Spanien

Christian Brenner

AELIX Therapeutics, Barcelona, ​​Spanien

Christian Brenner

Zentrum für globale Gesundheit und Krankheiten, Abteilung für Pathologie, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, USA

Roger Paredes

Stiftung zur Bekämpfung von Infektionen, Universitätsklinikum Germans Trias i Pujol, Badalona, ​​​​Katalonien, Spanien

Roger Paredes

Abteilung für Infektionskrankheiten, Universitätsklinikum Germans Trias i Pujol, Badalona, ​​Katalonien, Spanien

Roger Paredes

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MN-J., CB, AO und RP haben die Studie entworfen und die Forschung überwacht. AB analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. AE-T. trug zur Dateninterpretation und Redaktion des Manuskripts bei. AE-T., MC und AO richteten die Tierversuche ein und sammelten Proben. AE-T., MC und MP führten die fäkale DNA-Extraktion, die Bibliotheksvorbereitung und die Sequenzierung durch. LR, TE und AO führten Zytokinprofile und Bestimmungen der Immunantwort durch. FC-M., MN-J. und AB trug zur Datenverarbeitung, -verwaltung und -speicherung bei. AB und AE-T. sind Co-Erstautoren des Manuskripts. AO und RP sind korrespondierende Autoren des Manuskripts. Alle Autoren haben die Entwürfe kritisch redigiert, das Manuskript überarbeitet und die endgültige Fassung in der eingereichten Fassung genehmigt.

Korrespondenz mit Alex Olvera oder Roger Paredes.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Deutschen Krankenhauses Trias i Pujol (IGTP) und der Generalitat de Catalunya genehmigt (Projektnummer: 10559).

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Borgognone, A., Elizalde-Torrent, A., Casadellà, M. et al. Die Impfung mit einem HIV-T-Zell-Immunogen führt zu Veränderungen in der Darmmikrobiota der Maus. npj Biofilms Microbiomes 8, 104 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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Eingegangen: 25. August 2022

Angenommen: 12. Dezember 2022

Veröffentlicht: 30. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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npj-Impfstoffe (2023)