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May 04, 2023

Die Darmmikrobiota trägt zur Pathogenese von Anorexia nervosa bei Menschen und Mäusen bei

Nature Microbiology Band 8,

Nature Microbiology Band 8, Seiten 787–802 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Anorexia nervosa (AN) ist eine Essstörung mit hoher Sterblichkeit. Ungefähr 95 % der Fälle sind Frauen und die Bevölkerungsprävalenz liegt bei etwa 1 %, es fehlt jedoch eine evidenzbasierte Behandlung. Die Pathogenese von AN hängt wahrscheinlich mit der Genetik und verschiedenen Umweltfaktoren zusammen, und bei Personen mit AN wurde mithilfe von Amplikonsequenzierung und relativ kleinen Kohorten eine veränderte Darmmikrobiota beobachtet. Hier untersuchten wir, ob eine gestörte Darmmikrobiota zur AN-Pathogenese beiträgt. Shotgun-Metagenomik und Metabolomik wurden an Stuhl- bzw. Serumproben einer Kohorte von 77 Frauen mit AN und 70 gesunden Frauen durchgeführt. Mehrere bakterielle Taxa (z. B. Clostridium-Arten) wurden in AN verändert und korrelierten mit Schätzungen des Essverhaltens und der psychischen Gesundheit. Auch das Darmvirom war bei AN verändert, einschließlich einer Verringerung der Virus-Bakterien-Wechselwirkungen. Bakterielle Funktionsmodule, die mit dem Abbau von Neurotransmittern verbunden sind, wurden mit AN angereichert und verschiedene Strukturvarianten in Bakterien wurden mit Stoffwechselmerkmalen von AN verknüpft. Die Serummetabolomik ergab einen Anstieg der Metaboliten, die mit einer verringerten Nahrungsaufnahme einhergingen (z. B. Indol-3-propionsäure). Kausale Inferenzanalysen deuteten darauf hin, dass bakterielle Metaboliten im Serum möglicherweise den Einfluss einer veränderten Darmmikrobiota auf das AN-Verhalten vermitteln. Darüber hinaus führten wir eine fäkale Mikrobiota-Transplantation von AN-Fällen auf keimfreie Mäuse unter energiebeschränkter Fütterung durch, um das AN-Essverhalten widerzuspiegeln. Wir fanden heraus, dass die verringerte Gewichtszunahme und die induzierte Genexpression im Hypothalamus und im Fettgewebe mit einem abweichenden Energiestoffwechsel und Essverhalten zusammenhängen. Unsere „Omics“- und mechanistischen Studien deuten darauf hin, dass ein störendes Darmmikrobiom zur AN-Pathogenese beitragen kann.

Anorexia nervosa (AN) ist eine schwerwiegende psychische Erkrankung und Essstörung, die durch ein verzerrtes Körperbild, zwanghafte Gedanken über Essen, rituelle Verhaltensmuster einschließlich reduzierter Nahrungsaufnahme, Gewichtsverlust, erhöhter körperlicher Aktivität und emotionaler Starrheit gekennzeichnet ist1. AN betrifft in etwa 95 % der Fälle vor allem Frauen und hat eine Bevölkerungsprävalenz von etwa 1 %2. Es kann in zwei Subtypen eingeteilt werden, den häufig einschränkenden Typ (AN-RS) und den weniger verbreiteten Essattacken- oder Purging-Typ (AN-BP)1. Die Evidenzbasis für die Behandlung fehlt3 und obwohl eine spezialisierte multidisziplinäre Behandlung die Mortalität senken kann4, erreicht weniger als die Hälfte der AN-Fälle eine vollständige Remission5. Die Gesamtsterblichkeitsrate wird auf 5,6 % pro Jahrzehnt geschätzt und ist damit viel höher als in der Allgemeinbevölkerung6.

Trotz Forschungen zur Bestimmung der Ätiologie von AN bleibt es ein Syndrom, das heißt eine Ansammlung von Symptomen ohne klar definierte einheitliche Ursache. Zwillingsstudien haben Erblichkeitsschätzungen von 50–60 % ergeben7 und genomweite Assoziationsstudien haben acht genomische Loci identifiziert, die Korrelationen mit psychiatrischen Störungen, körperlicher Aktivität sowie metabolischen und anthropometrischen Merkmalen zeigen. Dies ist unabhängig von häufigen Varianten im Zusammenhang mit dem Body-Mass-Index8,9. Auf pathophysiologischer Ebene ist AN durch multiple endokrine Veränderungen10 und gestörte Signalübertragung von Neurotransmittern in verschiedenen Teilen des Gehirns11 gekennzeichnet.

Der menschliche Verdauungstrakt enthält komplexe Ansammlungen von Mikroorganismen, die über Metaboliten und andere Wege den Stoffwechsel, die Immunität und die Neurobiologie des Wirts beeinflussen können12. Dazu kann die Darm-Mikrobiota-Hirn-Achse gehören, die Gehirnfunktionen beeinflussen kann, einschließlich der Regulierung von Appetit, Verhalten und Emotionen13. Beispielsweise ist der bakterielle Metabolit caseinolytische Peptidase B (ClpB), der überwiegend von Enterobakterien produziert wird, ein Antigen-Nachahmer des α-Melanozyten-stimulierenden Hormons, das magersüchtige Wirkungen haben kann14,15.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine abweichende Darmmikrobiota an der Pathogenese von AN beteiligt sein könnte. Mehrere kleine Studien, die Amplikonsequenzierung zur Charakterisierung der Darmmikrobiota auf Gattungsebene in AN verwendeten, wurden veröffentlicht16,17,18,19 und zeigten eine Dysbiose der Darmbakterienmikrobiota (siehe Ergänzende Anmerkung 1). Darüber hinaus wurde in einem Mausmodell für Anorexie gezeigt, dass Veränderungen in der Darmmikrobiota mit Veränderungen im Essverhalten und der Expression hypothalamischer Neuropeptide verbunden sind20.

Hier untersuchten wir die Hypothese, dass eine gestörte Darmflora und ein gestörtes Serummetabolom zur komplexen Pathogenese von AN beitragen. Zu diesem Zweck führten wir eine Schrotflinten-Metagenomik an Stuhlproben von 77 weiblichen AN-Fällen und 70 gleichaltrigen weiblichen Kontrollpersonen durch, was eine eingehende Analyse der bakteriellen und archaealen Darmmikrobiota auf taxonomischer, funktioneller und genetischer Ebene sowie Analysen der Darmflora ermöglichte virale Darmmikrobiota. Wir haben auch das Serummetabolom charakterisiert, das mit den Darmmetagenomdaten in Bezug auf einzelne Marker des Ess- und psychologischen Verhaltens analysiert wurde. Kausalmechanismen wurden in silico mithilfe bidirektionaler Mediationsanalysen und in vivo durch fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) von Darmmikrobiota aus AN-Fällen auf weibliche keimfreie Wurfgeschwister untersucht. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass eine gestörte AN-Darmmikrobiota und die damit verbundenen bakteriellen Metaboliten zur AN-Pathogenese beitragen (Extended Data Abb. 1).

Zusammengefasste Statistiken zu den klinischen Merkmalen der 77 eingeschriebenen Frauen mit AN und 70 Kontrollfrauen gleichen Alters, bei denen ein gesundes Gewicht (HC) gilt, sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Es wurde der validierte Eating Disorder Inventory-3 (EDI-3)-Fragebogen verwendet um das Ausmaß des spezifischen Essverhaltens abzuschätzen21 und eine detaillierte Beschreibung der EDI-3-Subskala finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 2. Wie erwartet waren Frauen mit AN viel schlanker, hatten niedrigere Nüchtern-Serumkonzentrationen von Glukose und Insulin und eine höhere Insulinsensitivität, wie von geschätzt Homöostatische Modellbewertung für Insulinresistenz (HOMA-IR) und niedrigeres C-reaktives Protein im Serum. Detaillierte Ausgangsmerkmale der Studienteilnehmer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Darüber hinaus waren bei AN-Fällen Fälle vom Typ AN-RS durch höhere Seruminsulinwerte und eine geringere Insulinsensitivität gekennzeichnet als AN-BP-Personen (Ergänzungstabelle 1). Beim Vergleich der Stuhlproben von AN und HC gab es keinen signifikanten Unterschied in der Bakterienzellzahl zwischen AN und HC oder innerhalb der Subtypen von AN (PWilcoxon > 0,05, Ergänzungstabelle 1).

Auf der Phylum-Ebene waren AN-Mikrobiota-Proben durch eine Verringerung von Bacteroidota und Actinobacteriota gekennzeichnet (Erweiterte Daten, Abb. 2a). Auf Familienebene dominierten Bacteroidaceae in beiden Gruppen (Extended Data Abb. 2b). Unter den 20 am häufigsten vorkommenden Familien war die Häufigkeit von Christensenellales CAG-138 in AN als neue Beobachtung für diese Kohorte höher, wohingegen die Häufigkeit von Ruminococcaceae und Lachnospiraceae in HC höher war. Unter den 89 identifizierten Bakterienfamilien war Christensenellaceae am stärksten an AN angereichert (Extended Data Abb. 2c). Wir beobachteten eine höhere β-Diversität des AN-Mikrobioms auf Gattungsebene (Extended Data, Abb. 2d), wobei Bacteroides in beiden Gruppen der dominierende Phylotyp war (Extended Data, Abb. 2e). Unter den Top-30-Gattungen waren Faecalibacterium, Agathobacter, Gemmiger, nicht klassifiziertes Lachnospiraceae G, Ruminococcus 2, Roseburia, Dysosmobacter – Oscillibacter, Coprococcus, Oscillospirales 4 CAG-103 und Eisenbergiella in HC häufiger anzutreffen, während nicht klassifiziertes Christensenellales CAG-138 in häufiger vorkam AN (Erweiterte Daten Abb. 2e). Darüber hinaus war Lactobacillus unter den 225 identifizierten Bakteriengattungen am stärksten an AN angereichert (Extended Data Abb. 2f). Trotz des Unterschieds in den Hauptgattungen zwischen AN und HC stellten wir fest, dass der Reichtum an Pangenomen metagenomischer Arten (MSP, im Folgenden als Arten bezeichnet) zwischen den beiden Gruppen ähnlich war (Extended Data, Abb. 2g). In Enterotypanalysen22 fanden wir eine höhere Prävalenz des Ruminococcacea-Enterotyps (R-Enterotyp) bei AN im Vergleich zu HC und eine höhere Prävalenz desselben Enterotyps bei AN-BP als beim AN-RS-Subtyp (Extended Data Abb. 2h). .

Auf Artenebene (Ergänzungstabelle 3) beobachteten wir, dass die AN-Darmmikrobiota durch eine höhere β-Diversität gekennzeichnet ist (Abb. 1a). Innerhalb der AN-Untergruppen wies der AN-BP-Subtyp auf Artenebene eine heterogenere Bakteriengemeinschaft auf als der AN-RS-Subtyp (Abb. 1b). Im Vergleich zwischen stationären und ambulanten AN-Fällen stellten wir fest, dass die β-Diversität der stationären Patienten auf Artenebene höher war als die der ambulanten Patienten (ergänzende Abbildung 1 und Daten). Die jüngste Änderung des Körpergewichts innerhalb von 4 Wochen war nicht mit der Zusammensetzung der Darmbakterien verbunden (Ergänzungstabelle 4). Die Arten, deren Häufigkeitsverteilung zwischen AN und HC nach der Entschlüsselung der Interferenzen mehrerer Medikamente (selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer, Antipsychotika und Benzodiazepine, siehe Ergänzungstabelle 2) signifikant unterschiedlich war, sind in Abb. 1c dargestellt. Zu den dezimierten Arten in AN gehörten Roseburia intestinalis und Roseburia inulinivorans, Arten, die über eine hohe Fähigkeit zur Verdauung pflanzlicher Polysaccharide verfügen und als Teil der gesundheitsrelevanten Darmmikrobiota gelten23. In einer ungerichteten Netzwerkanalyse mit Koabundanz (Extended Data Abb. 3) identifizierten wir eine Bakteriengemeinschaft bestehend aus Eisenbergiella, dem Butyrat produzierenden Bakterium SS3/4 – (Clostridium) sp. CAG:81, Faecalibacterium prausnitzii 3, (Oscillibacter) sp. ER4/Firmicutes-Bakterium CAG: 129_59_24, Oscillibacter sp. 57_20, (Clostridium) sp. 2789STDY5834924, nicht klassifizierte Lachnospiraceae und nicht klassifizierte Dysosmobacter – Oscillibacter, die in HC häufiger vorkamen. Eine Gemeinschaft, die stark an AN angereichert war, bestand aus Erysipelatoclostridium ramosum, Enterocloster Bolteae, (Clostridium) innocuum und Blautia sp. CAG:257.

a,b Boxplot (Linie, Median; Box, Interquartilbereich (IQR); Whiskers, 1,5× IQR) der β-Diversität von AN (n = 77) und HC (n = 70) Darmmikrobiota (a) und von zwei AN-Subtypen (AN-RS n = 56, AN-BP n = 21) und HC-Darmmikrobiota (b) auf Bakterienartenebene (Canberra-Abstand). Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurde durch den Wilcoxon-Rangsummentest (zweiseitig) bestimmt. c: Deutlich unterschiedliche Bakterienarten zwischen AN und HC. Unterschiede in der Häufigkeit wurden mithilfe der MetadeconfoundR-Pipeline festgestellt, bei der Kovariaten wie Alter, BMI, Rauchen und mehrfache Medikamenteneinnahme korrigiert wurden. Cliffs Delta-Werte geben Schätzungen der Effektgröße. Für jedes kontrastierte MSP wird neben der MSP-Anmerkung die Prävalenz in der gesamten Kohorte, HC, AN und Padj angegeben. d, Wärmekarte, die zeigt, dass Darmbakterienarten mit Essstörungswerten in AN-Fällen verknüpft sind, unter Verwendung eines linearen Regressionsmodells, bei dem Alter, BMI, Rauchen und mehrfacher Drogenkonsum als Kovariaten definiert und angepasst wurden. Variablen in der spezifischen Essstörungsskala sind blau markiert und die allgemeine psychologische Skala ist rot markiert. Der rechte Bereich der Wärmekarte zeigt die Richtung jeder Variablen an. Für jedes MSP wird neben der MSP-Anmerkung die Prävalenz in AN angegeben. +, Padj < 0,05 nach der Benjamini-Hochberg-Methode (genaue P-Werte siehe).

Quelldaten

Wir untersuchten numerische Kovariationen zwischen der absoluten Häufigkeit von Bakterien auf Gattungs- und Artenebene und bioklinischen Variablen in der kombinierten HC- und AN-Kohorte. Wir haben ein lineares Regressionsmodell verwendet, das Störfaktoren wie Alter, Rauchen und Mehrfacheinnahme von Medikamenten bereinigt (Methoden und Ergänzende Anmerkung 3, Abb. 2 und Daten).

Interessanterweise wurden einige Bakteriengruppen mit Essstörungswerten und psychischen Zuständen in Verbindung gebracht, nachdem mehrere Störfaktoren berücksichtigt wurden, darunter Alter, Body-Mass-Index (BMI), Rauchergeschichte und Medikamente. Auf Artenebene stellten wir fest, dass Clostridium-Arten positiv mit den Essstörungswerten korrelierten (Abb. 1d), was auf eine mögliche Rolle dieser Arten bei der Regulierung des Essverhaltens und neuropsychiatrischer Symptome hinweist24. Darüber hinaus fanden wir unter den Bakterienarten, die umgekehrt mit den Essstörungswerten korrelierten, dass die absolute Häufigkeit von Lactococcus acidophilus25 und Faecalibacterium prausnitzii26, die beide mit depressiven Symptomen assoziiert sind, mit einem Wert für zwischenmenschliche Entfremdung zusammenhängt (Abb. 1d). . Darüber hinaus korrelierte die absolute Häufigkeit von Parasutterella positiv mit der Unzufriedenheit mit dem Körper und die absolute Häufigkeit von Bifidobacterium mit einem Marker für Perfektionismus. Trotz einer ähnlichen absoluten Häufigkeit von Brachyspira in AN und HC korrelierte diese Gattung positiv mit Markern für „Drang zur Schlankheit“ in AN (Extended Data Abb. 4). Wie in Abb. 5 der erweiterten Daten gezeigt, fanden wir keinen Unterschied in den zirkulierenden Mengen an magersüchtigem ClpB14 zwischen AN- und HC-Gruppen (Ergänzende Anmerkung 4).

Wir haben die Wachstumsdynamik der bakteriellen Darmmikrobiota anhand der metagenomischen Daten geschätzt, indem wir das Peak-to-Tal-Verhältnis (PTR)27 für 50 Bakterienarten berechnet haben. 35 davon waren in mehr als 20 Proben vorhanden. Die mittleren PTR-Werte unterschieden sich deutlich zwischen AN und HC (PWilcoxon = 2,0 × 10−4, Extended Data Abb. 6), was möglicherweise mit der starken Verringerung der Nahrungsaufnahme bei AN-Patienten zusammenhängt. Es wurde vorhergesagt, dass sechs Bakterien eine deutlich geringere Wachstumsrate in AN aufweisen (PWilcoxon < 0,05, Extended Data Abb. 6). Dabei handelte es sich um Akkermansia muciniphila, Alistipes finegoldii, Coprococcus catus, Eubacterium siraeum, Odoribacter splanchnicus und das Butyrat produzierende Bakterium SS3/4.

Wir beobachteten einen höheren Virusreichtum (Chao1, Abb. 2a) und eine höhere Virusvielfalt (Shannon, Abb. 2b) in AN-Kotproben im Vergleich zu HC. Die jüngste Veränderung des Körpergewichts innerhalb von 4 Wochen war nicht mit der Zusammensetzung der Darmviren verbunden (Ergänzungstabelle 4). Nach der Entschlüsselung der Kovariaten (Alter, Rauchen und Drogenkonsum) identifizierten wir 31 Virusarten, deren AN-Anreicherung oder -Abnahme auftrat (Abb. 2c). Von großem Interesse ist, dass 25 der 30 vermehrten Virusarten in AN Lactococcus-Phagen mit bekannten Lactococcus-lactis-Wirten waren – Bakterien, die in großem Umfang bei der Herstellung fermentierter Lebensmittelprodukte verwendet wurden.

a,b, Boxplot (Linie, Median; Box, IQR; Whiskers, 1,5× IQR) der Veränderungen im Chao1-Anteil (a) und der Shannon-Diversität (b) der viralen Darmmikrobiota zwischen AN (n = 77) und HC ( n = 70) auf der Ebene der Virusarten. Die Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest (a,b) untersucht. c, Cliffs Delta-Werte kontrastierter Darmvirusarten zwischen AN und HC mit Padj < 0,05 durch Benjamini-Hochberg-Korrektur (angegeben neben der Virusanmerkung). Die unterschiedlichen Arten wurden durch die MetadeconfoundR-Pipeline identifiziert, wobei die Auswirkungen von Cofaktoren wie Alter, Rauchen und mehrfacher Drogeneinnahme entschlüsselt wurden. d, Unterschied in der Anzahl der trans-Königreich-ökologischen Korrelationen zwischen der viralen und bakteriellen Darmmikrobiota in AN (n = 77) im Vergleich zu HC (n = 70) und zwischen zwei AN-Subtypen (AN-RS, n = 56, AN-BP). n = 21) unter Verwendung des SparCC-Algorithmus.

Quelldaten

Die Analyse der Virus-Bakterien-Korrelationen innerhalb der AN- und HC-Darmmikrobiota ergab einen bemerkenswerten Rückgang der Anzahl der Virus-Bakterien-Wechselwirkungen bei AN (219 für HC gegenüber 84 für AN, exakter PFisher-Test = 8,8 × 10−15, Abb. 2d). . Dies wurde hauptsächlich durch geschwächte Wechselwirkungen zwischen Virusspezies und Bakterienproduzenten kurzkettiger Fettsäuren wie Roseburia inulinivorans, Faecalibacterium prausnitzii und Roseburia hominis verursacht (ergänzende Abbildung 3 und Daten). In der Trans-Königreich-Analyse konnten wir kein Zusammenspiel zwischen Lactococcus-Phagen und Lactococcus-Bakterien beobachten (Ergänzende Abbildungen 3 und 4 sowie Daten).

In Analysen von AN-Untergruppen zeigte die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) auf der Canberra-Distanz keine bemerkenswerten Veränderungen in der Darmvirenzusammensetzung (PPERMANOVA = 0,571, ergänzende Abbildung 5 und Daten). Beim Vergleich der Anzahl der Virus-Bakterien-Korrelationen in AN-RS- und AN-BP-Darmmikrobiota stellten wir jedoch eine Verringerung der Anzahl und ein viel geringeres Verhältnis positiver Korrelationen in AN-RS fest (164 für AN-BP gegenüber 44 für AN-RS, exakter PFisher-Test < 2,2 × 10−16) (Abb. 2d und ergänzende Abb. 4). Dies deutet darauf hin, dass die Darmmikrobiota bei AN-RS die Virus-Bakterien-Wechselwirkungen im Darm geschwächt hat.

Mithilfe von Gut Metabolic Modules (GMMs)28 und Gut Brain Modules (GBMs)29 zur Vorhersage der Funktionspotenziale von Darmbakterien identifizierten wir 159 Funktionsmodule. Insbesondere wurde die Häufigkeit von GBMs für die Serotonin-Biosynthese und den Abbau von Dopamin, Glutamat und Tryptophan, Metaboliten mit Auswirkungen auf Stimmung und Appetit, in AN angereichert (Abb. 3a). Umgekehrt war die Häufigkeit der Glutamatsynthese-II- und Vitamin-K2-Wege bei HC höher (Abb. 3a)30. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Wege der Serotoninsynthese und des Glutamatabbaus umgekehrt mit den zirkulierenden Glukose- und Insulinkonzentrationen oder der Insulinsensitivität korrelierten (Abb. 3b). Während wir Unterschiede bei den GBMs beobachteten, konnten wir keine Unterschiede bei den GMMs zwischen AN und HC feststellen (Ergänzungstabelle 5).

a, Cliffs Delta-Effektgröße kontrastierter Funktionsmodule zwischen AN (n = 77) und HC (n = 70) unter Verwendung der MetadeconfoundR-Pipeline, wobei Interferenzen von Kovariaten wie Alter, BMI, Rauchen und mehrfacher Medikamenteneinnahme korrigiert wurden. Goldbarren, in AN häufiger vorkommende Funktionsmodule; blaue Balken, Funktionsmodule häufiger in HC. Für jedes kontrastierte Modul wird neben der Modulanmerkung der P-Wert nach Benjamini-Hochberg-Korrektur angegeben. b: Wärmekarte der Zusammenhänge zwischen klinischen Variablen und funktionellen Potenzialen des Darmbakterioms anhand eines linearen Regressionsmodells, bei dem die Auswirkungen von Kovariaten wie Alter, Rauchen und mehrfacher Medikamenteneinnahme entschlüsselt wurden. + zeigt P < 0,05 durch Benjamini-Hochberg-Korrektur an (genaue P-Werte siehe).

Quelldaten

Bakterielle Genome können Strukturvarianten (SVs) aufweisen, die möglicherweise funktionelle Gene beeinträchtigen, die das Zusammenspiel zwischen Mikroben und ihrem Wirt beeinflussen31. Daher können Unterschiede in der Anwesenheit oder Häufigkeit von SVs zwischen ansonsten identischen Bakterienstämmen kritische phänotypische und funktionelle Unterschiede zugrunde liegen31,32. Hier haben wir SVs in allen Proben profiliert und 5.056 Deletions-SVs und 2.423 variable SVs bei 56 Bakterienarten identifiziert (Abb. 4a, b). Bei einigen Arten beobachteten wir deutliche Unterschiede in der Variation der Kopienzahl. Wir identifizierten 87 Deletions-SVs und 18 variable SVs in Bacteroides uniformis bei 134 Individuen, 78 Deletionen und 15 variable SVs in Faecalibacterium prausnitzii bei 124 Individuen und 110 Deletions-SVs und 55 variable SVs in Parabacteroides distasonis bei 121 Individuen. Für die archaeale Mikrobiota identifizierten wir SVs nur in Methanobrevibacter smithii bei 13 Personen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 6 und Daten). Um mögliche Unterschiede in der Bakteriengenetik zu untersuchen, haben wir den Canberra-Abstand der bakteriellen SV-Profile zwischen allen 147 Proben weiter berechnet (Abb. 4c). AN- und HC-Proben unterschieden sich signifikant in der β-Diversität der SV-Zusammensetzung (PWilcoxon <2,2 × 10−16). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass sich die Zusammensetzung der bakteriellen SVs zwischen den beiden Gruppen unterscheidet.

a, Anzahl der SVs jeder Bakterien- oder Archaeenart bei 147 (77 Fällen und 70 Kontrollen) Studienteilnehmern. Für jede Art ist die Anzahl der Deletions- und variablen SVs angegeben. b, Kreisdiagramm mit der Gesamtzahl der identifizierten SVs. c, Boxplot (Linie, Median; Box, IQR; Whiskers, 1,5× IQR) der β-Diversität (Canberra-Distanz) der SV-basierten genetischen Zusammensetzung im AN- (n = 77) und HC-Bakteriom (n = 70). Der P-Wert wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest bestimmt. d, Akkorddiagramm, das signifikante Zusammenhänge zwischen Essstörungswerten und bakteriellen SVs nach Anpassung an Alter, BMI, Rauchen und mehrfachen Drogenkonsum zeigt. e, Heatmap, die die Zusammenhänge zwischen SVs von Bacteroides uniformis und EDI-3-Scores unter Verwendung eines linearen Regressionsmodells zeigt, bei dem die Auswirkungen von Alter, BMI, Rauchen und mehrfacher Drogeneinnahme entschlüsselt wurden. + zeigt P < 0,05 an, korrigiert durch Benjamini-Hochberg (genaue P-Werte siehe). In d und e sind die Variablen der Essstörungsskala in Blau, die allgemeine psychologische Skala in Rot und die bakteriellen SVs in Schwarz dargestellt. f, Die Deletionsrate des 10-kbp-Deletions-SV, das Thiamin-Monophosphat-Kinase im Genom von B. uniformis in der AN-Gruppe beherbergt. g, Boxplot (Linie, Median; Box, IQR; Whiskers, 1,5× IQR), das die EDI-3-Scores bei Anorexie-Personen mit (n = 49) und ohne (n = 28) der 10-kbp-Deletion zeigt. Die Signifikanz wurde durch den Wilcoxon-Rangsummentest (zweiseitig) bestimmt.

Quelldaten

Bei der Untersuchung der Beziehungen zwischen SVs von Darmbakterien und Markern des Essverhaltens stellten wir fest, dass in AN-Fällen bakterielle SVs nach der Entschlüsselung mehrerer Kovariaten signifikant mit Essstörungswerten assoziiert waren (Abb. 4d). Als bemerkenswertes Beispiel haben wir in der Assoziationsanalyse zwischen SVs im Genom von B. uniformis und den Esswerten des Wirts herausgefunden, dass eine 10-kbp-Deletion direkt mit Markern für Bulimie und Selbstverleugnung verbunden war, was darauf hindeutet, dass diese Deletion SV beteiligt sein könnte bei der Regulierung von Essstörungen und psychologischen Merkmalen bei AN (Abb. 4e). Tatsächlich zeigte die Genanalyse, dass der Anfang dieser spezifischen Genomregion in B. uniformis eine Thiamin-Monophosphat-Kinase kodiert (Abb. 4f und Ergänzungstabelle 6), das distale Enzym, das am Biosyntheseweg von Thiamin (Vitamin B1) beteiligt ist. Thiaminmangel wird mit der psychischen Gesundheit in Verbindung gebracht, einschließlich Gedächtnisverlust, Angstzuständen, Depressionen, Reizbarkeit, Schlaflosigkeit sowie Appetitverlust und Magen-Darm-Beschwerden33. Etwa ein Drittel der AN-Fälle können an einem Thiaminmangel leiden34. Wir fanden heraus, dass AN-Fälle, denen diese bakterielle Genomregion fehlt, höhere Werte für Bulimie (ein Schlüsselmerkmal für den AN-BP-Subtyp) und Selbstverleugnung aufwiesen (Abb. 4g), ein Muster, das auch durch unsere Korrelationsanalysen nahegelegt wird (Abb. 4e). Ein weiteres Beispiel für die Verknüpfung der Bakteriengenetik mit stoffwechselbezogenen bioklinischen Variablen ist in (Extended Data Abb. 7) und der Ergänzenden Anmerkung 5 aufgeführt.

Wir führten eine ungezielte Metabolomics-Profilierung des Serums aus AN-Fällen und Kontrollen durch. Dies ergab ein Serummetabolomprofil bestehend aus 28 polaren Metaboliten und 35 Mikrobiota-bezogenen Metaboliten, das sich zwischen AN und HC signifikant unterschied (Abb. 5a), während es sich zwischen den beiden AN-Subtypen nur geringfügig veränderte (Extended Data Abb. 8a). Wir identifizierten 25 Serummetaboliten mit Konzentrationsunterschieden zwischen Fällen und Kontrollen nach Anpassung an Störfaktoren (angepasster P-Wert (Padj) <0, 05) (Abb. 5b).

a, Hauptkomponentenanalyse (PCA) des Serummetabolomprofils von AN-Fällen und HC-Teilnehmern. b, Cliffs Delta-Werte der kontrastierenden Metaboliten zwischen AN (n = 77) und HC (n = 70) nach Anpassung an Alter, BMI, Rauchen und mehrfache Medikamenteneinnahme. Goldlutscher sind mit AN angereicherte Metaboliten, und blaue Lutscher zeigen mit HC angereicherte Serummetaboliten. c, Arbeitsablauf für die bidirektionale Mediationsanalyse für mikrobielle Darmmerkmale, Serummetaboliten und Wirtsphänotypen. d, Sankey-Diagramm, das das abgeleitete kausale Beziehungsnetzwerk der Richtung 1 zeigt, wobei mikrobielle Merkmale des Darms, einschließlich Bakterienarten, Darmgehirn-/Stoffwechselmodule und Bakteriengenetik, als kausale Faktoren behandelt wurden, Metaboliten Mediatoren sind und EDI-3-Scores Ergebnisse sind. e, Beispiele für abgeleitete kausale Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Merkmalen, Metaboliten und EDI-3-Scores. Richtung 1 bedeutet mikrobielle Merkmale → durch Metaboliten vermittelte Essstörungswerte, dargestellt mit einer schwarzen Linie; Richtung 2 bedeutet mikrobielle Merkmale → Metaboliten, vermittelt durch EDI-3-Scores, dargestellt durch eine gestrichelte rote Linie. Die Anteile der Mediationseffekte werden in der Mitte der Ringdiagramme angezeigt. FFA, freie Fettsäure.

Quelldaten

Serumkonzentrationen sowohl der primären (Cholsäure (CA), Glykocholsäure (GCA)) als auch der sekundären Gallensäuren (Glykohyocholsäure (GHCA), 7-Oxo-Hyocholsäure (7-Oxo-HCA), Glykohyodesoxycholsäure (GHDCA), 7 -Oxo-Desoxycholsäure (7-Oxo-DCA), ω/α-Muricholsäure (ω/α-MCA) und Ursodesoxycholsäure (UDCA) waren bei AN höher, was auf eine mögliche Rolle der Darmmikrobiota bei AN hinweist Veränderungen in der sekundären Gallensäuresynthese und im Metabolismus sowie in der Sättigungsregulation35. Darüber hinaus waren die Serumkonzentrationen von Indol-3-essigsäure und Indol-3-propionsäure (IPA), zwei Tryptophan-Metaboliten, bei AN im Vergleich zu HC höher. Interessanterweise ist IPA mit der Sekretion des Glucagon-ähnlichen Peptids 1 verbunden, das das Sättigungsgefühl anregen und die Magenentleerung verlangsamen kann36,37. In der AN-Gruppe wurde auch eine Fehlregulation von Valin sowie gesättigten und langkettigen ungesättigten Fettsäuren beobachtet (Abb. 5b und Ergänzende Anmerkung 6).

Um die Rolle von Serummetaboliten bei der Interaktion zwischen Darmmikrobiota und Wirtsphänotypen zu untersuchen, haben wir bidirektionale Mediationsmodelle erstellt. Für Richtung 1 stellten wir die Hypothese auf, dass Serummetaboliten (einschließlich Mikrobiota-bezogener Metaboliten) als Variablen die kausale Wirkung mikrobieller Merkmale des Darms (Bakterienarten, Darmhirnmodule und Bakteriengenetik) auf die Phänotypen des Wirts vermitteln (Eating Disorder Inventory-3 (EDI-3). ) Scores und Stoffwechselmerkmale). Für Richtung 2 behandelten wir Phänotypen als Mediatoren und Veränderungen der Metaboliten als Ergebnisse von Veränderungen der mikrobiellen Merkmale (Abb. 5c). Diese bidirektionale In-silico-Analyse ermöglichte es uns, das Ausmaß zu quantifizieren, in dem ein hypothetischer Mediator (ein Metabolit) an der Wechselwirkung zwischen einer Ursache (mikrobielle Merkmale) und ihrer Wirkung (phänotypische Wirtsmerkmale) beteiligt ist.

Wir führten zunächst den kausalen Rückschluss auf bakterielle Merkmale auf EDI-3-Fragebogenergebnisse in AN-Fällen durch (Erweiterte Daten, Abb. 8b). Abgeleitete kausale Zusammenhänge in Richtung 1 bestanden aus 13 mikrobiellen Merkmalen als Initiatoren, 11 Metaboliten als Mediatoren und 7 EDI-3-Scores als Ergebnisse (Abb. 5d). Als bemerkenswertes Beispiel identifizierten wir das Streben nach Schlankheit als Ergebnis der AN-angereicherten Bakterienart C. paraputrificum (Abb. 1c), das mit Veränderungen der Serum-IPA-Spiegel verbunden war, die ebenfalls in der AN-Gruppe angereichert waren. C. paraputrificum ist ein Produzent mehrerer Tryptophan-Kataboliten, darunter IPA, Indolacrylsäure, Indolessigsäure und Tryptamin, die alle an der Regulierung des Appetits und der psychischen Gesundheit beteiligt sind24 (Abb. 5e).

In einem anderen Beispiel wurde Indoxylsulfat, das bei AN-Patienten angereichert war, als Mediator von AN-angereichertem (Clostridium) sp. identifiziert. CAG:269 im Score für Körperunzufriedenheit (Abb. 5e). Indoxylsulfat ist ein kardio- und urämisches Toxin und löst nachweislich bei Menschen und Tiermodellen angst- oder depressive Verhaltensweisen aus38,39. Clostridium ist eine Gattung indolproduzierender Bakterien, die Tryptophanase40 kodieren können, das entscheidende Enzym, das Tryptophan in Indol, Pyruvat und Ammoniak umwandelt41.

Als nächstes analysierten wir den kausalen Zusammenhang zwischen mikrobiellen Merkmalen und Stoffwechselmerkmalen des Wirts in der gesamten Kohorte (Erweiterte Daten, Abb. 8c). Das kausale Netzwerk in Richtung 1 bestand aus 14 mikrobiellen Merkmalen, 10 Metaboliten und 5 metabolischen Merkmalen als kausale Behandlungen, Mediatoren bzw. Ergebnisse (Erweiterte Daten, Abb. 8d). Insbesondere fanden wir heraus, dass das Serotoninsynthesemodul den BMI des Wirts über die sekundäre Gallensäure Glycoursodesoxycholsäure, die durch Serotonin hochreguliert wird, ursächlich beeinflusst42 (Extended Data Abb. 8e). Schließlich vermittelte Serumleucin im Einklang mit unseren vorherigen Erkenntnissen den Einfluss von B. vulgatus auf die Glukosehomöostase (Extended Data Abb. 8e). Wir beobachteten keinen unidirektionalen Kausalzusammenhang zwischen Veränderungen im Essverhalten und dem psychologischen Status, den mikrobiellen Merkmalen des Darms und den Metaboliten (Ergänzungstabelle 7).

Um mögliche kausale Zusammenhänge zwischen einer veränderten Darmmikrobiota bei AN und relevanten Phänotypen zu untersuchen, transplantierten wir fäkale Mikrobiota aus drei zufällig ausgewählten AN-RS-Fällen (um Einheitlichkeit zu erreichen, da AN-BP einen heterogeneren Phänotyp aufweist als der AN-RS-Subtyp) und drei altersangepasste HC-Teilnehmer zu drei unabhängigen Würfen weiblicher keimfreier (GF) Mäuse (Erweiterte Daten, Abb. 9a). Um Variationen im genetischen Hintergrund zu minimieren, haben wir Wurfgeschwister als Kontrollmäuse einbezogen. In jeder Wurfstudie wurden 8, 6 bzw. 6 Wurfgeschwister nach dem Zufallsprinzip als Empfänger von AN- oder HC-Fäkalmikrobiota ausgewählt. Nach der Stuhltransplantation wurden die Empfängermäuse einzeln gehalten und erhielten drei Wochen lang eine auf 30 % kalorienreduzierte Diät, um eine verringerte Nahrungsaufnahme bei menschlichem AN nachzuahmen (Extended Data, Abb. 9b). Die Fütterung mit Futter nach Belieben führte bei GF-Mäusen zu keinen phänotypischen Veränderungen44, eine Beobachtung, die mit einem früheren Bericht über Kwashiorkor45 übereinstimmt (Extended Data Abb. 10a).

Nach 21 Tagen zeigten GF-Mäuse, denen Stuhl aus AN-Fällen transplantiert worden war, eine größere anfängliche Abnahme des Körpergewichts und eine langsamere Gewichtszunahme im Laufe der Zeit im Vergleich zu Mäusen, die HC FMT erhielten (Abb. 6a und erweiterte Daten Abb. 10b; siehe Ergänzende Anmerkung 7 für). Diskussion).

a, Veränderung des Körpergewichts (BW) im Vergleich zum Körpergewicht am Tag 0 nach einer energiereduzierten Diät (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, untersucht über 3 unabhängige Experimente). Die Signifikanz wurde durch eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) berechnet, gefolgt von einem Benjamini-Hochberg-Post-hoc-Test. b,c, mRNA-Spiegel der angegebenen Mäusegene im Hypothalamus (b) und im weißen Leistenfettgewebe (c) in den fäkalen Mikrobiota-Mausempfängern (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, untersucht über 3 unabhängige Untersuchungen). Experimente). Die Signifikanz zwischen den beiden Gruppen wurde mithilfe des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests getestet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (a–c) dargestellt. d, Venn-Diagramm der identifizierten und übertragenen ASVs zwischen menschlichen Spendern und GF-Mausempfängern. e, Links: Wärmekarte der 84 konservierten ASVs bei menschlichen Spendern. Mitte: Unterschiede in den 84 konservierten ASVs, die aus dem Blinddarminhalt zwischen AN-T- und HC-T-GF-Mausempfängern abgeleitet wurden (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, untersucht über 3 unabhängige Experimente). Übertragene mikrobielle Veränderungen sind blau markiert. Rechts: taxonomische Informationen zu ASVs.

Quelldaten

Nach der FMT führten wir eine hypothalamische Genexpressionsanalyse durch. AN-transplantierte und HC-transplantierte Empfänger unterschieden sich in der Expression mehrerer hypothalamischer Gene, die an der Kontrolle des Essverhaltens und des Energieverbrauchs beteiligt sind (Abb. 6b). Dazu gehörte eine erhöhte Expression der Appetitzügler Bdnf46 und Cartpt47 sowie des Serotoninrezeptors Htr1b (der an der nachgeschalteten Regulierung von Serotonin beteiligt ist) bei AN-FMT-Empfängern. Die Expression von Snca, das das neuronale Protein Alpha-Synuclein kodiert, das mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist, war bei AN-transplantierten Mäusen höher48. Darüber hinaus analysierten wir die Messenger-RNA-Spiegel (mRNA) von Genen, die für Proteine ​​kodieren, die die Thermogenese des Fettgewebes regulieren. Wir fanden heraus, dass die Häufigkeit von Ucp1-, Elovl3- und Pgc1α-mRNA im Leistenfett AN-transplantierter Mäuse erhöht war, was auf eine verstärkte Thermogenese des Fettgewebes in dieser Gruppe von Mäusen hinweist (Abb. 6c).

Die 16S-ribosomale Ribonukleinsäure (rRNA)-Gen-Amplikonsequenzierung von menschlichen Spenderstühlen und Blinddarminhalten von GF-Mausempfängern identifizierte 85 überlappende Amplikonsequenzvarianten (ASVs; Abb. 6d), von denen 45 (53 %) veränderte ASVs in Spendern auf Empfänger übertragen wurden ( Abb. 6e). Beim Serum-Metabolom-Profiling wurden 31 konservierte Metaboliten zwischen Spendern und Empfängern festgestellt, und Veränderungen von 19 davon (61 %) wurden vom Menschen auf die Maus übertragen (Erweiterte Daten, Abb. 10c). Wir haben drei ASVs identifiziert: ASV_021, ASV_229 und ASV_002, die auf Gattungsebene als Bacteroides annotiert wurden. Die relative Häufigkeit dieser ASVs und die Expression von Bräunungsgenen, einschließlich Ucp1 (Extended Data Abb. 10d), korrelierten stark positiv, was auf eine mögliche Rolle dieser ASVs bei der Gewichtsabnahme oder geringeren Gewichtszunahme durch verstärkte Fettbräunung hinweist. Die umgekehrte Korrelation zwischen der relativen Häufigkeit von ASV_122, bezeichnet als Gattung Akkermansia, und dem hypothalamischen appetitunterdrückenden Gen Htr1b ist ebenfalls bemerkenswert und lässt auf eine mögliche Rolle von ASV_122 bei der Appetitregulation schließen (Extended Data, Abb. 10d). Zusammengenommen deuten Veränderungen der Genexpression im Hypothalamus- und Fettgewebe sowie Veränderungen des Körpergewichts im Laufe der Zeit bei Mäusen darauf hin, dass eine gestörte Darmmikrobiota bei menschlicher AN zu einigen Elementen der komplexen Pathogenese von AN beitragen könnte.

Mithilfe einer Kombination aus Sequenzierung und Metabolomik zur Charakterisierung des Darmmikrobioms und Metaboloms bei Menschen und Mäusen zeigen wir, dass die bakteriellen und viralen Komponenten des Mikrobioms und des Serummetaboloms bei AN-Patienten im Vergleich zu gesunden Personen verändert sind. Wir stellen außerdem fest, dass sich die SVs der Bakterienarten zwischen AN und gesunden Kontrollen unterscheiden, und in silico kausale Inferenzanalysen deuten darauf hin, dass bakterielle Metaboliten einige Auswirkungen einer veränderten Darmmikrobiota auf das AN-Verhalten vermitteln. Schließlich verlieren GF-Mäuse, denen AN-Stuhl transplantiert wurde und die eine kalorienreduzierte Diät erhielten, zunächst mehr Gewicht und verzeichneten mit der Zeit eine langsamere Gewichtszunahme im Vergleich zu Mäusen, denen Stuhl von gesunden Personen transplantiert wurde. Dies war mit einer höheren Expression von Appetitzügler-Genen im Hypothalamus und einer höheren Expression von Thermogenese-bezogenen Genen im Fettgewebe AN-transplantierter Mäuse verbunden.

Sowohl in FMT-Experimenten als auch in Silico-Inferenzanalysen beobachteten wir Veränderungen in den zirkulierenden Konzentrationen von Glycin-Chenodesoxycholsäure, Indol-3-propionsäure, Taurin-α-Muricholsäure und Taurin-Hyodesoxycholsäure. Wir schlagen vor, dass diese Metaboliten als potenzielle Mediatoren einiger AN-Phänotypen fungieren könnten. Beispielsweise ist Indol-3-propionsäure ein Tryptophan-Metabolit, der an der Serotoninaktivität beteiligt ist49, und Hyodesoxycholsäure ist eine 6α-hydroxylierte Gallensäure, auch Muricholsäure genannt, die die Körpergewichtszunahme reduziert50. Diese Gallensäure ist an der Sättigungsregulation beteiligt51. Die Serotoninaktivität sowie die Appetitregulation könnten an der Entwicklung und/oder Aufrechterhaltung des AN-Syndroms beteiligt sein. Zukünftige Studien müssen die individuellen und kombinierten Auswirkungen dieser Metaboliten auf den Energiestoffwechsel untersuchen. Dennoch könnten viel mehr Darmbakterienarten und abgeleitete Metaboliten die beobachteten AN-Merkmale bei Menschen und Mäusen vermitteln, wie in einem aktivitätsbasierten Anorexiemodell20,52 berichtet.

Analysen von Deletion und variablen SVs in Darmbakterienspezies zeigten, dass die Bakteriengenetik AN-relevante Verhaltensmerkmale und Pathophysiologie beeinflussen kann. Von besonderem Interesse ist eine 10-kbp-Deletion im Genom von B. uniformis, die mit Schätzungen von Bulimie und Selbstverleugnung in Verbindung gebracht wurde. Wir gingen davon aus, dass diese Deletion zum Verlust eines für die Thiamin-Monophosphat-Kinase kodierenden Gens führt, was zu einem relativen Mangel an von der Mikrobiota produziertem Thiamin führen könnte. Dies ist im Zusammenhang mit der AN-Pathologie von Interesse, da bekannt ist, dass verschiedene psychische und intestinale Gesundheitsprobleme mit einem Thiaminmangel zusammenhängen33.

Unsere Studien der viralen Darmmikrobiota in AN zeigten eine teilweise Entkopplung der ökologischen Wechselwirkungen zwischen viralen Spezies und kurzkettigen Bakterienspezies mit Auswirkungen auf die Gehirnbiologie53. Darüber hinaus wurden AN-Proben mit Lactococcus-Phagen mit bekannten bakteriellen L.-lactis-Wirten angereichert. Die AN-assoziierte Anreicherung von Lactococcus-Phagen kann zu einer Störung der Lebensmittelfermentation führen und deutet auf die mögliche Verwendung fermentierter Lebensmittel bei der zukünftigen Behandlung von AN hin. Der Grund für diese Anreicherung von Lactococcus-Phagen ist ungeklärt, aber unser Befund könnte den Test eines Multistamm-Probiotikums, das L. lactis enthält, bei AN-Jugendlichen rechtfertigen54.

Unsere Studie weist Einschränkungen auf: (1) Die Verwendung einer querschnittlichen dänischen AN-Kohorte schränkt die Generalisierbarkeit der Ergebnisse auf andere Ethnien ein; (2) Die gleiche Einschränkung gilt für die Verwendung von AN-Patienten zur Behandlung in einem spezialisierten Zentrum, da diese Patienten möglicherweise nicht repräsentativ für mildere Formen von AN sind. und (3) obwohl die Auswirkungen mehrerer Kovariaten entschlüsselt wurden, hatten wir keine Informationen über Ernährung und körperliche Aktivität – Verhaltensweisen, die sich auf die Darmmikrobiota auswirken.

Zusammenfassend deckt die vorliegende Multi-Omics-Studie tiefgreifende und komplexe Störungen der Darmmikrobiota bei Personen mit AN auf, mit funktionellen Auswirkungen und veränderten Serummetaboliten. Diese Verbindungen können über den Blutkreislauf oder über neuronale Signalwege zwischen Darm, Mikrobiota und Gehirn wirken und die Regulierung von Appetit, Emotionen und Verhalten im Gehirn beeinflussen. FMT von menschlichen AN-Spendern auf GF-Mäuse unter energiebeschränkter Fütterung führte zu einer geringeren Körpergewichtszunahme und einer Reihe von Veränderungen in der Expression von Hypothalamus- und Fettgewebegenen, die an der Verhaltenskontrolle und der Energiehomöostase beteiligt sind. Die Kombination aus Multi-Omics und In-vivo-Experimenten ergänzt unsere kausalen Inferenzanalysen, um die Identifizierung spezifischer bakterieller Metaboliten zu ermöglichen, die möglicherweise AN-Merkmale des menschlichen Wirts vermitteln. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass eine stark gestörte Darmmikrobiota zu einigen Stadien der Pathogenese von AN beiträgt.

Die AN-Patienten wurden alle von einem erfahrenen beratenden Psychiater diagnostiziert und erfüllten die DSM-5-Kriterien für die restriktiven oder Binge/Purging-Subtypen von AN1. Da 90–95 % der Personen mit diagnostizierter AN weiblich sind, haben wir beschlossen, nur Frauen in die vorliegende Studie einzubeziehen, und da die ethnische Zugehörigkeit Einfluss auf die Darmmikrobiota haben kann, haben wir nur dänisch-kaukasische Frauen mit AN-Fällen einbezogen, die aus drei spezialisierten Zentren in Dänemark ab 1 rekrutiert wurden 1. September 2014 bis 31. Juli 2016. Die Zentren waren: Zentrum für Essstörungen (Universitätsklinikum Odense), Abteilung für Kinder- und Jugendpsychiatrie (Universitätsklinikum Aarhus) und Abteilung für psychiatrische Forschung (Universitätsklinikum Aalborg). Zu den Ausschlusskriterien gehörten eine Antibiotika- oder Antimykotika-Behandlung innerhalb der letzten 3 Monate sowie akute oder chronische somatische Erkrankungen oder Infektionen. Alle eingeschlossenen Patienten wurden in spezialisierten Zentren behandelt und zu Beginn ihrer Behandlung von einem erfahrenen und spezialisierten Psychologen oder Psychiater befragt. Das validierte Eating Disorder Inventory (EDI, Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 2) wurde für das Interview und als Fragebogen verwendet, der von geschulten Gesundheitsfachkräften ausgefüllt wurde21. Die Ausschlusskriterien für die altersentsprechenden gesunden Kontrollfrauen waren ein BMI unter 18,5 oder über 25 kg m−2, regelmäßige Medikamente jeglicher Art außer Antibabypillen und Antibiotika innerhalb der letzten 3 Monate. Die Rekrutierung der Kontrollteilnehmer erfolgte über öffentliche Ausschreibungen und über den direkten Kontakt zu Gesundheitspersonal, Medizinstudenten und deren Angehörigen. Der BMI und andere klinische Merkmale der gesunden Kontrollpersonen sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Das Studienprotokoll wurde bei ClinicalTrials.gov (NCT02217384) registriert und die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der regionalen wissenschaftlichen Ethikkommission für Süddänemark genehmigt (Aktenzeichen 42053 S-20140040). Alle an dieser Studie beteiligten Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Stationäre Patienten. Alle unten beschriebenen Messungen wurden während der Routinebehandlung in der Spezialeinheit zur somatischen und psychischen Stabilisierung von Patienten mit schwerer AN durchgeführt. Eine sichere und effektive Gewichtswiederherstellung von 2,0–3,0 % pro Woche ist das Ziel der Behandlung im stationären Bereich. Die Betreuung erfolgte durch ein multidisziplinäres Team und entspricht internationalen Richtlinien. Unter der Aufsicht ausgebildeter Krankenschwestern oder Ernährungsberater wurden zu festgelegten Zeiten individuell abgestimmte Mahlzeiten verabreicht. Konnten die Mahlzeiten nicht innerhalb der vorgegebenen Zeiträume (15 Minuten für einen Snack und 30 Minuten für eine Hauptmahlzeit) eingenommen werden, wurden ergänzende Nahrungsgetränke entweder oral oder über eine Zwölffingerdarmsonde hinzugefügt. Um den individuellen Vorlieben Rechnung zu tragen, wurde eine Auswahl von drei verschiedenen Mahlzeiten angeboten. Der Makronährstoffgehalt war konsistent und lag innerhalb der empfohlenen Energieprozentbereiche: 40–50 % Kohlenhydrate (maximal 10 % Zucker), 30–40 % Fett und 20–25 % Protein. Die tägliche Energiezufuhr wurde entsprechend dem Gewichtsverlauf individualisiert. Wenn es einem Patienten nicht gelang, 2 % der wöchentlichen Gewichtszunahme zu erreichen, wurde der Energiegehalt des Tagesmenüs erhöht. Auf alle Mahlzeiten folgte eine beaufsichtigte Ruhepause von 30 bis 60 Minuten im Sitzen. Zwischen den Pausen war leichte körperliche Aktivität wie ein Spaziergang erlaubt; Es waren jedoch keine Formen des körperlichen Trainings erlaubt. Bei Patienten mit übermäßigem Bewegungsdrang oder sonstiger mangelnder Einhaltung von Verhaltensregeln wurde die Verhaltensüberwachung bei Bedarf auf 24 Stunden am Tag ausgeweitet.

Ambulante Patienten. AN-Patienten besuchten regelmäßig Ambulanzen, in denen ein multidisziplinäres Team aus Ärzten, Krankenschwestern, Psychologen und Gesundheitsverhaltenspädagogen für die Betreuung zuständig war.

Sie erhielten einen individuellen Ernährungsplan, der die gleiche Makronährstoffzusammensetzung wie oben für stationäre Patienten aufwies. Ebenso wie die stationären Patienten wurden auch alle ambulanten Patienten in kognitiv-verhaltenstherapeutische Behandlungskurse aufgenommen.

Die Körpergröße wurde mit einem an der Wand befestigten Stadiometer gemessen und das Gewicht wurde morgens vor dem Frühstück auf einer geeichten Plattformwaage gemessen. Der BMI wurde als Gewicht dividiert durch das Quadrat der Körpergröße (= kg/m2) berechnet.

Blutproben wurden am Morgen nach einem Fasten über Nacht entnommen. Die Blutproben wurden auf Eis gesammelt und zu Serum und Plasma verarbeitet und anschließend bei –80 °C gelagert. Die Serumkonzentrationen von Natrium, Kalium, Albumin und Kreatinin wurden durch enzymatische Tests auf einem Roche/Hitachi-Cobas-C-System gemessen. Die Serumkonzentrationen von Gesamtcholesterin, High-Density-Lipoprotein-Cholesterin und Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin wurden mithilfe der Phosphowolframsäure-Magnesiumchlorid-Fällungsmethode bestimmt. Die immunreaktiven Insulinspiegel im Serum wurden mithilfe eines enzymgebundenen Immunosorbens-Assays gemessen, während die Serumkonzentration der Alaninaminotransferase mit einer enzymatischen coulometrischen Methode einschließlich Pyridoxalphosphataktivierung analysiert wurde.

Die Analyse von Plasma-ClpB wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt55.

Der Stuhl wurde gemäß den Richtlinien der International Human Microbiome Standards (IHMS) (SOP 03 V1) in Kits von AN-Fällen und HC zu Hause gesammelt und sofort bei –20 °C eingefroren, bis er auf Trockeneis transportiert und 4–24 Stunden später eingefroren wurde −80 °C in Plastikröhrchen in den Biobanken. Die DNA-Extraktion aus Aliquots von Stuhlproben wurde gemäß IHMS SOP P7 V256 durchgeführt.

Für die Zählung der Bakterienzellen (ergänzende Abbildung 7) wurden 0, 08–0, 12 g gefrorene (–80 ° C) Stuhlproben 15-fach in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (Sigma-Aldrich) mit einem pH-Wert von 7, 2 verdünnt und mithilfe von Gewebe mechanisch homogenisiert Lyser (40 Min., 12,5 Bewegungen pro Sekunde; QIAGEN) und mit 2 % Paraformaldehyd fixiert (10 Min., Raumtemperatur; Biotum). Anschließend wurden die Proben 120-fach in gefiltertem Färbepuffer (1 mM EDTA, 0,01 % Tween20, pH 7,2 DPBS, 1 % BSA (Sigma-Aldrich)) verdünnt. Um Klumpen zu minimieren, wurden die Proben durch ein Zellsieb (Porengröße 5 μm; pluriSelect) filtriert und im Färbepuffer vorgefeuchtet. Als nächstes wurde die Bakterienzellsuspension mit SYBR Green I (1:200.000; Thermo Fisher) in DMSO (Sigma-Aldrich) gefärbt und 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Zur genauen Bestimmung der Bakterienzellzahl wurde den Proben vor der Analyse eine bekannte Konzentration von 123count eBeads (Invitrogen) zugesetzt. Die Messungen wurden mit einem BD Fortessa LSRII-Durchflusszytometer (BD Biosciences) durchgeführt und die Daten wurden mit der BD FACSDiVaTM-Software erfasst. Auf den FITC-Kanal (530/30 nm) wurde ein Schwellenwert von 200 angewendet. Fluoreszenzintensität bei grünen (530/30 nm, FITC), blauen (450/50 nm, Pacific Blue), gelben (575/26 nm, PE) und roten (695/40 nm, PerCP-Cy5-5) Fluoreszenzkanälen Es wurden Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtintensitäten (FSC und SSC) gesammelt. Die Messungen wurden bei einer voreingestellten Flussrate von 0,5 μl s−1 durchgeführt. Die Daten wurden in R mit dem Flowcore-Paket (v1.11.20)57 in R (v4.1.2) verarbeitet. Die feste Gating-Strategie trennte die mikrobiellen Fluoreszenzereignisse vom Hintergrund der Stuhlprobe.

Die DNA wurde mittels fluorometrischer Qubit-Quantifizierung (Thermo Fisher) quantifiziert und mittels DNA-Größenprofilierung auf einem Fragmentanalysator (Agilent) qualifiziert. Zum Aufbau der Bibliothek wurde hochmolekulare DNA (>10 kbp; 3 µg) verwendet. Das Scheren der DNA in Fragmente von etwa 150 bp wurde mit einem Ultraschallgerät (Covaris) durchgeführt und der Aufbau einer DNA-Fragmentbibliothek erfolgte mit den Kits Ion Plus Fragment Library und Ion Xpress Barcode Adapters (Thermo Fisher). Gereinigte und amplifizierte DNA-Fragmentbibliotheken wurden mit dem Ion Proton Sequencer (Thermo Fisher) sequenziert, wobei mindestens 20 Millionen hochwertige Lesevorgänge von durchschnittlich 150 bp pro Bibliothek generiert wurden.

Um die Genzahltabelle zu erstellen, wurde die METEOR-Software verwendet58: Zuerst wurden die Lesevorgänge von AlienTrimmer59 auf niedrige Qualität gefiltert. Nach der Entfernung von Lesevorgängen geringer Qualität und Lesevorgängen menschlicher DNA wurden 75,7 % ± 2,7 % qualitativ hochwertige Metagenomik-Sequenzierungslesevorgänge der Fäkalien-DNA mithilfe von Bowtie2 (Ref. 61) auf den Integrated Gut Catalog 2 (IGC2)60 abgebildet, der 10,4 Millionen Gene umfasst ). Lesevorgänge, die einem eindeutigen Gen im Katalog zugeordnet waren, wurden den entsprechenden Genen zugeordnet. Anschließend wurden Lesevorgänge, die mit demselben Alignment-Score mehreren Genen im Katalog zugeordnet waren, entsprechend dem Verhältnis ihrer eindeutigen Zuordnungszahlen zu den erfassten Genen zugeordnet. Die resultierende Zähltabelle wurde mit dem R-Paket MetaOMineR v1.3162 weiterverarbeitet. Es wurde auf 14 Millionen zugeordnete Lesevorgänge verkleinert, um Unterschiede in der Sequenzierungstiefe und Zuordnungsrate zwischen den Proben zu berücksichtigen. Dann wurde die verkleinerte Matrix hinsichtlich der Genlänge normalisiert und durch Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million abgebildeter Fragmente in eine Häufigkeitsmatrix umgewandelt. Die Genzahl wurde als Anzahl der in der Häufigkeitsmatrix vorhandenen Gene (Häufigkeit streng positiv) berechnet.

IGC2 wurde zuvor mit MSPminer63 unter Verwendung eines öffentlich verfügbaren aktualisierten MSP-Datensatzes64 in 1.990 MSPs organisiert. Die relative Häufigkeit von MSP wurde als mittlere Häufigkeit seiner 100 „Marker“-Gene (d. h. der Gene, die insgesamt am meisten korrelieren) berechnet. Wenn in einer Probe weniger als 10 % der „Marker“-Gene zu sehen waren, wurde die Häufigkeit des MSP auf 0 gesetzt. Dieser Ansatz wurde in den Konsortien MetaHIT62 und Metacardis65 verwendet. Für die 4 MSPs mit weniger als 100 Kerngenen wurden alle verfügbaren Kerngene verwendet.

Häufigkeiten auf höheren taxonomischen Rängen wurden als Summe der MSP berechnet, die zu einem bestimmten Taxa gehören. Die MSP-Anzahl wurde als die Anzahl der in einer Probe vorhandenen MSPs (d. h. deren Häufigkeit streng positiv ist) bewertet. Das Enterotyp-Profiling wurde wie zuvor gezeigt durchgeführt66.

Gene aus dem IGC2-Katalog wurden mit Diamond67 auf KEGG-Orthologe (KO) aus der KEGG-Datenbank68 (v8.9) kartiert. Jedes Gen wurde dem am besten bewerteten KO unter den Treffern mit einem E-Wert < 10 × 10−5 und einem Bit-Score > 60 zugeordnet. Anschließend bewerteten wir das Vorhandensein und die Häufigkeit von GMMs28 und GBMs29 in einer metagenomischen Probe mithilfe der im R-Paket omixerRpm (v0.3.2) implementierten Pipeline, wie zuvor beschrieben28,29.

Wir haben die Berechnungspipeline verwendet, um die Wachstumsdynamik von Darmbakterien aus metagenomischen Proben abzuleiten, wie zuvor beschrieben27. Die Sequenzierungsablesungen wurden einer Datenbank zugeordnet, die vollständige genomische Referenzen von 2.991 Stämmen enthält, die zu 1.509 Mikrobenarten gehören. Für jede Bakterienart wurde ein Referenzstamm mit einer Prävalenz von 100 % in den Proben ausgewählt. Anschließend wurde eine Abdeckungskarte auf der Grundlage ausgerichteter Lesevorgänge zum Referenzgenom erstellt. Genomsegmente wurden in 10-kbp-Regionen eingeteilt und die Abdeckung der resultierenden Bins wurde berechnet und geglättet. Der Ort des Replikationsursprungs und -terminus wurde durch Anpassungen desselben Stamms über mehrere Proben vorhergesagt. Schließlich wurden die PTRs für jede Bakterienart in jeder Probe als geglättete Sequenzierungsabdeckung des repräsentativen Stamms an der vorhergesagten Spitzenposition dividiert durch die an der vorhergesagten Tiefpunktposition berechnet.

Vor der SVs-Klassifizierung wurde die Pipeline mit iterativem Coverage-basierten Lesezuweisungsalgorithmus durchgeführt, um die mehrdeutigen Lesevorgänge mit hoher Genauigkeit der wahrscheinlichsten Referenz neu zuzuordnen31,32. Die in der proGenomes-Datenbank (http://progenomes1.embl.de/) bereitgestellten Referenzgenome wurden verkettet und dann in genomische 1-kbp-Bins unterteilt und zur Erkennung hochvariabler genomischer Segmente verwendet. Die SGV-Finder-Pipeline31 wurde verwendet, um die SVs zu erkennen, die entweder (1) einen Deletionsprozentsatz des Genomsegments in der gesamten Population von <25 % aufweisen (variable SVs, vSVs), (2) einen Deletionsprozentsatz zwischen 25 % und 75 % aufweisen. (Deletions-SVs, dSVs; die Abwesenheit oder Anwesenheit dieses bestimmten Genomsegments wurde beibehalten) oder (3) mit einem Deletionsprozentsatz von >75 % (dieses Genomsegment wurde von der Analyse ausgeschlossen). Alle Bakterienarten mit SV-Anruf waren in mindestens 10 % der Gesamtproben vorhanden und wurden für die anschließende Analyse verwendet.

Das R-Paket „mediation“69 (v4.5.0) wurde verwendet, um kausale Zusammenhänge zwischen Darmmikrobenmerkmalen, polaren und mikrobiotabezogenen Metaboliten sowie Stoffwechselmerkmalen und Essstörungswerten abzuleiten. Um die Testzahlen zu reduzieren, behielten wir die Kandidatengruppen bei, die nur aus Variablen bestanden, die stark miteinander verbunden waren; Das heißt, für eine kandidierende kausale Gruppe mit mikrobiellen Merkmalen, Metaboliten und phänotypischen Variablen war der Zusammenhang zwischen den mikrobiellen Merkmalen des Darms und dem Serummetaboliten signifikant (Padj < 0,1); der Zusammenhang zwischen Metabolit und phänotypischer Variable war signifikant (Padj < 0,1); und der Zusammenhang zwischen mikrobiellem Merkmal und phänotypischer Variable war signifikant (Padj < 0,1). Nach der Durchführung der Mediationsanalyse wurden nur Kandidatengruppen mit Signifikanz in Richtung 1 für die Sankey-Diagramm-Visualisierung beibehalten.

Wir haben die virale Darmmikrobiota mithilfe von MiCoP70 profiliert, da diese Methode dafür optimiert ist, Viren direkt aus Massensequenzierungs-Metagenomik-Lesevorgängen aufzurufen und die relative Häufigkeit innerhalb des Virom-Datensatzes zu berechnen. Als Referenzdatensatz greift MiCoP auf die RefSeq Viral-Datenbank71 des NCBI zurück. Wir identifizierten insgesamt 209 Virusarten mit einer Prävalenz von > und = 10 % und einer relativen Häufigkeit von > und = 0,01 % für 147 (77 AN gegenüber 70 HC) Personen, die im Datensatz enthalten waren. Reichtum, Alpha- und Beta-Diversität wurden mit den R-Paketen „fossil“72 und „vegan“73 berechnet. Der zweiseitige Wilcoxon-Rangsummentest wurde verwendet, um statistisch signifikante Unterschiede in den Reichhaltigkeits- und Alpha-Diversitätsindizes zwischen Gruppen zu bestimmen. Für die Canberra-Distanz wurde eine permutationelle multivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) bei n = 999 durchgeführt. Die Virus-Bakterien-Wechselwirkungen sowohl in den AN-RS- als auch in den AN-BP-Mikrobiomdaten wurden mit dem Sparse Correlations for Compositional (SparCC)74-Algorithmus berechnet. Vor der SparCC-Analyse wurden die AN-Datensätze zu bakteriellen und viralen Mikrobiota in AN-RS- und AN-BP-Datensätze unterteilt, die dann separat zur SparCC-Analyse übermittelt wurden.

Die als mit der Darmmikrobiota in Zusammenhang stehenden Metaboliten aufgeführten Metaboliten basierten auf Literaturrecherchen75,76. Die Serumproben wurden randomisiert und die Probenvorbereitung erfolgte wie zuvor beschrieben43,77. Kurz gesagt, 400 µl Methanol (MeOH) mit internen Standards (Heptadecansäure, Deuterium-markiertes DL-Valin, Deuterium-markierte Bernsteinsäure und Deuterium-markierte Glutaminsäure, 1 µg ml−1) wurden zu 30 µl der Serumproben gegeben , die dann mit dem Vortex gemischt und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert wurden. Die Proben wurden dann zentrifugiert (9.400 × g, 3 min) und 350 μl des Überstands wurden nach der Zentrifugation gesammelt. Das Lösungsmittel wurde zur Trockne eingedampft, 25 μl MOX-Reagenz wurden zugegeben und die Probe wurde 60 Minuten lang bei 45 °C inkubiert. N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (25 μl) wurde zugegeben und nach 60-minütiger Inkubation bei 45 °C wurden 25 μl der Retentionsindex-Standardmischung (n-Alkane, 10 μg ml−1) hinzugefügt.

Die Analysen wurden mit einem Agilent 7890B-Gaschromatographen durchgeführt, der an ein Agilent 7200 Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer gekoppelt war. Die folgenden Parameter wurden verwendet: Das Injektionsvolumen betrug 1 µl mit 100:1-Aufteilung auf PTV bei 70 °C, Erhitzen auf 300 °C bei 120 °C min−1; Säule: Zebron ZB-SemiVolatiles mit einer Länge von 20 m, einem Innendurchmesser von 0,18 mm, einer Filmdicke von 0,18 µm, mit einem anfänglichen Heliumfluss von 1,2 ml min−1, der nach 16 min auf 2,4 ml min−1 ansteigt. Ofentemperaturprogramm: 50 °C (5 Min.), dann auf 270 °C bei 20 °C min−1 und dann auf 300 bei 40 °C min−1 (5 Min.). EI-Quelle: 250 °C, 70 eV Elektronenenergie, 35 µA Emission, Lösungsmittelverzögerung 3 min. Massenbereich 55 bis 650 amu, Aufnahmerate 5 Spektren pro Sekunde, Aufnahmezeit 200 ms pro Spektrum. Quad bei 150 °C, 1,5 ml min−1 N2-Kollisionsfluss, Aux-2-Temperatur 280 °C.

Kalibrierungskurven wurden unter Verwendung von Alanin, Zitronensäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Glycin, Milchsäure, Äpfelsäure, 2-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxybuttersäure, Linolsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Cholesterin, Fructose, Glutamin, Indol-3-propionsäure, Isoleucin, Leucin, Prolin, Bernsteinsäure, Valin, Asparagin, Asparaginsäure, Arachidonsäure, Glycerin-3-phosphat, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Serin und Threonin, gekauft von Sigma-Aldrich in einem Konzentrationsbereich von 0,1–80 μg ml−1. Ein Aliquot jeder Probe wurde gesammelt, gepoolt und zusammen mit der CRM1950-Serumprobe des National Institute of Standards and Technology (NIST), einer hausintern gepoolten Serumprobe, als Qualitätskontrollproben verwendet. Die relative Standardabweichung der Konzentrationen betrug im Durchschnitt 16 % für die gepoolten Qualitätskontrollproben und 10 % für die NIST-Proben.

Das Probenvorbereitungsverfahren wurde wie zuvor beschrieben78 durchgeführt. Die Platte wurde mit 450 µl Acetonitril vorkonditioniert, bevor 100 µl Probe und 10 µl interne Standardmischung aus Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS) und Gallensäuren (BAs) (200 ng ml−1 bzw. 1.000 ng ml−1) hinzugefügt wurden. Anschließend wurden 450 µl Acetonitril mit 1 % Ameisensäure in jede Vertiefung gegeben und die Proben mithilfe eines 10-Zoll-Vakuumverteilers extrahiert. Das Eluat wurde unter einem Stickstoffgasstrom zur Trockne eingedampft und in 80 µl MeOH/2 mM wässriges Ammoniumethanoat rekonstituiert.

Die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer Acquity UPLC BEH C18-Säule (100 mm × 2,1 mm Innendurchmesser, 1,7 µm Partikelgröße) durchgeführt, die mit einer C18-Vorsäule (Waters) ausgestattet war. Die mobile Phase A bestand aus H2O:MeOH (v/v 70:30) und die mobile Phase B aus MeOH, wobei beide Phasen 2 mM Ammoniumacetat als Ionisierungsmittel enthielten. Die Flussrate wurde auf 0,4 ml min−1 mit dem Elutionsgradienten wie folgt eingestellt: 0–1,5 min, mobile Phase B wurde von 5 % auf 30 % erhöht; 1,5–4,5 min, mobile Phase B wurde auf 70 % erhöht; Nach ca. 4,5–7,5 Min. wurde die mobile Phase B auf 100 % erhöht und 5,5 Min. lang gehalten. Eine Nachlaufzeit von 5 Minuten wurde verwendet, um die Ausgangsbedingungen für die nächste Analyse wiederherzustellen. Die Gesamtlaufzeit pro Probe betrug 18 Minuten. Die Einstellungen der dualen Elektrospray-Ionisationsquelle waren wie folgt: Kapillarspannung betrug 4,5 kV, Düsenspannung 1.500 V, N2-Druck im Zerstäuber betrug 21 psi und die N2-Flussrate und Temperatur als Hüllgas betrugen 11 l min−1 und 379 °C. jeweils. Um genaue Massenspektren im Massenspektrometrie-Scan (MS) zu erhalten, wurde der m/z-Bereich im Negativionenmodus auf 100–1.700 eingestellt. Für die gesamte Datenerfassung wurde die Software MassHunter B.06.01 (Agilent) verwendet.

Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte mit einer hauseigenen Spektralbibliothek unter Verwendung von MS- (und Retentionszeit-)Tandem-Massenspektrometrie-Informationen. Die Quantifizierung basierte auf einer Matrix-angepassten Kalibrierungskurve, die mit nativen Verbindungen versetzt war. Die Kalibrierungskurve bestand aus Konzentrationen im Bereich von 0–1.600 ng ml−1 für BAs. Die relative Standardabweichung für die BAs betrug im Durchschnitt 17,8 % für die Qualitätskontrollproben und 19,4 % für die NIST-Proben.

Tierprotokolle wurden von den Wissenschaftsethikkommissionen der Hauptstadtregion Kopenhagen, Dänemark, genehmigt. Weibliche keimfreie Swiss Webster-Mäuse wurden gezüchtet und bis zum Beginn der Experimente in der Abteilung für experimentelle Medizin der Universität Kopenhagen in flexiblen gnotobiotischen Filmisolatoren gehalten. Den Mäusen wurde autoklaviertes Futter (7 % Einfachzucker, 3 % Fett, 50 % Polysaccharid, 15 % Protein (w/w), Energie 3,5 kcal g−1) und Wasser nach Belieben unter 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelheit verabreicht Zyklus (Licht an um 7:30 Uhr) und konstante Temperatur (21–22 °C) und Luftfeuchtigkeit (55 ± 5 %).

Stuhlproben aus zufällig ausgewählten Untergruppen von drei Patienten mit AN (Frauen im Alter von 20, 22 und 20 Jahren mit einem BMI von 10,3, 11,5 bzw. 11,7 kg m−2) und drei HC (Frauen im Alter von 20, 22 und 21 Jahren mit einem BMI von 22,6, 21,1 bzw. 21,2 kg m-2), die repräsentativ für Fälle und Kontrollen waren, wurden zur Kolonisierung von 6 Wochen alten weiblichen GF-Wurfgeschwistern verwendet. Kurz gesagt wurden 250 mg Stuhlproben mit 5 ml LYBHI-Medium (ergänzt mit 0,05 % Cystein und 0,2 % Hämin als Reduktionsmittel), verdünnt in 20 % Glycerin (20 ml g-1 Stuhl), in einem anaeroben Kryoröhrchen suspendiert; Diese Inokulumproben wurden dann 5 Minuten lang gewirbelt und anschließend 5 Minuten lang stehengelassen, um die Partikel auszufällen. Die Fäkalschlämme wurden dann in 1-ml-Kryoröhrchen überführt und sofort bei –80 °C eingefroren. Am ersten Tag wurden beide Mäusegruppen in autoklavierten, individuell belüfteten Käfigen gehalten, wo sie die erste Dosis (200 µl) Kotbrei erhielten. Anschließend erhielten die Mäuse 2 Tage lang autoklaviertes Futter und Wasser nach Belieben und ihre Nahrungsaufnahme wurde aufgezeichnet. Am dritten Tag wurde den Mäusen eine zweite Dosis Fäkalienmaterial von den gleichen übereinstimmenden AN- und HC-Spendern wie zuvor verabreicht. Danach wurden die Mäuse in beiden Gruppen einzeln gehalten und 3 Wochen lang einer 30 % energiebeschränkten autoklavierten Futterdiät (die Menge der gegebenen Nahrung wurde auf 70 % der ad libitum-Nahrungsaufnahme für jede Maus eingestellt) unterzogen, wobei Wasser ad libitum verabreicht wurde. Sowohl die mit Magersucht transplantierten (AN-T) als auch die normalen Kontroll-transplantierten (HC-T) Mäuse wurden alle 5 Tage nach Beginn der energiereduzierten Diät gewogen.

Am Ende der Studie wurden die Mäuse mit Isofluran betäubt und Blut aus der Hohlvene wurde in Röhrchen mit EDTA gesammelt. Blutproben wurden 6 Minuten lang bei 4.032 g und 4 °C zentrifugiert. Das Plasma wurde isoliert und für nachfolgende biochemische Tests bei –80 ° C gelagert. Das subkutane weiße Fettgewebe der Leiste, der Blinddarm und der Hypothalamus jeder Maus wurden präzise präpariert und für die quantitative PCR-Analyse gesammelt. Von der vorliegenden Studie wurden keine Tiere oder Datenpunkte ausgeschlossen.

Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Geweben extrahiert, gefolgt von einer Konzentrationsmessung. Ein µg RNA wurde mit dem Reverse Transcription System (Promega) in komplementäre DNA transkribiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit dem Nachweissystem LC480 (Roche Diagnostics) und SYBR Green I Supermix (Takara) durchgeführt. Alle qPCRs wurden 10 Minuten lang mit thermischen Zyklen bei 95 °C durchgeführt, gefolgt von 45 Zyklen von 0,01 s bei 95 °C und 20 s bei 60 °C. Die Daten wurden auf das Housekeeping-Rpl36-Gen für Fettgewebe und das Rplp0-Gen79 für Hypothalamus normalisiert und gemäß der Delta-Delta-CT-Methode analysiert. Die in dieser Studie verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind in der Ergänzungstabelle 8 aufgeführt.

Mikrobielle DNAs wurden aus Stuhlproben (~250 mg) von menschlichen Spendern und Mausempfängern mithilfe des NucleoSpin Soil Mini Kits (MACHEREY-NAGEL) isoliert und gereinigt. Die DNA wurde dann unter Verwendung des Phusion High-Fidelity PCR-Mastermix (New England Biolabs) durch PCR amplifiziert, die auf die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens abzielte (Primersequenzen in der Ergänzungstabelle 8). Das folgende PCR-Programm wurde verwendet: 98 °C für 30 s, 25× (98 °C für 10 s, 55 °C für 20 s, 72 °C für 20 s), 72 °C für 5 min. Die Amplifikation wurde überprüft, indem die Produkte auf einem Agarosegel laufen gelassen wurden. Indizes wurden in einer anschließenden PCR unter Verwendung eines Illumina Nextera-Kits mit dem folgenden PCR-Programm hinzugefügt: 98 °C für 30 s, 8× (98 °C für 10 s, 55 °C für 20 s, 72 °C für 20 s), 72 °C für 5 Min. Die Anbringung der Indizes wurde überprüft, indem die Produkte auf einem Agarosegel laufen gelassen wurden. Produkte aus der Nested-PCR wurden auf der Grundlage der Bandenintensität gepoolt und die resultierende Bibliothek mit Magnetkügelchen gereinigt. Die DNA-Konzentration der gepoolten Bibliotheken wurde fluormetrisch gemessen. Die Sequenzierung wurde auf einem Illumina MiSeq-Desktop-Sequenziergerät unter Verwendung des MiSeq-Reagenzienkits V3 (Illumina) für 2 × 300 bp Paired-End-Sequenzierung durchgeführt. Paired-End-Lesevorgänge wurden anschließend mithilfe der DADA2-Pipeline (v1.16.0)80 gekürzt, zusammengeführt und analysiert.

Vor der statistischen Analyse in der vorliegenden Studie wurden keine Daten ausgeschlossen. Da es sich bei der Studie um eine Beobachtungsstudie handelt, wurden keine Zuordnung und Randomisierung berücksichtigt. Diese Studie umfasst alle verfügbaren Proben (n = 147) von Patienten mit Anorexie und gesunden Personen. Obwohl keine statistischen Methoden zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen verwendet wurden, ähneln unsere Stichprobengrößen denen in früheren Veröffentlichungen43,81. Die Proben wurden zufällig auf die Metagenomik- und Metabolomik-Chargen verteilt. Während der Datenerfassung in metagenomischen, biochemischen und metabolomischen Analysen waren die Forscher hinsichtlich der Gruppenzuordnung blind. Alle Analysen menschlicher Proben wurden mit R (v4.1.2) durchgeführt. Genexpressionsanalysen und Körpergewichtsvergleiche für Tierstudien wurden mit GraphPad Prism (v9.3.0) durchgeführt.

Differentialanalyse

Wir haben die Differenzialanalyse mit der im R-Paket metadeconfoundR (v0.1.8; siehe https://github.com/TillBirkner/ metadeconfoundR oder https://doi.org/10.5281/zenodo.4721078) implementierten metadeconfoundR-Pipeline durchgeführt untersuchten, inwieweit die beobachteten Unterschiede zwischen AN- und HC-Teilnehmern in Mikrobiom- oder Metabolomanalysen durch Kovariaten wie Alter, BMI, Rauchen und Medikamente verfälscht werden. Diese Pipeline verwendete zunächst univariate Statistiken, um Zusammenhänge zwischen Mikrobiommerkmalen und dem Krankheitsstatus zu finden, gefolgt von einem Post-hoc-Test zum Vergleich verschachtelter linearer Modelle, um die verwirrenden Auswirkungen potenzieller Kovariaten zu prüfen, und schließlich zur Rückgabe einer Statusbezeichnung.

Assoziationsanalyse

Für die Assoziations- und Mediationsanalyse zwischen Omics-Merkmalen und Essverhalten sowie psychologischen Merkmalen innerhalb der AN-Gruppe überprüften wir zunächst die Normalität kontinuierlicher Variablen mit dem Shapiro-Wilk-Normalitätstest und stellten fest, dass die meisten Variablen nicht normalverteilt waren. Daher haben wir vor der Assoziationsanalyse die kontinuierlichen Variablen mithilfe einer empirischen Normalquantiltransformation standardisiert, um einer Standardnormalverteilung (N ~ (0, 1)) zu folgen. Anschließend haben wir ein lineares Regressionsmodell implementiert, um die Zusammenhänge zwischen Omics-Merkmalen und Essverhalten sowie psychologischen Merkmalen mithilfe der folgenden Formel zu bewerten, wobei Störfaktoren als Kovariaten hinzugefügt wurden.

Zu den Medikamenten gehörten selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer, Antipsychotika und Benzodiazepine.

Für die Assoziationsanalyse zwischen Omics-Merkmalen und Stoffwechselmerkmalen des Wirts wurden vor der linearen Regressionsanalyse auch eine Normalitätsprüfung und Datenstandardisierung durchgeführt. Im linearen Regressionsmodell wurden die oben genannten Störfaktoren als Kovariaten einbezogen, mit Ausnahme des BMI, da der extrem niedrige BMI die bemerkenswerteste phänotypische Veränderung bei AN-Patienten im Vergleich zu HC-Patienten darstellt.

Unterschiede in der mikrobiellen Diversität im Darm (Genreichtum, Artenzahl, taxonomische Zusammensetzung) zwischen AN und HC wurden mithilfe von Wilcoxon-Tests berechnet, und der Kruskal-Wallis-Test wurde zur Beurteilung der Signifikanz von Unterschieden zwischen mehreren Gruppen verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle P-Werte mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert und Padj < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Auf anonymisierte klinische Daten, die in Sharepoint über Odense Patient Data Explorative (Datei-Nr. OP_153) gespeichert sind, können Sie über [email protected] zugreifen oder sie finden sich in der Ergänzungstabelle 2. Rohe Shotgun-Sequenzierungsdaten und 16s-rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden im European Nucleotide Archive mit den Zugangsnummern PRJEB51776 bzw. PRJEB60103 hinterlegt. Metabolomics-Daten sind im Metabolomics Workbench-Repository unter dem Link https://doi.org/10.21228/M8KT5B verfügbar. Die KEGG-Datenbank ist unter https://www.genome.jp/kegg/ verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Mit der Datenanalyse und -visualisierung verbundene Codes sind unter https://github.com/fjw536/AnorexiaGutMicrobiome.git verfügbar.

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YF erhielt das Marie-Skłodowska-Curie-Einzelstipendium (797267), das der vorliegenden Studie gewidmet war. Das Novo Nordisk Foundation Center for Basic Metabolic Research ist eine unabhängige Forschungseinrichtung an der Universität Kopenhagen, die teilweise durch eine uneingeschränkte Spende der Novo Nordisk Foundation finanziert wird. RKS wurde vom Odense University Hospital Research Fund (R15-A800) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yong Fan, René Støving, Samar Berreira Ibraim.

Novo Nordisk Foundation Center for Basic Metabolic Research, Fakultät für Gesundheit und Medizin, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Yong Fan, Tulika Arora, Liwei Lyu, Evelina Stankevic, Tue Haldor Hansen, Fredrik Backhed und Oluf Pedersen

Zentrum für Essstörungen, Universitätsklinikum Odense und Forschungseinheit für medizinische Endokrinologie, psychiatrische Dienste in der Region Süddänemark, Open Patient Data Explorative Network (OPEN) und Klinisches Institut, Universität Süddänemark, Odense, Dänemark

René Klinkby Støving

Universität Paris-Saclay, INRAE, MGP, Jouy-en-Josas, Frankreich

Samar Berreira Ibraim, Florence Thirion, Nicolas Pons, Nathalie Galleron, Benoît Quinquis, Florence Levenez, Hugo Roume und S. Dusko Ehrlich

Fakultät für Wissenschaft und Technologie, Universität Örebro, Örebro, Schweden

Tuulia Hyötyläinen, Tim Sinioja & Oddny Ragnarsdottir

Medizinische Fakultät der Universität Kopenhagen und Universitätsklinikum Herlev-Gentofte, Kopenhagen, Dänemark

Liwei Lyu und Oluf Pedersen

Forschungseinheit INSERM U1073 und TargEDys, Universität Rouen, Rouen, Frankreich

Pierre Dechelotte

Labor für Molekulare Bakteriologie, Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Rega-Institut Ku Leuven, Leuven, Belgien

Gwen Falony, Sara Vieira-Silva und Jeroen Raes

Zentrum für Mikrobiologie, VIB, Leuven, Belgien

Gwen Falony, Sara Vieira-Silva und Jeroen Raes

Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene und Forschungszentrum für Immuntherapie (FZI), Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, Deutschland

Gwen Falony und Sara Vieira-Silva

Institut für Molekularbiologie (IMB), Mainz, Deutschland

Gwen Falony und Sara Vieira-Silva

Abteilung für Kinder- und Jugendpsychiatrie, Universitätsklinikum Aarhus, Aarhus, Dänemark

Sehr Clausen

Abteilung für klinische Medizin, Fakultät für Gesundheit, Universität Aarhus, Aarhus, Dänemark

Sehr Clausen

Abteilung für psychiatrische Forschung, Universitätsklinikum Aalborg, Aalborg, Dänemark

Kjaersdam Telleus-Spiele

Abteilung für Kommunikation und Psychologie, Fakultät für Sozial- und Geisteswissenschaften, Universität Aalborg, Aalborg, Dänemark

Kjaersdam Telleus-Spiele

Das Wallenberg-Labor, Abteilung für Molekulare und Klinische Medizin, Institut für Medizin, Sahlgrenska-Akademie, Universität Göteborg, Göteborg, Schweden

Fredrik Bäckhed

Abteilung für klinische Physiologie, Universitätsklinikum Sahlgrenska, Region Västra Götaland, Göteborg, Schweden

Fredrik Bäckhed

Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Universität Örebro, Örebro, Schweden

Matej Oresic

Turku Bioscience Centre, Universität Turku und Åbo Akademi University, Turku, Finnland

Matej Oresic

Abteilung für klinische Neurowissenschaften und Bewegungsneurowissenschaften, University College London, London, Großbritannien

S. Dusko Ehrlich

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OP konzipierte und entwarf das Studienkonzept, detailliert das Protokoll und überwachte alle Phasen des Studienprotokolls, einschließlich des Verfassens der Unterlagen. YF, RKS, SBI und FT führten die Datenanalyse durch, interpretierten die Ergebnisse und trugen zur Ausarbeitung des Papiers bei. TH, TS und OR unterstützten die Metabolomprofilierung. YF entwarf und führte alle Tierversuche mit Unterstützung von TA und LLLL durch und ES führte die Zählung der Bakterienzellen durch. RKS und THH führten eine Phänotypisierung der Studienteilnehmer durch. PD, NP, NG, BQ, FL, HR, GF, SV-S., JR, LC, GKT, FB, MO und SDE trugen zur technischen Projektentwicklung und -überwachung bei und überarbeiteten die Entwürfe des Papiers. Alle Autoren haben zur Durchsicht und Bearbeitung des Artikels beigetragen.

Korrespondenz mit Oluf Pedersen.

FB ist Aktionär von Implexion Pharma. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Microbiology dankt Tom Hildebrandt und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Der Workflow wurde mit BioRender.com erstellt.

a,b,e Boxplot (Linie, Median; Box, Interquartilbereich (IQR); Whiskers, 1,5× IQR) des Vergleichs zwischen AN (Gold, n = 77) und HC (Blau, n = 70) der relativen Häufigkeit von die 12 Bakterienstämme, die bei mindestens 10 % der Individuen nachgewiesen wurden (a), die 20 am häufigsten vorkommenden Bakterienfamilien (b) und die häufigsten 30 Gattungen (e). Die Merkmale werden nach abnehmender mittlerer Häufigkeit sortiert. Nullwerte werden auf 1e-10 eingestellt. Blau gefärbte Merkmale sind in der HC-Gruppe angereichert, und Gold ist in der AN-Gruppe angereichert. Die Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rang-Summen-Test bestimmt, gefolgt von einer Drogenentschlüsselung und einer mehrfachen Testkorrektur mit der Benjamini-Hochberg-Methode für alle Merkmale (a, b und e, genaue p-Werte siehe Quelldaten). c,f, Absolutwerte der Cliff-Delta-Effektgröße der Familien (c) und Gattungen (f) im Gegensatz zwischen AN und HC nach medikamentöser Dekonfundierung (angepasster p-Wert ≤ 0,1). Gold-Balkendiagramme deuten darauf hin, dass Merkmale in AN häufiger vorkommen; Blaue Balkendiagramme weisen auf Merkmale hin, die in HC häufiger vorkommen (c, f). d,g, Boxplot (Linie, Median; Box, IQR; Whiskers, 1,5× IQR), das die β-Diversität (Canberra-Distanz) des Darmbakterioms auf Gattungsebene (d) und den Reichtum an metagenomischen Arten-Pangenomen (MSPs) zeigt ( g) zwischen AN (Gold, n = 77) und HC (blau, n = 70). Die Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest (d, g) bestimmt. h, das obere Feld zeigt die Enterotyp-Prävalenz bei AN (n = 77) und HC (n = 70), das untere Feld zeigt die Enterotyp-Prävalenz bei HC- und AN-Patienten, aufgeteilt in AN-RS (n = 56) und AN-BP (n = 21). ) Gruppen.

Quelldaten

Knotengröße und Knotenfarbe repräsentieren die mittlere Häufigkeit bzw. die Gattung eines bestimmten MSP. Gattungen, die nur von einem MSP repräsentiert werden, sind grau gefärbt. Rote und blaue Linien zeigen positive bzw. negative Korrelationen an. Die Linienstärke stellt den absoluten Korrelationskoeffizienten dar. Es werden nur Korrelationen mit einem absoluten Koeffizienten über 0,4 angezeigt; MSP ohne Korrelation über dem Schwellenwert werden ausgeblendet.

Variablen in der spezifischen Essstörungsskala sind blau markiert, und in der allgemeinen psychologischen Skala sind sie rot markiert. +, angepasster p < 0,05 (genaue p-Werte siehe Quelldaten).

Quelldaten

a, Relative Häufigkeit der Enterobacteriaceae-Familie in den Gruppen HC (n = 70) und AN (n = 77). b: Transformierte ClpB-Konzentration im Nüchternplasma im logarithmischen Maßstab zwischen den Gruppen HC (n = 70) und AN (n = 77). c, transformierte ClpB-Konzentration im Nüchternplasma im logarithmischen Maßstab zwischen restriktivem AN (AN-RS n = 56) und Binge-Purge-AN-Subtyp (AN-BP n = 21). Die Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest zwischen zwei Gruppen (ac) berechnet. Boxplots zeigen den Median- und Interquartilbereich (IQR) an und Whiskers repräsentieren den 1,5-fachen IQR (ac).

Quelldaten

Boxplots zeigen den Median- und Interquartilbereich (IQR) an, Whiskers zeigen den 1,5-fachen IQR an. Die Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest bestimmt.

Quelldaten

ac, Streudiagramm, HOMA-IR, Nüchtern-Plasmainsulin und Glukose bei Personen, die eine 1-kbp-Variation im A. putredinis-Genom aufweisen (n = 147). Signifikanz bestimmt durch zweiseitigen Spearman-Korrelationstest, korrigiert durch die Falscherkennungsrate unter Verwendung der Benjamini- und Hochberg-Methode. Das Fehlerband ist eine lineare Regressionslinie mit einem 95 %-Konfidenzband (ac). Punkte, die AN- und HC-Individuen darstellen, waren rot bzw. blau gefärbt. d, oberes Feld, standardisierte Variabilität (y-Achse) entlang einer genomischen Region von A. putredinis (x-Achse). Unteres Feld, Orte (blauer Balken) des interessierenden Gens.

Quelldaten

a, Hauptkomponentenanalyse (PCA)-Diagramm des Serummetaboloms der AN-Subtypen, AN-BP (Binge/Purge-Anorexie), AN-RS (restriktive Anorexie). b, Zusammenfassende Anzahl der abgeleiteten Mediationsbeziehungen für Richtung 1 (mikrobielle Merkmale des Darms → durch Serummetaboliten vermittelte Essstörungswerte), Richtung 2 (mikrobielle Merkmale des Darms → durch Essstörungswerte vermittelte Serummetaboliten). c, Zusammenfassende Anzahl der abgeleiteten Vermittlungsbeziehungen für Richtung 1 (darmmikrobielle Merkmale → durch Serummetaboliten vermittelte Phänotypen), Richtung 2 (darmmikrobielle Merkmale → durch Phänotypen vermittelte Serummetaboliten) für die gesamte Kohorte. d, Sankey-Diagramm, das das abgeleitete kausale Beziehungsnetzwerk der Richtung 1 zeigt, wobei mikrobielle Merkmale des Darms, einschließlich Bakterienarten, Darmgehirn und Stoffwechselmodule sowie Bakteriengenetik, als kausale Faktoren behandelt wurden, Serummetaboliten Mediatoren sind und Stoffwechselmerkmale Ergebnisse sind. e, Beispiele für abgeleitete kausale Zusammenhänge zwischen Darmmikrobenmerkmalen, Metaboliten und Stoffwechselmerkmalen des Wirts. Richtung 1, die mikrobielle Merkmale → durch Serummetaboliten vermittelte Stoffwechselmerkmale bedeutet, ist mit einer schwarzen Linie dargestellt, während Richtung 2, die mikrobielle Merkmale → durch Stoffwechselmerkmale vermittelte Serummetaboliten bedeutet, mit einer festgelegten roten Linie dargestellt ist. Der Anteil des Mediationseffekts wird in der Mitte der Ringdiagramme angezeigt. GDCA, Glycodeoxycholsäure; GHCA, Glykohyocholsäure; GHDCA, Glykohyodesoxycholsäure; GUDCA, Glycoursodesoxycholsäure; HCA, Hyocholsäure; Homöostatische HOMA-IR-Modellbewertung der Insulinresistenz; P-, Plasma; S-, Serum.

Quelldaten

a, Arbeitsablauf für die Zubereitung von fäkaler Mikrobiota-Aufschlämmung. Stuhl (250 mg) von Anorexie (AN) und Kontrolle (HC) wurde auf Trockeneis geschnitten, in eine anaerobe Kammer überführt und mit 5 ml LYBHI-Medium, verdünnt in 20 % Glycerin, resuspendiert. Die resuspendierten Fäkalienschlämme wurden in Kryoröhrchen aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung schnell wieder bei -80 °C eingefroren. Alle Stuhlproben der passenden AN- und HC-Spender wurden am selben Tag vorbereitet und gefrorene Aliquots wurden zur Sondenernährung an Mäuse gefroren gelagert. b, Versuchsschema für die Transplantationsstudie mit GF-Mäusen. In jeder unabhängigen Wurfstudie wurden weibliche GF-Wurfgeschwister im Alter von sechs Wochen aus dem Zuchtisolator genommen und nach dem Zufallsprinzip 200 µl Kotbrei von drei AN-Fällen oder drei HC-Probanden erhalten. Beide Mäusegruppen wurden in autoklavierten, individuell belüfteten Käfigen gehalten und erhielten zwei Tage lang autoklaviertes Futter und Wasser nach Belieben. Nach zwei Tagen wurde den Mäusen eine zweite Dosis Fäkalienmaterial von denselben übereinstimmenden AN- und HC-Spendern wie zuvor verabreicht. Danach wurden die Mäuse in beiden Gruppen einzeln gehalten und drei Wochen lang einer 30 % kalorienreduzierten Futterdiät unterzogen. Während dieser Zeit wurde Wasser nach Belieben verabreicht. Sowohl die mit Magersucht transplantierten (AN-T) als auch die normalen Kontroll-transplantierten (HC-T) Mäuse wurden alle fünf Tage nach Beginn der energiereduzierten Diät gewogen. Erstellt mit Biorender.com.

a: Veränderung des Körpergewichts und des Fettanteils von keimfreien (GF) Wurfgeschwistern der Maus (n = 21), die mit ad libitum-Futter gefüttert und mit Mikrobiota von Anorexie-Patienten transplantiert wurden. b: Veränderung des Körpergewichts im Vergleich zum Körpergewicht am Tag 0 nach einer energiereduzierten Diät für drei unabhängige Experimente (n = 8, 6 bzw. 6 für unabhängige Chargen). Die Daten werden als Mittelwert ± Sem(a,b) ausgedrückt. Die Signifikanz wurde durch eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) berechnet, gefolgt von einem Benjamini-Hochberg-Post-hoc-Test. c, Serummetabolomprofil bei menschlichen Spendern und GF-Mausempfängern, die mit einer 30 % energiereduzierten Diät gefüttert wurden. Die Daten wurden als log2-transformierte Faltungsänderungen (log2FC) zwischen AN- und Kontrollgruppen ausgedrückt. Positive log2FC-Werte weisen auf AN-angereicherte Metaboliten hin, während negative log2FC-Werte auf HC-angereicherte Metaboliten hinweisen. Serummetaboliten, die bei menschlichen Spendern und GF-Mausempfängern zwischen AN- und HC-Gruppen dauerhaft verändert waren, wurden mit blauen Balken markiert. CA, Cholsäure; DCA, Desoxycholsäure; FFA, freie Fettsäure; w/a-MCA, ω/α-Muricholsäure; HDCA, Hyodesoxycholsäure; TaMCA, Taurin-α-muricholsäure; CDCA, Chenodesoxycholsäure; LCA, Lithocholsäure; UDCA, Ursodesoxycholsäure; G, glycinkonjugierte Gallensäuren; T, Taurin-konjugierte Gallensäuren. d, Wärmekarte im linken Bereich, die die Korrelation zwischen ASVs und quantifizierten Genen im Hypothalamus oder im subkutanen weißen Fettgewebe zeigt. Taxonomische Informationen zu ASVs finden Sie im rechten Bereich. +, p < 0,05, korrigiert durch die Benjamini-Hochberg-Methode (genaue p-Werte siehe Quelldaten).

Quelldaten

Ergänzende Anmerkungen, Abb. 1–7 und Referenzen.

Ergänzungstabellen 1–8.

Quelldaten für ergänzende Abbildungen. 1–6.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fan, Y., Støving, RK, Berreira Ibraim, S. et al. Die Darmmikrobiota trägt zur Pathogenese von Anorexia nervosa bei Menschen und Mäusen bei. Nat Microbiol 8, 787–802 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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Eingegangen: 23. Juni 2022

Angenommen: 03. März 2023

Veröffentlicht: 17. April 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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Naturmikrobiologie (2023)