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Oct 22, 2023

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Nature Genetics Band 55,

Nature Genetics Band 55, Seiten 268–279 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Mithilfe von Genexpressionsprofilen konnten zahlreiche Prozesse identifiziert werden, die sich im Laufe des Alterns verändern. Wie diese Veränderungen entstehen, ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier kombinierten wir die Sequenzierung entstehender RNA und die Immunpräzipitation des RNA-Polymerase-II-Chromatins, gefolgt von der Sequenzierung, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären, die Veränderungen der Genexpression bei Mäusen im Wildtyp-Alter auslösen. Wir fanden heraus, dass in der Leber von 2-Jährigen 40 % der verlängernden RNA-Polymerasen blockiert sind, was die produktive Transkription verringert und die Transkriptionsleistung in einer von der Genlänge abhängigen Weise verzerrt. Wir zeigen, dass dieser Transkriptionsstress durch endogene DNA-Schäden verursacht wird und die meisten Genexpressionsveränderungen im Alter in den meisten hauptsächlich postmitotischen Organen erklärt und sich insbesondere auf alterstypische Signalwege wie Nährstoffwahrnehmung, Autophagie, Proteostase, Energiestoffwechsel, Immunfunktion und zellulären Stress auswirkt Widerstandsfähigkeit. Altersbedingter Transkriptionsstress ist von Nematoden bis zum Menschen evolutionär konserviert. Somit verschlechtert die Anhäufung von stochastischen endogenen DNA-Schäden während des Alterns die Basaltranskription, die das altersbedingte Transkriptom etabliert und eine Funktionsstörung der wichtigsten Signalwege des Alterns verursacht, was offenbart, wie DNA-Schäden funktionell den Hauptaspekten des normalen Alterns zugrunde liegen.

Alterung ist durch einen fortschreitenden molekularen, zellulären und physiologischen Verfall gekennzeichnet, der zu verminderter Vitalität, altersbedingten Krankheiten und erhöhter Sterblichkeit führt. Da viele Prozesse mit dem Alter abnehmen oder sich verändern1, ist überraschend wenig über den Funktionsstatus des basalen Transkriptionsprozesses im Alter bekannt. Gealterte Ratten- und Fruchtfliegengehirne produzieren weniger Messenger-RNAs2,3 und die Variation der Transkription von Zelle zu Zelle nimmt in mehreren Geweben zu4,5,6, während die Transkriptionskoordination von Gen zu Gen mit zunehmendem Alter abnimmt7. Allerdings wird die Transkription im Alter hauptsächlich im Zusammenhang mit Veränderungen der Genexpression untersucht. Die Transkriptomik trug wesentlich zur Identifizierung zahlreicher zellulärer Pfade und Prozesse bei, die vom Altern betroffen sind8,9,10. Obwohl ein Teil der altersbedingten, organspezifischen Genexpressionsveränderungen durch Transkriptionsfaktoren, microRNAs11,12, veränderte Zelltypzusammensetzung8,13 und epigenetische Veränderungen14,15 erklärt werden kann, zeigte eine kürzlich durchgeführte Transkriptomik-Metaanalyse, dass die meisten Genexpressionsähnlichkeiten zwischen älteren Menschen bestehen Mausorgane konnten nicht auf diese bekannten Regulationsmechanismen zurückgeführt werden8.

Die Anhäufung von DNA-Schäden wurde als zugrunde liegende Ursache für normales Altern16,17 und die oben genannten Transkriptionsphänotypen6,7,18,19 postuliert, hauptsächlich basierend auf Ähnlichkeiten mit Zellen, die DNA-schädigenden Stoffen oder vorzeitig alternden DNA-Reparaturstörungen wie dem Cockayne-Syndrom ausgesetzt waren Trichothiodystrophie. Diese Erkrankungen weisen Defekte in der transkriptionsgekoppelten Reparatur (TCR) auf, die zu blockierten RNA-Polymerasen auf DNA-Läsionen führen20, was darauf hindeutet, dass transkriptionsblockierende DNA-Schäden auch an der normalen Alterung beteiligt sein könnten. Obwohl sich endogene transkriptionsblockierende DNA-Läsionen bei normalem Altern ansammeln21,22,23,24,25, ist derzeit nicht klar, ob sie signifikante Transkriptionsreaktionen hervorrufen. In dieser Studie analysierten wir die basale Transkription, die den Veränderungen der Genexpression bei Mäusen im normalen Wildtyp-Alter (WT) zugrunde liegt, mithilfe einer in vivo entstehenden RNA-Sequenzierungsmethode in Kombination mit RNA-Polymerase II (RNAPII)-Chromatin-Immunpräzipitation und anschließender Sequenzierung (ChIP-seq). Konfokale Bildgebung. Wir zeigen einen starken altersbedingten Rückgang der Transkription und eine Verzerrung der Transkriptionsleistung durch die Anhäufung von DNA-Schäden als allgemeinen Alterungsphänotyp, der allgemein zu altersbedingten Transkriptionsänderungen führt und sich insbesondere auf lebensspannenbestimmende Alterungsmerkmale auswirkt.

Um den Transkriptionsprozess im normalen Alterungsprozess zu untersuchen, erhielten erwachsene (15 Wochen) und alte (2 Jahre) männliche WT-Mäuse (n = 3 pro Gruppe) eine einzelne intraperitoneale Injektion mit Ethinyluridin (EU), einem inkorporierten Uridinanalogon in neu synthetisierte RNA in vivo26. Fünf Stunden nach der Injektion zeigte die Fluoreszenzfärbung von EU ein 1,5-fach reduziertes EU-Signal in alten Lebern (Abb. 1a). Der Rückgang war leberweit, betraf fast alle Hepatozyten und war nicht auf eine altersbedingte Polyploidisierung beschränkt (Abb. 1b). Da die Verringerung des EU-Signals mit Ausnahme der Nukleolen pannukleär war (Abb. 1a), was auf eine verringerte RNAPII-abhängige Transkription hinweist, haben wir getestet, ob niedrigere RNAPII-Spiegel die verringerte Transkription erklären könnten. Überraschenderweise zeigte die Immunfluoreszenzfärbung von RNAPII unter Verwendung derselben Leberproben einen 1,4-fachen Anstieg statt einer Abnahme bei gealterter Leber (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 1a). Die RNAPII-Initiierung und die proximale Pause des Promotors, die durch Phosphorylierung von Serin-5-Resten (ser5p) in der C-terminalen Domäne (CTD) gekennzeichnet sind, unterschieden sich nicht signifikant (Abb. 1d und erweiterte Daten Abb. 1b), was auf eine genomweite RNAPII-Promotoraktivität schließen lässt bleibt im Alter weitgehend unverändert. Die durch Serin-2-CTD-Phosphorylierung (ser2p) markierte Verlängerung von RNAPII zeigte jedoch einen 1,5-fachen Anstieg (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 1c). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Basaltranskription in der gealterten Leber verändert ist.

a, EU-markierte entstehende RNA (grün) in Hepatozytenkernen (DAPI-Gegenfärbung, blau) in der Leber erwachsener (blau) und alter Mäuse (rot). Rechts: Fluoreszenzintensitäten, quantifiziert in Box- und Whisker-Plots. Die Mittellinien zeigen die Mediane, die Kästchengrenzen markieren den IQR und die Whiskers geben die Minimal- und Maximalwerte an. P = 2,1129 × 10−129 (zweiseitiger ungepaarter t-Test). Gezählte Kerne: adulte n = 506; alt n = 500; n = 3 Mäuse pro Gruppe. b, XY-Streudiagramm der Fluoreszenzintensität von EU-markierter entstehender RNA (willkürliche Einheiten (au)) und entsprechende Kerngrößen, gemessen in einzelnen Hepatozyten der erwachsenen (blau) und alten (rot) WT-Leber. c–e, Gesamt-RNAPII (c), an ser5p phosphoryliertes RNAPII (d) und an ser2p phosphoryliertes RNAPII (e), Immunfluoreszenzfärbung (rot) in Hepatozyten (gegengefärbt durch DAPI, blau) in erwachsener und alter Leber. Box- und Whisker-Diagramme der Fluoreszenzintensitäten. Die Mittellinien zeigen die Mediane, die Kästchengrenzen markieren den IQR und die Whiskers geben die Minimal- und Maximalwerte an. P-Werte durch zweiseitigen ungepaarten t-Test, n = 3 Mäuse pro Gruppe. Gezählte Kerne und P-Werte: c, adult: n = 206; alt: n = 155, P = 6,64186 × 10−21; d, Erwachsener n = 2.926; alt n = 2.643, P = 0,323195587; e, Erwachsener n = 2.697; alt n = 2.708. P = 0. Maßstabsbalken, 50 μm. f, Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens zur EU-markierten Sequenzierung entstehender RNA. g, Anteil (%) der EU-seq-Reads, die von verschiedenen RNA-Polymerasen synthetisiert wurden. RNAPI-II und mtRNAP (links) und RNAPIII (rechts), wobei die Gesamtsequenzwerte von Erwachsenen und Alten auf 100 % normalisiert sind. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SEM n = 3 Mäuse pro Gruppe. P = 0,012868073 (zweiseitiger ungepaarter t-Test). h, Anteil (%) der EU-seq-Lesevorgänge von RNAPII aus intronischen und exonischen Regionen. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SEM n = 3 Mäuse pro Gruppe. P = 0,013520897 (zweiseitiger ungepaarter t-Test).

Quelldaten

Um diese scheinbar widersprüchlichen Beobachtungen einer verringerten Transkription und einer erhöhten RNAPII-Häufigkeit zu untersuchen, isolierten und sequenzierten wir in vivo selektiv EU-markierte entstehende RNA (EU-seq), was zu einem deutlich höheren Anteil an intronischen Lesevorgängen im Vergleich zur Gesamt-RNA-Sequenzierung führte (Abb. 1f und erweiterte Daten Abb. 2a–c). Kontrollexperimente wiesen auf identische EU-Einbaudichten in erwachsenen und alten Lebern hin (Extended Data Abb. 2d–g), was eine geringere EU-Aufnahme als Erklärung für das geringere EU-Signal in alten Lebern ausschließt. Als nächstes bestimmten wir den Beitrag jeder RNA-Polymerase zum zellulären RNA-Pool, indem wir Lesevorgänge den RNA-Spezies zuordneten, die von jeder der verschiedenen Polymerasen transkribiert wurden. Wie erwartet stammte der Großteil der EU-markierten RNA aus RNAPII (Abb. 1g und Extended Data Abb. 2h), der einzigen RNA-Polymerase, die eine signifikante altersbedingte Verringerung der RNA-Synthese aufwies, was auch aus der etwa 1,5-fachen Abnahme ersichtlich ist Intron-abgeleitete Sequenzlesungen (Abb. 1h). Da sich die Spleißereignisse nicht wesentlich veränderten (Erweiterte Daten, Abb. 2i, j), deutet die Diskrepanz zwischen reduzierter De-novo-RNA-Synthese und erhöhter Verlängerung von RNAPII auf eine spezifische geringere RNAPII-Produktivität im Alter hin.

Um die Diskrepanz zwischen RNAPII-Häufigkeit und Transkription weiter zu untersuchen, führten wir ChIP-seq mit Antikörpern gegen Gesamt-, ser5p- und ser2p-RNAPII aus denselben oben beschriebenen Lebern durch. Wir untersuchten zunächst, ob eine genomweite Promotor-Stummschaltung die reduzierte Transkription erklären könnte. In Übereinstimmung mit den Immunfluoreszenzergebnissen (Abb. 1) unterschied sich die genomweite Gesamt- und ser5p-RNAPII-Belegung an Transkriptionsstartstellen (TSS) über alle Gene hinweg nicht signifikant im Alter (Abb. 2a, b). Auch der Übergang von RNAPII vom Promotor zur produktiven Verlängerung blieb unverändert (Abb. 2c). Um die Transkription bis zur frühen Elongation zu beurteilen, haben wir die genomweite entstehende RNA-Produktion in der ersten Kilobase gemessen, gemessen in der ersten Kilobase der intronischen Regionen (Abb. 2d) oder vom TSS (Abb. 2e). Wir beobachteten eine nahezu 1:1-Korrelation in der ersten Kilobase der Transkription über alle Gene hinweg, was darauf hindeutet, dass die gesamte Promotoraktivität, die effektiv in die Transkription übergeht, weitgehend unverändert bleibt. Während eine genomweite reduzierte Promotoraktivität den Phänotyp der reduzierten Transkription nicht erklären konnte, erwarteten wir eine veränderte Transkription durch höhere oder niedrigere Promotoraktivität. Alle exprimierten Gene (n = 3.970), die mehr als 90 % der RNAPII-abhängigen Produktion entstehender RNA ausmachen, wurden in drei gleiche Abschnitte von der TSS bis zur Transkriptionsterminationsstelle (TTS) aufgeteilt und die entsprechenden Lesevorgänge von entstehender RNA und von RNAPII ChIP-seq kartiert in jedem Behälter wurden zwischen alter und erwachsener Leber verglichen. Mithilfe einer Clusteranalyse identifizierten wir Gene, deren Transkription im Alter über alle Bins hinweg sowohl in entstehender RNA als auch in RNAPII ChIP-seq hoch- oder herunterreguliert wurde (Abb. 2f und Extended Data Abb. 3a – c), was die Promotorregulation widerspiegelt. Um zu analysieren, ob die identifizierten transkriptionell hochregulierten (n = 778) oder herunterregulierten (n = 394) Gene biologisch relevant für das Altern sind, haben wir das Enrichr-Tool zur Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)27,28 verwendet, um diese Gensignaturen mit den veröffentlichten zu vergleichen Alterungsstörungsdatenbank mit 34 Mausleber- und 15 Rattenleber-mRNA-Expressionsprofilen. Die transkriptionell hochregulierten und herunterregulierten Gensignaturen ähnelten stark den veröffentlichten Leberalterungsprofilen von Nagetieren (Abb. 2g, h), was darauf hindeutet, dass Promotorregulationsprogramme während des Alterns in allen Transkriptomikstudien konserviert bleiben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die etwa 1,5-fach geringere Synthese naszierender RNA in der alten Leber nicht auf eine verringerte Promotoraktivität oder den Übergang von RNAPII zur Elongation zurückzuführen ist.

a,b, Mittlere Gesamt-RNAPII- und RNAPII-ser5p-ChIP-seq-Read-Häufigkeit um TSS (TSS ± ​​750 bp-Region) aller Gene in erwachsenen (blau) und alten (rot) Lebern. Die graue Linie stellt die eingegebene DNA-Kontroll-ChIP-Sequenz dar. c, XY-Streudiagramm des RNAPII-Reiseverhältnisses aller exprimierten Gene aus erwachsener (x-Achse) und alter (y-Achse) Leber in den gesamten RNAPII-ChIP-seq-Daten. Jeder Punkt repräsentiert ein Gen. Jedes Gen ist der Durchschnitt von n = 3 Mäusen pro Gruppe. d,e, XY-Streudiagramm, das die entstehende RNA-Synthese der ersten 1 kb Introns vom TSS (d) oder vom TSS bis 1 kb stromabwärts (e) aller Gene in erwachsenen (y-Achse) und alten (x-Achse) Lebern darstellt. Jeder Punkt stellt ein Gen dar, in dem das Signal den Mittelwert von n = 3 Mäusen darstellt. f, Drei-Bin-Heatmap der log2-fachen Veränderungen (alt/erwachsen) der entstehenden RNA (links) und des gesamten RNAPII (rechts) auf Genkörpern von Promotor-hochregulierten und herunterregulierten Cluster-Genen. Jede Zeile repräsentiert ein Gen. g,h, Balkendiagramm, das die Überlappung zwischen allen GSEA-Alterungsdatensätzen von Mäusen (g) oder Ratten (h) und den transkriptionell hochregulierten und herunterregulierten Clustern zeigt. Die Signifikanz und der FDR für jede Überlappung wurden durch den exakten Fisher-Test und die mehrfache Testkorrektur nach der Benjamini-Hochberg-Methode berechnet. FDR < 0,05 gilt als signifikant.

Quelldaten

Eine genaue Untersuchung der Drei-Bin-Heatmap ergab ein konsistentes Muster einer allmählich abnehmenden entstehenden Transkription über Bins hinweg über Genkörper in den transkriptionell hochregulierten Genen, wohingegen die RNAPII-Werte den gegenteiligen Trend zeigten (Abb. 2f). Um die Allgemeingültigkeit dieses Phänomens zu beurteilen, haben wir die Drei-Bin-Heatmap auf alle exprimierten Gene erweitert, sortiert nach dem Grad des Transkriptionsrückgangs. Interessanterweise kam es bei fast allen Genen zu einem allmählichen Rückgang der Transkription in der alternden Leber und gleichzeitig zu einer zunehmenden RNAPII-Belegung im gesamten Genkörper, was darauf schließen lässt, dass es sich hierbei um ein genomweites Phänomen handelt (Abb. 3a). Promotor-hochregulierte Gene zeigten im Alter auch diesen Transkriptionsrückgang unabhängig von der Promotorregulierung (Abb. 2f und erweiterte Daten Abb. 3b, c). Um entstehende RNA und das verlängernde RNAPII-Verhalten besser zu quantifizieren, wurden alle exprimierten Gene in 20 Bins von TSS bis TTS unterteilt. Um die Zuordnung von Lesevorgängen zum TSS und TTS auszuschließen, haben wir nur die Bins 2–19 analysiert, die die Verlängerung darstellen. Wie erwartet beobachteten wir einen altersunabhängigen allgemeinen allmählichen Rückgang der entstehenden RNA in allen exprimierten Genkörpern (Abb. 3b), was auf die gerichtete Natur der Transkription und die Sequenzierung vollständiger (wachsender) entstehender RNA-Moleküle und nicht nur des RNAPII-Fußabdrucks zurückzuführen ist. Während die Transkription in der ersten Kilobase der Genkörper ähnlich ist (Abb. 2d, e), war der Rückgang über die gesamten Gene in der alten Leber deutlich stärker (Abb. 3b). Wir nannten diesen altersbedingten übermäßigen Rückgang der Transkription „allmählichen Verlust der produktiven Transkription“ (GLPT). Im Gegensatz dazu stiegen die Gesamt- und ser2p-RNAPII-Spiegel in den Genkörpern während des Alterns allmählich an (Abb. 3c, d), was mit Abb. 1 übereinstimmt. Der Transkriptionsverlust während der Elongation liefert eine Erklärung für die verringerte Transkription, die paradoxerweise mit steigenden Spiegeln einhergeht der Verlängerung von RNAPII.

a: Drei-Bin-Heatmap der log2-fachen Veränderungen (alt/adult) der entstehenden RNA und ChIP-seq des gesamten RNAPII auf Genkörpern, sortiert nach dem Grad des Transkriptionsrückgangs bei allen exprimierten Genen. b–d, Relative Sequenzierungsdichten der Transkriptionsverlängerungsphase zwischen TSS und TTS. b: Naszierende RNA-Sequenzierung in erwachsener (blau) und gealterter (rot) Leber. c, Gesamt-RNAPII-ChIP-seq in erwachsener (blau) und gealterter (rot) Leber. d, RNAPII-ser2p ChIP-seq in erwachsener (blau) und gealterter (rot) Leber. Alle exprimierten Gene; n = 3 Mäuse pro Gruppe. P-Werte: ungepaarter zweiseitiger t-Test mit 32 df. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (e,f) dargestellt. Prozentuale Änderung der Sequenzierungs-Lesedichte in der Transkriptionsverlängerungsphase im Alter zwischen TSS und TTS von Genkategorien basierend auf der Länge des genomischen Gens: EU-seq (e) und Gesamt-RNAPII-ChIP-seq (f). g, Prozentuale Änderung der Sequenzierungs-Lesedichte (alt/erwachsen) in EU-seq, wie in Abb. 2e dargestellt, in der die x-Achse die durchschnittliche Genlänge jeder Kategorie darstellt. h, Streudiagramm, das alle exprimierten Genlängen >20 kb (x-Achse) und die prozentuale Änderung der EU-seq-Dichten zwischen alten und erwachsenen Genen von TSS bis 20 kb stromabwärts (y-Achse) darstellt (n = 3.308). i, Prozentsatz blockierter RNAPII in Genkörpern. Die Farben geben die Genlängenklassen wie in Abb. 2e an. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung (10–22 kb: n = 662; 22–30 kb: n = 644; 30–50 kb: n = 788; 50–70 kb: n = 587; 70–110 kb: n = 643; und >110 kb: n = 646).

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Zuvor berichteten wir über den bevorzugten Verlust der mRNA-Expression langer Gene in der Leber von gealterten Nagetieren und im menschlichen Hippocampus29, der später auch bei Photorezeptoren von Fruchtfliegen30 und der Alterung des Gehirns31,32 beobachtet wurde. Daher haben wir getestet, ob die Genlänge an GLPT beteiligt ist. Wir haben zunächst die Gene aus Abb. 3b mit dem größten altersbedingten Transkriptionsrückgang ausgewählt. Diese GLPThigh-Gene (n = 914) waren tatsächlich im Durchschnitt signifikant länger im Vergleich zu allen exprimierten Genen oder transkriptionell hoch- oder herunterregulierten Genen (Extended Data Abb. 3d). Als nächstes gruppierten wir alle exprimierten Gene in sechs Genlängenklassen, die jeweils eine ähnliche Anzahl von Genen enthielten, und bestimmten den Prozentsatz der entstehenden RNA- und RNAPII-Veränderung im gesamten Genkörper im Alter. Diese Analyse ergab eindeutige, von der Genlänge abhängige gegensätzliche Trends: abnehmende Transkription und zunehmende RNAPII-Belegung (Abb. 3e, f). Interessanterweise zeigten alle Klassen eine ähnliche lineare Transkriptionsregression (Abb. 3g), als wir die mittlere Genlänge jeder Genklasse gegen den prozentualen Transkriptionsabfall über den Genkörpern auftrugen (Abb. 3g), was einem durchschnittlichen Verlust von etwa 0,35 % pro Kilobase in der alten Leber entspricht. Zur Bestätigung war der Transkriptionsrückgang in den ersten 20 kb des TSS über alle Genlängen hinweg ähnlich (Abb. 3h). Da Gene > 70 kb bereits etwa 60 % des RNAPII-abhängigen Pools entstehender RNA ausmachten (Extended Data Abb. 3e), trugen lange Gene überproportional zu verringerten Spiegeln entstehender RNA bei. Die Abnahme der De-novo-RNA-Synthese und die erhöhte RNAPII-Häufigkeit in Genkörpern führen zu längeren Verweilzeiten und einer geringeren Transkriptionsleistung von RNAPII. Durch Quantifizierung der Diskordanz zwischen entstehenden RNA-Spiegeln und der gesamten RNAPII-Belegung (Extended Data, Abb. 3f) schätzten wir auf eine von der Genlänge abhängige Gesamtmenge an unproduktivem RNAPII in Genkörpern in der 2 Jahre alten Leber (Abb. 3i), was bedeutet, dass sie ins Stocken geraten. Unter der Annahme, dass Maus-Hepatozyten eine ähnliche Anzahl an RNAPII-Molekülen pro Zelle aufweisen wie kultivierte menschliche Fibroblasten33, gehen wir davon aus, dass der durchschnittliche 2-jährige Maus-Hepatozyten während der Elongation zu jedem Zeitpunkt >18.000 blockierte RNAPII-Komplexe enthält (Extended Data Abb. 3g). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Alterung der Leber durch einen genlängenabhängigen, genomweiten Verlust der Transkriptionsverlängerung und einen erhöhten RNAPII-Stillstand gekennzeichnet ist.

Anschließend untersuchten wir, ob verschiedene potenzielle Parameter mit dem Grad der GLPT korrelierten, um einen Mechanismus zu identifizieren, der das Abwürgen von RNAPII erklärt. Wir fanden keine signifikanten Unterschiede zwischen GLPThigh-Genen und anderen Genkategorien (transkriptionell hochreguliert und herunterreguliert; Rest) im Nukleotidgehalt über Genkörper, Transkriptionsfehlerrate, alternatives Spleißen, Chromatinzugänglichkeit, Histonmodifikationen im Zusammenhang mit Euchromatin oder DNA-Methylierungsmustern, was der Fall wäre deuten darauf hin, dass epigenetische Veränderungen dafür verantwortlich sind (Extended Data Abb. 4–6). Diese Faktoren korrelieren nicht mit dem Grad der altersbedingten GLPT, der zu erwarten ist, wenn ein solcher Faktor ursächlich beteiligt ist, und erklären daher nicht den beobachteten Rückgang der Transkription.

Angesichts der genlängenabhängigen Verzögerung der Transkription ist die Anhäufung transkriptionsblockierender DNA-Schäden eine plausible Erklärung, da lange Gene eine höhere Wahrscheinlichkeit haben, stochastische Läsionen zu erleiden26,29. Daher haben wir die De-novo-RNA-Synthese in den Lebern von Xpg-/−-Mäusen überwacht, die aufgrund von Defekten in den DNA-Reparaturwegen TCR und der globalen Genom-Nukleotid-Exzisionsreparatur viele Merkmale einer weit verbreiteten vorzeitigen Alterung und einer Lebensdauer von 20 Wochen aufweisen Sie sind nicht in der Lage, transkriptionshemmende Läsionen zu entfernen34. Sowohl die EU-Färbung als auch die EU-seq im Alter von 7 und 14 Wochen (Abb. 4a – c) zeigten einen altersabhängigen, progressiven, pannukleären Rückgang der Transkription. EU-seq bei vorzeitig alternden globalen Genom-Nukleotid-Exzisionsreparatur- und TCR-defekten Ercc1Δ/−-Mäusen, die aufgrund eines zusätzlichen Defekts in der Interstrang-Cross-Link-Reparatur35,36 eine schwerere Leberalterungspathologie aufweisen, zeigten bereits bei 4 und mehr einen hohen Transkriptionsverlust nach 10 Wochen (Abb. 4d), was zeigt, dass das Ausmaß des Transkriptionsrückgangs, der DNA-Reparaturmangel und der Schweregrad der Leberpathologie korrelieren.

a, EU-markierte entstehende RNA (grün) in Leberkernen von 7 und 14 Wochen alten Xpg-/−-Mäusen im Vergleich zu 7 Wochen alten WT-Mäusen. b, Box- und Whisker-Plot-Quantifizierung von Abb. 4a. Die Mittellinien zeigen die Mediane, die Kästchengrenzen markieren den IQR und die Whiskers geben die Minimal- und Maximalwerte an. P-Werte: 7 Wochen altes Xpg−/− versus WT P = 2,4688 × 10−285; 14 Wochen altes Xpg−/− versus WT P = 0; zweiseitiger ungepaarter t-Test, 3 Mäuse pro Gruppe; gezählte Kerne n = 916, 864 und 738 für WT, Xpg−/− im Alter von 7 und 14 Wochen. c,d, Prozentuale Änderungen der EU-seq-Lesedichte zwischen TSS und TTS in Xpg−/− (c) und Ercc1Δ/− Mäusen (d) im Vergleich zur WT-Leberalterung (104 Wochen, schwarze Linie). e, Prozentualer Rückgang der entstehenden RNA-Produktion in ruhenden Xpg-/−-, Ercc1Δ/−- und WT-MDFs nach 1, 2 und 4 Wochen Kultivierung unter hypoxischen (3 %) und normoxischen (20 %) Bedingungen. Die Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung der P-Werte (zweiseitiger ungepaarter t-Test): Woche 2: Ercc1Δ/− gegenüber WT: P = 0,002353336; Woche 4, Xpg−/− versus WT: P = 6,13324 × 10−9; Ercc1Δ/− versus WT: P = 1,21727 × 10−9. Anzahl der Kerne: 3 % O2, Woche 1: 14 Xpg−/− und 14 WT; 17 Ercc1Δ/− und 14 WT; Woche 2: 15 Xpg−/− und 16 WT; 17 Ercc1Δ/− und 13 WT; Woche 4: 29 Xpg−/− und 27 WT; 34 Ercc1Δ/− und 28 WT. f, Box-and-Whisker-Plot fluoreszierender EU-markierter entstehender RNA in Ercc1Δ/− MDFs 24 Stunden nach UVC-Bestrahlung. Die Mittellinien zeigen die Mediane, die Kästchengrenzen markieren den IQR und die Whiskers geben die Minimal- und Maximalwerte an. P-Werte (zweiseitiger ungepaarter t-Test): 2 J m−2 versus 0 J m−2 = 5,66445 × 10−8; 4 J m−2 versus 0 J m−2 = 2,92531 × 10−28; 6 J m−2 versus 0 J m−2 = 5,59594 × 10−52. Gezählte Kerne: 0 J m−2, n = 146; 2 J m−2, n = 118; 4 J m−2, n = 132; 0 J m−2, n = 137. g, Prozentsatz der EU-seq-Lesedichten von Genen >110 kb vom TSS bis 10 kb stromaufwärts in Ercc1Δ/− MDFs 24 Stunden nach UVC-Bestrahlung im Vergleich zu nicht bestrahlten Zellen. Schwarze Linie: >110-kb-Genklasse aus normalen Leberalterungsdaten. h, Bias (Anteil) der Sequenzierung liest die Zuordnung zum kodierenden Strang während der WT-Alterung aus den gesamten RNAPII- und RNAPII-ser2p-ChIP-seq-Daten über alle Gene (n = 3.809), kurz (10–22 kb, n = 512) und längst Gene (>110 kb, n = 779). P < 0,0001, zweiseitiger ungepaarter t-Test im Vergleich zu Genen mit einer Genlänge von 1–10 kb, 3 Mäuse pro Gruppe. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± Sem i, Bias (Bruchteil) der Sequenzierungslesevorgänge, die während der WT-Alterung aus den gesamten RNAPII- und RNAPII-ser2p-ChIP-seq-Daten über den Genkörper (3 Bins) in allen Genen und den längsten Genen (>) auf den kodierenden Strang abgebildet werden 110 kb, n = 779). Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SEM j, Sequenzierungs-Lesedichteprofile des Ghr-Gens aus EU-seq, Gesamt-RNAPII (alle Lesevorgänge aggregiert) und Gesamt-RNAPII, aufgeteilt in Kodierungs- und Template-Strang in erwachsener (blau) und gealterter (rot) WT-Leber. k, phosphoryliertes ATM (rot) und γH2A.X (grün) in der Leber erwachsener und gealterter Mäuse. Rechts: Fluoreszenzintensitäten als Box- und Whisker-Plots. Die Mittellinien zeigen die Mediane, die Kästchengrenzen markieren den IQR und die Whiskers geben die Minimal- und Maximalwerte an. P = 7,19752 × 10−27 (zweiseitiger ungepaarter t-Test). Gezählte Kerne: adulte n = 313; alt n = 315; n = 3 Mäuse pro Gruppe. Maßstabsbalken, 50 μm.

Quelldaten

Um spontane, endogene DNA-Schäden als Auslöser des Transkriptionsrückgangs weiter zu untersuchen, kultivierten wir ruhende dermale Mausfibroblasten (MDFs) von Xpg-/−-, Ercc1Δ/-- und WT-Mäusen für 1, 2 und 4 Wochen, um die Anhäufung endogener DNA-Schäden zu ermöglichen. Ruhe vermeidet die Läsionsverdünnung, die auftritt, wenn sich Zellen vermehren. Interessanterweise zeigten Xpg-/-- und Ercc1Δ/--MDFs einen zeitabhängigen Rückgang der Synthese entstehender RNA, die bei 20 % Sauerstoff kultiviert wurde (Abb. 4e). Bei 3 % Sauerstoff kultivierte MDFs zeigten keine signifikant verringerte Transkription, was auf eine oxidative DNA-Schädigung als Ursache für den Transkriptionsverlust schließen lässt. Als nächstes beurteilten wir das Ausmaß der DNA-Schädigung, die den gleichen Grad an Transkriptionsrückgang auslöste, wie er bei gealterter Leber beobachtet wurde. Ruhende Ercc1Δ/−-MDFs wurden steigenden Dosen ultravioletten C-Lichts (UVC-Licht) ausgesetzt, das bekannte Mengen an transkriptionsblockierenden DNA-Läsionen induziert37. EU-Färbung und EU-seq zeigten einen dosisabhängigen Transkriptionsrückgang, bei dem 2 J m−2 UVC, was etwa 1,6 Transkriptionsblockierungsläsionen pro 100 kb DNA37 entspricht, 24 Stunden nach der UV-Exposition Transkriptionsniveaus ähnlich den Lebern von induzierten WT 2 Jahre alte Mäuse (Abb. 4f, g). Diese Schadensniveaus in Kombination mit einer Transkriptionsreduktion von 0,35 % pro Kilobase erklären auch, warum RNAPI, RNAPIII und mitochondriales RNAP (mtRNAP) keinen signifikanten Rückgang zeigen, da ihre Ziel-RNA-Arten sehr klein sind.

Wenn ein erheblicher Teil der sich im Alter verlängernden RNAPII durch endogene transkriptionsblockierende Läsionen blockiert wird, ist zu erwarten, dass während des strangspezifischen DNA-Amplifikationsschritts im RNAPII-ChIP-seq-Bibliotheksprotokoll die Läsion im Matrizenstrang, die die RNAPII tatsächlich blockiert, auftritt beeinträchtigen im Gegensatz zum unbeschädigten (kodierenden) Strang auch die DNA-Amplifikation dieses Strangs. Dies sollte zu einer Strangamplifikationsverzerrung zugunsten des kodierenden Strangs führen, die durch strangspezifische ChIP-Seq sichtbar gemacht werden kann, wie für UV-induzierte transkriptionsblockierende Läsionen gezeigt38. Zunächst haben wir bestätigt, dass UV-induzierte DNA-Schäden zu einer Verzerrung des kodierenden Strangs in unserem ChIP-seq-Protokoll führen, die nach der Reparaturzeit verschwand (Extended Data Abb. 7a). Wichtig ist, dass wir in alten Lebern eine altersbedingte, von der Genlänge abhängige Verzerrung des kodierenden Strangs in den Gesamt- und RNAPII-ser2p-ChIP-seq-Datensätzen fanden (Abb. 4h). Regionen mit einem hohen Kodierungsstrang-Bias wiesen sowohl einen unveränderten lokalen DNA-Methylierungsstatus als auch einen unveränderten Nukleotidgehalt auf (Extended Data Abb. 7b – f), was darauf hinweist, dass in der isolierten, gereinigten DNA aus gealterten Lebern Polymerase-blockierende Störungen vorhanden sind, die sie als beschädigte DNA identifizieren . Darüber hinaus nahm die altersbedingte Verzerrung des kodierenden Strangs zu den Genenden hin zu, insbesondere bei langen Genen (Abb. 4i), was mit dem Stillstand von RNAPII in Genkörpern (Abb. 3) und einer aktiveren TCR am Anfang der Gene korreliert39. Ein Beispiel ist das Wachstumshormonrezeptor-Gen (Ghr), ein > 265 kb langes Gen, das in zahlreichen unabhängigen Studien40, in Xpg−/−- und Ercc1Δ/−-Mutantenmäusen18,34 und in Zellkulturen, die UV-Licht ausgesetzt waren, häufig herunterreguliert wird41 . Ghr zeigt eine deutliche GLPT und eine erhöhte RNAPII-Häufigkeit im gesamten Genkörper. Wir stellten auch eine 20-prozentige Verschiebung der Lesevorgänge in Richtung des kodierenden Strangs in gealterten Lebern fest (Abb. 4j), was darauf hindeutet, dass die Ghr-Herunterregulierung das direkte Ergebnis transkriptionsblockierender Läsionen ist. Das durch DNA-Schäden verursachte Abwürgen von RNAPII führt zu einer nichtkanonischen DNA-Schadens-Checkpoint-ATM-Phosphorylierung in Abwesenheit doppelsträngiger DNA-Brüche42, was wir auch in gealterten Lebern beobachteten (Abb. 4k), was einen weiteren häufigen Transkriptionsstress im Alter zeigt. Da das Ausmaß der Verzerrung des kodierenden Strangs dem erwarteten Niveau entspricht, wenn es aus UV-behandelten Zellen extrapoliert wird38, zeigen unsere Daten, dass endogene Transkriptionsblockierungsläsionen eine genlängenabhängige Blockierung von RNAPII verursachen, die wir als altersbedingten Transkriptionsstress bezeichnen.

Um die funktionelle Bedeutung von Transkriptionsstress zu beurteilen, haben wir seine Wirkung auf der relevantesten Ebene, der reifen mRNA, quantifiziert. Der Transkriptionsverlust über Genkörper hinweg wirkte sich sowohl auf Introns als auch auf Exons aus, wie am Beispiel des Igf1-Gens (Abb. 5a,b) veranschaulicht wird, einem Schlüsselregulator der Nährstofferkennung, der an der Bestimmung der Gesundheit und Lebensdauer beteiligt ist43,44, dessen Expression mit zunehmendem Alter abnimmt45,46. Wie erwartet sammelte sich RNAPII auf dem 79-kb-Igf1-Genkörper an. Interessanterweise war die Verzerrung des kodierenden Strangs im ersten Drittel des Genkörpers nicht vorhanden, der auch durch normale oder sogar höhere Mengen an entstehender RNA und RNAPII gekennzeichnet war, was darauf hindeutet, dass der Rückgang der Transkription mit der Verzerrung des kodierenden Strangs korreliert. Daher ist durch DNA-Schäden verursachter Transkriptionsstress und nicht die Stummschaltung des Promotors der Auslöser für eine geringere IGF1-Expression in gealterter Leber. Um die Folgen von Transkriptionsstress auf genomweite Exons zu quantifizieren, berechneten wir den Verlust des ersten bis letzten Exons in entstehender RNA, der mit zunehmendem Alter über alle exprimierten Gene hinweg etwa um das 1,5-fache zunahm und von der Genlänge abhängig war (Abb. 5c). Dies stand im Einklang mit einer geringeren mRNA-Produktion im Alter (Abb. 5d) und lieferte einen Mechanismus für den zuvor beobachteten verringerten zellulären mRNA-Gehalt während des Alterns2,3. Dies impliziert einen Rückgang der Transkriptionsleistung und eine Verschiebung der Genexpression hin zu kleinen Genen während des Alterns.

a,b, Sequenzierungsdichteprofile des gesamten Igf1-Gens (mm10, chr10:87.858.265–87.937.047), einschließlich RNAPII-Kodierungsstrang-Bias (a) und nur Exons (b) aus der EU-Seq von Erwachsenen (blau) und älteren Menschen (rot) WT-Mäuseleber. Die Exons 1a und 1b sind alternative Startstellen. c, EU-seq-Dichteverhältnisse zwischen dem letzten und ersten Exon für alle exprimierten Gene (P = 5,06731 × 10−9), kurze (10–22 kb) und lange Gene (>110 kb, P = 0,000482946). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Die P-Werte stammen aus einem zweiseitigen ungepaarten t-Test (alt vs. Erwachsene). d, Vollständige Transkripthäufigkeit (relativ zum Erwachsenen), geschätzt durch Lesevorgänge, die 3'UTR aus der EU-seq aller exprimierten Gene (P = 0,048761825), kurzer (10–22 kb) und langer Gene (> 110 kb, P = 1,78654 ×) abdecken 10−6). Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± Standardabweichung, die P-Werte stammen aus einem zweiseitigen ungepaarten t-Test. e, Signifikante überrepräsentierte Signalwege in TShigh-Genen durch IPA-, KEGG-, Reactome- und GSEA-Marken, klassifiziert nach Hauptprozesskategorie (fett). Aggregierte P-Werte wurden aus einem exakten Fisher-Test ermittelt. Ausführliche Informationen zum Pfad finden Sie in der Ergänzungstabelle 2.

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Da Transkriptionsstress die Transkriptionsleistung verringert und verzerrt, haben wir analysiert, welche zellulären Prozesse und Signalwege am anfälligsten waren. Wir haben Gene mit einem > 1,5-fachen Transkriptionsverlust vom ersten bis zum letzten Exon im Alter (n = 830), die Gene mit hohem Transkriptionsstressniveau (TShigh) darstellen, für die funktionelle Untersuchung ausgewählt. Bemerkenswerterweise fanden wir eine hochsignifikante Überlappung mit den Gesamtprofilen von sechs unabhängigen Studien, die herunterregulierte mRNAs nach UVC-induzierter DNA-Schädigung untersuchten (Ergänzungstabelle 1), was den Zusammenhang zwischen transkriptionsblockierenden DNA-Läsionen und altersbedingtem Transkriptionsstress weiter untermauert. Bei der funktionellen Untersuchung wurden mehrere deutlich überrepräsentierte Zellwege identifiziert, die zuvor als Kennzeichen des Alterns eingestuft wurden1 (Abb. 5e und Ergänzungstabelle 2), wie z. B. die Nährstofferkennungswege IGF1, Insulin, Wachstumshormon und mTOR-Signalisierung, von denen bekannt ist, dass sie die Lebensdauer beeinflussen1,44 . Autophagie, die entfaltete Proteinreaktion und der Stressweg des endoplasmatischen Retikulums wurden ebenfalls identifiziert, was Transkriptionsstress mit dem Verlust der Proteostase in Verbindung bringt. Darüber hinaus fanden wir wichtige Energiestoffwechselprozesse wie die oxidative Phosphorylierung und den Pyruvatstoffwechsel, die durch Transkriptionsstress in der Leber von Ercc1Δ/−-Mäusen funktionell reduziert wurden. Zu den weiteren identifizierten Prozessen gehörten Immunfaktoren, der Fettsäurestoffwechsel und der NRF2-Antioxidationsweg, die alle ursächlich an lebensbezogenen und/oder altersbedingten Krankheiten beteiligt sind47,48,49,50. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Transkriptionsstress eine entscheidende Ursache für die Deregulierung der alterstypischen Signalwege und -prozesse bei alternden WT-Mäusen zu sein scheint.

Abschließend haben wir untersucht, ob Transkriptionsstress auf die Leber beschränkt ist oder auch in anderen Organen und Spezies auftritt. Der durch den Promotor hochregulierte Gensatz enthielt eine B-Zell-Signatur, die auf eine altersbedingte B-Zell-Infiltration8 hinweist, die auch Transkriptionsstress aufwies (Abb. 2f). EU-seq der Nieren von 2 Jahre alten Mäusen zeigte ebenfalls eine ähnliche GLPT wie die Leber von gealterten Mäusen (Abb. 6a). Als nächstes suchten und analysierten wir öffentliche Alterungsdatensätze zur Gesamt-RNA-Sequenzierung, die ausreichend Lesevorgänge enthielten, die Introns zugeordnet waren, die entstehende RNA darstellen. In zwei geeigneten und umfangreichen Datensätzen, gealterte menschliche Sehnen51 und Caenorhabditis elegans52, entdeckten wir eine ähnliche GLPT wie in der Leber von Mäusen im WT-Alter (Abb. 6a). Da die meisten öffentlichen Datensätze aus der mRNA-Sequenzierung stammen, haben wir mithilfe des Enrichr-Tools für GSEA auch unseren TShigh-Gensatz verwendet, um alle ausgewählten altersbezogenen Gensätze (n = 198) in der Alterungsstörungsbibliothek abzugleichen. Zum Vergleich wurden auch transkriptionell hochregulierte und herunterregulierte Gensätze einbezogen. Wir fanden in 65 % aller Alterungsdatensätze ein signifikantes Vorhandensein von TShigh-Genen (Abb. 6b). Die transkriptionell hochregulierten oder herunterregulierten Signaturen erzielten viel niedrigere Werte (Abb. 6b), während bei sechs zufälligen Gensätzen ähnlicher Größe keine Überlappung festgestellt wurde, was darauf hindeutet, dass Transkriptionsstress ein Haupttreiber für Transkriptionsveränderungen in alternden Organen ist.

a, Prozentuale EU-seq-Lesedichteänderungen der Transkriptionsverlängerung zwischen TSS und TTS exprimierter Gene (5-Bin-Verteilung) in EU-seq-Daten aus WT-gealterter Mausleber (schwarz, diese Studie, n = 3 pro Gruppe, n = 3.970). Gene), gealterte Mausniere (n = 2 pro Gruppe, n = 2.135 Gene, 7,5 Wochen gegenüber 104 Wochen, blau) und Gesamt-RNA-Seq der menschlichen Sehne (n = 4 pro Gruppe, n = 773 Gene, 69,5 ± 7,3 Jahre). versus 19 ± 5,8 Jahre; braun) und C. elegans (n ​​= 3 pro Gruppe, n = 2.872 Gene, Tag 10 versus Tag 1 nach dem jungen Erwachsenenstadium; grün). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung, Balkendiagramm der Überlappung zwischen GSEA-Alterungsdatensätzen und den in unserer Studie identifizierten TShigh-, Promotor-hoch- und herunterregulierten Genklassen. Signifikanz und FDR wurden mit dem exakten Fisher-Test und der Benjamini-Hochberg-Methode berechnet. c, Genanreicherungsverhältnis (X-Achse) zwischen identifizierten Gengruppen und GSEA-Alterungsdatensätzen in drei Spezies: Maus (oben), Ratte (Mitte) und Mensch (unten); TShigh (links), Promotor-herunterreguliert (Mitte) und Promotor-hochreguliert (rechts). Die Punktgröße stellt die Anzahl der GEO-Alterungsdatensätze dar. Wenn >1 Datensatz eines Gewebes vorhanden war, werden der Mittelwert ± Standardabweichung und der aggregierte P-Wert (exakter Fisher-Test) angezeigt.

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Als nächstes haben wir visualisiert, welche Organe und Gewebe deutlich angereichert waren. Für Organe mit mehreren Einträgen in der Datenbank haben wir die durchschnittliche Überlappung und die FDR-korrigierten aggregierten P-Werte (False Discovery Rate) berechnet. Wie erwartet hatten altersbedingte Leber-mRNA-Profile von Maus und Ratte die größte Ähnlichkeit mit dem TShigh-Gensatz (Abb. 6c). Tatsächlich war Transkriptionsstress ein dominanterer Mechanismus zur Gestaltung des Leberalterungstranskriptoms als die Transkriptionsregulation durch Promotoraktivität. Darüber hinaus schienen auch viele andere Organe wie Niere, Herz, Fettgewebe, Netzhaut, Muskel, Lunge, Neokortex und Rückenmark deutlich reich an Genen zu sein, die zum RNAPII-Stillstand neigen, was zeigt, dass viele Organe altersbedingten Transkriptionsstress aufweisen, was die Überlappung erklärt Genexpressionsmuster und hat auch einen größeren Einfluss auf die Genexpression als die altersbedingte Promotorregulation. Nicht alle Organe zeigten eine mRNA-Transkriptionsstresssignatur. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass unsere Liste der Transkriptionsstress-Abfragegene auf leberspezifische Gene ausgerichtet ist und/oder dass einige Organe weniger anfällig für Transkriptionsverzögerungen sind; Letzteres stimmt mit der segmentalen Natur des Phänotyps vorzeitiger Alterung bei TCR-Syndromen und entsprechenden mutierten Mäusen überein34,36. Proliferative Gewebe, zum Beispiel hämatopoetische Stammzellen, Haut und Darm, schienen weniger anfällig zu sein, was durch die Fähigkeit der DNA-Replikation erklärt werden kann, blockierte DNA-Schäden durch RNAPII aufzulösen, wodurch Läsionen vor der Reparatur durch andere Mechanismen geschützt werden20. Darüber hinaus mildert die Zellteilung DNA-Schäden und ermöglicht möglicherweise auch eine Reparatur. Daher identifizierten wir Transkriptionsstress als Hauptfaktor für die Gestaltung altersbedingter Transkriptome und als allgemeinen Alterungsphänotyp in vielen Geweben und Arten.

Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass transkriptionsblockierende DNA-Schäden während des normalen Alterns zu häufigen genomweiten, sich verlängernden RNAPII-Störungen führen, was zu einer verringerten, von der Genlänge abhängigen Transkriptionsleistung führt, was zu einer Fehlregulation vieler Wege führt, von denen bekannt ist, dass sie das Altern beeinflussen (Abb. 7). Basierend auf Ähnlichkeiten beim Transkriptionsstopp in UV-behandelten Zellen38 schätzen wir, dass ein anfängliches RNAPII, das auf einer Läsion blockiert ist, etwa drei nachfolgende RNAPII-Komplexe blockiert, was zu einer Warteschlange führt. Die zugrunde liegenden Mechanismen, die für altersbedingte Genexpressionsveränderungen verantwortlich sind, sind weitgehend unbekannt und werden oft auf aktive Regulierungsmechanismen wie die Promotorregulierung zurückgeführt8, auch in DNA-Reparaturmutanten-Mausmodellen mit vorzeitiger Alterung17. Wir vermuten jedoch, dass passiver Transkriptionsstress durch DNA-Schäden in Kombination mit der Genarchitektur, also der Genlänge, einen wesentlichen Teil dieser Veränderungen ausmacht.

Modell, das das Abwürgen von RNAPII durch DNA-Schäden und seine Folgen für das Altern beschreibt.

Jede Zelle kann bis zu 100.000 DNA-Läsionen pro Tag erleiden53, von denen die meisten schnell durch spezielle Reparaturprozesse repariert werden. DNA-Schäden als Ursache des Alterns basieren zu einem großen Teil auf vorzeitigen Alterungssyndromen mit zugrunde liegender Genominstabilität, wie dem TCR-defekten Cockayne-Syndrom und der Trichothiodystrophie, die eine kurze Lebensdauer und viele vorzeitige Alterungsmerkmale vor allem in postmitotischen Geweben aufweisen. Entsprechende Mausmodelle34,35,54 zeigen mRNA-Transkriptome, die sich deutlich mit denen älterer WT-Mäuse überschneiden18,19. Wir zeigen nun, dass passiver Transkriptionsstress anstelle einer aktiven Genregulation für die Gestaltung des alternden Transkriptoms verantwortlich ist. Obwohl wir nicht alle mutmaßlichen Gründe ausschließen konnten, die den beobachteten Transkriptionsstress-Phänotyp erklären, identifizierten wir in RNAPII-ChIP-seq-Daten von Lebern im WT-Alter eine Tendenz zum nicht transkribierten Strang, was darauf hindeutet, dass transkriptionsblockierende DNA-Schäden in Matrizensträngen die wahrscheinlichste Ursache dafür sind RNAPII blockiert. Obwohl sich DNA-Schäden während des Alterns anhäufen, war bisher unklar, ob diese Werte ausreichen, um Alterungsreaktionen in WT-Organismen hervorzurufen. Mögliche endogene transkriptionsblockierende Läsionen, Aldehyde21, fortgeschrittene Glykationsendprodukte22 und Cyclopurine23,24,25, können sich in gealterten Organen in ausreichender Menge ansammeln, um den beobachteten Transkriptionsstress zu erklären. Daher führt eine spontane, endogene DNA-Schädenakkumulation, ähnlich dem progeroiden Cockayne-Syndrom und der Trichothiodystrophie, zu Transkriptionsstress im normalen Alterungsprozess.

Unsere Daten zeigen, wie DNA-Schäden durch Transkriptionsstress zum Altern führen. Transkriptionsstress bestimmt weitgehend die Alterungsexpressionsprofile in mehreren Organen, wirkt sich auf die Organfunktion aus und verursacht insbesondere die Funktionsstörung vieler alterstypischer Signalwege. Darüber hinaus könnte die stochastische Natur von DNA-Läsionen das Transkriptionsrauschen erklären, das mit zunehmendem Alter zunimmt4,5,6. Transkriptionsstress könnte die Zellfunktion weiter beeinflussen, indem er den Verlust der Proteinkomplex-Stöchiometrie fördert, ein Phänotyp, der bei gealterten Killifischen55 und C. elegans56 beobachtet wird. Auch eine unausgeglichene Expression großer und kleiner Gene aufgrund transkriptionsblockierender Läsionen in Zellkulturen kann zum Zelltod führen und wurde als vorzeitiges Alterungssignal beim Cockayne-Syndrom angesehen57. Schließlich ist das Abwürgen von RNAPII auch ein direkter Hinweis auf das Altern. Die genetische Analyse von TCR und entsprechenden erblichen Syndromen weist darauf hin, dass die molekularen Folgen von TCR-Mutationen mit der Schwere der vorzeitigen Alterung korrelieren20. TCR-Defekte, die RNAPII auf DNA-Läsionen dauerhaft blockieren, führen zu schwerwiegenderen Formen der beschleunigten Alterung als Reparaturdefekte, die die Läsion weiterhin für andere Reparaturwege zugänglich machen20. Dies wurde außerdem bei mutierten Mäusen mit einer Punktmutation in RNAPII nachgewiesen, die die durch DNA-Schäden verursachte Ubiquitinierung aufhebt, die erforderlich ist, um blockiertes RNAPII aus einer DNA-Läsion zu entfernen, die eine verkürzte Lebensdauer und vorzeitige Alterung aufwies38. Das Anhalten von RNAPII auf einer DNA-Läsion führt zur Bildung einer R-Schleife und zur Aktivierung des DNA-Schadenskontrollpunkts ATM42, der Zelltod oder Seneszenz induzieren kann58 und damit einen Mechanismus liefert, wie das Anhalten von RNAPII zum Altern führt. R-Loops nehmen in den Augen gealterter Fruchtfliegen zu, vorwiegend in langen Genen59, was einen weiteren Beweis für dieses Szenario liefert. Wir zeigen, dass etwa 40 % aller sich verlängernden RNAPII-Komplexe durch DNA-Schäden in Lebern im WT-Alter blockiert werden; Somit tritt das identische Alterungssignal, das Progeroid-Syndrome verursacht, auch beim normalen Altern auf. Interessanterweise zeigten Gehirne von Patienten mit Alzheimer-Krankheit im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollpersonen auch eine verringerte Expression langer Gene60, was darauf hindeutet, dass das Ausmaß des Transkriptionsstresses an der Ätiologie der altersbedingten Krankheit beteiligt ist. Umgekehrt stellt eine lebensfördernde Ernährungseinschränkung den Verlust der langen Genexpression wieder her29, was darauf hindeutet, dass Langlebigkeitsinterventionen Transkriptionsstress lindern können. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die Anhäufung endogener DNA-Läsionen mit zunehmendem Alter Transkriptionsstress auslöst, der altersbedingte Genexpressionsprofile in vielen Organen und Geweben prägt, über weite evolutionäre Distanzen vorhanden ist und erklären kann, wie die Anhäufung von DNA-Schäden zu einem Funktionsverlust führt und dadurch die Primärfunktion stärkt Rolle für DNA-Schäden im Alterungsprozess16,17.

Die Unterbringung und Experimente mit Mäusen wurden gemäß dem Tierschutzgesetz der niederländischen Regierung, dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den von der niederländischen Ethikkommission genehmigten Richtlinien in voller Übereinstimmung mit der europäischen Gesetzgebung durchgeführt. Die institutionelle Ethikkommission für Tierpflege und -nutzung genehmigte alle Tierprotokolle. Männliche WT-Mäuse (Mus musculus) im F1 C57BL6J/FVB (1:1)-Hybridhintergrund wurden im Alter von 15 Wochen und 104 Wochen eingeschläfert. WT C57BL6J- und FVB-Stämme werden häufig von den Jackson Laboratories bezogen, um einen standardmäßigen genetischen Hintergrund aufrechtzuerhalten. DNA-Reparatur-defiziente vorzeitig alternde Mausmodelle, die in Haus- und WT-Wurfgeschwistern im F1 C57BL6J/FVB (1:1)-Hybridhintergrund erzeugt wurden, wurden nach 4 und 10 Wochen für Ercc1Δ/−-Mutanten eingeschläfert35; und 7 und 14 Wochen für Xpg−/− Mutanten34. Alle Tiere wurden mit synthetischen AIN93G-Pellets (Research Diet Services; Bruttoenergiegehalt 4,9 kcal g–1 Trockenmasse, verdauliche Energie 3,97 kcal g–1) gezüchtet und gehalten. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung (20–22 °C, 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus) gehalten und einzeln in einzelnen belüfteten Käfigen unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen im Animal Resource Center (Erasmus University Medical Center) gehalten. Zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen wurden keine statistischen Methoden verwendet, aber unsere Stichprobengrößen ähneln denen in früheren Veröffentlichungen8,18,26,29,38,41. Die Datenerhebung und -analyse erfolgte nicht blind gegenüber den Versuchsbedingungen und eine Randomisierung der Tiere in Versuchsgruppen war nicht anwendbar. In keiner Analyse wurden Tiere aus den Versuchsgruppen ausgeschlossen.

Um die durch endogene DNA-Schäden induzierte De-novo-RNA-Synthese zu bewerten, wurden Ercc1∆/−, mit 10 % FCS und 1 % PS bei 5 % CO2 und 3 % O2.

Mäusen wurde intraperitoneal 0,088 mg 5-EU (AXXORA) pro Gramm Körpergewicht injiziert. Fünf Stunden nach der intraperitonealen Injektion wurden die Mäuse eingeschläfert. Gewebeproben wurden für die Fluoreszenzfärbung mit Formalin fixiert oder für die RNA-Isolierung und ChIP-Experimente eingefroren.

Aus in Paraffin eingebetteten, formalinfixierten Leberstücken wurden 3–5 µm große Scheiben geschnitten. Die Schnitte wurden auf Objektträger (Superfrost Ultra Plus Adhesion Slides, Thermo Fisher Scientific) montiert. Für die RNAPII-Färbung wurden die Proben mit Xylol entparaffiniert, mit einem Alkoholgradienten rehydratisiert und vor der Antigengewinnung mit Milli-Q-Wasser gewaschen (30 Minuten in Citratpuffer, pH 6). Die verwendeten Antikörper waren: Alexa Fluor 594-RPB1-Antikörper (in einer Verdünnung von 1:250), der alle Formen von RNAPII unabhängig vom Phosphorylierungsstatus ihrer CTD erkennt (Kat.-Nr. 664908, BioLegend); RNAPII-ser2p (Kat.-Nr. ab5095, Abcam); RNAPII-ser5p (Kat.-Nr. ab5131, Abcam); Phospho-ATM (Ser1981, Kat.-Nr. 4526, Cell Signaling Technology); und Phosphohiston H2A.X (Ser139, Kat.-Nr. 9718; Cell Signaling Technology), alle in einer Verdünnung von 1:500. Um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren, wurde ein Maus-an-Maus-Detektionskit verwendet (Kat.-Nr. BMK-2202, Vector Laboratories). Die Schnitte wurden mit DAPI oder Hoechst 33342 gegengefärbt.

Nach den xylolbasierten Paraffinentfernungs- und Rehydratisierungsschritten (der Antigengewinnungsschritt wurde für die EU-Färbung weggelassen) verwendeten wir das Click-iT RNA Alexa Fluor 488 Imaging Kit (Kat.-Nr. c10329; Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Standard-Immunfluoreszenzprotokoll . Die Bilder wurden mit einem ZEISS LSM 700-System aufgenommen. Die Intensität der Färbung mit entstehender RNA wurde durch Berechnung der integrierten Dichtewerte für jede Kernfärbung mit der Fiji-Software61 quantifiziert. Die statistische Signifikanz wurde aus normalisierten Fluoreszenzintensitätswerten unter Verwendung eines ungepaarten Student-t-Tests in Prism Version 7.04 (GraphPad Software) berechnet. Für die EU-markierte naszierende RNA-Färbung in vitro wurden Zellen auf Deckgläsern gezüchtet. In konfluenten Wachstumsschalen wurde das Medium durch frisches Medium, ergänzt mit 1 % FCS, ersetzt und (sofern angegeben) für die angegebene Zeit auf 20 % O2 umgestellt. Das Medium wurde zweimal pro Woche erneuert. Um die De-novo-RNA-Synthese nach der UVC-Behandlung zu messen, wurden Ercc1∆/−- und WT-MDFs (beide C57BL6J/FVB F1-Hybridhintergrund) bis zur Konfluenz kultiviert und wie oben beschrieben aufrechterhalten, gefolgt von UVC-Bestrahlung (0, 2, 4 und 6 J m−). 2 UVC) mit einer keimtötenden 254-nm-Lampe (Philips). Die Tests wurden 24 Stunden später durchgeführt, damit sich die MDFs von den unmittelbaren Transkriptionseffekten in trans erholen konnten. Um ihr Transkriptionsniveau zu bestimmen, wurde dem Medium 1 Stunde lang 1 mM EU zugesetzt, bevor die Zellen zur vollständigen RNA-Extraktion gesammelt oder zur Fluoreszenzfärbung fixiert wurden. Die Zellen wurden mit eiskalter Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gewaschen und 20 Minuten lang auf Eis in 4 % Formalin fixiert. Anschließend wurden die Zellen in 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBS gewaschen und mit 0,5 % Triton X-100 in TBS 20 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Anschließend wurden die Deckgläser zweimal mit 3 % BSA in TBS gewaschen und 30 Minuten mit Click-iT-Reaktionsmix (Invitrogen) inkubiert. Nach der Click-iT-Reaktion wurden die Zellen einmal mit 3 % BSA in TBS und einmal mit TBS gewaschen, bevor sie 30 Minuten lang in TBS mit 1:1.000 Hoechst 33342 inkubiert wurden. Die Proben wurden mit Prolong Diamond (Invitrogen) montiert. Die Bilder wurden mit einem LSM700 ZEISS-Mikroskop aufgenommen und die EU-Färbeintensität in Kernen wurde mit Fiji quantifiziert (Bild J 1,53q).

Die Gesamt-RNA wurde aus schockgefrorenen Leber- und Nierenschnitten oder abgekratzten Zellen mit dem miRNeasy-Kit (QIAGEN) einschließlich des On-Column-DNase-Schritts (RNase-Free DNase Set, QIAGEN) isoliert. Die Qualität und Quantität der RNA wurde mit dem Bioanalyzer (Agilent Technologies) geschätzt und für weitere Analysen wurde nur hochwertige RNA (RNA-Integritätszahl >8) verwendet. Die Gesamt-RNA-Sequenzierung wurde wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt62. Um EU-markierte naszierende RNA selektiv zu isolieren, verwendeten wir das Click-iT nascent RNA Capture Kit (Kat.-Nr. c10365, Thermo Fisher Scientific): Biotinazid wurde mithilfe der Click-iT-Chemie an die Ethylengruppen der EU-markierten RNA gebunden . Die EU-markierte entstehende RNA wurde mit MyOne Streptavidin T1-Magnetkügelchen gereinigt. Eingefangene EU-RNA, die an Streptavidin-Kügelchen gebunden war, wurde sofort der Generierung einer On-Bead-Sequenzierungsbibliothek unter Verwendung des TruSeq-mRNA-Probenvorbereitungskits v2 (Illumina) gemäß den Protokollen des Herstellers mit Modifikationen unterzogen. Die ersten Schritte des Protokolls wurden übersprungen; Komplementäre DNA (cDNA) direkt auf den Kügelchen wurde durch Reverse Transkriptase (Super-Script II) unter Verwendung zufälliger Hexamer-Primer synthetisiert. Die cDNA-Fragmente wurden dann durch eine Endreparaturreaktion mit glatten Enden versehen, gefolgt von einem dA-Tailing. Anschließend wurden spezifische doppelsträngige Barcode-Adapter ligiert und eine Bibliotheksamplifikation über 15 Zyklen durchgeführt. PCR-Bibliotheken wurden gereinigt, auf einem Agilent Bioanalyzer unter Verwendung des DNA1000-Assays gemessen, in gleichen Konzentrationen gepoolt und auf einem HiSeq 2500 jeweils drei in einer Spur sequenziert.

Schockgefrorene Leber wurde in eiskaltem PBS zerkleinert, in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert und durch ein Zellsieb (Falcon) filtriert. Nach Zugabe von Formaldehyd (insgesamt 1 %) wurde das Homogenat 10 Minuten lang auf Eis geschüttelt und mit Glycin gequencht. Pelletiertes Homogenat wurde mit eiskaltem PBS gewaschen, in Zelllysepuffer (0,25 % Triton 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und in Kernlysepuffer (0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 8,0, vollständig EDTA-frei und PhosSTOP) resuspendiert. Die Proben wurden mit einem Dounce-Homogenisator weiter homogenisiert und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Kernfraktion wurde in Ultraschallpuffer (50 mM HEPES, pH 7,8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % Natriumdesoxycholat, 1 % Natriumdodecylsulfat, vollständig EDTA-frei und PhosSTOP) resuspendiert. Das Chromatin wurde mit einem Bioruptor-Ultraschallgerät (Diagenode) in Fragmente von 100–500 bp beschallt und zentrifugiert, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Aus dem Überstand wurden 15 µg Chromatin für eine Runde Immunpräzipitation verwendet. Für ChIP-seq wurden fünf Proben gepoolt. Für den Immunpräzipitationsschritt wurden Dynabeads M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG-Beads verwendet. Chromatinproben wurden 2 Stunden lang bei 4 °C mit Perlen vorgeklärt. Die vorgereinigten Chromatinproben wurden über Nacht bei 4 °C mit den RNAPII-Antikörpern rotiert: RNAPII-ser2p, RNAPII-ser5p oder RNAPII RPB1-NTD-spezifischer Antikörper (Klon D8L4Y, Cell Signaling Technology). Den Proben wurden 2 Stunden lang Dynabeads zugesetzt, um Protein-DNA-Komplexe abzubauen. Nach der Immunpräzipitation wurden die Proben zweimal mit den folgenden Puffern gewaschen: Ultraschallpuffer, zweimal mit Puffer A (50 mM HEPES, pH 7,8, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS). , komplett EDTA-frei und PhosSTOP), zweimal mit Puffer B (20 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, komplett EDTA-frei und PhosSTOP) und abschließend zweimal mit Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Die gebundene Fraktion des Chromatins wurde mit dem IPURE DNA Recovery for ChIP Kit (Diagenode) isoliert. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem Illumina TruSeq ChIP Library Prepared Kit erstellt. Die Proben wurden auf der HiSeq 4000-Plattform sequenziert.

EU-seq-Lesevorgänge wurden mit der Qualitätskontrollsoftware FastQC v.0.11.9, FastQScreen v.0.14.0 und Trimmomatic v.0.35 (Ref. 63) unter Verwendung der Parameter vorverarbeitet: SLIDINGWINDOW:4:15 LEADING:3 TRAILING:3 ILLUMINACLIP :adapter.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden nacheinander mit der ribosomalen DNA der Maus (BK000964.3), den mitochondrialen Sequenzen (UCSC, mm10) und dem Referenzgenom der Maus (GRCm38/mm10) unter Verwendung von Tophat2 v.2.0.9 (Ref. 64) mit den Standardeinstellungen außer verglichen die Option -g 1. ChIP-seq-Reads wurden mit Bowtie65 v.2.1.0 an das mm10-Maus-Referenzgenom angepasst. Der öffentliche Gesamt-RNA-seq-Datensatz verwendete denselben Kartierungsalgorithmus wie EU-seq unter Verwendung des entsprechenden Referenzgenoms (hg19 und ce10), um die entstehende RNA-Dynamik beim Altern zwischen Arten zu untersuchen. Auf die anderen öffentlichen Daten wurde derselbe Zuordnungsalgorithmus wie bei ChIP-seq angewendet.

Alle RefSeq-Gene (Release: 95), Exons und Introns wurden aus dem UCSC Genome Browser66 extrahiert und die Genlisten wurden auf das längste Transkript für jedes Gen reduziert. Gene mit Regionen, die ein anderes kodierendes oder nichtkodierendes Gen überlappen, wurden entfernt. Daher wurden für die weitere Analyse Gene verwendet, die nur Regionen aufweisen, die für ein bestimmtes RefSeq-Gen einzigartig sind. In einigen Experimenten, wie in dieser Studie angegeben, wurden bestimmte genomische Regionen (von TSS bis 1 kb stromabwärts; nur intronische Regionen; von TSS bis 20 kb stromabwärts; 3′UTR; erstes und letztes Exon exprimierter Gene; um die TSS-Region (–0,75 kb) bis +0,75 kb und −0,3 kb bis +0,3 kb) wurden auf die gleiche Weise erzeugt. Um den produktiven Verlängerungsprozess pro Gen zu untersuchen, wurden genomische Regionen um das TSS und TTS der Gene in k proportionale Bins unterteilt (standardmäßig k = 20). ; Aufgrund der Datenqualität in verschiedenen Datensätzen variiert die Anzahl der Bins (Details folgen)). Gene mit einer Länge von weniger als 10 kb wurden aus der Studie entfernt, um zu vermeiden, dass zu viele Lesevorgänge auf kurze Gene abgebildet werden, die Bins in der Gen-Proportional-Elongationsanalyse überlappen .

Es wurde eine Python-Pipeline (K_bining.py) erstellt, die ausgerichtete RNA/EU/ChIP-seq-Lesevorgänge im BAM/BW-Format als Eingabe zur Quantifizierung von Lesevorgängen in der Transkriptionsverlängerungsregion von Genen verwendet, und HTSeq wurde zur Lesequantifizierung in den oben genannten genomischen Regionen durchgeführt . Reads pro Million (RPM) wurden angewendet, um verschiedene Sequenzierungsbibliotheken zu normalisieren und technische Abweichungen (insbesondere Sequenzierungstiefe) in weiteren Studien auszuschließen. Der Gensatz „Alle Gene“ umfasst alle Gene mit mindestens einer Lesekartierung in der ersten Kilobase. Es wurde ein Gensatz mit Genen erstellt, die in jedem der 20 Bins mindestens 1 RPM aufweisen, und als „alle exprimierten Gene“ bezeichnet. Um die Leseverteilung über Genkörper hinweg zu untersuchen und aufgrund der Sequenztiefe und Datenqualität, wurden für jede EU-seq- und öffentliche Gesamt-RNA-Datensatzsammlung unterschiedliche Anzahlen von Bins (k) und die Anzahl aller exprimierten Gene (n) ausgewählt. Daher enthält der Satz „Alle exprimierten Gene“ in der WT-Alterung: n = 3.970 Gene und wurde in k = 20 Bins unterteilt (> 90 % aller EU-seq-Reads werden diesen Genen zugeordnet). Ercc1Δ/− Mäuse (k = 20, n = 2.430); Xpg−/− Mäuse (k = 20, n = 3.842); UV-behandelte Ercc1Δ/− MDFs (k = 10, n = 1974); WT alternde Niere (k = 20, n = 2.135); menschliche Sehne (k = 5, n = 773); C. elegans (k = 5, n = 2.872). Um die WT-Alterungs-EU-seq-Daten mit den entsprechenden RNAPII-ChIP-seq-Daten (aus derselben Leber generiert) abzugleichen, wurden auch die entsprechenden Gene aus dem Gensatz „Alle exprimierten Gene“ in den RNAPII-ChIP-seq-Datensätzen ausgewählt. Der intraprobenspezifische Hintergrund wurde durch Berechnung der Messwerte in den intergenen Regionen bestimmt und proportional entfernt. Das gesamte Hintergrundsignal wurde unter Verwendung der DNA-Eingabeproben subtrahiert. Um die „alle exprimierten Gene“ (n = 3.970) bei der WT-Alterung biologisch zu definieren, führten wir eine k-Mittelwert-Clusteranalyse in Kombination mit EU-seq- und gesamten ChIP-seq-Werten zwischen erwachsenen und alten Proben durch. Unter dem in den erweiterten Daten in Abb. 3a beschriebenen Kriterium haben wir die vier Hauptmuster, die in der k-Mittelwert-Clusteranalyse gefunden wurden, als vier biologische Gruppen definiert: Promotor-hochregulierte Gene, n = 778 (EU-seq- und RNAPII-ChIP-seq-Spiegel stiegen über drei an Mülleimer); Vom Promotor herunterregulierte Gene, n = 394 (EU-seq- und RNAPII-ChIP-seq-Spiegel verringerten sich über drei Bins); GLPThigh-Gene, n = 914 (steile progressive Abnahme des EU-seq-Levels, steile Erhöhung des RNAPII-ChIP-seq-Levels über drei Bins hinweg); Restgene, n = 1.884 (leichter progressiver Rückgang auf EU-seq-Ebene, leichter RNAPII-ChIP-seq-Anstieg über drei Bins hinweg). Um den Zusammenhang zwischen Genlänge und Transkriptionsstress-Phänotyp zu untersuchen, wurden die exprimierten Gene (n = 3.970) in WT-Mäusen entsprechend ihrer Länge in sechs Gruppen eingeteilt, die jeweils eine ähnliche Anzahl an Genen enthielten: 10–22 kb (n = 662, Durchschnitt = 16,47 kb, Median = 16,75 kb); 22–30 kb (n = 644, Durchschnitt = 26,87 kb, Median = 26,94 kb); 30–50 kb (n = 788, Durchschnitt = 40,19 kb, Median = 39,68 kb); 50–70 kb (n = 587, Durchschnitt = 59,18 kb, Median = 59,02 kb); 70–110 kb (n = 643, Durchschnitt = 87,93 kb, Median = 86,75 kb) und > 110 kb (n = 646, Durchschnitt = 199,47 kb, Median = 160 kb). In Zahlen zur Messung des Genklassenverhaltens haben wir zunächst das durchschnittliche Signal von n = 3 Mäusen pro Gen berechnet und anschließend das Signal für alle Gene in der Genklasse gemittelt.

Genontologie- und funktionelle Clustering-Analysen von TShigh-Genen wurden mithilfe mehrerer Datenbanken und Software durchgeführt: Ingenuity Pathway Analysis, GSEA v.4.2.2, das auch die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Reactome Pathway Databases und Aging Perturbations von GEO umfasst und die Down-Datensätze von Enrichr27,28,67,68. Datensätze in den Alterungsstörungen von GEO und den Down-Datensätzen von Enrichr wurden nur einbezogen, wenn junge/erwachsene Organe > 8 Wochen, alte > 14 Monate und der Altersunterschied zwischen jungen/erwachsenen und betagten Organen > 6 Monate beträgt (Maus, Ratte); Das menschliche Alter ist >56 Jahre mit einem Altersunterschied von mindestens >12 Jahren. Wir haben einen Schwellenwert von FDR < 0,05 angenommen. Aggregierte P-Werte für die wichtigsten identifizierten biologischen Prozesse wurden berechnet, indem die P-Werte der entsprechenden erkannten Unterpfade mithilfe des exakten Fisher-Tests kombiniert wurden.

Das RNAPII-Reiseverhältnis ist das Verhältnis zwischen RNAPII auf dem TSS und RNAPII im ersten 1-kb-Genkörper bei alten und erwachsenen Menschen. Der Gesamt-RNAPII-Dichtewert um das TSS (±300 bp) wurde durch den Gesamt-RNAPII-Dichtewert auf dem ersten 1-kb-Genkörper dividiert, gemessen ab 300 bp stromabwärts von TSS für jedes Gen. Um die entstehende RNA-Synthese aus der ersten 1-kb-Region der ersten Introns oder vom TSS bis 1 kb stromabwärts aller Gene zwischen Lebern erwachsener und alter Mäuse zu vergleichen, wurden alle Datensätze nur basierend auf der Lesetiefe der Sequenzierung normalisiert, ohne die ungefähren Werte zu korrigieren 1,5-fach reduzierte Anzahl intronischer Sequenzen in gealterter Leber. Um die Verlängerung der produktiven Transkription zu messen, wurden alle exprimierten Gene in k proportionale Bins unterteilt, in denen die mittlere Lesezahl aus dem EU-seq- und RNAPII-ChIP-seq-Datensatz berechnet wurde. Anschließend wurden die Zählungen auf den ersten Behälter normiert und aufgezeichnet. Die prozentualen Dichteänderungen pro Behälter wurden wie folgt berechnet: alt (Lesezahl) / Erwachsener (Lesezahl) × 100 %. Da das erste und letzte Bin das Signal am TSS enthält, in dem eine proximale Pause des RNAPII-Promotors vorliegt, und das TTS, in dem sich RNAPII ansammelt, haben wir die mittleren 18 Bins als Transkriptionsverlängerungsphase definiert. Die 3-Bin-Heatmap wird aus den 18-Bin-Daten abgeleitet, indem 6 aufeinanderfolgende Bins aggregiert und log2-fache Änderungen jedes Gens zwischen alten und erwachsenen Proben sowohl für EU-seq- als auch für gesamte RNAPII-ChIP-seq-Reads berechnet werden. Um den prozentualen Anstieg des RNAPII-Stillstands oder der unproduktiven RNAPII in gealterten Lebern zu bestimmen (Extended Data Abb. 3f), gingen wir von einer Grundlinie in erwachsenen Lebern aus, bei der der gesamte Gehalt an entstehender RNA in der Elongationsphase (18 Behälter) das Ergebnis des gesamten RNAPII ist Ebenen in der Elongationsphase (18 Bins). Die mittlere Beziehung über n = 3 Mäuse wird als Basislinie festgelegt. Da es in gealterter Leber zu einem Anstieg der RNAPII-Spiegel und einer Verringerung der entstehenden RNA-Spiegel im gesamten Genkörper kommt, wurde die erwartete Anzahl der gesamten RNAPII-ChIP-seq-Reads berechnet, die diese entstehenden RNA-Spiegel basierend auf der Basislinie der erwachsenen Leber unterstützen sollten ist das Verhältnis der EU-seq-Lesezahlen und der gesamten RNAPII-ChIP-seq-Lesezahlen in der Elongationsphase (18 Bins). Anschließend wurde die beobachtete Gesamtzahl der RNAPII-ChIP-seq-Lesevorgänge pro Probe in jeder gealterten Leberprobe bestimmt. Dann subtrahierten wir die erwartete Gesamtzahl der RNAPII-ChIP-seq-Lesevorgänge von der beobachteten Gesamtzahl der RNAPII-ChIP-seq-Lesevorgänge und dividierten diese durch die erwartete Lesezahl in der gealterten Leber: RNAPII-Stillstand im Alter (%) = (beobachtete RNAPII-Lesezahl − erwartet). RNAPII-Leseanzahl) / erwartete RNAPII-Leseanzahl × 100 %. Um die Nukleotidzusammensetzung zu analysieren, wurden die obersten 50 Gene von GLPThigh und die untersten 50 der restlichen Gene im Längenbereich von 70–110 kb ausgewählt und in 35 Bins von TSS bis TSS + 70 kb (2 kb pro Bin) unterteilt. Der Prozentsatz der Nukleotidzusammensetzung (Cytidin, Thymin, Adenin und Guanin) wurde mit Qualimap v.2.21 (Ref. 69) bestimmt. Das Transkriptionsfehlerverhältnis in den EU-seq-Datensätzen wurde mit BioConductor seqTools (R v.1.2.0. und IRanges-Pakete)70 berechnet. Die Gesamtfehlerraten wurden als Prozentsatz der gesamten Lesevorgänge mit einer nicht übereinstimmenden Basis an jeder Leseposition während des Ausrichtungsschritts berechnet. Die Analyse der EU-seq-Lesehäufigkeit an Spleißdonor- und -akzeptorstellen wurde mithilfe eines speziell geschriebenen Skripts durchgeführt: Splicingdonor&acceptorfinder.py, in dem die Expressionswerte von ±49 bp um die Spleißdonor- und -akzeptorstelle für alle ausgewählten Gene erfasst wurden HTSeq v.0.6.0. Alternative Spleißereignisse wurden von Astalavista v.4.0 (Ref. 71) mit Standardeinstellungen erkannt. Der DNA-Methylierungsstatus wurde von Qualimap v.2.21 und deepTools v.2.0 (Ref. 72) erkannt. Durchschnittliche RNAPII-Profile an Promotoren (±750 bp um das TSS) und durchschnittliche Histonmodifikationsprofile (H3K27ac, H3K4me3 und DNA-Methylierung) an TSS und Genkörpern wurden mit der Software HOMER v.4.11 (Befehl annotatePeak.pl)73 aufgezeichnet.

Um die Anzahl der auf einer Läsion blockierten RNAPII im Vergleich zur Warteschlange hinter der ursprünglich blockierten RNAPII zu berechnen, haben wir zunächst die Anzahl der DNA-Läsionen in unserem Datensatz exprimierter Gene geschätzt, der eine Gesamtlänge von 280.010.046 bp aufweist. Bei einer Läsionsdichte von 1,6 pro 100.000 bp in einem diploiden Genom erwarten wir etwa 8.960 DNA-Läsionen. Da DNA-Läsionen sowohl auf dem kodierenden Strang als auch auf dem Matrizenstrang gleichermaßen vorkommen und letzterer nur für die Blockierung von RNAPII wichtig ist, gibt es 4.480 DNA-Läsionen im Matrizenstrang des ausgewählten Gensatzes. Wenn wir davon ausgehen, dass alle DNA-Läsionen einen RNAPII-Komplex blockieren und wir schätzungsweise 18.000 blockierte RNAPII-Komplexe pro Zelle haben, schätzen wir, dass für jedes auf einer DNA-Läsion blockierte RNAPII drei RNAPII-Komplexe in der Warteschlange stehen. Die Strang-Bias-Analyse in den RNAPII-ChIP-seq-Daten wurde wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt38 und basiert auf der Beobachtung, dass die PCR-Amplifikation von RNAPII-ChIP-seq-Bibliotheken in Richtung des kodierenden Strangs tendiert, wenn in der Vorlage eine transkriptionsblockierende DNA-Läsion vorhanden ist Strang, an dem RNAPII blockiert ist, mit einigen Modifikationen. Wir haben zunächst überwacht, ob unser spezifisches ChIP-seq-Protokoll einen Strang-Bias erkennen kann, und haben die Analyse optimiert, indem wir unsere zuvor veröffentlichten RNAPII-ChIP-seq-Daten nach der UVB-Behandlung verwendet haben74. Kurz gesagt, Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge von RNAPII ChIP-seq wurden von SAMtools v.1.9 (Ref. 75) getrennt und verarbeitet und von BEDtools v.2.27.1 (Ref. 76) gezählt. Für jedes Gen im ausgewählten Gensatz haben wir zunächst die Ausrichtung des Matrizenstrangs (Vorwärts-/Rückwärtsstrang) korrigiert, da sich Gene sowohl auf dem Vorwärts- als auch auf dem Rückwärtsstrang befinden. Anschließend berechneten wir für jedes Gen im Datensatz die Fraktionsverzerrung in Richtung des kodierenden Strangs und anschließend wurde die Strangverzerrung für alle exprimierten Gene im Gensatz berechnet.

In-vitro-Experimente basieren auf Dreifachversuchen unabhängiger Experimente und die Diagramme werden als Mittelwerte dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten statistischen Tests und Quantifizierungen sind in den entsprechenden Teilen des Haupttextes, in den Abbildungslegenden oder in den Methoden beschrieben. Es wurde angenommen, dass die Datenverteilung normal sei, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet. Alle statistischen Tests wurden mit Prism oder den in R implementierten Paketen oder Funktionen (edgeRpackage- und fisher.test-Funktionen) durchgeführt, mit Ausnahme der Anreicherungsanalyse mit GSEA, Enrichr und Ingenuity Pathway Analysis, die von ihren Webanwendungen durchgeführt und ausführlich beschrieben wurden.

Es wurde ein statistischer und probabilistischer Rahmen für die EU-Inkorporation für einen Bereich von Abständen zwischen EU-Molekülen und im Falle einer 1,5-fachen Reduzierung für einen Bereich von EU-Inkorporations-Abstandsunterschieden erstellt. Die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens ein EU in entstehende RNA eingebaut wird, wurde in einer Situation modelliert, in der es aufgrund einer geringeren oder langsameren Aufnahme oder Verarbeitung zu einer 1,5-fachen Verringerung des EU-Einbaus in alten Mäuselebern kommt. Die Annahmen waren: (1) Da es bei der Click-iT-Reaktion einen mindestens 400-fachen Überschuss an Biotin für jedes eingebaute EU in entstehender RNA gibt, ist die Reaktion gesättigt oder folgt der gleichen Asymptote; (2) nur ein EU-Einbau pro RNA-Molekül reicht aus, um dieses spezifische Molekül zu isolieren; (3) Der EU-Einbau ist ein stochastischer Prozess, bei dem die Konzentration des verfügbaren EU im gesamten Nukleotidpool linear mit dem Abstand zwischen EU-Molekülen in den entstehenden RNAs korreliert. Wenn zwischen erwachsenen und alten Mäusen ein EU-Verfügbarkeitsunterschied besteht, ist zu erwarten, dass bei kurzen RNA-Arten (≤ 300 Nukleotide) die Wahrscheinlichkeit mindestens eines EU-Einbaus deutlich geringer ist und wir daher empirisch einen geringeren Prozentsatz der Sequenz-Read-Mappings beobachten würden solche kleinen RNA-Spezies in gealterter Leber. Der Prozess der EU-Integration wurde mittels eines Poisson-Prozesses in entstehende RNA-Arten modelliert. Konkret kann man sich die Anzahl der EU-Einbauten in entstehende RNA als einen Poisson-Prozess vorstellen, nicht in der Zeit, wie es allgemein verwendet wird, sondern in der Länge, gemessen in Nukleotiden. Wenn X(t) ein Poisson-Prozess ist, lautet die Wahrscheinlichkeit, dass es in einem Zeitintervall (0, t) kein Ereignis gibt, mathematisch exp(-λt), wobei λ die Intensität des Poisson-Prozesses ist. Ebenso ist die Wahrscheinlichkeit, dass es im Zeitintervall (0,t) mindestens ein Ereignis gibt, somit 1 − exp(-λt). Für jede RNA-Art in unseren angegebenen RNA-Längenklassen, die in den EU-seq-Datensätzen identifiziert wurde, wurde anschließend die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens eine EU eingebaut wurde, mithilfe der obigen Formel berechnet. Da \(1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over x}}} > 1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over y} }}\) Für alle x < y weisen Poisson-Prozesse mit höherer Intensität zwangsläufig eine größere Wahrscheinlichkeit auf, dass mindestens ein EU eingebaut wurde, als Poisson-Prozesse mit geringerer Intensität. Drei Gruppen von RNA-Spezies wurden untersucht: (1) ≤300 Nukleotide (Anzahl der RNA-Spezies n = 7.932); (2) zwischen 1.000 und 3.000 Nukleotide (Anzahl der RNA-Spezies, n = 1983); und (3) zwischen 2.000 und 4.000 Nukleotide (Anzahl der Arten, n = 1.802). Die Anzahl der RNA-Arten spiegelt die Gesamtzahl wider, die in der Genomdatenbank von Mus musculus (Ensembl) vorhanden ist. Obwohl die beiden letztgenannten Klassen immer noch kurze RNA-Arten darstellen, werden sie als Positivkontrolle einbezogen, bei der ein Unterschied nicht zu erwarten ist, wenn 1,5-fach weniger EU verfügbar ist. In allen Fällen waren die Wahrscheinlichkeitsvektoren nicht Gauß-förmig, wie durch den Kolmogorov-Smirnov-Test berechnet; Somit werden für jede feste Intensität des zugrunde liegenden Poisson-Prozesses der Median und der Interquartilbereich (IQR) für die Wahrscheinlichkeit berechnet, dass mindestens eine EU einbezogen wird. Die Signifikanz zwischen 1,5-fach voneinander entfernten Intensitäten wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

EU-seq- und ChIP-seq-Daten wurden auf der Website des NCBI Sequence Read Archive hinterlegt und sind öffentlich verfügbar (Zugangsnummer PRJNA603447). Die in diesem Dokument beschriebenen Mikroskopiebilder werden auf begründete Anfrage vom Hauptkontakt weitergegeben. Mehrere öffentliche Datensätze wurden erneut analysiert, darunter: Gesamt-RNA-seq-Daten aus der menschlichen Sehne51 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-2449/) und Caenorhabditis elegans52 (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA357503) für Abb. 6a, DNA-Methylierung (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE95361)77 , Histone H3K27ac und H3K4me3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA281127) für erweiterte Datenabbildungen. 5 und 6, MNase-seq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58005)78 und RNAPII ChIP-seq-Daten von UVB-bestrahlten Zellen (https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA230028) für erweiterte Daten Abb. 7a. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die gesamte in dieser Studie verwendete Software wird veröffentlicht und entweder im Haupttext oder in den Methoden zitiert. Der gesamte Originalcode wurde hinterlegt unter: https://github.com/Pothof-Lab/Transcriptional-Stress. Datenanalyseansätze unter Verwendung veröffentlichter Softwarepakete werden in den Methoden beschrieben.

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Referenzen herunterladen

Wir danken M. Tresini, G. Garinis, P. Mastroberardino und C. Milanese für die Bereitstellung von Reagenzien und Protokollen. Wir danken Y. van Loon und W. Vermeij für die allgemeine Unterstützung bei Mausexperimenten. Wir danken P. van Arp für die Unterstützung bei der RNA-Sequenzierung. Die RNA-Sequenzierung wurde in der ErasmusMC HuGeF-Einrichtung unter der Leitung von AG Uitterlinden und J. van Meurs und in der ErasmusMC Biomics-Einrichtung unter der Leitung von W. van Ijcken durchgeführt. RNAPII ChIP–seq wurde von der GenomEast-Plattform durchgeführt, einem Mitglied des „France Génomique“-Konsortiums (ANR-10-INBS-0009). Wir bedanken uns für finanzielle Unterstützung durch die National Institutes of Health/National Institute of Aging (P01 AG017242; DNA-Reparatur, Mutationen und Zellalterung) an JHJH und JP, den European Research Council Advanced Grant Dam2Age an JHJH, die Europäische Kommission EU ITN Address (GA- 316390) an JHJH, niederländische Forschungsorganisation ZonMW Memorabel-Projekt-Nr. 733050810 an JP und JHJH, Deutsche Forschungsgemeinschaft Projekt-Nr. 73111208-SFB829 an JHJH und European Joint Programme on Rare Diseases (EJPRD TC-NER) an JHJH. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Akos Gyenis, Jiang Chang.

Abteilung für Molekulargenetik, Erasmus MC Cancer Institute, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Niederlande

Akos Gyenis, Jiang Chang, Joris JPG Demmers, Serena T. Bruens, Sander Barnhoorn, Renata MC Brandt, Marjolein P. Baar, Marko Raseta, Kasper WJ Derks, Jan HJ Hoeijmakers und Joris Pothof

Universität zu Köln, Medizinische Fakultät, Exzellenzcluster für Altersforschung, Institut für Genomstabilität bei Alter und Krankheit, Köln, Deutschland

Akos Gyenis und Jan HJ Hoeijmakers

Zentrum für Molekulare Medizin, Universitätsklinikum Utrecht, Utrecht, Niederlande

Marjolein P.Baar

Abteilung für klinische Genetik und Fakultät für Onkologie und Entwicklungsbiologie, Universitätsklinikum Maastricht, Maastricht, Niederlande

Kasper WJ Derks

Princess Maxima Center for Pediatric Oncology, Oncode Institute, Utrecht, Niederlande

Jan HJ Hoeijmakers

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JP konzipierte und betreute das Projekt. JP, AG und JC haben die Experimente entworfen. JP, AG, JC und JHJH interpretierten die Daten. JP, AG und JC haben das Manuskript geschrieben und die Zahlen vorbereitet. JHJH las das Manuskript kritisch, führte das Konzept des altersbedingten Verlusts langer Gene ein und redigierte es. RMCB und SB führten die Mausexperimente und EU-Injektionen durch. AG führte und analysierte die EU- und RNAPII-Färbung bei WT-Mäusen. SB führte und analysierte die EU-Färbung bei Xpg-/-Mäusen. AG hat die EU-seq entwickelt und alle Sequenzierungsproben vorbereitet. JC, AG und KWJD haben die EU-seq-Analysepipeline entworfen. JC und KWJD haben die EU-seq-Mapping- und Normalisierungspipeline erstellt. JC hat die Algorithmen entworfen und die Skripte für die Datenanalysen geschrieben. JC und AG führten die bioinformatischen Analysen durch. JJPGD führte die In-vitro-Tests zur Akkumulation von Transkriptionsstress durch. MR führte die statistischen Analysen durch. STB und MPB führten die EU-Färbung in UV-exponierten Zellkulturen durch und analysierten die Zellalterung.

Korrespondenz mit Joris Pothof.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Genetics dankt Evgeny Nudler, George Garinis und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a–c, XY-Streudiagramme von (a) Gesamt-RNAPII, (b) RNAPII-ser5p und (c) RNAPII-ser2p; AU: beliebige Einheiten. blau: Wildtyp-Erwachsenenleber; rot = alte Leber. n = 3 Mäuse/Gruppe. Gesamtzahl der gezählten Kerne: a, erwachsen: n = 206, alt: n = 155. b, erwachsen, n = 748; alt n = 701. c, Erwachsener: n = 984; alt, n = 674.

Quelldaten

a, Flussdiagramm zur Analyse der EU-markierten entstehenden RNA-Sequenzierung (EU-seq). b, c: Sequenz-Read-Verteilung in EU-seq und Gesamt-RNA-Sequenzierung in Introns und Exons (b) und auf Genen abgebildet (c), was eine erhöhte Anzahl intronischer Reads in EU-seq zeigt, was auf eine entstehende RNA-Anreicherung hinweist. d, Bioanalyzer-Diagramme von On-Bead-synthetisierter cDNA zur Generierung von EU-seq-Bibliotheken. Da die Reverse Transkriptase keine cDNA durch kovalent an DNA gebundenes Biotin synthetisieren kann, wird cDNA nur zwischen kovalent EU-gebundenen Biotinen oder von EU-gebundenem Biotin bis zum RNA-Ende erzeugt. Die cDNA von Erwachsenen und alten Tieren ist nahezu identisch, was auf ähnliche EU-Inkorporationsraten hinweist. e, Tabelle, die den EU-Einbau für einen Bereich von Abständen zwischen EU-Molekülen darstellt, wie durch den Poisson-Prozess modelliert. Drei Gruppen von RNA-Spezies wurden untersucht: 1) ≤300 Nukleotide (n = 7932), 2) 1000 bis 3000 Nukleotide (n = 1983) und 3) 2000 bis 4000 Nukleotide (n = 1802). Dargestellt sind der Medianwert und der Interquartilbereich (IQR). f, statistische und probabilistische Rahmentabelle, die eine 1,5-fache Reduzierung für eine Reihe von EU-Eingliederungsentfernungsunterschieden darstellt. Wenn sich der EU-Einbau bei Erwachsenen und älteren Menschen unterscheidet, wird erwartet, dass bei RNA-Arten ≤300 Nukleotide die Wahrscheinlichkeit mindestens eines EU-Einbaus deutlich geringer ist. Für jedes spezifizierte Paar von 1,5-fach voneinander entfernten Intensitäten wurde die erwartete Faltungsänderung in der gealterten Leber berechnet und die entsprechenden 7932-dimensionalen Wahrscheinlichkeitsvektoren durch den Mann-Whitney-U-Test verglichen. Es besteht eine sehr hohe, signifikante Wahrscheinlichkeit, dass ein Unterschied zwischen Erwachsenen und alten Tieren beobachtet werden sollte (p < 2,2 × 10−16, Spalte 3), wenn die EU-Inkorporation in gealterter Leber um das 1,5-fache reduziert wird. g, prozentuale Sequenzablesungen in EU-seq-Datensätzen, die den Längenkategorien von RNA-Arten zugeordnet sind: i) ≤300 Nukleotide, ii) 1000 bis 3000 Nukleotide und iii) 2000 bis 4000 Nukleotide. Die Kategorie ≤300 Nukleotide Länge zeigt einen nicht signifikanten (p-Wert = 0,061093, zweiseitiger ungepaarter t-Test) 1,2-fachen Anstieg bei gealterter Leber, was darauf hinweist, dass es unwahrscheinlich ist, dass die EU-Verfügbarkeit zwischen erwachsener und gealterter Leber unterschiedlich ist. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. h, Prozentsatz EU-markierter entstehender RNA-Reads, die von verschiedenen RNA-Polymerasen (RNAPI-II-III und mitochondriales RNAP (RNAP-MT)) synthetisiert werden. Angepasste alte Werte (orange) wurden durch proportionale Kompensation der entstehenden Transkriptionsreduktion berechnet, wie in Abb. 1a beobachtet. n = 3 Mäuse/Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. i, Alternatives Spleißen in EU-seq-Daten. n = 3 Mäuse/Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. j, Verhältnisse der Spleißdonor- und -akzeptorstellen in EU-seq. n = 3 Mäuse/Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der k-Means-Clustering-basierten Identifizierung mutmaßlicher Regulierungsmechanismen hinter den altersbedingten Genexpressionsänderungen. b, c, Die mittlere Log2-fache Änderung der EU-seq- und Gesamt-RNAPII-ChIP-seq-Werte in der alternden Leber in den Genkörpern (3 Bins) von (b) „Promoter-hochregulierten“ Genen (n = 778) und (c ) „Promotor herunterregulierte“ Gene (n = 394). Berechnet aus Hauptabbildung 2 f. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. d, Durchschnittliche Genlänge (linkes Feld) aller exprimierten Gene, Promotor-hochregulierten Gene, Promotor-herunterregulierten Gene und Gene mit einem hohen allmählichen Verlust der produktiven Transkription (GLPThigh), wie in Abb. 2a dargestellt und nach Genlänge klassifiziert (rechts). Panel) Gruppen: 10–22 kb (blau; n = 662); 22–32 kb (schwarz; n = 644); 32–50 kb (rosa; n = 788), 50–70 kb (gelb; n = 587), 70–110 kb (orange; n = 643) und >110 kb (rot; n = 646). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. P-Wert = 7,84163*10−22, zweiseitiger ungepaarter t-Test. e, Der Beitrag (%) jeder Genlängenklasse zum gesamten entstehenden RNA-Pool in erwachsenen Proben. f, Berechnung des Anteils unproduktiver RNAPII-Komplexe in gealterter Leber. g, Schätzung der Anzahl blockierter RNAPII-Komplexe in gealterter Leber.

Quelldaten

Transkriptionsparameter in den identifizierten funktionellen Genclustern (wie in der erweiterten Abbildung 3a beschrieben): a–d, durchschnittliche Nukleotidzusammensetzung pro kb Genlänge im Matrizenstrang für die ersten 70 kb aus TSS der 50 besten GLPThigh-Gene 70–80 kb ( schwarze Linie) im Vergleich zu 50 Restgenen von 70–80 kb, die niedrige GLPT-Werte enthalten (rote Linie). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. e, Transkriptionsfehlerraten in EU-seq-Daten von erwachsenen (blau) und alten (rot) Lebern des Wildtyps in 4 verschiedenen Gensätzen: „Promoter-hochreguliert“ (n = 778), „Promoter-herunterreguliert“ (n = 394), GLPThoch (n = 914), Rest (n = 1884). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. f, Balkendiagramm, das das Verhältnis zwischen EU-seq-Reads zeigt, die auf Spleißdonor- und -akzeptorstellen von Genen in jedem funktionellen Gencluster in e abgebildet sind. Durchschnitt von n = 3 / Gruppe angezeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± SD.

Quelldaten

Funktionelle Gencluster: Promotor-hochregulierte Gene, Promotor-herunterregulierte Gene, Gene mit einem hohen allmählichen Verlust der produktiven Transkription (GLPThigh) und Rest. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Blaue Linien repräsentieren erwachsene Leber, rote Linien repräsentieren alte Leber. Durchschnitt von n = 3 / Gruppe angezeigt für: a, Gesamt-RNAPII. b, Serin 5 phosphoryliertes (ser5p) RNAPII. c, Histon-3-Lysin-27-Acetylierung (H3K27Ac; offenes Chromatin). d, Histon-3-Lysin-4-Trimethylierung (H3K4Me3; offenes Chromatin). e, unzugängliches Chromatin, da MNase nur DNA verdaut, die nicht an Proteine, einschließlich Nukleosomen, gebunden ist.

Quelldaten

Funktionelle Gencluster: Promotor-hochregulierte Gene, Promotor-herunterregulierte Gene, Gene mit einem hohen allmählichen Verlust der produktiven Transkription (GLPThigh) und Rest. Blaue Linien stehen für erwachsene Leber, rote Linien für alte Leber. Durchschnitt von n = 3 / gezeigte Gruppe der Sequenzierungslesedichte von TSS + 750 bp bis TTS + 4 kb für: a, Histon-3-Lysin-27-Acetylierung (H3K27Ac; offenes Chromatin). b, Histon-3-Lysin-4-Trimethylierung (H3K4Me3; offenes Chromatin). c, unzugängliches Chromatin, da MNase nur DNA verdaut, die nicht an Proteine, einschließlich Nukleosomen, gebunden ist. d, DNA-Methylierungsstatus.

Quelldaten

a, Balkendiagramm, das den Bias des kodierenden Strangs in den gesamten RNAPII-ChIP-seq-Daten 1 Stunde und 6 Stunden nach der Bestrahlung von MCF7-Zellen mit 55 J/m2 UVB darstellt (Daten aus 76). Alle Gene (n = 18224), kurze Gene (10–22 kb) und lange Gene (>110 kb). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Beachten Sie, dass der Strang-Bias in MCF7-Zellen nur eine Stunde nach der UVB-Behandlung vorhanden ist, wenn RNAPII immer noch auf DNA-Läsionen blockiert ist und die DNA-Reparatur im Gange ist. Nach 6 Stunden wurde der größte Teil des blockierten RNAPII aus den DNA-Läsionen entfernt. Dies zeigt, dass i) das verwendete Protokoll in der Lage ist, eine Tendenz zum kodierenden Strang zu erkennen und daher zur Analyse alternder Proben verwendet werden kann, ii) die Tendenz zum kodierenden Strang ein vorübergehender Phänotyp nach UVB ist. Basierend auf veröffentlichten Mengen an Kodierungsstrang-Bias nach einer bekannten UVC-induzierten DNA-Läsionsdichte38 schätzen wir, dass Lebern von Mäusen im Wildtyp-Alter einen Kodierungsstrang-Bias-Anteil im Bereich von 0,05–0,10 aufweisen. b–f, Mittlere lokale DNA-Methylierungsabdeckung (b) und (c–f) lokaler Nukleotidzusammensetzungsstatus in Matrizensträngen von 50 Genen, die im Allgemeinen die höchste kodierende Strangverzerrung aufweisen. Die intragenische intronische Region wird mit dem höchsten kodierenden Strang-Bias (High-Strang-Bias-Loci) ausgewählt. Dieser Loci-Gensatz wird verglichen mit ti) zufällig ausgewählten intragenen Loci ähnlicher Größe: 6 mal 50 zufällige intronische Stellen im Matrizenstrang und ii) dem vollständigen intronischen Transkriptom; alle Introns aus dem Transkriptom (einschließlich Positionen mit hohem Strang-Bias). Durchschnitt von n = 50 / dargestellte Gruppe. Die Daten sind Mittelwerte ± SD.

Quelldaten

Ergänzende Tabelle 1. Überschneidung zwischen TShigh-Genen und sechs unabhängigen Transkriptomstudien mit Genen, die durch UV-Schäden herunterreguliert wurden. Tabelle zu Abb. 5. Ergänzungstabelle 2. Zellpfade und -prozesse, die in der TShigh-Kategorie deutlich überrepräsentiert sind. Tabelle zu Abb. 5.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 17. Dezember 2021

Angenommen: 07. Dezember 2022

Veröffentlicht: 19. Januar 2023

Ausgabedatum: Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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