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Apr 30, 2023

Protokolle zur Dissoziation der Darmschleimhaut beeinflussen die Proportionen der Zelltypen und einzelne Zellen

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9897 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat die Untersuchung der zellulären Landschaft von Organen revolutioniert. Die meisten Einzelzellprotokolle erfordern frisches Material, was die Probengröße pro Experiment begrenzt und folglich zu Batch-Effekten führt. Dies gilt insbesondere für Proben, die durch komplexe medizinische Eingriffe wie Darmschleimhautbiopsien gewonnen werden. Darüber hinaus ist das zur Gewinnung einzelner Zellen erforderliche Gewebedissoziationsverfahren eine Hauptlärmquelle; Verschiedene Dissoziationsverfahren, die auf verschiedene Kompartimente des Gewebes angewendet werden, induzieren künstliche Unterschiede in der Genexpression zwischen Zelluntergruppen. Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir ein einstufiges Dissoziationsprotokoll entwickelt und dessen Anwendung bei kryokonservierten Darmschleimhautbiopsien demonstriert. Mithilfe von Durchflusszytometrie und scRNA-seq-Analyse verglichen wir dieses einstufige Dissoziationsprotokoll mit dem aktuellen Goldstandard, dem zweistufigen Kollagenase-Verdau, und einer Anpassung einer kürzlich veröffentlichten Alternative, dem dreistufigen kälteaktiven Bacillus licheniformus-Protease-Verdau. Sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen als auch die Zusammensetzung des Zelltyps waren zwischen der einstufigen und der zweistufigen Kollagenase-Dissoziation vergleichbar, wobei erstere zeiteffizienter war. Der kalte Proteaseverdau führte zu einer gleichen Lebensfähigkeit der Zellen, bewahrte jedoch die Epithelzelltypen besser. Folglich sind für die Analyse seltenerer Zelltypen, wie z. B. Gliazellen, größere Gesamtzahlen an Biopsiezellen als Eingangsmaterial erforderlich. Die mehrstufigen Protokolle wirkten sich unterschiedlich auf Zelltypen aus, die sich über mehrere Kompartimente erstreckten. Zusammenfassend zeigen wir, dass kryokonservierte Darmschleimhautbiopsien verwendet werden können, um die logistischen Herausforderungen und Batch-Effekte in großen scRNA-seq-Studien zu überwinden. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Verwendung kryokonservierter Biopsien, die mit einem einstufigen Kollagenase-Protokoll verdaut wurden, eine groß angelegte scRNA-seq, FACS, Organoidgenerierung und intraepitheliale Lymphozytenexpansion ermöglicht.

Auch wenn es schon über 30 Jahre her ist, dass die erste cDNA aus einer einzelnen Zelle extrahiert wurde1, ermöglichen technologische Entwicklungen im Bereich der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) erst seit Kurzem die Erstellung von Einzelzell-Genexpressionsprofilen im Hochdurchsatzverfahren2. Diese Entwicklung ermöglicht die unvoreingenommene Untersuchung heterogener Zellpopulationen in Geweben, ohne dass Zelltypen separat isoliert werden müssen. Über die Kartierung der zellulären Expression hinaus ermöglicht dies die Untersuchung potenzieller Zell-Zell-Interaktionen im Kontext eines Gewebes3.

Derzeit laufen mehrere weltweite Bemühungen, den menschlichen Körper sowohl im Hinblick auf Gesundheit (Human Cell Atlas4) als auch Krankheit (LifeTime-Konsortium5) mit Einzelzellauflösung zu kartieren. Ein Bereich, in dem bereits große Anstrengungen unternommen werden, ist der Bereich der Gastroenterologie; Es werden (derzeit) Atlanten über den „gesunden“ Darm von Föten, Kindern und Erwachsenen erstellt6,7. Dies hat zur Identifizierung neuer Zelltypen und ihrer spezifischen Funktionen geführt, wie etwa der BEST4-Epithelzellen, die an der pH-Messung beteiligt sind8, und hat erste Hinweise darauf geliefert, warum manche Patienten mit Morbus Crohn nicht auf bestimmte Medikamente ansprechen9.

Die Darmschleimhaut ist ein komplexes Organ, das in mehrere Kompartimente unterteilt werden kann: die Epithelschicht, die sich im luminalen Teil befindet; und die Lamina propria-Schicht, die unter dem Epithel liegt. Jedes Kompartiment besteht aus einer Mischung von Zelltypen, die spezielle und lokale Funktionen haben können und unterschiedlich über den Magen-Darm-Trakt verteilt sind10,11. Auf der luminalen Seite besteht die Darmschleimhaut aus einer azellulären Schleimschicht, die die Darmbakterien vom Epithel trennt. Diese Schicht fungiert als zweite Barriere zwischen der Außenwelt und dem inneren Darm. Direkt darunter befindet sich die Epithelschicht, in die Immunzellen eindringen und spezifische Funktionen zur antimikrobiellen Abwehr und Antigensignalisierung erfüllen. Eine dieser nur hier vorkommenden Immunzellpopulationen ist die intraepitheliale Lymphozytenpopulation (IEL), die sich funktionell von den Lymphozyten in der Lamina propria (LPL), der darunter liegenden Schicht, unterscheidet. Die letztere Schicht enthält auch andere Immunzellen, Gefäße, Nerven und mesenchymale Zellen12,11,14.

Um einzelne Zellen eines solch komplexen und soliden Organs effektiv zu profilieren, muss das Gewebe dissoziiert werden, was ein wesentlicher erster Schritt in jedem scRNA-seq-Protokoll ist. Allerdings erschweren mehrere große Hürden die Skalierung von Einzelzell-Darmatlanten. Erstens können die Dauer der Dissoziation und das Verfahren selbst zu unerwünschten Artefakten bei der nachgeschalteten Genexpressionsauslesung führen15,16. Jeder Schritt im Dissoziationsverfahren kann die Genexpression beeinflussen, daher sollte die Verarbeitung auf das unbedingt Notwendige beschränkt werden. Zweitens sollte das Dissoziationsverfahren ausreichend gründlich sein und alle Zellen trennen, ohne empfindlichere Zelltypen zu beschädigen. Dies gilt insbesondere dann, wenn der Forscher eine genaue Wiedergabe des Originalgewebes untersuchen möchte, beispielsweise für die Verwendung von Zellatlanten. Dieses Gleichgewicht zwischen der Gewinnung einer repräsentativen Gruppe lebensfähiger Einzelzellen und der Minimierung von Artefakten erfordert eine Feinabstimmung.

Um diese genaue Wiedergabe des ursprünglichen Gewebes zu erhalten, können die aktuellen Dissoziationsverfahren für Darmbiopsien auf zwei Arten verbessert werden. Erstens, indem Unterschiede zwischen Zellen aus demselben Gewebe vermieden werden, die durch mehrstufige Verdauung entstehen: Idealerweise würde man das gesamte Gewebe mithilfe eines einstufigen Dissoziationsverfahrens verarbeiten. Der aktuelle Goldstandard für die Isolierung einzelner Zellen aus dem Darm ist jedoch ein zweistufiges Dissoziationsverfahren: Zuerst wird die Epithelschicht mit EDTA dissoziiert, gefolgt von der Lamina propria-Schicht mit einer 37 °C-Kollagenase-Behandlung (im Folgenden „.“) als das zweistufige Kollagenase-Protokoll)17,16,19. Zweitens waren aktuelle scRNA-seq-Protokolle für Darmgewebe bisher auf frisches Darmmaterial beschränkt, das entweder durch Biopsie während der Koloskopie oder als Resektionsmaterial aus einem chirurgischen Eingriff entnommen wurde. Dadurch kann nur eine sehr begrenzte Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet werden, was zu Batch-Effekten zwischen den Proben führen kann, ohne dass eine Korrektur möglich ist. Um diese Bedenken auszuräumen, ermöglicht ein kürzlich entwickeltes Verfahren zur Kryokonservierung von Darmschleimhautgewebe nun die Durchführung von Multi-Darmproben-Experimenten mit lebenden Zellen20,21.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein neuartiges Darmdissoziationsprotokoll (einstufige Kollagenase-Dissoziation) entwickelt, das für scRNA-seq-Protokolle geeignet ist und alle Zellen auf die gleiche Weise behandelt, mit dem Ziel, Batch-Effekte zwischen verschiedenen Zelltypen zu verhindern, die ansonsten nacheinander isoliert werden. Wir zeigen zunächst, dass die Kryokonservierung weder die Sequenzierungsqualitätsparameter noch die Zelllebensfähigkeit der einstufigen Kollagenase-dissoziierten Zellen beeinflusst, sondern vermutlich die Zusammensetzung des Zelltyps und die Genexpressionsniveaus beeinflusst. Anschließend vergleichen wir Sequenzierungsparameter, Zelllebensfähigkeit, Zellausbeute und Genexpression von scRNA-seq und FACS unter Verwendung dieser einstufigen Kollagenase-Dissoziation an kryokonservierten Biopsien mit der Goldstandard-Darmgewebe-Dissoziationsmethode (zweistufiges Kollagenase-Protokoll) und einer anderen Alternative unter Verwendung von a dreistufiger Verdau mit einer aus Bacillus licheniformis isolierten Protease, die bei 4 °C aktiv ist (dreistufige Protease) [adaptiert aus 22 und 23]. Das letztgenannte Protokoll zielt darauf ab, Genexpressionsartefakte zu minimieren, die im Allgemeinen mit der Dissoziation verbunden sind, indem die Zellen bei 4 °C metabolisch inaktiv gehalten werden. Darüber hinaus wurde es entwickelt, um den Tod von Anoikis-anfälligen Darmepithelzellen im gesunden Darm für scRNA-seq-Studien zu verhindern. Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden Biopsien auf Eis mit einer geringen EDTA-Konzentration inkubiert, um lose gebundene Immunzellen freizusetzen (Fraktion 1). Anschließend wird die Epithelschicht, die infiltrierende Immunzellen enthält, mithilfe kälteaktiver Protease (Fraktion 2) dissoziiert ) und beide Fraktionen werden kurz mit Kollagenase IV behandelt, um eine vollständige Verdauung sicherzustellen. Durch den Vergleich der Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen, die Zusammensetzung des Zelltyps und die Genexpressionsniveaus einzelner Zellen haben wir die bestmöglichen Anwendungsszenarien und die Einschränkungen für jedes Protokoll ermittelt. Anschließend haben wir dies in einem Protokollentscheidungstool zusammengefasst, das Wissenschaftlern bei der Entscheidung helfen kann, welches Protokoll am besten zu ihren biologischen Fragestellungen passt.

Um die Wirkung verschiedener Dissoziationsprotokolle in verschiedenen Zelltypen gleichzeitig und mit hoher Auflösung zu bewerten, wurde ein direkter Vergleich unter Verwendung von Durchflusszytometrie- (FACS) und scRNA-seq-Daten durchgeführt (Abb. 1A). Zwei separate Datensätze wurden verwendet, um entweder die Wirkung der Kryokonservierung oder des Zelldissoziationsprotokolls zu bestimmen (Abb. 1B). Für scRNA-seq wurde die Wirkung der Kryokonservierung an zwei gepaarten Proben unter Verwendung des einstufigen Kollagenase-Protokolls verglichen, wohingegen die Wirkung der Dissoziation auf die Lebensfähigkeit der Zellen, die Zusammensetzung des Zelltyps und die Genexpression an (einem größeren Satz von) Proben aus verschiedenen verglichen wurde Einzelpersonen. Für FACS wurde die Kryokonservierung anhand der einstufigen Kollagenase- und Fraktion 2 der dreistufigen Protease-Protokolle bewertet, wohingegen der Einfluss der Zelldissoziation anhand eines größeren Datensatzes bewertet wurde. Jedes Protokoll führte zu unterschiedlichen Kompartimenten (Abb. 1A):

Die aus dem Ein-Schritt-Kollagenase-Protokoll abgeleiteten Daten wurden auf die Zelltypzusammensetzung als Ganzes analysiert, von hier aus als gesamtes Biopsiekompartiment (WB) bezeichnet.

Die zweistufige Kollagenase wurde in zwei Teilen analysiert: den Fraktionen Epithelschicht (EL) und Lamina propria (LP).

Das dreistufige Proteaseprotokoll wurde unter Verwendung von scRNA-seq sowohl als 50/50-Mischung aus Fraktion 1 (F1) und 2 (F2) als auch nur als Fraktion 2 analysiert und unter Verwendung von FACS getrennt als Fraktion 1 und 2.

Studienübersicht und Datensätze. (A) Schematische Darstellung des Studienaufbaus. Es wurden Biopsien entnommen, entweder frisch verwendet oder kryokonserviert, und unter Verwendung des einstufigen Kollagenase-Protokolls mit Kollagenase bei 37 °C dissoziiert; die zweistufige Kollagenase mit EDTA in Schritt 1 und Kollagenase bei 37 °C in Schritt 2; oder das dreistufige Proteaseprotokoll, beginnend mit einer EDTA-Inkubation bei 4 °C in Schritt 1, einem Proteaseverdau in Schritt 2 und einem kurzen Kollagenaseverdau bei Raumtemperatur in Schritt 3. (B) Zur Untersuchung wurden zwei Datensätze generiert: 1. die Wirkung der Kryokonservierung und 2. die Wirkung verschiedener Dissoziationsprotokolle auf die Lebensfähigkeit, Zusammensetzung, das Transkriptom und die Funktionalität des Zelltyps. IEL, intraepitheliale Zelle; EC, Epithelzelle. Das Koloskopie-Piktogramm wurde von Gan Khoon Lay gezeichnet, https://thenounproject.com/term/colonoscopy/1250282/.

Um die Auswirkung der Kryokonservierung auf die Proben zu beurteilen, verglichen wir die Zelllebensfähigkeiten, die nach der Dissoziation unter Verwendung der einstufigen Kollagenase- und der dreistufigen Proteaseprotokolle mit einem Zelllebensfähigkeitsfarbstoff für die Durchflusszytometrie erhalten wurden. Wir fanden heraus, dass die Zelllebensfähigkeit der Proben aus beiden Protokollen ähnliche Lebensfähigkeiten aufwies (Median 81,5 %, SD 12,8 Abb. 2A, Ergänzungstabelle 1). Obwohl der Mittelwert der kryokonservierten Proben aus der Ein-Schritt-Kollagenase höher war als der der frischen Proben, waren die Unterschiede nicht signifikant (p > 0,05, nicht gepaarter t-Test).

Einfluss der Kryokonservierung auf Zellen, die mithilfe des einstufigen Kollagenase-Protokolls in FACS und scRNA-seq dissoziiert wurden. (A) Boxplots, die die Lebensfähigkeit von FACS-Zellen (%) in dissoziierten Zellen aus frischen im Vergleich zu kryokonservierten Proben für die gesamte Biopsie (einstufiges Kollagenase-Protokoll) und Fraktion 2 (dreistufiges Protease-Protokoll) (p-Wert > 0,05; nicht gepaarte t) zeigen -prüfen). Die Stichprobengröße ist im unteren Teil des Diagramms dargestellt. UMAPs von scRNA-seq-Daten, die aus zweigepaarten frischen und kryokonservierten Proben gewonnen wurden, die mit einstufiger Kollagenase dissoziiert wurden, gefärbt nach (B) Zelltypen und (C) Lagerbedingungen. (D) Balkendiagramm der relativen Zelltyphäufigkeiten, die aus den scRNA-seq-Daten gewonnen wurden, gefärbt nach Zelltyp.

Um die Auswirkung der Kryokonservierung auf scRNA-seq nach dem einstufigen Kollagenase-Protokoll zu untersuchen, verwendeten wir gepaarte frische und kryokonservierte Proben von zwei Personen. Erstens zeigten grundlegende Parameter für die Sequenzierungsqualitätskontrolle, dass die RNA-Integrität, gemessen an der Qualität der sequenzierten Lesevorgänge, der Zuordnung der Lesevorgänge zum Genom und den Zell-QC-Parametern, durch das Kryokonservierungsverfahren nicht beeinträchtigt wurde (Ergänzungstabelle 2). . Als nächstes gruppierten wir die Zellen anhand ihres Transkriptoms und bestimmten die Zelltypidentität, wie in Methoden beschrieben (Abb. 2B). Der Anteil der mitochondrialen Gene wurde pro Zellkategorie (Epithel, Stroma, Immun) bewertet, da ein zelltypabhängiger Unterschied in der Anzahl der mitochondrialen Gene besteht. Stroma- und Epithelzellen zeigen nach der Kryokonservierung einen Trend zu einer höheren mitochondrialen Genexpression, wohingegen Immunzellen eine geringere Anzahl mitochondrialer Gene aufweisen (Suppl. Abbildung 1A–D). Beim Vergleich des Anteils mitochondrialer Gene bei einer höheren Zelltypauflösung stellen wir fest, dass T-Zellen in frischen Proben eine deutliche bimodale Verteilung aufweisen, was auf die Gewinnung von Zellen geringer Qualität hinweisen könnte (Suppl. Abbildung 1E).

Durch die Verwendung eines UMAP als Visualisierung konnten wir beobachten, dass frische und kryokonservierte Zellen relativ gut auf die Zelltypen verteilt sind (Abb. 2C). Um aufzuzeigen, wie sich der Speichermodus auf die Zellzusammensetzung auswirkt, haben wir sowohl scRNA-seq-Daten (Abb. 2D) als auch Durchflusszytometrie (Suppl. Abbildung 2) verwendet. In den scRNA-seq-Daten haben wir Hinweise auf eine Abnahme der Anteile myeloischer Zellen (5–1 %) und Fibroblasten (11–4 %) sowie eine Zunahme der Epithelzellen (47–67 %) festgestellt (Abb. 2D). In ähnlicher Weise beobachteten wir nach der Kryokonservierung eine signifikante Abnahme des Zellanteils myeloischer Zellen (~ 5–2 %) sowie der B-Zellen (~ 13–6 %, in scRNA-seq-Daten nicht beobachtet), wohingegen der Anteil der Epithelzellen erhöht (~ 38–55 %) (Suppl. Abbildung 2).

Zusammenfassend stellten wir für beide Protokolle, einstufige Kollagenase und dreistufige Protease, fest, dass die Kryokonservierung (überprüft bis zu 14 Monate) keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatte. Wir fanden Hinweise darauf, dass die Gesamtzusammensetzung der Zelltypen durch die Kryokonservierung geringfügig beeinflusst wurde, mit Ausnahme von myeloischen Zellen, Fibroblasten und B-Zellen, die vermutlich nach der Kryokonservierung reduziert wurden (Abb. 2D, ergänzende Abbildung 2), was mit früheren Berichten übereinstimmt20. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kryokonservierung von Darmbiopsien eine Langzeitlagerung und Versuchsaufbauten mit höherem Durchsatz ermöglicht. Daher ist dies in Kombination mit dem Fehlen wesentlicher schädlicher Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen, die Zusammensetzung des Zelltyps oder die Genexpressionsniveaus die Probenverarbeitungsmethode der Wahl.

Als nächstes untersuchten wir den Einfluss des Zelldissoziationsprotokolls auf die Lebensfähigkeit von Zellen. In frischen Proben wurde die höchste Zelllebensfähigkeit in Fraktion 2 des dreistufigen Protease-Protokolls erreicht, die hauptsächlich aus Epithel- und Immunzellen besteht, einen signifikanten Unterschied erreichte sie jedoch nur im Vergleich zur EL-Fraktion der zweistufigen Kollagenase Protokoll (Abb. 3A, p < 0,05). Die zweithöchste Lebensfähigkeit wurde durch das einstufige Kollagenase-Protokoll (WB, Gesamtbiopsie) und die LP (Lamina propria, hauptsächlich Immunzellen) erreicht, die durch das zweistufige Kollagenase-Protokoll erhalten wurde (Abb. 3A, Ergänzungstabelle 1). Wir beobachteten, dass die nur mit EDTA behandelten Epithelzellen im zweistufigen Kollagenase-Protokoll die geringste Lebensfähigkeit zeigten (Abb. 3A, Ergänzungstabelle 1). Diese Vergleiche waren jedoch nicht signifikant (p < 0,05).

Auswirkung von Dissoziationsprotokollen auf die Lebensfähigkeit der Zellen, bewertet durch FACS und Hämozytometrie. Boxplots zum Vergleich der Zelllebensfähigkeit (%) in (A) frischen Proben, gemessen mit FACS; und kryokonservierte Proben, gemessen durch (B) FACS und (C) Trypanblau-Ausschluss. Auf der x-Achse sind Kompartimente und Dissoziationsprotokolle angegeben. Die durchschnittliche Lebensfähigkeit der Zellen wurde zwischen den Kompartimenten verglichen (nicht gepaarter t-Test). Nur signifikante Vergleiche (p-Wert < 0,05) werden als Balken und der jeweilige p-Wert über dem verglichenen Kompartiment angezeigt. Die Probengröße ist im unteren Teil jedes Diagramms dargestellt. WB, Gesamtbiopsie; EL, Epithelschicht; LP, Lamina propria; F1, Fraktion 1; F2, Bruch 2.

In kryokonservierten Proben verglichen wir die WB aus dem einstufigen Kollagenase-Protokoll und beide Fraktionen aus dem dreistufigen Protease-Protokoll. Unsere Ergebnisse deuten auf eine beeinträchtigte Zelllebensfähigkeit (~ 60–66 %) bei Fraktion 1 des dreistufigen Proteaseprotokolls hin (p < 0,05 nach FACS, Abb. 3B; nicht schlüssig nach Trypanblau-Ausschlusstest, Abb. 3C).

Schließlich untersuchten wir in allen Protokollen den Anteil der mitochondrialen Gene an der gesamten Genexpression. Wir fanden heraus, dass das einstufige Kollagenase-Protokoll im Vergleich zu den anderen Protokollen einen erhöhten Anteil der mitochondrialen Genexpression aufweist, was ein Indikator für einen erhöhten Zelltod ist24 (Suppl. Abbildung 3A–H).

Die einstufige Kollagenase-Dissoziation führte zu einer ausgewogenen Erholung von Epithel- und Immunzellen, zu denen auch andere Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Gliazellen gehörten (Abb. 4, Suppl. Abb. 4). Im Gegensatz dazu unterstützten beide mehrstufigen Protokolle die Isolierung spezifischer Zelltypen in einem der beiden isolierten Kompartimente (Abb. 4, ergänzende Abbildung 4). Das dreistufige Proteaseprotokoll unterstützt die Lebensfähigkeit von Epithelzellen, die einen großen Teil der Darmzelltypen ausmachen, und daher scheinen seltenere Zelltypen wie NKs ILCs (eine Mischung aus natürlichen Killerzellen und angeborenen Lymphoidzellen), Endothelzellen und Fibroblastenzellen unterrepräsentiert zu sein durch Vergleich in scRNA-seq-Daten. Beispielsweise werden NKs-ILCs durch FACS am besten in Fraktion 1 des dreistufigen Proteaseprotokolls erfasst (Suppl. Abbildung 4; ~ 5 % vs. < 1 % für Kollagenaseprotokolle), scheinen aber im scRNA-seq-Datensatz zu fehlen ( Abb. 4).

Unterschiede in den Zelltypanteilen wurden in jedem Protokoll mithilfe von scRNA-seq festgestellt. Boxplots der Zelltypanteile, charakterisiert durch scRNA-seq. Die resultierende Zelltypzusammensetzung der Proben wurde über alle Protokolle und Kompartimente hinweg getestet (Wilcoxon-Rangsummentest mit Holm-Korrektur für Mehrfachtests, Ergänzungstabelle 6). Kompartimente und Dissoziationsprotokolle sind auf der x-Achse angegeben. Die Probengröße ist in der Legende des Diagramms dargestellt. WB, Gesamtbiopsie; EL, Epithelschicht; LP, Lamina propria; F1, Fraktion 1; F2, Bruch 2.

Da bestimmte Forschungsfragen möglicherweise die Isolierung bestimmter Zelltypen erfordern, haben wir bewertet, welches Protokoll die Isolierung der einzelnen Hauptzelltypen mit der höchsten Zelllebensfähigkeit am besten unterstützt. Die Epithelschicht des zweistufigen Collagenase-Protokolls und Fraktion 2 des Protease-Protokolls unterstützen die Isolierung von Epithelzellen besser als das einstufige Collagenase-Protokoll (p-Wert < 0,05, Abb. 4, bestätigt durch Durchflusszytometrie, Suppl. Abbildung 4). ). Andererseits liefert Fraktion 1 des dreistufigen Proteaseprotokolls die am stärksten gereinigte Immunpopulation (Abb. 4), wenn auch mit einer beeinträchtigten Lebensfähigkeit der Zellen bei Verwendung kryokonservierter Biopsien (Abb. 3B–C) und einer Verringerung der schichtspezifischen Immunzellen wie die CD8 + LPL T-Zellen (Suppl. Abbildung 6). Für die beste Trennung schichtspezifischer Immunzellen ist jedoch das zweistufige Kollagenase-Protokoll das Protokoll der Wahl. Dennoch bleibt die variable Trennung der Kompartimente bei allen mehrstufigen Dissoziationsprotokollen ein Problem und stellt eine potenzielle Quelle von Verzerrungen dar. Diese Variabilität kann durch mehrere Faktoren verursacht werden, wie z. B. Inkubationszeit, Zentrifugationsgeschwindigkeit, Konzentration von Enzymen und Chemikalien, Temperatur, Gewebeoberfläche und intrinsische Spendervariabilität25. Daher kann die Anwendung der kombinatorischen scRNA-seq- und Oberflächenproteinsequenzierung (CITE-seq)26 auf einstufige Kollagenase-dissoziierte Biopsien eine gute Alternative sein, die die Untersuchung schichtspezifischer Immunpopulationen wie der CD103 + IEL-Zellen ermöglicht, ohne Schicht- spezifische Batch-Effekte. Darüber hinaus können andere Anreicherungsstrategien, wie z. B. Bead-Anreicherung und FACS, diese Zelltyp-Anreicherung ermöglichen, ohne auf ein bestimmtes Dissoziationsprotokoll beschränkt zu sein, obwohl zusätzliche Laborschritte erforderlich sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das einstufige Kollagenase-Protokoll die Darmzusammensetzung mit einer ausgewogenen Lebensfähigkeit der Zellen erfasst, während die mehrstufigen Kollagenase- und Protease-Protokolle vorzuziehen sind, wenn der Schwerpunkt auf bestimmten Kompartimenten oder Zelltypen liegt.

Verschiedene Zelltypen können unterschiedlich auf chemische Behandlungen reagieren und bergen daher potenzielle Batch-Effekte. Um festzustellen, ob die verschiedenen Dissoziationsprotokolle solche Batch-Effekte hervorrufen, führten wir eine differenzielle Genexpressions- (DE) und Signalweganalyse an gepaarten frischen und kryokonservierten scRNA-seq-Proben durch, die mit dem einstufigen Kollagenase-Protokoll dissoziiert wurden (Ergänzungstabelle 2 und 3a + b). .

Frühere Studien deuten darauf hin, dass 10–50 % des Transkriptoms von der Dissoziation betroffen sind27. Daher verringern ähnliche Dissoziationsbehandlungen für alle Zelltypen, wie im einstufigen Kollagenase-Protokoll, den DE zwischen Zellen, der durch unterschiedliche Dissoziationsbehandlungen induziert wird. Um die Wirkung der unterschiedlichen Behandlung zu quantifizieren, führten wir eine DE-Analyse der Epithelzellen durch, die in der EL- vs. LP-Fraktion der Studie von Smillie et al. eingefangen wurden. Datensatz17. Die Untersuchung dieser Epithelzellen, die in beiden Fraktionen des zweistufigen Protokolls vorhanden sind, ermöglicht die Quantifizierung der Wirkung der unterschiedlichen Behandlung zwischen der EL-Fraktion (nur EDTA) und der LP-Fraktion (EDTA, gefolgt von Kollagenase). Diese DE-Analyse ergab 222 DE-Gene, von denen zuvor beschrieben wurde, dass 34 in Kollagenase-dissoziierten Muskelstammzellen von Mäusen durch Kollagenase induziert werden15. Bemerkenswerterweise wurde festgestellt, dass jedes dieser 34 Kollagenase-induzierten Gene in der LP-Fraktion (dh der mit Kollagenase behandelten Fraktion) hochreguliert war. Zusammengenommen zeigt diese Analyse einen deutlichen Batch-Effekt zwischen der EL- und der LP-Fraktion, der durch die unterschiedliche Behandlung induziert wurde, und weist auf eine Anreicherung zuvor beschriebener Kollagenase-induzierter Gene hin (34/222 Kollagenase-induzierte Gene in der DE-Genliste im Gegensatz zu). 104/3947, die in den Nicht-DE-Genen lagen, Fisher Exact p < 0,00001). Es ist dieser Batch-Effekt der Differenzialbehandlung, der mit dem einstufigen Kollagenase-Protokoll umgangen wird.

Wir verglichen Kollagenase-behandelte Epithelzellen des Ein-Schritt-Protokolls einerseits mit den EDTA-behandelten Zellen des Zwei-Schritt-Kollagenase-Protokolls und andererseits mit den EDTA + Protease + Kollagenase-behandelten Zellen des Protease-Protokolls. Wir fanden heraus, dass die Epithelzellen des einstufigen Kollagenase-Protokolls eine Hochregulierung von 95 (10 % der gesamten DE-Gene) bzw. 60 (7 % der gesamten DE-Gene) bekannten Kollagenase-induzierten Genen16 (Suppl. Tabelle 3a) aufweisen, einschließlich Gene wie FOS und JUN (Suppl. Tabelle 3a + b, Suppl. Abbildung 5). Von diesen 95 und 60 DE-Genen überlappen insgesamt nur 13 Kollagenase-induzierte Gene, was darauf hindeutet, dass Kollagenase möglicherweise nicht der einzige Faktor ist, der hier zu den Unterschieden in der Genexpression beiträgt.

Die Immunzellen (myeloische Zellen, B- und T-Lymphozyten) zeigten mit Ausnahme der B-Zellen größtenteils ähnliche Zahlen an DE-Genen zwischen dem einstufigen Kollagenase-Protokoll und den mehrstufigen Protokollen. In diesen Zellen beobachteten wir eine große Diskrepanz in der Anzahl hochregulierter gegenüber herunterregulierter Gene im einstufigen Kollagenase-Protokoll im Vergleich zum mehrstufigen Protokoll; 976 Gene werden im zweistufigen Protokoll im Vergleich zum einstufigen Kollagenase-Protokoll herunterreguliert, während 90 Gene hochreguliert werden (Suppl. Tabelle 3a).

Bemerkenswerterweise weisen myeloische und B-Zellen den höchsten Anteil an Kollagenase-induzierten Genen auf, die im einstufigen Kollagenase-Protokoll im Vergleich zum dreistufigen Protease-Protokoll hochreguliert sind (27 % bzw. 25 %) (Ergänzungstabelle 3a)16. Dies weist darauf hin, dass diese Zelltypen möglicherweise am empfindlichsten auf die Kollagenase-Verdauungszeit reagieren, was möglicherweise die Zusammensetzung der Zellsubtypen des Zelltyps beeinflusst, z. B. hauptsächlich Plasmazellen gegenüber hauptsächlich B-Zellen (Suppl. Abbildung 4). Es gibt einen Trend zu einem höheren Anteil an B-Zellen und einem geringeren Anteil an Plasmazellen in Protease im Vergleich zu einstufigen Kollagenase-verdauten Zellen in FACS, was diese Theorie stützt (Suppl. Abbildung 4). Darüber hinaus bedeutet dies, dass viele Gene von anderen Faktoren als dem für die Verdauung verwendeten Enzym beeinflusst werden, wie beispielsweise der Verdauungsdauer und Temperaturunterschieden.

Insgesamt enthält die Lamina propria-Schicht aus dem zweistufigen Kollagenase-Protokoll, die mit Kollagenase I + II-haltiger Liberase behandelt wird, die meisten myeloischen Zellen (Abb. 4, Ergänzungstabelle 6). Wir erwarteten jedoch ähnliche Anteile myeloischer Zellen in mit Kollagenase IV behandelten einstufigen Kollagenase-dissoziierten Biopsien, da die enzymatische Verdauung und ihre Dauer ansonsten vergleichbar sind. Es wurde gezeigt, dass Dissoziationsenzyme die Wirksamkeit der Dissoziation von Zellsubtypen beeinflussen28. Die geringere Anzahl myeloischer Zellen im einstufigen Kollagenase-Protokoll im Vergleich zum zweistufigen Kollagenase-Protokoll kann auf die Kryokonservierung der einstufigen Kollagenase-dissoziierten Proben zurückzuführen sein20 (Abb. 4, ergänzende Tabelle 6).

Zu den Signalwegen, die in T-Zellen nach einem einstufigen Kollagenase-Verdau im Vergleich zu einem dreistufigen Protease-Verdau hochreguliert werden, gehören „Signalisierung durch Interleukine“ und „zelluläre Reaktionen auf äußere Reize“, was darauf hindeutet, dass das Protokoll mit warmer Kollagenase indirekt T-Zellen aktivieren kann Kalte Proteaseverdauung kann die Aktivierung von Immunzellen während der Isolierung verhindern (Ergänzungstabelle 3b).

Fibroblasten zeigten in beiden Vergleichen mit dem einstufigen Protokoll die meisten DE-Gene: 2.184 Gene waren DE mit dem zweistufigen Kollagenase-Protokoll und 1.833 mit dem dreistufigen Protease-Protokoll. Interessanterweise gab es unter diesen DE-Genen jedoch nur einen kleinen Anteil an Kollagenase-induzierten Genen (8 % bzw. 10 %) (Ergänzungstabelle 3a). Dies bedeutet, dass Fibroblasten nicht unbedingt empfindlich auf die Behandlung mit Kollagenase reagieren, aber wahrscheinlich haben andere zur Dissoziation verwendete Chemikalien einen größeren Einfluss (z. B. EDTA).

Um die Machbarkeit der Sammlung lebensfähiger und funktionsfähiger Einzelzellen nach dem einstufigen Kollagenaseverdau auf kryokonservierten Biopsien zu demonstrieren, haben wir gezeigt, dass sowohl Darmorganoide (Suppl. Abbildung 8A) als auch IELs (Suppl. Abbildung 8B–C) erfolgreich aus dem Darm vermehrt werden können verbleibende Zellen nach scRNA-seq. Für die IEL-Vermehrung wurden die restlichen Zellen FACS-sortiert und 10 Tage lang gezüchtet. Auf diese Weise konnten IELs ausgehend vom Ausgangsmaterial bis zu 30-fach erweitert werden, während ihr Phänotyp erhalten blieb (Suppl. Abbildung 6). Diese Ergebnisse unterstreichen die Möglichkeit, mithilfe kryokonservierter Biopsien sowohl die Funktionalität als auch die Genexpression von Zellen aus denselben Proben zu untersuchen. Insgesamt eröffnen diese Ergebnisse die Möglichkeit, Einzelzell-Omics-Experimente zu entwerfen, gefolgt von einer experimentellen Validierung anhand desselben biologischen Materials, wodurch die Batch-Effekte reduziert und das Abrufen mehrerer Informationsebenen aus Proben mit demselben genetischen und Umweltkontext erleichtert werden.

In dieser Studie präsentieren wir ein einstufiges Kollagenase-Darmbiopsie-Verdauungsprotokoll als fundierte Alternative zum aktuellen Goldstandard der zweistufigen Kollagenase-Dissoziation17,19,29 und der dreistufigen Protease-Dissoziation [angepasst von22 und23]. Die Hauptvorteile dieses einstufigen Protokolls sind die Reduzierung von Zeit, Kosten und Verfahren, die Vermeidung von Batch-Effekten, die mit der sequentiellen Dissoziation verschiedener Kompartimente in den mehrstufigen Protokollen verbunden sind, kombiniert mit einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit und experimenteller Flexibilität (Abb . 5). Darüber hinaus zeigen wir, dass dieses Protokoll auch nach der Kryokonservierung lebensfähige Einzelzellen erzeugt, die für Funktionsstudien mit Organoiden oder nachgelagerte Analysen mit scRNA-seq oder FACS geeignet sind.

Entscheidungsbaum für die Einzelzelldissoziation von Darmgewebe für scRNA-seq. (A) Flussdiagramm, das Forschern bei der Auswahl eines Dissoziationsprotokolls für Darmgewebe basierend auf ihren spezifischen Bedürfnissen helfen soll. (B) Überblick über die Hauptunterschiede zwischen den Protokollen. IEL, intraepitheliale Zelle; EC, Epithelzelle; EL, Epithelschicht; LP, Lamina propria; F1, Fraktion 1; F2, Bruch 2.

Die Kryokonservierung von Biopsien ermöglicht eine effizientere Verarbeitung und damit eine geringere Anzahl experimenteller Chargen. Da frisches Biopsiematerial selten von mehreren Spendern gleichzeitig entnommen wird, wird frisches Material in der Regel einzeln verarbeitet. Im Gegensatz dazu erhöht die Kryokonservierung die Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden können, enorm und führt zu einer Vermischung von Proben aus unterschiedlichen Zeitpunkten und Patienten; Mit dem einstufigen Kollagenase-Protokoll können 8 Proben pro Person innerhalb von 1 Stunde verarbeitet werden. Darüber hinaus ermöglicht die Kryokonservierung das Warten auf Pathologieberichte des (angrenzenden) Gewebes sowie die Untersuchung des Entzündungs- oder Malignitätsstatus der Proben vor der Probenverarbeitung. Dies kann von großem Vorteil sein, wenn dieselben Patienten im Längsschnitt untersucht werden und wenn versucht wird, Proben rund um ein bestimmtes damit verbundenes klinisches Ereignis zu sammeln. Durch diese gezielte Probenauswahl kann die Verarbeitung ungeeigneter Proben eingeschränkt und damit die Kosten weiter gesenkt werden. Zuvor hat sich gezeigt, dass die Kryokonservierung zu lebensfähigen Zellen führt, die für die scRNA-Sequenz in verschiedenen Geweben geeignet sind, beispielsweise in Nieren-30-, Pankreas-31- und Synovialgewebe32. Für die Darmschleimhaut wurde unseres Wissens nach bisher keine solche Studie durchgeführt. Darüber hinaus haben Konnikova et al. zeigten, dass die Kryokonservierung der Darmschleimhaut eine hohe Lebensfähigkeit und Funktionalität der Zellen bewahrt, was die Eignung von kryokonserviertem Darmschleimhautgewebe für scRNA-seq20 impliziert. Anhand der begrenzten Anzahl von zwei gepaarten Proben sehen wir, dass die Kryokonservierung über die gute Lebensfähigkeit und Funktionalität der Zellen hinaus nur geringe Auswirkungen auf die Zusammensetzung des Zelltyps und die Genexpression hat und für die Verwendung in der scRNA-seq-Analyse geeignet ist.

Trotz der klaren Vorteile der Kryokonservierung von Proben und der Verwendung von einstufigen gegenüber mehrstufigen Protokollen gibt es bestimmte Fälle, in denen andere Versuchsaufbauten optimaler sind. Beispielsweise kann ein mehrstufiges Dissoziationsprotokoll zur Optimierung der Ausbeute schichtspezifischer Zelltypen vorzuziehen sein oder wenn Oberflächenproteine ​​zur Markierung solcher Zelltypen, die nur in einer bestimmten Schicht vorhanden sind, nicht verfügbar sind. Darüber hinaus bringt die Kryokonservierung zwar viele Vorteile mit sich, der Verlust myeloischer Zellen erfordert jedoch die Verwendung von frischem Material, wenn es sich hierbei um den Zelltyp handelt, der hauptsächlich von Interesse ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Entscheidung für ein Dissoziationsprotokoll viele Faktoren abgewogen werden müssen, darunter Zellzusammensetzung, Zelllebensfähigkeit und Chargeneffekte. Abhängig von den gestellten Forschungsfragen kann sich die Bedeutung dieser Faktoren verschieben. Daher gibt es nicht den besten Dissoziationsansatz für alle möglichen Situationen. Basierend auf den Vergleichen in dieser Studie haben wir ein Protokollentscheidungstool entwickelt, das Wissenschaftler durch mehrere Fragen in einem Entscheidungsbaum führen kann, um bei der Entscheidung über die optimale Dissoziationsstrategie für ihren Versuchsaufbau und ihre Fragen zu helfen (Abb. 5).

Durch die Vermehrung von Epithel- und Immunzellen mithilfe kryokonservierter und dissoziierter Zellen haben wir die Vielseitigkeit des einstufigen Protokolls für die Verwendung in anderen Experimenten als scRNA-seq gezeigt. Wir glauben, dass aus demselben biologischen Material mehrere Datenschichten gewonnen werden können, was die Anwendung sowohl funktioneller Validierungen als auch Hochdurchsatztechniken ermöglicht. Basierend auf unseren Ergebnissen, die das Vorhandensein von Oberflächenmarkern nach der Dissoziation von Zellen mithilfe von Protease oder Kollagenase zeigen, können Zellen beispielsweise in einer Methode verwendet werden, die gleichzeitig sowohl Oberflächenmarker als auch Einzelzelltranskription untersucht, wie z. B. CITE-seq. Eine weitere anwendbare Methode ist CyTOF, die die gleichzeitige Untersuchung von etwa 40 Zelloberflächenmarkern in Millionen von Zellen ermöglicht und so die Identifizierung von Oberflächenmarkern (seltener) Zelltypen ermöglicht33. Wie gezeigt, können Zellen bei richtiger Handhabung isoliert und vermehrt werden, was eine weitere Funktionsanalyse ermöglicht. Insgesamt könnte das hier vorgestellte einstufige Kollagenase-Dissoziationsprotokoll unter Verwendung kryokonservierter Biopsien positive Auswirkungen auf die personalisierte Medizin haben. Erstens können bestimmte Gewebe im Krankheitskontext gründlich charakterisiert werden, um pathogene Zelltypen zu identifizieren. Zweitens würden diese pathogenen Zellen die Entdeckung neuer Angriffspunkte für Therapien ermöglichen und könnten sogar zur Bewertung der Wirksamkeit solcher Medikamente verwendet werden34.

Eine der Einschränkungen aller Zelldissoziationsprotokolle besteht darin, dass die räumliche Konfiguration der Zellen verloren geht. Wie bereits erwähnt, ist der Darm ein komplexes Gewebe, dessen Lage eine wichtige Rolle dabei spielt, wie sich bestimmte Zellen verhalten. Derzeit gibt es neuartige Entwicklungen wie die bildgebende Massenzytometrie35 und die räumliche Transkriptomik36,37, die bei der Untersuchung der Zelllokalisation im Gewebe helfen können. In Verbindung mit tiefgreifenden Einzelzell-Multi-Omics-Techniken könnte die Charakterisierung des Interaktoms des Darms bei komplexen Erkrankungen die Türen zu neuen Fortschritten in der Medizin öffnen.

Zusätzlich zu den Einzelzell-Dissoziationsmethoden, die in diesem Manuskript verglichen werden, könnten Einzelzell-Isolierungsmethoden eine geeignete Alternative sein, um Batch-Effekte zu vermeiden, die mit der Dissoziationsmethode verbunden sind, oder für den Fall, dass nur gefrorenes Gewebe verfügbar ist38,39. Beim Vergleich des Kerntranskriptoms mit dem zytoplasmatischen Transkriptom einzelner Zellen sind die Korrelationen hoch, aber die Anzahl der in den Kernen eingefangenen UMIs bleibt immer ein Bruchteil dessen, was in einer einzelnen Zelle eingefangen werden kann40,41. Darüber hinaus gibt es derzeit kein Protokoll, mit dem Kerne für scRNA-seq aus der gesamten Vielfalt der Zelltypen, die im äußerst heterogenen Gewebe des Darms vorkommen, effizient isoliert werden können. Wenn solche Protokolle jedoch verfügbar werden, könnten sie eine interessante Alternative für kryokonservierte Einzelzell-Dissoziationsmethoden darstellen.

Wir stellen ein neuartiges Protokoll zur Dissoziation von Darmschleimhautgewebe vor, das es zukünftigen Wissenschaftlern ermöglichen wird, planbare, groß angelegte (multizentrische) Forschung mit begrenzten Batch-Effekten durchzuführen. Es gab nur wenige Studien, in denen Dissoziationsprotokolle für die Dissoziation von Darmschleimhautgewebe verglichen wurden, geschweige denn für die anschließende scRNA-Sequenz, was die Bedeutung der hier vorgestellten Ergebnisse unterstreicht. Angesichts der Zusammensetzung der Darmschleimhaut glauben wir, dass die in diesem Artikel beschriebene Methodik ein guter Ausgangspunkt für die Dissoziation und Kryokonservierung anderer Schleimhautgewebe wie Lungen- oder Mundschleimhaut zum Zweck von Einzelzellsequenzierungsstudien sein könnte. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse Forscher aus anderen Bereichen dazu inspirieren, Faktoren zu hinterfragen, die ihre scRNA-seq-Daten beeinflussen.

Biopsien wurden in RPMI1640, ergänzt mit GlutaMax (Gibco) und 5 % hitzeinaktiviertem FCS, gesammelt. Nach der Entnahme wurden sie maximal 30 Minuten auf Eis gehalten. Biopsien wurden entweder direkt zur Dissoziation verwendet (frisch) oder in kaltem Gefriermedium (90 % hitzeinaktiviertes FCS mit 10 % DMSO) kryokonserviert. Die Kryokonservierung von Biopsien und die Auftauvorgänge wurden wie zuvor beschrieben20 durchgeführt. Kurz gesagt, die Biopsien wurden schnell (< 60 s) in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut und zweimal mit kalter Auftaulösung (PBS ohne MgCl2 und CaCl2, ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem FCS) gewaschen. Wir haben zwei Datensätze erstellt: einen „Kryokonservierungsdatensatz“, der gepaarte, frisch kryokonservierte Proben von zwei Personen verwendet, die nur mit dem einstufigen Kollagenase-Protokoll dissoziiert wurden, und einen nicht gepaarten „Zelldissoziationsdatensatz“, der Darmbiopsien verschiedener Personen verwendet, die mit allen isoliert wurden Dissoziationsprotokolle, die hier unten beschrieben werden. Für den Datensatz „Zelldissoziation“ verwendeten wir zweistufige Kollagenase-verdaute Zellen von Smillie et al. Datensatz17.

Biopsien wurden nach einem dieser drei Protokolle dissoziiert:

Zweistufiges Kollagenase-Protokoll unter Verwendung frischer Biopsien und Kollagenase I + II-haltiger Liberase und Aufteilung der IEL- und LPL-Schicht, wie zuvor beschrieben17

Dreistufiges Proteaseprotokoll mit frischen Biopsien und kalter Protease wie zuvor beschrieben, Aufteilung von F1 und F2 [angepasst von 22 und 23]

Einstufiges Kollagenase-Protokoll, bei dem kryokonservierte Biopsien und Kollagenase IV verwendet werden, um Biopsien als Ganzes (WB) in einem Verdauungsschritt zu isolieren.

Kurz gesagt, das zweistufige Kollagenase-Protokoll inkubiert frische Biopsien 15 Minuten lang in RPMI1640 mit EDTA auf einem Drehspießgestell bei 37 °C, wonach durch gründliches Schütteln die Epithelschichten von der Lamina propria abgeworfen werden. Anschließend werden die geteilten Schichten separat verdaut, während sie 30 Minuten lang bei 37 °C rotieren: Die Epithelschicht wird mit TrypLE Express Enzyme (Gibco) und die Lamina propria-Schicht mit einem gemischten Kollagenasepräparat (Liberase TM) verdaut.

Das dreistufige Proteaseprotokoll schneidet Biopsien zunächst in kleine Stücke. Anschließend wird durch Pipettenmischen in kaltem (4 °C) HBSS, ergänzt mit EDTA, Fraktion 1 abgetrennt, bei der es sich hauptsächlich um Immunzellen handelt. Diese werden im Überstand entfernt und die Epithel- und Lamina propria-Zellen verbleiben in Gewebeklumpen. Die Epithelschicht und die Lamina propria werden dann durch eine 30-minütige Inkubation in HBSS mit kalter (4 °C) Protease und EDTA und anschließend durch einen 10-minütigen Kollagenaseverdau bei RT dissoziiert, um die endgültigen Gewebeklumpen zu dissoziieren (Fraktion 2). Alle Zellen werden dann mit ACK-Lysepuffer inkubiert, um nicht lebensfähige Zellen vor zwei letzten Waschgängen zu entfernen.

Das einstufige Kollagenase-Protokoll inkubiert Biopsien 25 Minuten lang bei 37 °C in einem Schüttelinkubator in Verdauungsmedium (RPMI1640, ergänzt mit GlutaMax (Gibco), 200 iU/ml Kollagenase IV C1889 (ThermoFisher), 10 iU/ml DNAse II D8764 ( ThermoFisher), 35 iU/ml SUPERaseIn AM2694 (Invitrogen), 2 % hitzeinaktiviertes FCS). Optimalerweise werden 2–4 Pinch-Biopsien pro 2,5 ml Verdauungsmedium dissoziiert. Nach 10-minütiger Inkubation im Verdauungsmedium werden die Biopsien mit einer p1000-Pipettenspitze resuspendiert. Wenn sich eine Biopsie nicht gut verdauen lässt (Rektum ist im Allgemeinen härter als Ileum, fibrotisches Gewebe kann schwieriger sein), kann man sie mit einer (gereinigten, sterilisierten) Schere schneiden und/oder die Pipettenspitze abschneiden, um ein größeres Pipettierlumen zu ermöglichen. Nach weiteren 15 Minuten Inkubation werden die Biopsien erneut mit einer p1000-Spitze und anschließend mit einer p200-Spitze pipettiert. Anschließend wird der Verdau durch Zugabe von 5 mM EDTA (Sigma) für 2 Minuten auf Eis gestoppt. Anschließend werden > 10 ml RT-PBS–/– hinzugefügt, um Resteffekte der Kollagenase-EDTA-Reagenzien zu minimieren, woraufhin die Zellen 5 Minuten lang bei 300 g und RT zentrifugiert werden. Das Pellet wird in 100 µl TrypLE Express Enzyme resuspendiert und 1,5 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von kaltem RPMI1640 mit 2 % hitzeinaktiviertem FCS gestoppt und die Zellen werden 5 Minuten lang bei 300 g und 4 °C zentrifugiert. Als nächstes wird das Pellet in Kaltwaschpuffer I (PBS -/- ergänzt mit 0,4 % BSA und 10 iU/ml DNase II) resuspendiert und durch ein 70 µm-Zellsieb filtriert. Um die Zellsammlung zu maximieren, wird der Filter noch einmal mit Kaltwaschpuffer II (PBS -/- ergänzt mit 0,4 % BSA) gewaschen und die Zellen werden nach 5-minütiger Zentrifugation bei 300 g und 4 °C gesammelt.

Um Multiplexing zu ermöglichen, das möglicherweise durch Unterschiede zwischen Sequenzchargen hervorgerufene Effekte verhindert, werden dissoziierte Zellen aus separaten Proben mit Barcode-Antikörpern („Zell-Hashing“) unter Verwendung von TotalSeq-A-Oligo-konjugierten Hashtag-Antikörpern (Biologend) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert [Stoeckius et al. 2018]. Kurz gesagt, 400.000 Zellen werden 30 Minuten lang auf einer Schüttelplatte auf Eis mit 0,5 μg Hashtag-Antikörpern und 100 μl Färbepuffer inkubiert. Danach werden die Zellen zweimal mit PBS, ergänzt mit 0,4 % BSA, gewaschen, um überschüssige Hashtags zu entfernen. Auf diese Weise werden die kryokonservierten Proben, die mit dem einstufigen Kollagenase-Protokoll dissoziiert wurden, separat gehasht und pro 4 Proben pro 10-fach-Spur-Pool gepoolt. Frische Proben werden gesammelt, dissoziiert und separat in eine einzelne 10-fach-Spur geladen.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde vor der Beladung auf einem 10X Genomics Chromium Controller durch Anfärben der Zellen mit Trypanblau-Färbereagenz (Sigma, T6146) im Verhältnis 1:1 bestimmt und mit einem Hämozytometer gezählt. Die prozentuale Lebensfähigkeit wurde berechnet als [Anzahl der gefärbten Zellen] dividiert durch [Anzahl aller Zellen] *100 %.

Hashtag- und cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung der Anweisungen von Biolegend in Kombination mit dem Protokoll erstellt, das dem 10X Genomics-Bibliothekskit beiliegt (v2 und v3 für das einstufige Kollagenase-Protokoll bzw. v3 und v3.1 für das dreistufige Protease-Protokoll). Diese Dissoziationsverfahren wurden mit zuvor veröffentlichten Daten verglichen, die mithilfe des zweistufigen Kollagenase-Protokolls17 gesammelt und mit 10X Genomics Library Prep v1 und v2 erstellt wurden. Bibliotheken, die Proben des einstufigen Kollagenase-Protokolls enthielten, wurden teilweise bei BGI (Hongkong) auf einem Illumina NovaSeq6000 unter Verwendung eines 150-bp-PE-Kits und auf einem BGISEQ500 unter Verwendung eines 100-bp-PE-Kits unter Verwendung benutzerdefinierter Programme (28-8-150 bp) sequenziert bzw. 100-8-150 bp). Die Bibliotheken wurden auf durchschnittlich 110.442 (SD 42.975) Lesevorgänge pro Zelle für die cDNA-Bibliotheken und 3.073 (SD 1.768) Lesevorgänge pro Zelle für die Hashtag-Bibliotheken sequenziert. Bibliotheken mit Proben des dreistufigen Proteaseprotokolls wurden am Sanger Institute (Hinxton, UK) sequenziert, teilweise auf einem HiSeq 4000 75 PE-Kit und teilweise auf einer NovaSeq S4 100 PE XP-Maschine. Proteasebibliotheken wurden für die cDNA-Bibliothek mit durchschnittlich 103.181 (SD 34.489) Lesevorgängen pro Zelle sequenziert.

Die mkfastq- und Count-Pipelines von CellRanger v3.0.2 wurden verwendet, um FASTQ-Dateien zu erstellen, die Sequenzierungsablesungen an das hg19-Referenzgenom für einstufige Kollagenaseproben und an das hg38-Referenzgenom für Proteaseproben anzupassen sowie Zellen und UMI (eindeutiger molekularer Identifikator) zu filtern ) Barcodes und Zählen der Genexpression pro Zelle. Die nachgelagerte Datenanalyse wurde mit Seurat v3.1.4 durchgeführt. Die Zählmatrix wurde nach Zellen gefiltert, die < 200 Gene und > 60 % mitochondriale Messwerte enthielten. Hashtag-Daten wurden mithilfe der Centered-Log-Ratio-Transformation normalisiert und HTODemux wurde verwendet, um jeder Zelle eine Hashtag-ID zuzuweisen. Für die weitere Analyse wurden nur einzelne Zellen mit Hashtag-ID ausgewählt.

Cluster wurden mit verschiedenen Auflösungen definiert, um den in den Daten vorhandenen Zelltypen gerecht zu werden. Die Klassifizierung der Zelltypen erfolgte mithilfe eines zweistufigen Ansatzes. Zunächst wurde das scPred-Paket42 verwendet, um ein SVM-Vorhersagemodell auf einer Teilmenge von 750 Zellen pro Zelltyp der Quelldaten aus dem zweistufigen Kollagenase-Protokoll17 zu trainieren, das unter Verwendung der gleichen QC-Schritte wie oben beschrieben gefiltert und vorbereitet wurde. Dieses Modell wurde verwendet, um grobe Zelltypen für Proben vorherzusagen, die mit jedem der beiden anderen Protokolle generiert wurden. Zweitens wurden Datensätze aller drei Protokolle mithilfe der SCTransform-Integration43 integriert, wobei der Anteil der mitochondrialen und ribosomalen Gene herausgerechnet wurde. Die ersten 30 Hauptkomponenten dieses integrierten Datensatzes wurden für die Zellclusterung mithilfe der FindCluster-Funktion von Seurat verwendet und zur Visualisierung wurde ein UMAP verwendet. Zelltypspezifische Marker für die resultierenden Zelltypen sind in Suppl dargestellt. Abbildung 9.

Der Kryokonservierungsdatensatz wurde verwendet, um die Auswirkung der Neuverwendung im Vergleich zur Kryokonservierung auf grundlegende Sequenzierungsqualitätsparameter zu bewerten. Zuerst haben wir einen Überblick über die Sequenzierungsparameter einer der frischen Proben aus dem Kryokonservierungsdatensatz im Vergleich zu einer gepaarten kryokonservierten Probe des Kryokonservierungsdatensatzes und fünf gleich verarbeiteten kryokonservierten Proben aus unserem Labor erstellt.

Als nächstes bewerteten wir für die Kryokonservierungs- und Dissoziationsdatensätze die Qualität der Daten, indem wir die Beziehung zwischen der Anzahl der exprimierten Gene und der Anzahl der in jedem Datensatz vorhandenen UMIs abfragten. Zweitens haben wir die mitochondriale Genexpression im Vergleich zur Anzahl der im Datensatz vorhandenen UMIs visualisiert.

Die DE-Analyse wurde mit MAST über die FindAllMarkers-Funktion von Seurat44 durchgeführt. Hierzu wurden log-2-transformierte RNA-Expressionsdaten im Bibliotheksmaßstab (10.000 Transkripte pro Zelle) als Eingabe verwendet. Es wurden nur Gene getestet, die in mindestens 10 % der Zellen vorhanden waren, die zu einem der untersuchten Cluster gehörten und eine logarithmische Faltungsänderung von mindestens 0,25 aufwiesen. In die Analysen wurden nur Vergleiche von > 100 Zellen pro Gruppe einbezogen, und in die nachfolgenden Signalweganalysen wurden nur Gene einbezogen, die in allen verglichenen Gruppen vorhanden waren.

Um den Einfluss der Kollagenase-Behandlung auf die Genexpression zu beurteilen, wurden Epithelzellen von Smillie et al. Der Datensatz17, der aus dem ersten bzw. zweiten Schritt des Protokolls stammt, wurde verglichen. Zunächst wurden Zellen aus dem Hauptdatensatz substituiert. Da Größenunterschiede zwischen den beiden Schritten die Analyse verfälschen könnten, wurden die Zellen auf eine entsprechende Anzahl von 2617 Zellen pro Dissoziationsschritt heruntergerechnet. Die differenzielle Expressionsanalyse wurde wie unten beschrieben durchgeführt und die resultierenden Gene wurden auf Überlappung mit einem Satz von 140 Kollagenase-induzierten Genen gescannt15. Der exakte Fisher-Test wurde durchgeführt, um zu beurteilen, ob die unterschiedlich exprimierten Gene mit Kollagenase-induzierten Genen angereichert waren.

Hochregulierte Pfade pro Cluster wurden mithilfe des ReactomePA-Pakets45 und der Reactome-Pathway-Datenbank (https://reactome.org/) bestimmt. Zuerst wurden die Gensymbole der hochregulierten Gene in Entrez-IDs umgewandelt, dann wurden Pfade berechnet, die mit einem angepassten p-Wert < 0,05 angereichert waren.

Einzelzellsuspensionen wurden mit einem der drei Antikörper-Panels angefärbt, wie in der Ergänzungstabelle 4 dargestellt. Kurz gesagt wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert und dann in 100 μl PBS, ergänzt mit 2 % FCS, resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 4 °C gefärbt, anschließend zweimal gewaschen und in 400 μl PBS, ergänzt mit 2 % FCS, resuspendiert. FACS-Daten wurden mit dem BD LSR-II-System (BD Bioscience) generiert und mit FlowJo v10 gemäß der in Suppl gezeigten Gating-Strategie analysiert. Abbildung 9.

Die Zellen wurden mit Lebensfähigkeitsfarbstoff gefärbt, wie in der Ergänzungstabelle 4 dargestellt. Abgestorbene Zellen wurden durch die Gating-Strategie bestimmt, wie in der Ergänzungstabelle 4 dargestellt. Abbildung 9.

Organoide wurden mithilfe von Zellen erzeugt, die mit dem einstufigen Kollagenase-Protokoll dissoziiert wurden. Die Zellen, die nach dem Laden des 10 × Chips für scRNA-seq übrig blieben, wurden für die Organoidkultur verwendet. Die Zellen wurden mit 10 ml HGF-Medium gewaschen. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 1000 U/min und 4 °C zentrifugiert und der Überstand entfernt. 15 µl Matrigel wurden dem Pellet zugesetzt, das in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert wurde. Die Platte wurde 15 Minuten lang kopfüber in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert. 200 μl EM-Medium mit Primocin wurden in die Vertiefungen gegeben (1:500). Organoide wurden expandiert, bis die gewünschte Dichte zum Einfrieren in flüssigem Stickstoff erreicht war.

IEL-Zellen (CD45 + CD3 + TCRαβ + CD8αβ + CD103 +) wurden aus Darmgewebe isoliert und gemäß dem Protokoll in vitro vermehrt46. Kurz gesagt, dissoziierte Zellen aus dem Darm mit IEL-Phänotyp wurden auf einem Zellsortierer MoFlo Astrios von Beckman Coulter sortiert. IELs wurden in RPMI mit 10 % Human-AB-Serum (Sigma Aldrich, H4522), 0,1 % IL-2 (RD System, AE5916003), 0,1 % pPHA-L (Sigma, L2769-2MG) und einer Mischung aus Feeder-Zellen kultiviert von bestrahlten PBMCs und Epstein-Barr-Virus-transformierten B-Zellen von 3 verschiedenen Spendern. Feeder-Zellmischungen wurden in einem Verhältnis von 10 PBMCs:1 EBV:1 CD8+-Zelle hergestellt. Anschließend wurden die Zellen 10 Tage lang vermehrt und mittels FACS analysiert, um die Reinheit der Zellen zu bestätigen.

Biologisches Material wurde von Patienten gemäß Protokollen erhalten, die von den regionalen Ethikkommissionen (Medizinische Ethikkommission des Universitätsklinikums Groningen und Ostengland, Cambridge South Research Ethikkommission) genehmigt wurden, und die Personen, die Material spendeten, gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Versuchsprotokolle wurden von der Medizinischen Ethikkommission des Universitätsklinikums Groningen (NL58808.042.16, NL24572.018.08) und der East of England, Cambridge South Research Ethics Committee (17/EE/0338) genehmigt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im MOLGENIS47-Repository verfügbar, https://downloads.molgeniscloud.org/downloads/singelcell_methodspaper/. Die FACS-Dateien, die diese Studie unterstützen, sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

Der gesamte Code ist über GitHub verfügbar: https://github.com/WeersmaLabIBD/SingleCell/tree/master/Method_comparisons.

Van Gelder, RN et al. Amplifizierte RNA, synthetisiert aus begrenzten Mengen heterogener cDNA. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 87, 1663–1667 (1990).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Svensson, V., Vento-Tormo, R. & Teichmann, SA Exponentielle Skalierung der Einzelzell-RNA-Sequenz im letzten Jahrzehnt. Nat. Protokoll. 13, 599–604 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, SA & Vento-Tormo, R. Cell PhoneDB: Ableitung der Zell-Zell-Kommunikation aus der kombinierten Expression von Ligand-Rezeptor-Komplexen mit mehreren Untereinheiten. Nat. Protokoll. 15, 1484–1506 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Regev, A. et al. Wissenschaftsforum: Der menschliche Zellatlas. Elife 1–30 (2017).

Rajewsky, N. et al. LifeTime und Verbesserung der europäischen Gesundheitsversorgung durch zellbasierte interzeptive Medizin. Natur 587, 377–386 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elmentaite, R. et al. Einzelzellsequenzierung des sich entwickelnden menschlichen Darms enthüllt transkriptionelle Zusammenhänge mit Morbus Crohn im Kindesalter. Entwicklungszelle 55(6), 771–783 (2020). https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.11.010.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Das Tabula Sapiens-Konsortium. Die Tabula Sapiens: ein transkriptomischer Atlas mehrerer Organe einzelner Zellen des Menschen. Wissenschaft. https://doi.org/10.1126/science.abl4896 (2022).

Jasper Deuring, J. et al. Die Aktivierung des Pregnan-X-Rezeptors schränkt die NF-κB-Aktivität der Schleimhaut bei aktiven entzündlichen Darmerkrankungen ein. PLoS ONE 14, 1–15 (2019).

Google Scholar

Zhang, H. et al. Das Verdauungssystem ist ein potenzieller Weg von COVID-19: Eine Analyse des Einzelzell-Koexpressionsmusters von Schlüsselproteinen im viralen Eintrittsprozess. Gut 69, 1010–1018 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Mowat, AM & Agace, WW Regionale Spezialisierung innerhalb des intestinalen Immunsystems. Nat. Rev. Immunol. 14, 667–685 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

James, KR et al. Ausgeprägte mikrobielle und immunologische Nischen des menschlichen Dickdarms. Nat. Immunol. 21, 343–353 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Powell, DW, Pinchuk, IV, Saada, JI, Chen, X. & Mifflin, RC Mesenchymale Zellen der intestinalen Lamina propria. Annu. Rev. Physiol. 73, 213–237 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allaire, JM et al. Erratum: The Intestinal Epithelium: Central Coordinator of Mucosal Immunity (Trends in Immunology (2018) 39(9) (677–696), (S1471490618300681), (10.1016/j.it.2018.04.002)). Trends Immunol. 40, 174 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Reißig, S., Hackenbruch, C. & Hövelmeyer, N. Isolierung von T-Zellen aus dem Darm. in Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols) 21–25 (Humana Press, New York, NY, 2014). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1212-4_3.

Van Den Brink, SC et al. Die Einzelzellsequenzierung zeigt die durch Dissoziation induzierte Genexpression in Gewebesubpopulationen. Nat. Methoden 14, 935–936 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

O'Flanagan, CH et al. Die Dissoziation solider Tumorgewebe mit kaltaktiver Protease für die Einzelzell-RNA-Sequenz minimiert konservierte Kollagenase-assoziierte Stressreaktionen. Genombiol. 20, 1–13 (2019).

Artikel Google Scholar

Smillie, CS et al. Intra- und interzelluläre Neuverdrahtung des menschlichen Dickdarms bei Colitis ulcerosa. Zelle 178, 714-730.e22 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parikh, K. et al. Diversität der Dickdarmepithelzellen bei Gesundheit und entzündlichen Darmerkrankungen. Natur 567, 49–55 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Herring, CA et al. Die unbeaufsichtigte Trajektorienanalyse von Einzelzell-RNA-Seq- und Bildgebungsdaten deckt alternative Ursprünge von Büschelzellen im Darm auf. Zellsystem 6, 37-51.e9 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Konnikova, L. et al. Hochdimensionale Immunphänotypisierung und Transkriptionsanalysen zeigen eine robuste Erholung lebensfähiger menschlicher Immun- und Epithelzellen aus gefrorenem Magen-Darm-Gewebe. Schleimhautimmunol. 11, 1684–1693 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitsialis et al. Einzelzellanalysen von Dickdarm und Blut zeigen deutliche Immunzellsignaturen von Colitis ulcerosa und Morbus Crohn. Gastroenterologie (2020).

Adam, M., Potter, AS & Potter, SS Psychrophile Proteasen reduzieren Einzelzell-RNA-Seq-Artefakte drastisch: Ein molekularer Atlas der Nierenentwicklung. Entwickler 144, 3625–3632 (2017).

CAS Google Scholar

Rebecca E. McIntyre. https://www.protocols.io/view/single-cell-dissociation-of-intestinal-gut-tissue-bq94mz8w.

Osorio, D. & Cai, JJ Systematische Bestimmung des Mitochondrienanteils in menschlichen und Mäusegeweben zur Qualitätskontrolle von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. Bioinformatik (Oxford, England), 37(7), 963–967. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa751 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Carrasco, A. et al. Vergleich der Lymphozyten-Isolierungsmethoden für endoskopische Biopsieproben aus der Dickdarmschleimhaut. J. Immunol. Methoden 389, 29–37 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stoeckius, M. et al. Gleichzeitige Epitop- und Transkriptommessung in einzelnen Zellen. Nat. Methoden 14, 865–868 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Machado et al. Stressabbau: Neue Methoden zur Linderung dissoziationsbedingter Artefakte Trends in der Zellbiologie S0962-8924(21)00096-9 (2021).

Schreurs, RRCE et al. Quantitativer Vergleich der Techniken zur Isolierung menschlicher mononukleärer intestinaler Leukozyten für durchflusszytometrische Analysen. J. Immunol. Methoden 445, 45–52 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martin, JC et al. Die Einzelzellanalyse von Morbus Crohn-Läsionen identifiziert ein pathogenes Zellmodul, das mit einer Resistenz gegen die Anti-TNF-Therapie verbunden ist. Zelle 178, 1493-1508.e20 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Denisenko, E. et al. Systematische Bewertung von Gewebedissoziation und Speicherverzerrungen in Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenz-Workflows. Genombiol. 21, 1–25 (2020).

Artikel Google Scholar

Bonnycastle, LL et al. Einzelzell-Transkriptomik aus menschlichen Pankreasinseln: Auf die Probenvorbereitung kommt es an. Biol. Methodenprotokoll. 4, 1–14 (2019).

Artikel Google Scholar

Donlin, LT et al. Hochdimensionale Analysen von Zellen, die aus kryokonserviertem Synovialgewebe dissoziiert wurden. bioRxiv 1–15 (2018). https://doi.org/10.1101/284844.

Ornatsky, O. et al. Hochgradig multiparametrische Analyse mittels Massenzytometrie. J. Immunol. Methoden 361, 1–20 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Corridoni, D., Chapman, T., Antanaviciute, A., Satsangi, J. & Simmons, A. Entzündliche Darmerkrankungen durch die Linse von Einzelzell-RNA-seq-Technologien. Entzündung. Darm Dis. 26, 1658–1668 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Chang, Q. et al. Bildgebende Massenzytometrie. Zytometrie A 91, 160–169 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Satija, R., Farrell, JA, Gennert, D., Schier, AF & Regev, A. Räumliche Rekonstruktion von Einzelzell-Genexpressionsdaten. Nat. Biotechnologie. 33, 495–502 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Achim, K. et al. Räumliche Hochdurchsatzkartierung von Einzelzell-RNA-Seq-Daten auf Ursprungsgewebe. Nat. Biotechnologie. 33, 503–509 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grindberg, RV et al. RNA-Sequenzierung aus einzelnen Kernen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 110, 19802–19807 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krishnaswami, SR et al. Verwendung einzelner Kerne für die RNA-Sequenz, um das Transkriptom postmortaler Neuronen zu erfassen. Nat. Protokoll. 11, 499–524 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lake, BB et al. Eine Vergleichsstrategie für Einzelkern- und Einzelzell-Transkriptome bestätigt die Genauigkeit der vorhergesagten Zelltyp-Expression aus Kern-RNA. Wissenschaft. Rep. 7, 6031 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abdelmoez, MN et al. SINC-seq: Die Korrelation vorübergehender Genexpressionen zwischen Zellkern und Zytoplasma spiegelt die Physiologie einzelner Zellen wider. Genombiol. 19, 66 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Alquicira-Hernandez, J., Sathe, A., Ji, HP, Nguyen, Q. & Powell, JE ScPred: Genaue überwachte Methode zur Zelltypklassifizierung aus Einzelzell-RNA-seq-Daten. Genombiol. 20, 1–17 (2019).

Artikel Google Scholar

Stuart, T. et al. Umfassende Integration von Einzelzellendaten. Zelle 177, 1888-1902.e21 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finak, G. et al. MAST: Ein flexibler statistischer Rahmen zur Bewertung von Transkriptionsänderungen und zur Charakterisierung der Heterogenität in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. Genombiol. 16, 1–13 (2015).

Artikel Google Scholar

Yu, G. & He, QY ReactomePA: Ein R/Bioconductor-Paket für die Analyse und Visualisierung von Reaktompfaden. Mol. Biosystem. 12, 477–479 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jabri, B. et al. Selektive Expansion intraepithelialer Lymphozyten, die den HLA-E-spezifischen natürlichen Killerrezeptor CD94 bei Zöliakie exprimieren. Gastroenterology 118, 867–879 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Van der Velde, J. et al. MOLGENIS-Forschung: Fortschrittliche Bioinformatik-Datensoftware für Nicht-Bioinformatiker. Bioinformatik 35, 6 (2019).

Google Scholar

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Wir danken Kate Mc Intyre für die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken Tjasso Blokzijl für seine Bemühungen bei der Erzeugung von Organoiden und für die Weitergabe seiner Protokolle und Bilder der Organoidprodukte. Wir danken Joram Mooiweer und Fulya Doganay für ihre Bemühungen bei der Isolierung und Expansion von IEL-Zellen.

WTCUV wird durch ein uneingeschränktes Forschungsstipendium von Takeda unterstützt. ADRS wird durch das CONACYT-I2T2-Stipendium (Nr. 459192) unterstützt. IJ wird durch ein Rosalind Franklin Fellowship der Universität Groningen und ein VIDI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Nr. 016.171.047) unterstützt. SW wurde von der Niederländischen Organ-on-Chip-Initiative unterstützt, einem NWO-Gravitationsprojekt (024.003.001), das vom Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft der niederländischen Regierung finanziert wird. RKW wird durch uneingeschränkte Forschungsstipendien von Takeda, Johnson and Johnson, Tramedico und Ferring 37 Pharmaceutical Company unterstützt, außerdem ist er Berater für Takeda Pharmaceuticals. LF wird durch uneingeschränkte Forschungsstipendien von Takeda, ein Oncode Investigator-Stipendium und ein NWO Vici-Stipendium (Nr. 917.14.374) unterstützt. EAMF wird durch ein uneingeschränktes Forschungsstipendium von Takeda, ein Clinical Fellow Grant von ZonMW und ein Gastrostart-Stipendium der Niederländischen Gesellschaft für Gastroenterologie unterstützt. MGPvdW wird durch ein NWO Veni-Stipendium (Nr. 192.029) unterstützt.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Werna TC Uniken Venema und Aarón D. Ramírez-Sánchez.

Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Universität Groningen, Universitätsklinikum Groningen, Groningen, Niederlande

Verna TC Uniken Venema, Emilia Bigaeva, Rinse K. Weersma & Eleonora AM Festen

Abteilung für Genetik, Universität Groningen, Universitätsklinikum Groningen, Groningen, Niederlande

Werna TC Uniken Venema, Aarón D. Ramírez-Sánchez, Sebo Withoff, Iris Jonkers, Lude Franke und Monique GP van der Wijst

Wellcome Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, Großbritannien

Rebecca E. McIntyre & Mennatallah Ghouraba

Abteilung für Gastroenterologie, Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

Tim Raine

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WTCUV, ADRS, EVB, REM, MG und MGPvdW führten Nasslaborexperimente durch. RKW, EAMF und TR stellten Muster zur Verfügung. WTCUV, ADRS, EAMF und MGPvdW haben das Manuskript konzipiert und geschrieben. SW und IHJ halfen beim Schreiben und Überprüfen des Manuskripts. LF, RKW und EAMF stellten die finanzielle Unterstützung für das Projekt bereit, das zu diesem Manuskript führte. WTCUV und ADRS führten die statistischen Analysen durch. Alle Autoren waren an der Bearbeitung des Manuskripts beteiligt.

Korrespondenz mit Eleonora AM Festen oder Monique GP van der Wijst.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Uniken Venema, WTC, Ramírez-Sánchez, AD, Bigaeva, E. et al. Protokolle zur Dissoziation der Darmschleimhaut beeinflussen die Proportionen der Zelltypen und die Genexpressionsniveaus einzelner Zellen. Sci Rep 12, 9897 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13812-y

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Eingegangen: 19. Januar 2021

Angenommen: 27. Mai 2022

Veröffentlicht: 14. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13812-y

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