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Oct 24, 2023

Immunogenität eines abgesonderten C

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 296 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Sowohl aktuelle Lebendimpfstoffe als auch abgeschwächte und abgetötete Virusimpfstoffe gegen das Bovine Virus Diarrhea Virus (BVDV) haben ihre Grenzen. Hier berichten wir über die Entwicklung eines Impfstoffs gegen BVDV-Untereinheiten durch (i) die Expression einer sekretierten Form eines rekombinanten E2-Glykoproteins unter Verwendung von BHK21-Zellen und (ii) die Bestimmung der Immunantworten in Mäusen. Das E2-Glykoprotein wurde durch Deletion der C-terminalen Transmembran-Ankerdomäne und Fusion mit einem V5-Epitop-Tag modifiziert. Dies ermöglichte den Nachweis mithilfe von monoklonalen Anti-V5-Antikörpern zusammen mit einer einfachen Reinigung der exprimierten, sekretierten Form von E2 aus dem Zellmedium. Darüber hinaus haben wir das grün fluoreszierende Protein (GFP), das über eine Ribosomen-Skipping-Sequenz des Thosea asigna-Virus 2A (T2A) mit E2 verknüpft ist, genetisch fusioniert und so ein selbstverarbeitendes Polyprotein [GFP-T2A-BVDV-E2trunk-V5] geschaffen, das diskrete [GFP- T2A]- und [E2trunk-V5]-Translationsprodukte: GFP-Fluoreszenz fungiert daher als Ersatzmarker der E2-Expression. BALB/c-Mäuse wurden mit aus Zellmedien gereinigtem [E2trunk-V5] geimpft und es wurden sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten beobachtet . Unser Antigen-Expressionssystem bietet daher sowohl (i) ein einfaches Antigen-Reinigungsprotokoll als auch (ii) eine praktikable Strategie für die weitere Produktion von Impfstoffen im großen Maßstab.

Das bovine virale Durchfallvirus (BVDV) ist ein wichtiger Infektionserreger bei Rindern, Schweinen und anderen Wiederkäuern. Es verursacht viralen Rinderdurchfall und Schleimhauterkrankungen und führt zu unterschiedlichen klinischen Folgen, die von leichten Erkrankungen bis hin zu akuten und schweren lebensbedrohlichen Erkrankungen reichen1. Zu den klinischen Anzeichen einer BVDV-Infektion gehören Fieber, Depression, Anorexie, Schleimhauterosionen, eitriger Augen- und Nasenausfluss, Husten, Pansenatonie, Durchfall, Aborte und verminderte Milchleistung2. Eine BVDV-Infektion führt auch zu einer Immunsuppression und erhöht dadurch die Anfälligkeit für bakterielle oder virale Lungenentzündung3. Bei Tieren mit BVDV-induzierter Immunsuppression kann die Exposition gegenüber anderen Krankheitserregern die Morbidität und Mortalität erheblich erhöhen, was entsprechend nachteilige wirtschaftliche Auswirkungen auf die Rindfleisch- und Milchindustrie hat4,5.

Das BVDV-Genom ist eine einzelsträngige Positiv-RNA von etwa 12,3 kb. BVDV gehört zur Gattung Pestivirus in der Familie Flaviviridae, zusammen mit dem Border Disease Virus (das Schafe befällt) und dem klassischen Schweinepestvirus6. BVDV umfasst zwei Hauptgenotypen: BVDV-1 (Pestivirus A, unterteilt in 22 Subtypen von BVDV-1a bis BVDV-1v) und BVDV-2 (Pestivirus B, unterteilt in vier Subtypen von BVDV-2a bis BVDV-2d). Ein weiteres atypisches Pestivirus, bekannt als HoBi-ähnliches Virus, wurde vorläufig als BVDV-3 identifiziert, das vier Subtypen aufweist7. Jedes BVDV hat zwei Biotypen, einen zytopathischen und einen nicht-zytopathischen, je nach den Auswirkungen des auf kultivierten Zellen gezüchteten Virus. Der nichtzytopathische Stamm schädigt infizierte Zellen nicht8. Es kann den sich entwickelnden Fötus infizieren, wenn Kühe während der frühen Trächtigkeit dem Virus ausgesetzt sind. Darüber hinaus wird BVDV in der Herde durch die Produktion persistent infizierter (PI) Kälber9 aufrechterhalten, da diese gegenüber dem Virus immuntolerant werden und im Laufe ihres Lebens große Mengen des Virus ausscheiden. Daher gelten PI-Tiere als Hauptquelle für die Verbreitung von BVDV10. Zu den wirksamsten Maßnahmen in BVDV-Präventionsprogrammen gehören Biosicherheitsmaßnahmen, die Ausrottung von PI-Rindern und Impfungen5,11.

Aktuelle Impfstoffe gegen BVDV sind multivalente modifizierte Lebendvirusimpfstoffe und inaktivierte Virusimpfstoffe11,12,13,14. Im Handel erhältliche Lebendimpfstoffe, abgeschwächte und inaktivierte Impfstoffe weisen eine begrenzte Sicherheit und Wirksamkeit auf: Der modifizierte Lebendvirusimpfstoff kann zur Virulenz zurückkehren und zu PI-Kälbern führen, wohingegen der inaktivierte Virusimpfstoff nur eine kurze Schutzdauer aufweist und keine zelluläre Immunantwort stimulieren kann15. Daher ist ein sicherer und wirksamer Impfstoff gegen BVDV-Untereinheiten erforderlich, um Rinder langfristig vor BVDV zu schützen.

Das Transmembranprotein E2 ist eines der BVDV-Strukturproteine, das über die C-terminale Domäne in der Virusmembran verankert ist. Als wichtiges immunogenes Glykoprotein ist E2 an der Virusfusion mit Wirtszellen beteiligt und enthält wichtige Antigenstellen, die während einer Infektion mit BVDV neutralisierende Antikörper hervorrufen können16,17. Daher ist E2 ein Hauptkandidat für die Entwicklung von Untereinheiten-Impfstoffen. In dieser Studie haben wir ein eukaryotisches Expressionssystem entwickelt, um rekombinantes E2-Glykoprotein zu exprimieren, das mit gelöschter Transmembran-Ankerdomäne kloniert wurde, wodurch dieses verkürzte E2-Glykoprotein nach der Transfektion von Säugetierzellen in das Gewebekulturmedium sezerniert werden kann. Rekombinantes E2-Glykoprotein wurde in Säugetierzellen hergestellt, um die korrekten posttranslationalen Modifikationen sicherzustellen, und es wurde beobachtet, dass die korrekten Glykosylierungsmuster bei Mäusen immunogen waren. Die Sequenzen, die für die durch die Transmembrandomäne deletierte Form von E2 kodieren, wurden genetisch mit dem V5-Epitop-Tag fusioniert, um (i) den Proteinnachweis durch Western Blot zu ermöglichen und (ii) das exprimierte verkürzte E2 aus dem Zellmedium zu reinigen. Darüber hinaus verwendeten wir die selbstspaltende Sequenz des Thosea asigna-Virus 2A (T2A), um das verkürzte E2-Gen und das grün fluoreszierende Protein (GFP) zu verknüpfen. Die 2A-Peptide sind klein und können die Spaltung effizient vermitteln, um die Koexpression mehrerer Gene zu ermöglichen18,19. Das GFP wurde als Ersatzmarker für die E2-Proteinexpression verwendet. Dieser Marker konnte nach der Transfektion von Babyhamster-Nieren (BHK)-21-Zellen leicht durch nicht-invasive Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen sichtbar gemacht werden. Wir haben auch die Immunogenität von sekretierten C-terminal verkürzten E2-Glykoproteinen in Mäusen anhand einer Reihe von Immunantworten untersucht, nämlich dem Titer antigenspezifischer Antikörper im Serum, der Lymphozytenproliferation, der Subpopulation in Splenozyten und der Konzentration verschiedener Zytokine.

Die synthetisierte C-terminal verkürzte Form des BVDV-E2-Gens (Abb. 1A und B) wurde zunächst in das pGEM-T Easy Vector-System kloniert und durch automatisierte Sanger-Sequenzierung verifiziert, bevor sie (unter Verwendung von ApaI und PstI) aus diesem Vektor herausgeschnitten und entfernt wurde auf den pJC3-Expressionsvektor übertragen (Abb. 1C). Das Programm NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)20 wurde verwendet, um N-Glykosylierungsstellen aus dem BVDV-E2-Glykoprotein voller Länge vorherzusagen. Dieses Programm sagt voraus, dass das BVDV-E2-Glykoprotein voller Länge fünf potenzielle N-Glykosylierungsstellen aufweist (N115, N184, N228, N259, 296) (Abb. 1D).

Genomstruktur von BVDV und Synthese der Region, die das E2-Glykoprotein kodiert. BVDV-Genomorganisation (nicht maßstabsgetreu) und Polyproteinverarbeitung (A). Dargestellt sind die Klonierungsstrategie und die Synthese von Genen, die für die C-terminal verkürzten (Transmembranverankerungsdomänen gelöschten) Formen des E2-Glykoproteins (eingerahmte Bereiche) kodieren, zusammen mit dem Signalpeptid (horizontal schraffierter Bereich) und dem C-terminalen V5-Epitop-Tag (Schrägstrich). Bereich) (B). Klonierung der verkürzten Form des E2-Glykoproteins in den pJC3-Expressionsvektor. Das Plasmid pJC3 kodiert für ein [GFP-T2A-mCherry]-Polyprotein, das von einem einzelnen offenen Leserahmen kodiert wird. Die Transkription wird durch den Enhancer/Promotor des humanen Cytomegalievirus und die durch das Polyadenylierungssignal des bovinen Wachstumshormons polyadenylierte mRNA gesteuert. Sequenzen, die für die verkürzte Form des E2-Glykoproteins kodieren, wurden durch Restriktion mit ApaI und PstI aus dem pGEM-T Easy Vector herausgeschnitten und dann in pJC3 eingefügt, ähnlich eingeschränkt, um mCherry FP zu entfernen und Plasmid [GFP-T2A-BVDV-E2-Stamm] zu erzeugen ( C). Der NetNGlyc-1.0-Server (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0) wurde verwendet, um N-glykosylierte Stellen aus E2-Glykoproteinen voller Länge vorherzusagen. Ein N-Glykosylierungspotential von > 0,5 war der Grenzwert für Sequenzen (D).

Um festzustellen, ob die C-terminal verkürzte Form des BVDV-E2-Glykoproteins in das Zellkulturmedium sezerniert wurde, wurden Immun-Dot-Blot-Assays auf dem Medium durchgeführt, wobei ein monoklonaler Antikörper gegen den V5-Epitop-Tag oder Maus-Anti-BVDV-Antiserum an verschiedenen Stellen verwendet wurde Zeiten nach der Transfektion. Die Western-Blot-Analyse transfizierter BHK-21-Zellextrakte zeigte die maximale Expression des verkürzten E2-Glykoproteins nach 48 Stunden. Die bei ~ 55 kDa beobachtete Proteinbande ist etwas diffus, was mit dem Grad der Heterogenität der Molekülmasse übereinstimmt, die durch die Proteinglykosylierung entsteht (Abb. 2A). Die Immun-Dot-Blots zeigten, dass das verkürzte E2-Glykoprotein in das Medium sezerniert und vom V5-Epitop-Tag und dem BVDV-Antiserum erkannt wurde (Abb. 2B); Diese sekretierte Form war im Zellmedium für die Dauer des Experiments (96 Stunden) stabil, was mit den Western-Blot-Daten übereinstimmt.

Bewertung der Expression verkürzter E2-Glykoproteine. (A) Western-Blot-Analysen transfizierter Zellextrakte. Proben von Zellextrakten wurden vor dem Transfer vorbereitet und analysiert (12 % SDS-PAGE), wie in den Methoden beschrieben. (B) Immuno-Dot-Blot-Analysen der Zellmedien. Gewebekulturmedien aus BHK-21-Zellen, die zu den angegebenen Zeitpunkten mit verkürztem E2-Glykoprotein transfiziert wurden. Die Membranen wurden mit dem monoklonalen Maus-Anti-V5-Antikörper (1:8000) oder dem Maus-Anti-BVDV-Antiserum (1:4000) als Primärantikörper sondiert. Spur M: vorgefärbter Proteinmarker, Spur Mock: nicht transfizierte BHK-21-Zellen.

Mittels ELISA wurden die Serumkonzentrationen BVDV-spezifischer Antikörper verschiedener Subtypen (IgG, IgG1 und IgG2a) bestimmt. Nach der ersten Impfung war der Gesamt-IgG-Antikörpertiter in der Hochdosisgruppe bis Woche 8 signifikant (P < 0,05) höher als der in der Niedrigdosisgruppe (Abb. 3A). Darüber hinaus stimulierte verkürztes E2-Glykoprotein die gleichzeitige Produktion von IgG1- (Abb. 3B) und IgG2a-Antikörpern (Abb. 3C). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der IgG1-Spiegel um etwa das 3,5-Fache und der IgG2a-Spiegel um etwa das 2,5-Fache erhöht, was auf eine Hochregulierung der IgG-Subtypen hinweist, die mit der T-Zell-abhängigen Immunität verbunden sind.

ELISA-Analyse von BVDV-spezifischen Antikörperreaktionen, die durch verkürztes E2-Glykoprotein induziert werden: (A) Gesamt-IgG, (B) IgG1 und (C) IgG2a. Die Antikörperreaktionen bei Mäusen wurden 0, 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der intraperitonealen Immunisierung mit 5 oder 35 μg verkürztem E2-Glykoprotein oder PBS bewertet. Den Mäusen wurde in den Wochen 0 und 2 zweimal eine Injektion verabreicht. Die Daten werden als mittlere Absorptionswerte ± Standardabweichungen dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben (a, b, c) auf dem Balken zeigen signifikante (P < 0,05) Unterschiede zwischen den Gruppen zum gleichen Zeitpunkt unter Verwendung des Duncan-Tests an. () Gruppe I: 5 μg verkürztes E2-Glykoprotein; () Gruppe II: 35 μg verkürztes E2-Glykoprotein; () Gruppe III: PBS.

Um die zellvermittelte Immunantwort zu bewerten, wurden Splenozyten von Mäusen isoliert und in vitro mit 5 μg verkürztem E2-Glykoprotein restimuliert. Die Lymphozytenproliferation wurde ausgewertet, um den Stimulationsindex (SI) darzustellen. Wie Abb. 4 zeigt, war die T-Lymphozyten-Proliferationsaktivität in der Hochdosisgruppe signifikant (P < 0,05) höher als in der Niedrigdosis- und Kontrollgruppe. In der Kontrollgruppe wurde kein Einfluss auf die Lymphozytenproliferation festgestellt, was zeigte, dass das verkürzte E2-Glykoprotein in vivo eine zellvermittelte Immunantwort auslösen kann.

Stimulation der Lymphozytenproliferation bei Mäusen durch verkürztes E2-Glykoprotein. Der Stimulationsindex (SI) wurde berechnet, indem der mittlere OD-Wert der stimulierten Vertiefungen durch den der Kontrollvertiefungen dividiert wurde (nur Medien). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichungen von drei Einzelexperimenten dargestellt. Behandlungen mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c) auf dem Balken weisen auf signifikante (P < 0,05) Unterschiede hin. () Gruppe I: 5 μg verkürztes E2-Glykoprotein;() Gruppe II: 35 μg verkürztes E2-Glykoprotein;() Gruppe III: PBS;() Positivkontrolle: ConA.

Um den Phänotyp der T-Zell-Subpopulation in Milzlymphozyten zu bestimmen, wurde eine Durchflusszytometrie mit Einzelmarkierung zur Definition verschiedener Subpopulationen durchgeführt. 4 Wochen nach der Immunisierung war der prozentuale Anstieg der CD4+-T-Lymphozyten in der Milz in der Hochdosisgruppe signifikant höher (24,6 % ± 1,6 %, P < 0,05) als in den anderen Gruppen, und der prozentuale Anstieg bei Die CD8+-T-Lymphozyten in der Milz waren in der Hochdosisgruppe signifikant höher als in der Niedrigdosisgruppe (5 μg) (10,7 % ± 1,0 % vs. 7,7 % ± 1,9 %, P < 0,05; Abb. 5).

Durchflusszytometrische Analyse des Prozentsatzes von CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten in der Milz. Mäuse wurden in den Wochen 0 und 2 zweimal intraperitoneal mit verkürztem E2-Glykoprotein immunisiert, und Mäuse in der Kontrollgruppe wurden mit PBS immunisiert. Splenozyten von Mäusen wurden 4 Wochen nach der Immunisierung isoliert und mit monoklonalen Anti-Maus-CD4+- und CD8+-Antikörpern gefärbt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichungen der Mäuse in derselben Behandlung dargestellt (n = 4). Verschiedene Buchstaben (a, b, c) auf dem Balken weisen auf signifikante (P < 0,05) Unterschiede zwischen den Gruppen zum gleichen Zeitpunkt hin.() Gruppe I: 5 μg verkürztes E2-Glykoprotein;() Gruppe II: 35 μg verkürztes E2-Glykoprotein E2-Glykoprotein;() Gruppe III: PBS.

Um die Polarisation der Immunantwort weiter zu charakterisieren, wurden die Konzentrationen der Th1-Zytokine IL-12 (Abb. 6A) und IFN-γ (Abb. 6B) oder eines Th2-Zytokins IL-4 (Abb. 6C) im Serum ermittelt immunisierte Mäuse wurden in den Wochen 0, 2 und 4 gemessen. Im Gegensatz zu den Seren der Kontrollgruppe enthielten die Seren der Mäuse in beiden Studiengruppen IL-12, IFN-γ und IL-4. Diese Ergebnisse zeigen, dass verkürzte E2-Glykoproteine ​​effektiv sowohl spezifische Th1- als auch Th2-Reaktionen hervorrufen können.

Konzentration der Zytokine (A) IL-12, (B) IFN-γ und (C) IL-4 in Mäusen, die mit 5 oder 35 μg verkürztem E2-Glykoprotein oder PBS immunisiert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung der Serumkonzentration jedes Zytokins dargestellt, die mit kommerziellen ELISA-Kits bestimmt wurde. Verschiedene Buchstaben (a, b, c) auf dem Balken weisen auf signifikante (P < 0,05) Unterschiede zwischen den Gruppen zum gleichen Zeitpunkt hin.() Gruppe I: 5 μg verkürztes E2-Glykoprotein;() Gruppe II: 35 μg verkürztes E2-Glykoprotein E2-Glykoprotein;() Gruppe III: PBS.

Die Kontrolle der BVDV-Infektion bei Rindern beruht auf Biosicherheitsmaßnahmen, der Identifizierung und Entfernung von PI-Rindern sowie Impfungen. PI-Kälber sind die Hauptüberträger von BVDV, da sie gegenüber dem Virus immuntolerant werden und im Laufe ihres Lebens große Mengen des Virus ausscheiden. Daher tragen Impfungen nun dazu bei, die Bevölkerung immun zu machen; Immunität ist besonders wichtig für die Zuchtweibchen in der Herde1. In den letzten Jahren wurde in vielen Studien versucht, wirksamere BVDV-Impfstoffe zu entwickeln. Abgeschwächte Lebendimpfstoffe werden häufig gegen BVDV eingesetzt und lösen starke humorale und zellvermittelte Immunantworten mit starkem Schutz für den Fötus aus21,22. Abgeschwächte Lebendimpfstoffe, die auf dem nichtzytopathischen Stamm basieren, werden im Allgemeinen nicht für die Impfung trächtiger Tiere empfohlen, da dieser Stamm die Plazenta passieren und den Fötus infizieren kann. In Studien wurde versucht, das Sicherheitsproblem der Entwicklung eines mutierten Virus durch die Löschung des Npro-Gens und die Inaktivierung der Endoribonukleaseaktivität des Strukturglykoproteins Erns22,23 zu überwinden, aber das Impfvirus könnte immer noch die Plazenta passieren24. Inaktivierte Impfstoffe sind während der Schwangerschaft sicher25,26,27, ihre Wirksamkeit ist jedoch begrenzt, da sie keine zelluläre Immunantwort auslösen28,29. Es wurde kein signifikanter Kreuzschutz gegen verschiedene Virusstämme berichtet30,31. Daher ist die Entwicklung von Subunit-Impfstoffen ein wirksamer Ansatz. Darüber hinaus sind in verschiedenen Virusstämmen exprimierte Antigene potenzielle Impfstoffkandidaten; Diese Impfstoffe könnten einen Kreuzschutz gegen verschiedene BVDV-Stämme auslösen. In der vorliegenden Studie haben wir ein verkürztes E2-Glykoprotein geklont und exprimiert. Das E2-Glykoprotein ist das am stärksten divergierende Antigen zwischen den BVDV-Typen 1 und 2 und dem HoBi-ähnlichen Pestivirus und kann neutralisierende Antikörper hervorrufen16,17.

Die Hauptziele der vorliegenden Studie waren (i) die Klonierung einer sekretierten verkürzten Form des BVDV-E2-Glykoproteins, (ii) die Verwendung von Säugetierzellkulturen als Antigen-Expressionsplattform und (iii) die Bewertung der Immunwirkungen des Impfstoffs bei Mäusen . Die Konstruktionsstrategie, die wir in dieser Studie angewendet haben, bestand darin, eine genetische Fusion des C-terminal verkürzten (deletierten Transmembranankers) E2-Glykoproteins mit GFP zu erzeugen, das über eine T2A-Ribosomen-Skipping-Sequenz verknüpft ist, um ein selbstverarbeitendes Polyprotein (GFP-T2A-BVDV-E2) zu erzeugen Stamm). Diese Strategie hat keinen Einfluss auf die Funktion jedes Proteins stromabwärts von T2A18,19,32. Darüber hinaus sind die Vorteile dieser Strategie (i) die einfache Identifizierung und Quantifizierung der Signalintensitäten der GFP-Fluoreszenz lebender Zellen mithilfe von Assays und (ii) die anschließende fluoreszenzaktivierte Zellsortierung stabil transfizierter Zellen. Untereinheitenimpfstoffe sind häufig auf ein einzelnes Protein angewiesen, um eine wirksame Immunantwort im geimpften Wirt auszulösen. Daher sind sowohl die Menge als auch die antigenische Authentizität des rekombinanten Proteins von entscheidender Bedeutung33. Daher wurde unser verkürztes E2-Glykoprotein in Säugetierzelllinien exprimiert, um eine authentischere Proteinfaltung vom Virustyp und eine komplexe Glykosylierung zu erzeugen, die verschiedene Proteinfunktionen beeinflusst, einschließlich Faltung, Stabilität, Aktivität, authentische Antigenität, Transport und Immunantwort. Unsere Daten zeigten, dass das verkürzte E2-Glykoprotein erfolgreich in das Gewebekulturmedium sezerniert wurde (Abb. 2B) und eine laufende Expression innerhalb der Zelle nachgewiesen wurde (Abb. 2A), was mit unseren zuvor berichteten Ergebnissen übereinstimmt32. Die Western-Blot-Analysen von Zellextrakten nach der Transfektion von verkürztem E2-Glykoprotein ergaben eine diffuse und keine diskrete Bande mit dem vorhergesagten Molekulargewicht (55 kDa), die für die Glykosylierung charakteristisch ist (Abb. 2A). Darüber hinaus zeigte das verkürzte E2-Glykoprotein Antigenität, wie im Immunblotting unter Verwendung von Maus-Anti-BVDV-Antiserum gezeigt wurde (Abb. 2).

Da die Qualität der Immunantwort für die Wirksamkeit des Impfstoffs von entscheidender Bedeutung ist, haben wir die Immunantwort nach der Immunisierung mit dem verkürzten E2-Glykoprotein-Impfstoff untersucht. Wenn Gesamtvirus-BVDV als ELISA-Beschichtungsantigen verwendet wurde, war der Titer des Gesamt-IgG in den Impfgruppen (verkürztes E2-Glykoprotein) im Vergleich zur Kontrollgruppe nach der Immunisierung signifikant höher (Abb. 3A). Darüber hinaus vermittelte das verkürzte E2-Glykoprotein sowohl BVDV-spezifische IgG1 (Th2) (Abb. 3B) als auch IgG2a (Th1) (Abb. 3C) Antikörperreaktionen. Darüber hinaus zeigten die mit dem Impfstoff immunisierten Mäuse eine IgG1-Überlegenheit, die mit der Th2-Shift-Reaktion zusammenhängt. Parallel dazu waren die IL-4-Spiegel in den Impfgruppen deutlich höher als in der Kontrollgruppe (Abb. 6C). IL-4 ist ein repräsentatives Zytokin des Th2-Typs, das mit der Proliferation, Differenzierung und Reife von B-Zellen assoziiert ist und die Antikörperproduktion reguliert34. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass das verkürzte E2-Glykoprotein wirksam ist, um eine spezifische humorale Immunantwort auszulösen.

Th1-Zellen sind an der zellulären Immunität beteiligt und sezernieren das Effektor-Zytokin vom Th1-Typ. Somit können der Th1-Zytokinspiegel und die T-Lymphozyten-Proliferationsaktivität den Grundstatus der zellulären Immunität widerspiegeln35. Unsere Daten zeigten, dass die Zytokinspiegel vom Th1-Typ (IL-12 und IFN-γ) in den Impfgruppen nach der Immunisierung signifikant höher waren als in der Kontrollgruppe (Abb. 6A und B). Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen der Niedrigdosis- und der Hochdosisgruppe beobachtet. Bemerkenswerterweise beobachteten wir einen deutlich erhöhten SI in den restimulierten Milz-T-Lymphozyten von Mäusen, die mit verkürztem E2-Glykoprotein immunisiert wurden (Abb. 4). Darüber hinaus waren die Prozentsätze sowohl von CD4+- als auch CD8+-T-Zellen in der Milz immunisierter Mäuse signifikant erhöht, obwohl CD4+ etwas höher war als CD8+ (Abb. 5), was auf eine starke Aktivierung von T-Zellen hinweist. CD4+ T-Zellen sezernieren ein Spektrum an Zytokinen und sind entscheidend für die Aktivierung sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunität, wohingegen CD8+ T-Zellen mit der Zytokinaktivität von T-Lymphozyten zur Eliminierung intrazellulärer Krankheitserreger verbunden sind 36. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das verkürzte E2-Glykoprotein induzieren kann eine zelluläre Immunantwort bei Mäusen.

In dieser Studie ergab unsere Antigen-Expressionsstrategie ein authentisches rekombinantes Protein vom sekretorischen Virustyp und bietet eine praktikable Strategie für die Produktion von Impfstoffen im großen Maßstab. Eine weitere einfache Reinigung ist mit einem V5-Epitop-Tag möglich. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass verkürzte E2-Glykoproteine ​​sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten auslösen. Bemerkenswert ist, dass wir in der Impfstoffformulierung kein zusätzliches Adjuvans verwendet haben, was die günstige Immunogenität des verkürzten E2-Glykoproteins hervorhebt. Unsere Konstruktionsstrategie ermöglichte es uns, eine qualitativ hochwertige Antigenexpression zu erzielen, und unsere Bewertung bestätigte die Wirksamkeit des Impfstoffs. Diese vielversprechenden Ergebnisse können als Grundlage für weitere Forschungen dienen. Zukünftig werden wir Feldversuche bei Rindern durchführen, um die Wirksamkeit genauer zu untersuchen und das Potenzial dieses Untereinheitenimpfstoffs gegen BVDV umfassend zu bewerten.

Die Transmembrandomäne des BVDV-E2-Glykoproteins wurde mit dem TMHMM-2.0-Programm (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM) vorhergesagt. Unseres Wissens wurde in Rinderherden in Taiwan nur über den BVDV-Typ-2-Stamm berichtet. Daher wurde die C-terminal verkürzte Form des BVDV-E2-Gens (Position 2462–3481 Nukleinsäure) unter Verwendung einer aus Rindern in China isolierten Sequenz (Stamm XJ-04, GenBank-Nukleotidsequenz-Zugangsnummer FJ527854) synthetisiert, die auch (d ) eine Tobacco Etch Virus-Protease-Spaltstelle (-ENLYFQG-), die verwendet werden kann, um sowohl (ii) eine kurze Linkersequenz (-GSDQTENSG-) als auch (iii) den V5-Epitop-Tag (-GKPIPNPLLGLDST-COOH) zu entfernen (Abb. 1A). und B). Das synthetisierte BVDV-E2-Gen (Eurofins Genomics, Ebersberg, Deutschland) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers in den pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) kloniert. Alle Klone wurden durch automatisierte Sanger-Sequenzierung (GATC Biotech, Cambridge, UK) verifiziert.

Die kodierte Sequenz des BVDV-E2-Gens wurde mit ApaI und PstI (New England Biolabs, Hitchin, UK) verdaut und in den pJC3-Expressionsvektor kloniert, der ebenfalls eingeschränkt war (Abb. 1C). Der pJC3-Expressionsvektor basierte auf pcDNA3.1, wobei T2A GFP- und Monomer-Cherry-Fluoreszenzprotein-Gene (mCherry FP) verknüpfte37,38. Dies ergab einen Klon, der die verkürzte Form des E2-Glykoproteins (GFP-T2A-BVDV-E2-Stamm) kodierte.

BHK-21-Zellen (BCRC-Nr. 60041) und Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK) (BCRC-Nr. 60126) wurden vom Bioresource Collection and Research Center, Taiwan, bezogen und in Eagles minimalem essentiellen Medium (Invitrogen, NY, USA) vermehrt. USA) ergänzt mit hitzeinaktiviertem 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in 5 % CO2 bei 37 °C.

In dieser Studie verwendeten wir den BVDV-Typ-2-Stamm BVDV/TW 2014, der vom Large Animal Hospital der National Pingtung University of Science and Technology (NPUST), Taiwan, bezogen wurde39. Das Virus wurde in MDBK-Zellen kultiviert. Die BVDV-Titer wurden mit der Methode von Reed und Muench40 bestimmt und als fluoreszierende Antikörper-Infektionsdosis FAID50/ml39,41 ausgedrückt. Kurz gesagt, eine Virusprobe (100 μl) und MDBK-Zellen (100 μl von 1 × 105 Zellen/ml) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen 6 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 gemeinsam kultiviert. Zur Fixierung der Zellen wurde gepufferte Formalde-Fresh-Lösung (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und eine 1:5-Verdünnung von Anti-BVDV-fluoreszenzkonjugiertem polyklonalem Antiserum (VMRD, Pullman, WA, USA) verwendet Virenerkennung. Fluoreszierende Vertiefungen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Olympus CKX41, Olympus Co. Ltd., Tokio, Japan) beobachtet.

Um das sekretierte Protein nachzuweisen, wurde Plasmid-DNA unter Verwendung von PolyJet In-vitro-DNA-Transfektionsreagenz (SignaGen Laboratories, Ijamsville, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Medium und der Zellextrakt wurden 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Transfektion in die BHK-21-Zellen gesammelt. Zellkulturmedien wurden gesammelt und durch Zentrifugation (2000 × g bei 4 °C für 15 Minuten) geklärt, und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen dekantiert, bevor er bei –20 °C gelagert wurde. Die Überstände wurden auf Eis aufgetaut, bevor sie auf eine Nitrozellulosemembran (0,2 µm; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) getupft wurden, wo sie mittels Dot-Blot-Assay mit einem monoklonalen Antikörper gegen das V5-Epitop-Tag (1:8000; MBL) analysiert wurden International, Nagoya, Japan) oder Maus-Anti-BVDV-Antiserum (1:4000)39 als Primärantikörper und mit Meerrettichperoxidase (HRP) markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG als Sekundärantikörper (1:8000; KPL, Gaithersburg, MD, USA). Das Signal wurde mit dem Clarity Western ECL-Substrat (Bio-Rad) entwickelt.

24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Transfektion wurden die BHK-21-Zellen gewaschen und die Zellen unter Verwendung von RIPA-Lyse- und Extraktionspuffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), der einen EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktail enthielt, lysiert (komplett; Roche Diagnostics, Burgess Hill, UK), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Zelllysat wurde dann mittels SDS-PAGE analysiert und auf Polyvinylidendifluorid-Transfermembranen (Immobilon-P; Merck Millipore, Tullagreen, Irland) elektrogeblottet. Nach der Blockierung mit 5 % Difco-Magermilch (w/v, BD, Le Pont de Claix, Frankreich) wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit einem Primärantikörper untersucht, der den V5-Epitop-Tag erkannte (1:8000; MBL International). oder Maus-Anti-BVDV-Antiserum (1:4000)39. Nach dreimaligem Waschen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP als Sekundärantikörper (1:8000; KPL) inkubiert und mit dem G:BOX-Bildgebungssystem abgebildet und Analysesoftware (Syngene, Frederick, MD, USA).

Zur Quantifizierung des verkürzten E2-Glykoproteins wurden die Medien 48 Stunden nach der Transfektion der BHK-21-Zellen gesammelt. Der geklärte Überstand wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers auf das mit V5 markierte Protein Purification Kit Version 2 (MBL International) aufgetragen. Die eluierten Proteinfraktionen, die das verkürzte E2-Glykoprotein enthielten, wurden gepoolt und unter Verwendung eines Amicon-Ultrazentrifugenfilters mit einer Porengröße von 30 kDa (Merck Millipore, Burlington, MA, USA) konzentriert. Die Proteinschätzung wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) durchgeführt.

Der in dieser Studie verwendete Impfstoff war ein nicht-adjuvanter Impfstoff, der eine gereinigte verkürzte Form des E2-Glykoproteins enthielt, aufgeteilt in niedrige (5 µg) und hohe (35 µg) Konzentrationen pro Dosis. Die Impfantigenkonzentration basierte auf früheren dosisabhängigen Experimenten32. Den Ergebnissen des Sterilitätstests zufolge enthielten die Impfstoffe keine lebensfähigen Mikroorganismen.

Die Mausexperimente wurden vom Animal Care and Use Committee der NPUST genehmigt und gemäß den ethischen Regeln und Gesetzen der Universität durchgeführt (IACUC-Genehmigung Nr. 110-046). Die in dieser Studie verwendeten Mäuse wurden in einer aseptischen Umgebung gezüchtet und gehalten, um sie vor opportunistischen Infektionen zu schützen. Die Mäuse wurden in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 Stunden bei einer konstanten Temperatur (22 ± 1 °C) und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 % ± 10 % gehalten; Alle Tiere hatten nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren, und die Tiere wurden am Ende des Untersuchungszeitraums auf humane Weise eingeschläfert. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Siebenundzwanzig 4 Wochen alte BALB/c-Mäuse (LASCO, Taipei, Taiwan) wurden wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe I (Impfung, n = 9), erhielt 5 µg verkürztes E2-Glykoprotein; Gruppe II (Impfung, n = 9), die 35 µg verkürztes E2-Glykoprotein erhielt; und Gruppe III (Kontrolle, n = 9), die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) erhielt. Die mit 5 bzw. 35 µg verkürztem E2-Glykoprotein immunisierten Mäuse dienten als Niedrigdosis- bzw. Hochdosisgruppe. Den Mäusen wurden in den Wochen 0 und 2 zweimal 200 μl des Impfstoffs intraperitoneal injiziert. Von jeder Maus wurden Seren zur weiteren Bestimmung in den Wochen 0, 2, 4, 6 und 8 entnommen.

Die spezifischen Serumtiter von Antikörpern gegen BVDV wurden durch indirekten ELISA nachgewiesen. Polystyrol-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (ExtraGENE, Taichung, Taiwan) wurden mit 1,25 μg/ml Gesamtvirusantigen (BVDV/TW 2014) in Beschichtungspuffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3 und 3 mM NaN3; pH 9,6) beschichtet. und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Die optimale Beschichtungskonzentration und Serumverdünnung wurden durch Schachbretttitration bestimmt. Die Platten wurden dreimal mit PBS mit Tween 20 (PBST) gewaschen, mit 1 % BSA (KPL) in PBST 1 Stunde bei 37 °C blockiert und dreimal mit PBST gewaschen. Anschließend wurden 50 μl ausreichend verdünntes Maus-Antiserum als Primärantikörper in die Vertiefungen gegeben und die Platten 1,5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die Platten viermal mit PBST und 100 μl ausreichend verdünntem HRP-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (KPL), Anti-Maus-IgG1 (Polyklon, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) oder Anti-Maus gewaschen Als Sekundärantikörper wurde IgG2a (Polyklon, Bethyl Laboratories) hinzugefügt. Anschließend wurden die Platten 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und viermal mit PBST gewaschen. Anschließend wurden 100 μl TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate (KPL) zugegeben und die Farbreaktion 10 Minuten lang durchgeführt, bevor TMB Stop Solution (KPL) hinzugefügt wurde, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen (Anthos 2020; Anthos, Cambridge, UK).

Vier Wochen nach der Immunisierung wurde der Lymphozytenproliferationstest mit dem Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS; Promega) durchgeführt. Splenozyten von vier zufällig ausgewählten Mäusen pro Gruppe wurden in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden (1 × 106 Zellen pro Well) ausgesät und mit verkürztem E2-Glykoprotein (5 μg/ml) in RPMI-1640, ergänzt mit 10 % FBS, co-kultiviert und 72 Stunden lang bei 37 °C in einer befeuchteten 5 % CO2-Atmosphäre gehalten. Darüber hinaus wurden parallel zum Test zellfreie Medien mit vollständigem RPMI-1640 verwendet. Die Zellen allein dienten als Negativkontrolle und das starke Mitogen Concanavalin A (ConA; Sigma-Aldrich, MO, USA) wurde als Positivkontrolle für eine Endkonzentration von 2 μg/ml verwendet. Jede Splenozytenprobe wurde dreifach ausgewertet. MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-tetrazolium) wurde zu jeder Vertiefung gegeben und dann 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert unter 5 % CO2. Die Absorption bei 490 nm wurde gemessen. Der Stimulationsindex wurde wie folgt bestimmt: (optische Beugung [OD] der Behandlung – OD des Hintergrunds)/(OD der Negativkontrolle – OD des Hintergrunds).

Vier Mäuse wurden verwendet, um die Häufigkeit von CD4+- und CD8+-T-Zellen für jede Testgruppe 4 Wochen nach der Immunisierung zu bestimmen. Kurz gesagt, Splenozyten aus den Mäusen jeder Gruppe wurden durch Aufbrechen der Milz mit einem 3-ml-Spritzenzylinder in RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) isoliert. Nachdem die Milzhomogenisate durch ein 100-μm-Zellsieb geleitet und in ACK-Lysepuffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) behandelt worden waren, um Erythrozyten zu lysieren, wurden die Zellen zweimal gewaschen und in PBS mit 1 % Albumin aus Rinderserum resuspendiert (1 × 107 Zellen/ml). Isolierte Splenozyten (106 Zellen) wurden mit FITC-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD4+ und PE-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD8+ (BD Pharmingen, San Jose, CA) 30 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und 50.000 Zellen, entsprechend dem Anteil an CD4+- und CD8+-T-Zellen, durch Durchflusszytometrie mit einem FACScalibur-Gerät (BD Biosciences) charakterisiert.

Zytokinspiegel im Serum von immunisierten Mäusen in Woche 0, 2 bzw. 4 wurden mit kommerziellem Interleukin (IL)-12 p70 (ab119531), Interferon-gamma (IFN-γ; ab100689) und IL-4 nachgewiesen ( ab100710) ELISA-Kits (Abcam, Cambridge, MA, USA), gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Konzentration jedes Zytokins wurde anhand der aufgezeichneten Standardkurve berechnet.

Alle Daten wurden mit der SAS-Statistiksoftware (Version 9.0, Cary, NC, USA) analysiert. Für die Mausexperimente wurden die Unterschiede zwischen den Behandlungen zu jedem Zeitpunkt mithilfe einer Varianzanalyse und Duncan-Mehrfachvergleichen analysiert. Unterschiedliche Buchstaben (a, b, c) auf dem Balken weisen auf signifikante (P < 0,05) Unterschiede zwischen den Gruppen zum gleichen Zeitpunkt hin.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im Uniprot-Repository unter der Zugangsnummer C4NF75 verfügbar.

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Die Autoren danken Professor Chun Yen Chu (NPUST, Taiwan) für die Finanzierung und wissenschaftliche Beratung sowie Professor RE Randall (University of St. Andrews, UK) für Anti-V5-Antikörper.

Diese Arbeit wurde vom taiwanesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie [MOST-106-2911-I-020-501; MOST-107-2313-B-020-011-MY3] und dem UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council [BB/P025080/1].

Internationaler Studiengang für Tierimpfstofftechnologie, International College, National Pingtung University of Science and Technology, No. 1, Shuefu Rd., Neipu, Pingtung, 91201, Taiwan

Yi Ting Lo, Wan Chen Chang und Hsing Chieh Wu

Forschungskomplex für biomedizinische Wissenschaften, School of Biology, University of St Andrews, St Andrews, Schottland, Großbritannien

Martin D. Ryan und Garry A. Luke

Graduierteninstitut für Tierimpfstofftechnologie, Hochschule für Veterinärmedizin, Nationale Pingtung-Universität für Wissenschaft und Technologie, Neipu, Pingtung, Taiwan

Hsing Chieh Wu

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YTL führte experimentelle Arbeiten durch und verfasste das Manuskript. MDR akquirierte Fördermittel und entwarf das verkürzte Formular. GAL führte das Klonen von Konstrukten durch. Der ÖRK leistete technische Unterstützung bei den Immunitätstests. HCW führte das Klonen von Konstrukten, die Datenanalyse und den Entwurf des Manuskripts durch. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Hsing Chieh Wu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 09. August 2022

Angenommen: 20. Dezember 2022

Veröffentlicht: 06. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

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