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May 02, 2023

Die Dynamik von Entzündungszellen steuert die Neovaskularisation und die Gewebeheilung nach lokalisierter, durch Strahlung verursachter Verletzung bei Mäusen

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 571 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Lokale Überbelastung durch ionisierende Strahlung führt zu chronischen Entzündungen, Gefäßschäden und Kachexie. Hier untersuchen wir die Kinetik von Entzündungszellen vom Tag (D)1 bis D180 nach der Bestrahlung der Hinterbeine der Maus und analysieren die Rolle von Monozyten (Mo)-Untergruppen bei der Geweberevaskularisierung. Bei D1 stellen wir fest, dass Mo- und T-Zellen aus Milz und Knochenmark ins Blut mobilisiert werden. Die Bildung neuer Gefäße während der frühen Phase, wie durch einen etwa 1,4- bzw. 2-fach erhöhten angiographischen Score und eine erhöhte Kapillardichte gezeigt, korreliert mit einer Zunahme zirkulierender T-Zellen sowie von Mohi- und Typ-1-ähnlichen Makrophagen im bestrahlten Muskel. Bei D90 werden Gefäßverdünnung und Kachexie beobachtet, verbunden mit einer verringerten Anzahl zirkulierender Molo- und Typ-2-ähnlicher Makrophagen im bestrahlten Gewebe. Darüber hinaus hat ein CCR2- und CX3CR1-Mangel einen negativen Einfluss auf die Neovaskularisation. Allerdings steigert die adoptive Übertragung von Mohi das Gefäßwachstum. Unsere Daten belegen die strahleninduzierten dynamischen Entzündungswellen und die wichtige Rolle von Entzündungszellen bei der Neovaskularisation.

Jedes Jahr kommt es zu akuten Strahlenunfällen mit hoher Dosis, die auf Industrieunfälle (Verlust radioaktiver Quellen) oder Überdosierungen infolge medizinischer Anwendungen (Strahlentherapie und interventionelle Radiologieverfahren) zurückzuführen sind. Die Strahlenschädigung ist in den ersten Tagen bis Jahren nach der Bestrahlung durch aufeinanderfolgende und unvorhersehbare Entzündungswellen gekennzeichnet, die zur horizontalen und vertikalen Ausbreitung der Gewebeschädigung führen, einschließlich Gefäßverdünnung und Muskelkachexie1. Gefäßschäden und -verdünnung gelten als Hauptursache für die langfristige Morbimortalität bei Patienten, die nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu einer Gewebeischämie führt2. Eine lokale übermäßige Exposition gegenüber ionisierender Strahlung hat schwerwiegende gesundheitliche Folgen, insbesondere wenn die absorbierte Dosis 25 Gy übersteigt, und führt zu Gewebenekrose1,3. Die Reparatur einer akuten Skelettmuskelverletzung ist ein streng regulierter Prozess, der hauptsächlich aus drei Phasen besteht, darunter Entzündung, Regeneration und Angiogenese4,5. Im präklinischen Modell der Ganzkörperbestrahlung wurde gezeigt, dass die Anzahl sowohl der Myonuklei als auch der Satellitenzellen pro Myofaser dosisabhängig verringert wurde6. Darüber hinaus blockiert eine einzelne Bestrahlungsdosis von 18 Gy die Muskelregeneration, indem sie die Letalität von Myoblasten induziert7. Studien zur Muskelpathologie mit einer Bestrahlungsdosis von mehr als 25 Gy haben morphologische Veränderungen, Blutungen, Nekrose, Entzündung, Fibrose und Mitochondrienzerstörung gezeigt8,9,10,11. Ischämie ist der häufige Prozess bei beiden Krankheiten, der radiolokalen Schädigung und der Herz-Kreislauf-Erkrankung. Bei ischämischen Erkrankungen ist eine unzureichende Organperfusion nach einem thrombotischen Gefäßverschluss der versorgenden Arterie ein wesentlicher Faktor für den postischämischen Umbau12. Die Exposition von Säugetierzellen wie Endothelzellen gegenüber ionisierender Strahlung führt jedoch hauptsächlich zum durch DNA-Schäden verursachten Zelltod13. Ischämie ist durch Gefäßschädigung/-verdünnung und Entzündung gekennzeichnet, die zu einer Fibrose führt, die durch kollagenbasierte Narben gekennzeichnet ist14. Die ischämische Gewebereaktion basiert auf vier Hauptprozessen: Vaskulogenese, Angiogenese, Arteriogenese und Kollateralwachstum, die zur Gewebereparatur und -umgestaltung bei akuten und chronischen ischämischen Gefäßerkrankungen beitragen15. Diese Prozesse resultieren aus Veränderungen hämodynamischer Kräfte innerhalb der Gefäßwand, die zu einer Veränderung der Gefäßhomöostase führen15,16.

Die Infiltration von Entzündungszellen in hypoxischen Bereichen ist ein Kennzeichen der Gewebeischämie, die jeweilige Rolle bestimmter Leukozytenuntergruppen bei der postischämischen Neovaskularisation – CD4+- und CD8+-T-Zellen17,18, NK-Zellen19, regulatorische T-Zellen20, Mastzellen21, Monozyten/Makrophagen22 – hingegen nicht völlig verstanden. An diesem Prozess sind insbesondere T-Lymphozyten beteiligt, wie die Tatsache zeigt, dass Nacktmäuse, denen alle T-Zell-Untergruppen fehlen, eine deutliche Verringerung des postischämischen Gefäßwachstums aufweisen23. Leukozyten und Monozyten lösen eine Neovaskularisierung durch die Freisetzung mehrerer angiogener/arteriogener Faktoren aus, darunter vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin (IL)-1β und Metalloproteinasen24,25. Darüber hinaus wurde die Rolle von Monozyten im Neovaskularisationsprozess von verschiedenen Gruppen dokumentiert18,26.

Monozyten sind eine heterogene Population mit zwei Hauptsubtypen bei Mäusen: Ly6ChiLy6G-7/4hi „inflammatorische“ Monozyten (Mohi) und Ly6CloLy6G-7/4lo „residente“ Monozyten (Molo), entsprechend den Subpopulationen CD14hiCD16− bzw. CD14loCD16+ beim Menschen27. Mohi exprimieren die induzierbare NO-Synthase (NOS) und proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und IL-12, während die Molo große Mengen an Arginase 1, das entzündungshemmende Zytokin IL-10 und VEGF produzieren. Mohi dringt schnell in Entzündungsherde ein, während Molo unter homöostatischen Bedingungen in lymphoide und nicht-lymphoide Organe gelangt, CX3CR1-abhängig durch das Gefäßendothel patrouilliert28 und in verschiedenen Zusammenhängen die Geweberegeneration begünstigt29. Wir haben kürzlich die zentrale Rolle der Monozyten-/Makrophagenaktivierung bei der Orchestrierung des Neovaskularisierungsmechanismus in einem Mausmodell lokaler kolorektaler Bestrahlung gezeigt22. Darüber hinaus führte in einem Mausmodell der Ischämie der Hinterbeine die Transplantation von Mohi, nicht jedoch von Molo, zur Aktivierung der postischämischen Neovaskularisation26.

Es wird angenommen, dass die Rekrutierung von Monozyten in ischämischen Bereichen hauptsächlich über die Signalübertragung von Chemokinen/Chemokinrezeptoren erfolgt. Insbesondere CCL2 und sein verwandter Rezeptor CCR2 sowie Fractalkin (CX3CL1) und die Liganden von CX3CR1 sind in diesem Zusammenhang beteiligt30,31,32. Tatsächlich wird CCL2 an der Stelle des Kollateralwachstums hochreguliert und die Revaskularisierung wird durch die CCL2-Behandlung deutlich verstärkt33. In ähnlicher Weise verringert in ischämischen Hinterbeinmodellen ein Mangel an CCL2 oder CCR2 die postischämische Entzündung und das Gefäßwachstum25,34 und verstärkt die Atrophie des Gastrocnemius-Muskels35. Eine therapeutische Modulation der Entzündungsreaktion könnte daher vielversprechend sein, um die reparative Reaktion zur Vorbeugung postischämischer Erkrankungen zu verbessern15,16.

Hier analysierten wir mithilfe eines Mausmodells einer lokalisierten strahleninduzierten Verletzung der Hinterbeine die Dynamik der Mobilisierung und Rekrutierung angeborener und adaptiver Entzündungszellen in verschiedenen Geweben (Knochenmark (BM), Milz, Blut und Muskeln) von D1 bis D180 Bestrahlung. Wir haben zum ersten Mal die Entzündungswellen gezeigt, die Verletzungen durch ionisierende Strahlung charakterisieren. Diese Wellen entsprachen dem Wechsel zwischen Proliferations-/Mobilisierungsphasen, der in verschiedenen Geweben wie Milz, Blut und Muskeln beobachtet wurde; bei BM waren sie jedoch weniger ausgeprägt. Wir haben zwei Phasen nach der Bestrahlung der Hinterbeine hervorgehoben, die zunächst einer frühen Phase mit Entzündung und Neovaskularisation entsprechen, die mit der Mobilisierung von CD4- und CD8-T-Zellen aus der Milz, der Infiltration im Mohi-Muskel und ihrer Differenzierung in proinflammatorische Makrophagen (Typ 1) korreliert -ähnliche Makrophagen/M1-ähnliche). In der Spätphase zeigten wir Gefäßverdünnung und Kachexie, die mit einer Abnahme der Molo-Zahlen in Blut und Muskeln und der Differenzierung von Molo in Typ-2-ähnliche Makrophagen (M2-ähnliche) im Muskel korrelierten.

Abschließend untersuchten wir genauer die Rolle von Mohi und M1-like bei der Neovaskularisation in der frühen Phase. Der Mangel an CCR2 oder CX3CR1 beeinträchtigte die Arteriogenesemechanismen, wohingegen die intramuskuläre Injektion von Mohi bei WT-Mäusen die Arteriogenese verbesserte.

Um den Strahlungseffekt auf die Hinterbeine zu untersuchen, haben wir zunächst die Kinetik der Entwicklung der Läsion durch eine semiquantitative Analyse der Wundausdehnung, der Ulzeration, der feuchten Abschuppung und des Zurückziehens der Gliedmaßen während des Wundheilungsprozesses jede Woche bis zum Tag 180 beurteilt. 14 Tage nach der Bestrahlung stieg der Verletzungswert an, erreichte seinen Höhepunkt bei D35 und sank dann langsam bis D180 (Abb. 1a). Diese schädliche Wirkung der Bestrahlung war mit Kachexie/Muskelschwund (Rhabdomyolyse) verbunden. Das Gewicht von Gastrocnemius und Tibialis verringerte sich bei D120, 150 und 180 progressiv und signifikant um das 2- bzw. 1,5-fache im Vergleich zur nicht bestrahlten Gruppe (P < 0,01, Abb. 1b).

a Kinetische Entwicklung der jede Woche gemessenen Verletzungswerte und repräsentative Fotos von strahlenbedingten Verletzungen der Hinterbeine zu verschiedenen Zeitpunkten. b Entwicklung des Muskelgewichts, gemessen an Tibialis und Gastrocnemius, unbestrahlt (NIR) und bestrahlt, an den Tagen 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 nach der Bestrahlung. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. NIR; n = 8 Tiere/Zeitpunkt, ANOVA +/− SEM.

Es ist bekannt, dass BM und Milz nach einer Verletzung Entzündungszellen freisetzen und nach der Bestrahlung zum Entzündungsprozess beitragen22. CD11b+-Leukozyten, die Neutrophilen und Monozyten entsprachen, wurden vom BM oder der Milz ins Blut mobilisiert und dann in den bestrahlten Muskel infiltriert (Abb. 2a, b). Wir konnten keine Ansammlung von Monozyten im Muskel feststellen, was darauf hindeutet, dass sie sich in Makrophagen differenzierten36. Unbestrahlt (NIR) entspricht den zu unterschiedlichen Zeitpunkten eingeschläferten Wurfgeschwistern und zeigte zu jedem Zeitpunkt vergleichbare Ergebnisse hinsichtlich der Anzahl der Entzündungszellen im Gewebe (Blut, Milz, Knochenmark und Muskeln).

a–d Quantitative Analyse (links) und repräsentatives Durchflusszytometrie-Gating (rechts) der Zellzahlen für Neutrophile (CD45 + CD11b+Ly6G+7/4hi, grüne Linie), Mohi (CD45 + CD11b+Ly6G–7/4hi, rote Linie). ) und Molo (CD45 + CD11b+Ly6G–7/4lo, blaue Linie) (gesteuert auf CD45+- und CD11b+-Zellen) in Knochenmark, Milz, Blut bzw. Muskel. e Quantitative Analyse (links) und repräsentatives Durchflusszytometrie-Gating (rechts) der Zellzahlen für DC (CD45 + CD11b+CD11c+MHCII+), M1-ähnliches Mɸ (CD45+CD11b-F4/80+CD64+MHCII+) und M2-ähnliches Mɸ (CD45+CD11b-F4/80+CD64+MHCII−) im Muskel, unbestrahlt (NIR) und bestrahlt, an den Tagen 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 post Bestrahlung. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. NIR; n = 8–10 Tiere/Zeitpunkt, ANOVA +/− SEM.

Bei BM vermehrten sich Neutrophile (CD11b+Ly6G+7/4hi) bei D1, D150 und D180 signifikant (P < 0,001) im Vergleich zu NIR (Abb. 2a). Mohi (CD11b+Ly6G-7/4hi) vermehrte sich bei D14 und D180 (P < 0,05) und Molo (CD11b+Ly6G-7/4lo) bei D150 bzw. D180 (P < 0,001) im Vergleich zu NIR (Abb. 2a). Interessanterweise waren bei D5 die Neutrophilen, Mohi und Molo im Vergleich zu NIR erschöpft und vermehrten sich dann, um bei D7 bis D90 auf das Grundniveau zurückzukehren. Darüber hinaus stiegen die Neutrophilen-, Mohi- und Molo-Zahlen in der Milz bei D14 und D150 an (P < 0,001, Abb. 2b).

Im Blut stiegen die Neutrophilen-, Mohi- und Molo-Zahlen von D1 bis zum Ende des Experiments an (P < 0,001, Abb. 2c).

Im Muskel wurden Mohi, Molo und Neutrophile rekrutiert und erreichten ihren Höhepunkt bei D1, D5 und D60 und kehrten dann bei D3, D30 und D120 auf das Grundniveau zurück (Abb. 2d). M2-like erreichte nach Muskelbestrahlung einen Höhepunkt bei D1 (P <0,01, Abb. 2e), wohingegen dendritische Zellen bei D60 (P <0,01, Abb. 2e) ihren Höhepunkt erreichten. Wir bemerkten auch einen, wenn auch nicht signifikanten, Anstieg von M1-like im Muskel bei D60.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass nach Muskelbestrahlung angeborene Entzündungszellen früh und massiv aus Milz und BM in den Muskel rekrutiert werden. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse die zeitlich wiederkehrenden, aufeinanderfolgenden Entzündungswellen nach Strahlenschäden, die abwechselnden Phasen der Proliferation angeborener Entzündungszellen in BM und Milz (Abb. 2a, b) und der Mobilisierung durch das Blut (Abb. 2c) entsprechen ihre Infiltration im bestrahlten Muskel (Abb. 2d, e).

Wir haben zuvor in einem Mausmodell einer kolorektalen Verletzung gezeigt, dass nach der Bestrahlung T-Lymphozyten in das verletzte Gewebe rekrutiert wurden22. Hier stellten wir fest, dass in unserem Modell CD4- und CD8-T-Zellen in ähnlicher Weise aus der Milz mobilisiert wurden und von D1 (P <0, 001, Abb. 3a) bis D90 einen starken signifikanten Rückgang zeigten. Danach vermehrten sich die T-Zellen und erreichten bei D120 fast das Grundniveau, und dann nahm die T-Zellzahl bei D150 und D180 im Vergleich zur NIR wieder ab (P < 0,001, Abb. 3a). Im Blut stieg die T-Zellzahl an und erreichte ihren Höhepunkt bei D30 und D60 (P < 0,001, Abb. 3b). Im Muskel wurden T-Zellen rekrutiert und erreichten ihren Höhepunkt bei D1 und D30 (P < 0,001, Abb. 3c).

a–c Quantitative Analyse (links) und repräsentatives Durchflusszytometrie-Gating (rechts) der Zellzahlen für CD4 (CD45+CD3+CD4+) und CD8 (CD45+CD3+CD8+) in Milz, Blut und Muskel, unbestrahlt (NIR) und bestrahlt, an den Tagen 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 nach der Bestrahlung. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. NIR; n = 8–10 Tiere/Zeitpunkt, ANOVA +/− SEM.

Diese Ergebnisse zeigen, dass eine lokalisierte Bestrahlung der Hinterbeine einen Rückgang der T-Zellen-Zahlen in der Milz verursachte, was auf deren Mobilisierung und Rekrutierung von der Milz zum bestrahlten Muskel hindeutet. Ähnlich wie bei angeborenen Zellen beobachteten wir aufeinanderfolgende Wellen der Mobilisierung und Rekrutierung von T-Zellen im Blut und in den Muskeln. Allerdings beobachteten wir solche Wellen in der Milz nicht, wahrscheinlich weil die T-Zellen sofort mobilisiert wurden.

Es ist bekannt, dass CCL2 und CX3CL1 über die Anziehung und Retention von Monozyten und T-Zellen im ischämischen Bein zur Neovaskularisierung beitragen26,37.

Die mRNA-Expression von CCL2 stieg bei D14 und D30 im bestrahlten Muskel im Vergleich zu NIR signifikant um das 11- bzw. 14-fache an (Abb. 4a). In ähnlicher Weise erhöhte sich die mRNA-Expression von CX3CL1 im bestrahlten Muskel im Vergleich zu NIR-Gewebe signifikant um das 3,7-fache bei D30 und um das 7,7-fache bei D90 (Abb. 4b).

a Quantitative Bewertung von CCL2- und CX3CL1-mRNA im Muskel. b, c Quantitative Auswertung (linke Seitentafeln) und repräsentative Mikrofotografien (rechte Seitentafeln) von CD68-positiven Zellen (b, angezeigt durch Pfeile) oder CD3-positiven Zellen (c, angezeigt durch Pfeile) pro mm2 im unbestrahlten ( NIR) und bestrahlter Muskel. Die Ergebnisse wurden als Prozentsätze relativ zum NIR ausgedrückt, auf 100 % gesetzt und der bestrahlte Muskel wurde an den Tagen 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 nach der Bestrahlung auf den NIR-Muskel normalisiert, Skala Balken: 100 µm. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. NIR; n = 6 Tiere/Zeitpunkt, ANOVA +/− SEM.

Die Hochregulierung von Chemokinen war mit der Infiltration von Makrophagen und Lymphozyten im Muskel verbunden. Am Tag 7 und am Tag 14 nach der Bestrahlung stieg die Anzahl der CD68-positiven Makrophagen im Vergleich zu NIR-Gewebe um das 3,5- bzw. 4-fache (P < 0,001) und nahm am Tag 30 ab. Die Anzahl der CD3-positiven Lymphozyten stieg bei D7 um das 39-fache, bei D14 um das 24-fache und bei D30 um das 18-fache (Abb. 4b, c und ergänzende Abb. 1).

Diese Ergebnisse zeigen, dass lokalisierte Bestrahlung zur Hochregulierung von Chemokinen wie CCL2 und CX3CL1 und zur Rekrutierung von Entzündungszellen führt.

Als nächstes analysierten wir die proangiogenen Akteure eNOS im Muskel nach der Bestrahlung. Die eNOS-mRNA-Spiegel im bestrahlten Muskel waren bei D7, D14, D30 und D90 im Vergleich zu NIR um das 2,8-, 2,6-, 2,5- bzw. 2,3-fache hochreguliert (Abb. 5a). Dementsprechend waren auch die eNOS-Proteinspiegel bei D30 im Vergleich zu NIR signifikant um das 2,3-fache hochreguliert (P < 0,001, Abb. 5b).

a–d Quantifizierung der eNOS-mRNA- und Proteinspiegel im Muskel. e, f Quantitative Auswertung und repräsentative Mikrofotografien der Mikroangiographie (c; Gefäße erscheinen in Weiß) und der Kapillardichte (d; Kapillaren erscheinen in Rot, Pfeile zeigen Beispiele für Isolektin B4-positive Kapillaren, Maßstabsbalken: 100 µm). Die Ergebnisse wurden als Prozentsätze relativ zum unbestrahlten (NIR) ausgedrückt, auf 100 % gesetzt, und der bestrahlte Muskel wurde an den Tagen 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 auf NIR-Muskel normalisiert Nachbestrahlung. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. NIR; n = 5–8 Tiere/Zeitpunkt, ANOVA +/− SEM.

Darüber hinaus haben wir den Neovaskularisationsprozess nach der Bestrahlung im Muskel mithilfe unabhängiger und komplementärer Mikroangiographie- und Immunhistochemie-Ansätze bewertet. Der angiographische Score war am Tag 14 im Vergleich zur NIR-Gruppe signifikant um das 1,4-Fache (P < 0,01) erhöht. Darüber hinaus wurde die Kapillardichte bei D7 und D14 im Vergleich zur NIR-Gruppe um das 1,7-fache (P < 0,05) bzw. das Doppelte (P < 0,001) erhöht (Abb. 5c, d). Darüber hinaus analysierten wir mithilfe des Bayes'schen Ansatzes mit latenten Variablen38 die Korrelation zwischen dem Neovaskularisierungsprozess und der Mobilisierung/Rekrutierung von Entzündungszellen während der frühen Phase (D0-D30) und der späten Phase (D60-D180). Von D1 bis D30 nach der Bestrahlung fanden wir eine signifikante Korrelation zwischen der Bildung neuer Gefäße und der Mobilisierung von CD4/CD8-Zellen (beide P < 0,01) aus der Milz und deren Zunahme im Blut (beide P < 0,05) (Tabelle 1). In gleicher Weise war der Anstieg der Mohi-infiltrierten Zahlen und deren Differenzierung in M1-ähnliche in bestrahlten Muskeln mit der Neovaskularisation verbunden (beide P < 0,01) (Tabelle 1).

Bei D60 kehrte der angiographische Score jedoch auf das Grundniveau zurück und sank dann bei D90, D120 und D150 signifikant ab (P < 0,01) im Vergleich zur NIR-Gruppe (Abb. 5c). Darüber hinaus kehrte die Kapillardichte bei D30 auf das NIR-Niveau zurück und nahm im Vergleich zur NIR-Gruppe signifikant von D60 auf D180 ab (P < 0,05) (Abb. 5d). Noch wichtiger ist, dass wir von D60 bis D180 mit dem Bayes'schen Ansatz gezeigt haben, dass die Abnahme der Molo-Zahlen im Blut (P < 0,05) und im Muskel (P < 0,001) sowie ihre Differenzierung in M2-ähnlichen Werten im Muskel (P < 0,05) zunimmt ) korrelierte mit diesem Prozess der Gefäßverdünnung (Tabelle 1).

Um die Rolle von Monozyten/Makrophagen im Neovaskularisierungsprozess nach Bestrahlung der Hinterbeine direkt zu untersuchen, haben wir die Rolle von Mohi und Molo anhand von Mäusen mit CCR2- oder CX3CR1-Mangel genauer untersucht. Bei Ccr2-/-Mäusen waren die zirkulierenden Mohi- (P <0,001, Abb. 6a) und Molo-Spiegel (P <0,01, Abb. 6b) im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen bei D3 nach der Bestrahlung signifikant reduziert. Darüber hinaus haben Lu et al. zeigten, dass die Mobilisierung von Monozyten (Mohi und Molo), jedoch nicht von Lymphozyten oder Neutrophilen, bei Ccr2-/−-Mäusen vom BM zum Blut und vom Blut zum verletzten Muskel beeinträchtigt war, was darauf hindeutet, dass der im Blut analysierte niedrige Monozytenspiegel nicht auf die Hinterbeine zurückzuführen war Bestrahlung39. In ähnlicher Weise haben wir auch die geringe Anzahl von Makrophagen im CCR2-/−-Muskel im Vergleich zu WT-Mäusen 10 Tage nach der Bestrahlung nachgewiesen (P <0, 05; Abb. 6d). Als nächstes versuchten wir, den Einfluss der CCR2- und CX3CR1-Signalwege auf das Gefäßwachstum nach der Bestrahlung zu bewerten. Zehn Tage nach der Bestrahlung war der angiographische Score bei Mäusen mit CCR2- und CX3CR1-Mangel im Vergleich zu ihren Wildtyp-Gegenstücken verringert (P < 0,001, Abb. 6e).

a–c Quantitative Analyse der Zellzahlen für Mohi, Molo und Neutrophile im Blut von WT-Mäusen oder Mäusen mit CCR2- und CX3CR1-Mangel. **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. bestrahlter WT, n = 3–4 Tiere/Zeitpunkt. d Quantitative Analyse der Infiltration von CD68+-Makrophagen aus dem Blut in verletzte Muskeln am Tag 10 nach der Bestrahlung bei WT-Mäusen oder Mäusen mit CCR2- und CX3CR1-Mangel, n = 5 Tiere/Zeitpunkt. e Quantitative Auswertung und repräsentative Mikroangiographien bei WT-Mäusen oder Mäusen mit CCR2- und CX3CR1-Mangel 10 Tage nach der Bestrahlung der Hinterbeine. f Quantitative Auswertung und repräsentative Mikroangiographien 10 Tage nach der Bestrahlung der Hinterbeine bei Tieren, denen PBS, 105 Mohi oder 105 Molo intramuskulär injiziert wurden. *P < 0,05 im Vergleich zu Mäusen, denen PBS injiziert wurde. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz relativ zum unbestrahlten (NIR) ausgedrückt, auf 100 % gesetzt und der bestrahlte Muskel wurde auf NIR-Muskel normalisiert, n = 5–12 Tiere/Zeitpunkt, ANOVA +/– SEM.

Wie erwartet zeigen unsere Ergebnisse deutlich, dass eine Störung der CCL2/CCR2- und CX3CL1/CX3CR1-Signalwege das postischämische Gefäßwachstum behindert.

Da Molo-Monozyten im BM selten sind und schwer in ausreichenden Mengen aus dem Blut zu gewinnen sind, haben wir Mohi und Molo aus der Milz als Ersatz für zirkulierende Monozyten-Untergruppen verwendet. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Untergruppen der Blut- und Milz-Monozyten in Transkriptom und Funktion nahezu identisch sind40. Am Tag nach der Bestrahlung der Hinterbeine erhielten WT C57BL/6-Mäuse eine intramuskuläre Injektion von PBS, 105 Mohi oder 105 Molo. 10 Tage nach der Bestrahlung verbesserte der Mohi-Transfer den angiographischen Score (P < 0,5, Abb. 6f) im Vergleich zu mit PBS behandelten Mäusen. Im Gegensatz dazu verbesserte die Injektion von Molo den angiographischen Score nicht.

Diese Ergebnisse zeigen eindeutig eine zentrale Rolle der Mohi-Aktivierung bei der Orchestrierung von Gefäßentzündungen und der Förderung der Neovaskularisation in der akuten Phase nach der Bestrahlung der Hinterbeine.

Eine lokale Überexposition mit ionisierender Strahlung hat schwerwiegende gesundheitliche Folgen, insbesondere wenn die absorbierte Dosis 25 Gy übersteigt, und führt zu Gewebenekrose1. Die Strahlenschädigung ist in den ersten Tagen bis Wochen nach der Bestrahlung durch aufeinanderfolgende und unvorhersehbare Entzündungswellen gekennzeichnet, die zu einer oberflächlichen und tiefen Ausbreitung der Gewebeschädigung einschließlich Gefäßverdünnung und Muskelkachexie führen1. In diesem Bericht haben wir zum ersten Mal die dynamischen Entzündungswellen gezeigt, die strahleninduzierte Verletzungen charakterisieren. In der Milz und im Knochenmark entsprachen diese Wellen abwechselnden Phasen zwischen Zellproliferation und -mobilisierung durch das Blut und ihrer anschließenden Infiltration in die bestrahlten Muskeln. Diese Wellen waren bei Neutrophilen, Mohi und dann Molo, hauptsächlich in der Milz und den Muskeln, viel ausgeprägter. Allerdings stieg die Zahl der angeborenen zirkulierenden Zellen im Blut nach der Bestrahlung von D1 auf D180, während ihre Zahl im bestrahlten Muskel recht niedrig war, was auf eine Anreicherung im Blut schließen lässt. Darüber hinaus wurden T-Zellwellen in Blut und Muskeln beobachtet. Viele Studien haben bereits die Mobilisierung und Rekrutierung von Entzündungszellen nach kolorektaler lokalisierter Bestrahlung22, femoraler Ischämie oder Myokardinfarkt20,24,41 gezeigt. Im Vergleich zum klassischen kardiovaskulären ischämischen Modell14 war die Anzahl der M2-ähnlichen Makrophagen im bestrahlten Muskel jedoch nur am Tag 1 erhöht. Wir haben mehrere Hypothesen, die diese Beobachtung erklären könnten, darunter (i) die Proliferation von M2-residenten Zellen im Gewebe, (ii) den Defekt beim M2-Austritt (Migrationsfähigkeit)42 oder (iii) die Resistenz gegen radioinduzierte Apoptose von M2-Zellen Prozess im Muskel.

Mehrere Studien haben zuvor gezeigt, dass bestrahltes ischämisches Endothel entzündungsfördernde Eigenschaften aufweist. Endothelzellen exprimieren Chemokine wie CCL2 und CX3CL1, was zur Rekrutierung und Infiltration von Entzündungszellen über ihre Rezeptoren CCR2 oder CX3CR1 führt, um die Bildung neuer Gefäße zu verbessern26,30. Wir haben gezeigt, dass bestrahltes Gewebe während der frühen Phase (D0-D30 nach IR) proangiogene (eNOS) und proarteriogene Faktoren (CX3CL1, CCL2) exprimiert, um die Mobilisierung von proinflammatorischen CD4- und CD8-T-Zellen zu induzieren. und Mohi aus der Milz und BM über das Blut und ihre Rekrutierung und Infiltration in bestrahltem Gewebe, was zur Differenzierung von Mohi in M1-ähnliche Makrophagen führt. Danach beobachteten wir eine späte Phase (D60-D180 nach IR), die durch eine Korrelation zwischen der verringerten entzündungshemmenden Molo-Rekrutierung und ihrer Differenzierung in M2-ähnliche, Gefäßverdünnung und Kachexie gekennzeichnet war. Obwohl wir bei D90 nach der Bestrahlung einen Anstieg der CX3CL1- und eNOS-mRNA-Expression feststellen konnten, beobachteten wir keinen ähnlichen Anstieg der entsprechenden Proteine, was mit Gefäßverdünnung und Kachexie übereinstimmt.

Diese Ergebnisse stimmen mit der Literatur über die Rolle von CCL2 und CX3CL1 bei der Rekrutierung von Entzündungszellen und der Verbesserung der Neovaskularisation überein. Daher erhöhte die lokale Infusion oder Überexpression von CCL2 nach einem Verschluss der Oberschenkelarterie die Anzahl der zirkulierenden Monozyten, und es wurde gezeigt, dass ihre Akkumulation die kollaterale und periphere Leitfähigkeit sowie die Neovaskularisation unterstützt26,31. CX3CL1-defiziente Mäuse enthielten im Atherogenesemodell deutlich weniger Makrophagen als Kontrollen43. Diese Daten ergänzen die zunehmenden Belege dafür, dass Monozyten/Chemokinwege eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Angiogenese spielen. Darüber hinaus sind auch T-Lymphozyten an diesem Prozess beteiligt, da Nacktmäuse, denen alle T-Zell-Untergruppen fehlen, eine deutliche Verringerung des postischämischen Gefäßwachstums aufweisen23. Darüber hinaus wurde vermutet, dass CD4- und CD8-T-Zell-Untergruppen eine Rolle bei der Gefäßumgestaltung spielen. Tatsächlich zeigen CD4- und CD8-defiziente Mäuse eine signifikante Verringerung des postischämischen Gefäßwachstums17,18.

Als nächstes zeigten wir, dass Monozyten nach einer lokalisierten Bestrahlung der Hinterbeine zum Neovaskularisierungsprozess beitrugen, indem wir Mäuse mit CCR2- und CX3CR1-Mangel verwendeten. Die Deletion von CCR2 oder CX3CR1 verringerte die Anzahl der zirkulierenden Monozyten und verringerte den angiographischen Score, wie bereits berichtet. Es wurde gezeigt, dass CCR2 und CX3CR1 die Monozytenrekrutierung in ischämischen Geweben steuern30,44. CCR2 ist hauptsächlich an der Regulierung des zirkulierenden Mohi-Spiegels beteiligt. Interessanterweise verhindert das Fehlen von CCR2 insbesondere die Mohi-Infiltration im ischämischen Myokard29,40. Außerdem wurde gezeigt, dass die CCR2-Expression durch BM-Zellen, nicht aber durch verletzte Muskelgewebezellen, erforderlich ist, um nach einer akuten Skelettmuskelverletzung eine Entzündungsreaktion auszulösen45, um eine anschließende Muskelkapillararterialisierung zu ermöglichen46. Mohi fördert die Arteriogenese und Angiogenese durch die Produktion von Wachstumsfaktoren35,47,48,49. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die CX3CR1-Signalübertragung das Überleben von Monozyten fördert, bei denen es sich um kurzlebige Zellen handelt50: Eine endogene CX3CR1-Signalübertragung könnte für das Überleben neu mobilisierter Monozyten mit BM-Ursprung erforderlich sein. Dies wird durch unsere Beobachtung einer geringeren Anzahl von Molo-Monozyten bei CX3CR1-/- Mäusen im Vergleich zu WT-Tieren gestützt. CX3CR1-defiziente Mäuse zeigten eine ausreichende Monozytenrekrutierung und Revaskularisierung für die Hautreparatur und Wundangiogenese; Allerdings waren die myeloische Zellreaktion und das Ausmaß der Neovaskularisation im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen gedämpft51. Darüber hinaus haben viele Studien bei Arteriosklerose gezeigt, dass die CX3CL1/CX3CR1-Signalübertragung an der Angiogenese während der Bildung von Plaque-Mikrogefäßen beteiligt ist44,52,53.

Schließlich haben wir eine wichtige Rolle von Mohi-Monozyten beim postischämischen Gefäßwachstum hervorgehoben. Die muskuläre Verabreichung von Mohi steigerte die Arteriogenese, wohingegen die Injektion von Molo keinen Einfluss auf diesen Prozess hatte. Wir zeigen, dass der adoptive Transfer der entzündlichen Untergruppe der Monozyten früh nach der Auslösung einer Ischämie der Hinterbeine die Reperfusion nach einer Ischämie deutlich steigert. In einem Kaninchenmodell der akuten Oberschenkelarterienligatur wurde gezeigt, dass das Wachstum der Kollateralarterie direkt von der Anzahl der zirkulierenden Monozyten abhängt25. Darüber hinaus könnte das ausgeprägte proarteriogene Potenzial aus der unterschiedlichen Expression angiogener Faktoren wie MMP-926,54 durch die Freisetzung von extrazellulärer Matrix-gebundenem VEGF55 resultieren. Bei Myokardinfarkten hatte eine selektive Depletion von M2-Makrophagen eine katastrophale Prognose mit einer Zunahme häufiger Herzrupturen. Die Gewebereparatur wurde vollständig durch eine externe Versorgung mit M2-ähnlichen Makrophagen gerettet56. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Rolle von M1-ähnlichen und M2-ähnlichen Zellen bei der Gewebereparatur, die ihren sequentiellen und komplementären Funktionen entspricht, indem M1-ähnliche Makrophagen den Heilungsprozess einleiten, indem sie die Angiogenese stimulieren38,57, während M2-ähnliche Zellen fördern Stabilisierung der Angiogenese und Gewebereifung durch Unterstützung der Vergrößerung des Durchmessers regenerierender Fasern58 während der Skelettmuskelregeneration bei Mäusen.

Somit könnten Monozyten/Makrophagen als Biomarker zur Bewertung und Verwaltung des bestrahlten Gewebes verwendet werden, um dem Patienten eine personalisierte regenerative medizinische Behandlung anzubieten. Die Infiltration von M1-/M2-ähnlichen Makrophagen konnte mit drei verschiedenen Methoden untersucht werden. Für die Beurteilung der Makrophageninfiltration eignet sich am besten die Durchflusszytometrie mit Antikörpermischungen, dieser Ansatz hängt jedoch von der Menge des entnommenen Gewebes ab. Daher könnten PCR und immunhistochemische Färbung verwendet werden, um die Expression von Zytokinen oder Entzündungszellen zu analysieren.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Entzündungszellen nach der Bestrahlung der Hinterbeine eine wichtige Rolle spielen, um den Neovaskularisierungsprozess zu ermöglichen und die Blutgefäße aufrechtzuerhalten, um die Entwicklung von Kachexie zu begrenzen.

Alle durchgeführten Tierversuche wurden von der institutionellen Tierversuchs- und Ethikkommission (C2EA) des Instituts für Strahlenschutz und nukleare Sicherheit (IRSN) genehmigt. Die Experimente wurden gemäß den französischen Veterinärrichtlinien und den von der Europäischen Gemeinschaft für Versuchstiere formulierten Richtlinien (APAFIS#12903-2018010418086132 v1 und APAFIS #19137-2019021313569870 v1) durchgeführt. Als Versuchstiere wurden männliche C57Bl/6-Mäuse (8 Wochen alt) verwendet (Janvier, Frankreich). Acht Wochen alte männliche CCR2–/–, CR3CR1–/– und ihre Wildtyp (WT) C57BL/6-Wurfgeschwister wurden von den Jackson Laboratories gekauft. Alle Tiere wurden unter stabilen Mikroumgebungsbedingungen (22 ± 1 °C) mit abwechselnden 12-stündigen Licht- und Dunkelzyklen gehalten und erhielten Standard-Laborfutter und Wasser. Mäuse wurden mit Isofluran-Inhalation (2 %) anästhesiert und ihr rechtes Hinterbein wurde einer Einzeldosis von 80 Gy-Bestrahlung unter Verwendung von 10-MV-Röntgenstrahlen bei 2,6 Gy/min auf einem Bestrahlungsfeld von 2*24 cm (Elekta Synergy Platform, Elekta SAS, Boulogne-Billancourt, Frankreich).

Die Kinetik der Entwicklung der Läsion wurde durch eine semiquantitative Analyse bewertet. Jedem klinischen Zeichen, einschließlich Wundausdehnung, Geschwürbildung, feuchter Abschuppung und Zurückziehen der Gliedmaßen, wurde eine Bewertung zwischen 0 (normal) und 1 (maximale Verletzung) zugewiesen, was zu einer Gesamtverletzungsbewertung von bis zu 5 während der Wundentwicklung und dem Heilungsprozess jede Woche nach der Wunde führte Bestrahlung.

Gastrocnemius wurden herausgeschnitten, in PBS gespült und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Gewebe wurden mit einem Kryostaten in 7 μm dicke Abschnitte geschnitten.

Makrophagen und CD3-positive Zellen wurden nach CD68-Antikörper- (1/250, Biorad) oder CD3-Färbung (1/250, DAKO) und anschließender Färbung mit einem Esel-488-AF-Anti-Ratten- oder Anti-Kaninchen-IgG (1/250) sichtbar gemacht , Jackson ImmunoResearch). CD68- und CD3-positive Zellen wurden in zufällig ausgewählten Feldern unter Verwendung der Image J-Software (NIH) gezählt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, um die Muskelstruktur zu analysieren.

Nach der Bestrahlung wurde die Neovaskularisation wie zuvor mit zwei verschiedenen Methoden bewertet59.

Zum Zeitpunkt der Tötung wurden die Mäuse anästhesiert (Alfaxan (80 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und es wurde eine longitudinale Laparotomie durchgeführt, um einen Polyethylenkatheter in die Bauchschlagader einzuführen und Kontrastmittel (Barium) zu injizieren Sulfat, 1 g/ml). Anschließend wurde eine Angiographie der Hinterbeine durchgeführt und Bilder (zwei pro Tier) mit einem hochauflösenden digitalen Röntgenwandler aufgenommen. Die Bilder wurden zusammengestellt, um eine vollständige Ansicht der Hinterbeine zu erhalten. Die Anzahl der von Gefäßen besetzten Pixel wurde im Quantifizierungsbereich mit der Primed-Angio-Software (Trophy System, Paris, Frankreich) gemessen. Der Quantifizierungsbereich wurde durch die Platzierung des Beckens, des Knies und der Kante des Femurs begrenzt und die äußere Grenze des Beins. Die Ergebnisse wurden dann als Verhältnis von bestrahltem zu nicht bestrahltem Bein ausgedrückt.

Der Gastrocnemius-Muskel wurde aus der rechten (bestrahlten Extremität) und der linken (NIR-Extremität) herausgeschnitten und zur Kryosektion in OCT-Verbindung (Sakura Finetek France, Villeneuve d'ASCQ, Frankreich) eingefroren. Gefrorene Muskelschnitte (7 µm) wurden mit einem DyLight 594 Labeled GSLI-Isolectin B4 (Vector Laboratories, Verdünnung 1:200) gefärbt, um Kapillaren zu identifizieren. Es wurde die Anzahl der Kapillaren pro mm2 Muskelfläche bestimmt.

Mäuse wurden durch Zervixluxation nach Sedierung mit Isofluran-Inhalation (4 %) an den Tagen 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 oder 180 nach der Bestrahlung der Hinterbeine eingeschläfert (n = 8–10 Mäuse pro Tag). Zeitpunkt). Peripheres Blut wurde über eine Punktion der unteren Hohlvene mit Heparinlösung entnommen. Vollblut wurde nach Immunfluoreszenzfärbung mit der BD FACS-Lyselösung (BD Biosciences) lysiert und die Gesamtleukozytenzahl im Blut mithilfe von Kova-Objektträgern bestimmt. Knochenmarkszellen wurden aus dem Femur entnommen und durch ein 40-μm-Nylonnetz (BD Biosciences) gefiltert. Die Milzen wurden gesammelt und vorsichtig durch ein 40-μm-Nylonnetz (BD Biosciences) geleitet. Sowohl für Splenozyten als auch für aus dem Knochenmark stammende Zellen wurde die Zellsuspension 10 Minuten lang bei 4 °C und 400 × g zentrifugiert. Rote Blutkörperchen wurden unter Verwendung von Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Sigma-Aldrich) lysiert und Splenozyten und Knochenmarkszellen wurden mit PBS gewaschen. Nicht bestrahlte und bestrahlte Muskeln wurden gesammelt, mit einer feinen Schere zerkleinert und vorsichtig durch den Bel-Art Scienceware 12-Well-Gewebesdisaggregator (ThermoFisher Scientific) geleitet. Die Zellen wurden dann durch ein Nylonnetz (40 μm) filtriert und zentrifugiert (10 min, 400 × g, 4 °C).

Aus dem interessierenden Gewebe isolierte Zellen wurden 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C mit der folgenden Antikörpermischung inkubiert. Zum Nachweis von Entzündungszellen wurden die Gesamtzellen auf AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti-CD11b (ThermoFisher Scientific), APC-konjugiertes Anti-Ly-6B.2 (Klon 7/4, Biorad) und PE-konjugiertes Anti-CD11b (ThermoFisher Scientific) untersucht. konjugiertes Anti-Ly6G, PB-konjugiertes Anti-CD64, APC-konjugiertes Anti-F4/80, PerCP5.5-konjugiertes Anti-MHCII (BD Biosciences), FITC-konjugiertes Anti-CD4 (Klon RM4-5; eBioscience), PercpCy5 -konjugiertes Anti-CD8 (Klon 53-6.7, BD Pharmingen), APC-konjugiertes Anti-CD3 (Klon 17A2, eBioscience), PE-Cyanin7-konjugiertes Anti-CD11c (Klon N418, eBioscience) während 30 Minuten bei 4 °C.

Wir haben verschiedene Antikörpermischungen in verschiedenen Geweben wie folgt verwendet:

Knochenmark: Mischung 1: Mo: FITC-konjugiertes Anti-CD11b, APC-konjugiertes Anti-Ly-6B.2, PE-konjugiertes Anti-Ly6G; Mischung 2: Lymphozyten: AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti-CD4, PercpCy5-konjugiertes Anti-CD8, APC-konjugiertes Anti-CD3,

Milz: Mischung 1: Mo: FITC-konjugiertes Anti-CD11b, APC-konjugiertes Anti-Ly-6B.2, PE-konjugiertes Anti-Ly6G; Mischung 2: Lymphozyten: AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti-CD4, PercpCy5-konjugiertes Anti-CD8, APC-konjugiertes Anti-CD3,

Blut: Mischung 1: Mo: FITC-konjugiertes Anti-CD11b, APC-konjugiertes Anti-Ly-6B.2, PE-konjugiertes Anti-Ly6G; Mischung 2: Lymphozyten: AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti-CD4, PercpCy5-konjugiertes Anti-CD8, APC-konjugiertes Anti-CD3,

Muskel: Mischung 1: Mo: AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti-CD11b, APC-konjugiertes Anti-Ly-6B.2, PE-konjugiertes Anti-Ly6G; Mix 2: Lymphozyten: AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti-CD4, PercpCy5-konjugiertes Anti-CD8, APC-konjugiertes Anti-CD3, Mix 3: Makrophagen: AF700-konjugiertes Anti-CD45, FITC-konjugiertes Anti- CD11b, PE-konjugiertes Anti-Ly6G, PB-konjugiertes Anti-CD64, APC-konjugiertes Anti-F4/80, PerCP5.5-konjugiertes Anti-MHCII, PE-Cyanin7-konjugiertes Anti-CD11c Mohi (CD11b+Ly6G–7/ 4hi), Molo (CD11b+Ly6G–7/4lo), M1-ähnliche Zellen (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII+) und M2-ähnliche Zellen (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII-) , DC (CD11c+MHCII+), CD4 (CD3+CD4+) und CD8 (CD3+CD4+).

Die Gesamtzahl der Zellen wurde dann auf das Muskelgewicht normalisiert. Die Zellen wurden mit einem Durchflusszytometer (Canto II, BD Biosciences) analysiert.

Die Gesamt-RNA wurde aus gefrorenen Muskelproben mit Trizol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, Frankreich) extrahiert. Nach der Quantifizierung auf einem NanoDrop ND-1000-Gerät (NanoDrop Technologies, Rockland, DE) wurde die reverse Transkription mit QuantiTect Reverse Tranription (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die PCR wurde mit dem ABI PRISM 7900 unter Verwendung des Power SYBR PCR Master Mix (Bioline) durchgeführt. Ct für Maus-GAPDH wurde verwendet, um die Probenamplifikation zu normalisieren. Als Primer dienten folgende Oligonukleotide (Applied Biosystems): GAPDH vorwärts: 5′-CGTCCCGTAGACAAAATGGTGAA-3′, rückwärts: 5′-GCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3′; eNOS vorwärts: 5′-CGCCCACCCAGGAGAGATCCAC-3′, rückwärts 5′-GCATCGGCAGCCAAACACCAAAGT-3′; CCL-2 vorwärts: 5′-CCCCACTCACCTGCTGCTA-3′, rückwärts 5′-TTACGGGTCAACTTCACATTCAAA-3′; CX3CL1 vorwärts: 5′-GTGGCTTTGCTCATCCGCTATCAG-3′, rückwärts: 5′-CACATTGTCCACCCGCTTCTCA-3′.

Es wurde eine Herstellung von Proteinextrakten durchgeführt. Kurz gesagt, zur Herstellung des Gesamtproteins wurden Tibialis-anterior-Muskeln von bestrahlten und nicht bestrahlten Hinterbeinen in RIPA-Puffer (50 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 % Desoxycholat, 0,1 % Sicherheitsdatenblatt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren). Die Proteine ​​wurden in einer denaturierenden Gradientengelelektrophorese aufgelöst und auf 0,2 μm dicke Nitrozelluloseblätter (Biorad, Marnes la Coquette, Frankreich) geblottet. Für das Immunblotting wurden Antikörper gegen eNOS (1:1000; BD Biosciences) verwendet. Als Kontrolle der Proteinbeladung wurden die Membranen abgezogen und mit einem gegen GAPDH gerichteten monoklonalen Antikörper (1:10.000, Abcam) inkubiert und ein spezifisches Chemilumineszenzsignal nachgewiesen.

Für das adoptive Transferexperiment wurden Milzen von 8 Wochen alten C57BL/6-Mäusen auf einem 40-mm-Zellsieb mechanisch dissoziiert. Splenozyten gefärbt mit AF700-konjugiertem Anti-CD45, FITC-konjugiertem Anti-CD11b, APC-konjugiertem Anti-Ly-6B.2, Pacific Blue-konjugiertem Anti-Ly6G und PE-konjugiertem Anti-NK1.1. CD11b+Ly6G-NK1.1-7/4hi und CD11b + Ly6G2NK1.1-7/4lo wurden dann mithilfe eines FACS BD InFlux ausgewählt. Die Reinheit beider Teilmengen betrug 99 %. Vor der Injektion wurden die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss gezählt. Insgesamt wurden C57BL/6-Empfängern am nächsten Tag nach der Bestrahlung der Hinterbeine insgesamt 105 Mohi-Monozyten oder 105 Molo-Monozyten intramuskulär injiziert.

Die Ergebnisse wurden als ± SEM ausgedrückt. Zum Vergleich der einzelnen Parameter wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. Anschließend wurden Post-hoc-T-Testvergleiche nach Bonferroni durchgeführt, um zu ermitteln, welche Gruppenunterschiede für die signifikante Gesamt-ANOVA verantwortlich sind. Ein Wert von P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Die Untersuchung des statistischen Zusammenhangs zwischen der Infiltration von Entzündungszellen und Leukozytenuntergruppen einerseits und der postischämischen Neovaskularisation andererseits ist eine Herausforderung, da diese beiden Messungen an unterschiedlichen Tierkohorten durchgeführt wurden. Dies macht die klassischen statistischen Ansätze ineffizient, da Vorhersage- und Antwortvariablen nicht für dasselbe Thema beobachtet werden. Das Bayesianische Modell der latenten Variablen60 bietet die Möglichkeit, Prioritäten für die Verteilung der Entzündungszellen und die Anzahl der Leukozyten-Untergruppen einzubeziehen, um deren Korrelation mit dem Gefäßwachstum abzuschätzen. Die Modellanpassung wurde mit JAGS-Software über die Markov-Kette Monte Carlos durchgeführt. Alle P-Werte in den verschiedenen statistischen Analyseabschnitten wurden für mehrere Tests mithilfe des Benjamini- und Hochberg-Verfahrens korrigiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in diesem Dokument und seinen Zusatzinformationsdateien und Zusatzdaten 1 enthalten.

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Dr. Celine Loinard wird vom Institut für Strahlenschutz und nukleare Sicherheit (IRSN), Fontenay-aux-Roses, Frankreich, unterstützt.

Institut für Strahlenschutz und nukleare Sicherheit (IRSN), Fontenay-aux-Roses, Frankreich

Céline Loinard, Mohamed Amine Benadjaoud, Bruno Lhomme, Stéphane Flamant und Radia Tamarat

CEA, Fontenay-aux-Roses, Frankreich

Jan Baijer

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CL und RT konzipierten die Studie, gestalteten die Experimente und interpretierten die Daten. CL, MAB, BL, SF und JB führten die Experimente durch und analysierten die Daten. CL und RT haben das Manuskript mit der endgültigen Zustimmung aller Co-Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Céline Loinard.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Jemond Dalli und Karli Montague-Cardoso. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Loinard, C., Benadjaoud, MA, Lhomme, B. et al. Die Dynamik von Entzündungszellen steuert die Neovaskularisation und die Gewebeheilung nach lokalisierter, durch Strahlung verursachter Verletzung bei Mäusen. Commun Biol 6, 571 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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Eingegangen: 04. Juli 2022

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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