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Aug 19, 2023

Molekulare Testgeräte für on

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4245 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Escherichia coli (E. coli)-Zellen sind in Fäkalien vorhanden, die die Hauptquelle für krankheitsverursachende Stoffe im Wasser sein können. Daher wird E. coli als Indikator für die Wasserqualität empfohlen. Wir haben eine innovative Plattform zum Nachweis von E. coli zur Überwachung der Wasserqualität vor Ort entwickelt, indem wir die papierbasierte Probenvorbereitung mit der isothermen Nukleinsäureamplifikation kombinieren. Die Plattform führt die Bakterienlyse und DNA-Anreicherung auf einem Papierblock über kugelbasierte Ventile zur Flüssigkeitskontrolle durch, ohne dass Laborgeräte erforderlich sind. Anschließend erfolgt die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) in einer batteriebetriebenen Kaffeetasse und die kolorimetrische Erkennung . Wir haben die Plattform verwendet, um E. coli in Umweltwasserproben in etwa 1 Stunde nachzuweisen, mit einer Quantifizierungsgrenze von 0,2 KBE/ml und 3 Kopien pro Reaktion. Die Plattform wurde für den Nachweis mehrerer E. coli-Stämme und für Wasserproben mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen bestätigt. Wir haben die Funktionen der Plattform validiert, indem wir Freizeitwasserproben analysiert haben, die in der Nähe des Atlantischen Ozeans gesammelt wurden und unterschiedliche Konzentrationen an Salz und Bakterien enthalten.

Wasserressourcen auf der ganzen Welt sind einer Vielzahl biologischer oder nichtbiologischer Schadstoffe ausgesetzt, deren Vorkommen über ein bestimmtes Maß hinaus für den Menschen schädlich sein kann1. Eine gute öffentliche Gesundheit erfordert eine regelmäßige Überwachung der Wasserqualität, um Krankheiten vorzubeugen. Weltweit sterben jedes Jahr etwa 1,6 Millionen Menschen an durch Wasser übertragenen Krankheiten, die durch biologische Schadstoffe verursacht werden1, was Länder aller Wirtschaftsstufen betrifft2. Krankheitserreger sind die größten biologischen Schadstoffe im Wasser und daher ist es wichtig, das Vorhandensein dieser Krankheitserreger in Freizeit- und Trinkwasserquellen zu überwachen. Zu diesen Krankheitserregern gehören Salmonellen, Staphylokokken, Vibrio cholera, Legionellen, Shigellen, Escherichia coli (E. coli) und andere coliforme Bakterien3. Diese Krankheitserreger können in Wasserquellen eingeschleppt werden und dann direkt über das Trinkwasser oder indirekt beim Baden und anderen Freizeitaktivitäten im Wasser in den menschlichen Körper gelangen. Aus diesem Grund wurden von verschiedenen Organisationen wie der Weltgesundheitsorganisation (WHO), der US-amerikanischen Umweltschutzbehörde (EPA) oder der Europäischen Union akzeptable Grenzwerte für einige dieser Krankheitserreger in der Gesetzgebung festgelegt4.

Fäkalienverschmutzung ist die Hauptquelle für Krankheitserreger im Wasser1,4, einschließlich Bakterien, die in den Ausscheidungen von Menschen und Warmblütern vorkommen. E. coli ist eine Bakterienart, die normalerweise im Darm von Warmblütern lebt, obwohl einige toxische Stämme (z. B. E. coli O157:H7) Bauchkrämpfe, Erbrechen und Durchfall verursachen können. Schon kleine Mengen kontaminiertes Wasser mit diesen giftigen Stämmen können Krankheiten verursachen5. Da E. coli im Darm von Menschen und Warmblütern vorhanden ist und diese Bakterien über den Kot freigesetzt werden, kann E. coli als Indikator für fäkale Kontamination im Süßwasser dienen4,6.

Die EPA veröffentlichte 2012 aktualisierte Kriterien mit einer Empfehlung für die Qualität von Süß- und Meerwasser in Freizeitgewässern7. Sie berichteten über zwei Kriterien, eines für eine geschätzte Krankheitsrate (NGI oder NEEAR-GI-Krankheit, während NEEAR für National Epidemiological and Environmental Assessment of Recreational Water und GI für Magen-Darm steht) von 36 pro 1000 Primärkontakt-Erholungspersonen und eines für 32 pro 1000 primäre Kontakt-Ersteller. Die empfohlenen Kriterien für E. coli in Süßwasser für den NGI von 32 pro 1000 primäre Kontaktrekreatoren in einem beliebigen 30-Tage-Intervall sind ein geometrischer Mittelwert von 100 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro 100 ml und ein statistischer Schwellenwert (STV). von 320 KBE pro 100 ml7. Daher sollte die Quantifizierungsgrenze (LoQ) jeder für die Wasserqualitätsüberwachung entwickelten Methode unter 100 KBE/100 ml oder 1 KBE/ml liegen.

Konventionelle Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern im Wasser sind meist kulturbasierte Ansätze und Trenn-/Filtrationstechniken in Laboren8. Obwohl diese herkömmlichen Labortests aufgrund ihrer Genauigkeit und Empfindlichkeit die Standardmethoden sind, erfordern sie sperrige und kostspielige Instrumente, qualifiziertes Personal und lange Durchlaufzeiten. Ein weit verbreitetes Testsystem ist das IDEXX Colilert, das die Anzahl der Gesamtkolibakterien und E. coli in einem einzigen Test quantifizieren kann. Obwohl das IDEXX Colilert-System beliebt und relativ einfach zu verwenden ist, erfordert es sperrige und teure Ausrüstung wie einen Inkubator, wobei aufgrund der Bakterienkultur eine lange Zeit bis zum Ergebnis (24 Stunden) erforderlich ist9. Daher gibt es einen wachsenden Trend zur Entwicklung kleiner, einfach zu bedienender und kostengünstiger Geräte für Vor-Ort-Methoden für schnellere Ergebnisse1, die sofortige Maßnahmen ermöglichen und möglicherweise Menschen vor der Ansteckung mit Krankheiten schützen. Die Entwicklung kostengünstiger Vor-Ort-Methoden kann auch ressourcenbeschränkten Ländern oder Regionen zugute kommen, in denen Laboreinrichtungen nicht verfügbar oder leicht zugänglich sind.

Zu den tragbaren Plattformen vor Ort gehören Ansätze, die auf enzymatischen Assays10,11,12, Mikrofluidik13,14,15, Lateral-Flow-Streifen16,17 und papierbasierten Analysegeräten11,18 basieren, die mit Fluoreszenz-19, Kolorimetrie20 oder elektrochemischer21-Detektion für eine schnelle und einfache Interpretation gekoppelt sind der Ergebnisse. Zu den oft genannten Einschränkungen dieser Ansätze gehören ein geringes verarbeitetes Probenvolumen (z. B. mikrofluidische Geräte), eine relativ geringe Empfindlichkeit aufgrund fehlender Amplifikation (z. B. Lateral-Flow-Strips und Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken) und lange Inkubationszeiten (z. B. enzymatische Assays). . Andererseits bieten Nukleinsäureamplifikationstests (NAAT) wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) eine höhere Empfindlichkeit und schnellere Ergebnisse als Kulturmethoden und werden daher häufig bevorzugt22,23,24. Dennoch erfordern PCR-Ansätze eine Probenvorbereitung, hochentwickelte Instrumente und geschultes Personal, während isotherme Amplifikationstechniken wie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) einfacher zu implementieren sind, da keine Temperaturzyklen erforderlich sind25,26,27. Beispielsweise haben Lee et al. verwendeten Spritzenfilter und Magnetkügelchen zur DNA-Extraktion, gefolgt von LAMP in einem tragbaren Gerät27.

In dieser Arbeit berichten wir über die Entwicklung einer Vor-Ort-Testplattform für den Nachweis von E. coli in Wasser. Die Plattform kann (1) große Probenvolumina (1–10 ml) mithilfe einer ventilgesteuerten, papierbasierten Probenvorbereitungsmethode verarbeiten, (2) DNA mithilfe von LAMP amplifizieren und (3) Amplifikate anhand von Farbveränderungen erkennen. Wir verwendeten ein 3D-gedrucktes Gerät und kugelbasierte Ventile für die sequentielle Abgabe der Reagenzien, die für die Zelllyse, DNA-Anreicherung und -Reinigung benötigt wurden, und die resultierende DNA wurde auf einem Chromatographiepapier konzentriert. LAMP wurde dann durch eine batteriebetriebene, intelligente Kaffeetasse erreicht, die als Wasserbad fungiert und für eine konstante Temperatur sorgt. Für den kolorimetrischen Nachweis wurde der Farbstoff SYBR Green verwendet. Mit dieser Testplattform haben wir den Nachweis von E. coli in Umweltwasserproben in etwa 1 Stunde (ca. 30 Min. Probenvorbereitung und ca. 45 Min. LAMP) nachgewiesen.

Wie in Abb. 1 dargestellt, besteht das Gerät aus einer Puffereinheit, einer Mischeinheit, einer Detektionseinheit und einem Abfallbehälter. Die Detektionseinheit bestand aus einer Polycarbonat-Wellschicht, doppelseitigem Klebeband, zwei Schichten thermoplastischer Folien und einem Chromatographiepapier. Der Behälter wurde aus einer 3 mm dicken Polycarbonatplatte (McMaster-Carr, Elmhurst, IL) unter Verwendung einer CNC-Fräsmaschine (Sherline Products, Vista, Kalifornien) zu einem Quadrat von 2 cm × 2 cm geformt und mit einer Vertiefung aus 4 mm Durchmesser versehen. In der Mitte wurde ein Durchmesser von mm (oder 6 mm) erzeugt. Ein Stück Whatman™ 1-Chromatographiepapier (Fisher Scientific) und zwei 75 μm dicke Polyester-Thermalbindungslaminierfolien (Lamination Plus, Kaysville, UT, USA) wurden mit einem in Kreise mit 3,5 mm oder (5,5 mm) Durchmesser geschnitten Graphtec Craft Robo-S Schneideplotter (Graphtec Corporation, Yokohama, Japan). Das Papier wurde dann zwischen die beiden thermoplastischen Folien gelegt und durch einen Laminator, GBC® Catena 65 Roll Laminator (GBC, Lake Zurich, IL, USA), geführt, der auf eine Rollgeschwindigkeit von „1“ und eine Temperatur von 220 °F eingestellt war wie zuvor beschrieben28,29. Dieses laminierte Papierpad wurde dann mit doppelseitigem Klebeband (3 M 9087 weißes Klebeband, RS Hughes, Sunnyvale, CA) an der Polycarbonat-Wellschicht befestigt und bildete die Detektionseinheit.

Explosionszeichnung der Gerätekomponenten. Die Puffereinheit oben enthält vier Behälter und eine Öffnung. Diese 4 Reservoirs sind für den Lysepuffer, den Bindungspuffer und 2 Waschpuffer. Die Öffnung am Boden jeder Vertiefung wird durch eine Edelstahlkugel blockiert, um zu verhindern, dass die Reagenzien nach unten fließen, bis dies gewünscht ist. Die Mischeinheit in der Mitte ist trichterförmig, um das Mischen zu verbessern und dafür zu sorgen, dass die Reagenzien und die Probe durch das Papier in der Detektionseinheit gelangen, die durch den Vorsprung (➇) an der Unterseite der Mischeinheit eingeführt wird. Die Mischeinheit verfügt über einen Stift, der die Kugel nach oben drückt, das Ventil öffnet und es den Reagenzien ermöglicht, nach unten zu gelangen, wenn die Puffereinheit gedreht wird, um den Stift mit der Kugel auszurichten. Schließlich dient der Abfallbehälter im Boden zwei Zwecken: (1) dem Sammeln des Abfalls und (2) bei Bedarf der Beschleunigung des Filtervorgangs durch Anschließen eines Vakuums oder eines Saugmechanismus.

Zur Herstellung der Puffereinheit, der Mischeinheit und des Abfallbehälters wurde ein kommerzieller 3D-Drucker, Ultimaker 3 (Ultimaker, Geldermalsen, Niederlande), verwendet. Die Geräte wurden mit Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) bedruckt, wobei die Druckschichthöhe auf 0,1 mm und die Fülldichte auf 100 % eingestellt war. Die zur Ventilierung in jeder Vertiefung verwendeten Kugeln waren korrosionsbeständige Kugeln aus rostfreiem Stahl 316 mit einem Durchmesser von 4,0 mm (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). Das Ventilkonzept ist in Abb. 2 dargestellt. Dieser Ventilmechanismus ähnelt einem Kugelschreiber, bei dem Tinte auf das Papier abgegeben wird, wenn beim Schreiben auf die Metallkugel an der Spitze des Stifts gedrückt wird.

Ventilmechanismus auf Kugelbasis. (links) Das Ventil ist geschlossen, wenn die Kugel den Abfluss des Reagenzes blockiert. (rechts) Das Ventil wird geöffnet, nachdem die Puffereinheit gedreht und der Stift mit der Kugel ausgerichtet wurde, wodurch die Kugel angehoben wird und die Reagenzien in die Mischeinheit fließen können.

Die Puffereinheit hat eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 7,1 cm, einer Höhe von 1 cm, drei Reservoirs mit einem oberen Durchmesser von 2 cm und einem mit 2,4 cm, alle mit einer Tiefe von 1 cm und einem unteren Durchmesser von 0,38 cm. Die größte Vertiefung (in Abb. 1) soll das größere Volumen einer Probe und eines Reagenzes aufnehmen. Diese Reservoirs können Volumina von bis zu 1,28 bzw. 1,78 ml aufnehmen. Die Öffnung an der Oberseite wurde für zwei Zwecke konzipiert: (1) um zu visualisieren, wann die Reagenzien das Papier vollständig durchdrungen haben, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren, und (2) um bei Bedarf die Zugabe von Proben mit mehr als 1 ml (bis zu 10 ml) zu ermöglichen ). Die Mischeinheit hat eine Höhe von 4,5 cm, einen oberen Außendurchmesser von 6,5 cm, einen oberen Innendurchmesser von 5,5 cm, einen unteren Außendurchmesser von 8 cm und einen Innendurchmesser von 6 cm. Die Wandstärke beträgt oben 1 cm und unten 2 cm, wodurch ein Vakuum am Gerät erreicht wird, ohne dass Luft in die Wände des 3D-gedruckten Materials eindringt. Der Vorsprung an der Unterseite der Mischeinheit (Teil Nr. 8 in Abb. 1) sorgt dafür, dass sie genau in die Vertiefung der Detektionseinheit passt. Der Flüssigkeitsdurchgang von der Mischeinheit zur Detektionseinheit hat einen Durchmesser von 5 mm zur Integration mit den Detektionseinheiten mit 6 mm Durchmesser, die sich 3 cm von der Oberseite des Mischbehälters entfernt befinden. Der Abfallbehälter hat einen Außendurchmesser von 10 cm und eine Höhe von 3 cm. Diese Abmessungen und die der Mischeinheit könnten jedoch verringert werden, wenn kein Vakuum verwendet wird oder wenn ein Gerät mit einer anderen Herstellungstechnik hergestellt wird. Insgesamt beträgt die Gesamthöhe im zusammengebauten Zustand 7,5 cm.

Der Probenvorbereitungsprozess des Geräts besteht aus der sequentiellen Freisetzung der Pufferlösungen für die DNA-Lyse, -Bindung und -Waschung aus der Puffereinheit in die Mischeinheit durch Betätigung von Kugelventilen. Diese Lösungen werden dann zur DNA-Anreicherung und -Reinigung durch die Detektionseinheit auf das Chromatographiepapier geleitet. Zunächst werden alle Pufferlösungen in ihre jeweiligen Reservoirs in der Puffereinheit geladen, einschließlich 200 µL AL-Lysepuffer (QIAGEN), 200 µL Ethanol, 500 µL AW1 (QIAGEN) und 500 µL AW2 (QIAGEN). Zweitens wird 1 ml einer Wasserprobe in das erste Reservoir mit der Lyselösung gegeben, um die Probe 10 Minuten lang zu lysieren. Anschließend wird die Mischung durch Drehen der Puffereinheit und Betätigen des Ventils in die Mischeinheit abgegeben. Anschließend wurde die Puffereinheit sofort erneut gedreht, um den Bindungspuffer aus Behälter Nr. 2 abzugeben und mit der Probe/Lyse-Mischung zu vermischen. Nachdem diese Lösungen vollständig durch die Mischeinheit und dann in das Papierkissen in der Detektionseinheit gelangt sind, wird die Puffereinheit erneut gedreht, um die Waschpuffer AW1 aus Behälter Nr. 3 und AW2 aus Behälter Nr. 4 nacheinander abzugeben Reinigen Sie die gesammelte DNA auf dem Papier.

Nach der DNA-Reinigung wird die Detektionseinheit von der Mischeinheit getrennt und ist bereit für den nächsten Schritt: die DNA-Amplifikation. Nach dem Abnehmen wird die Unterseite der Detektionseinheit mit einem Stück PCR-Klebeband versiegelt und anschließend mit einer Einwegpipette der 50-µL-LAMP-Mix zugegeben. Ein weiteres Stück PCR-Band wird auf die Oberseite der Detektionseinheit geklebt, um die Detektionseinheit abzudichten und mögliches Verdunsten oder Auslaufen zu verhindern. Anschließend wird die Detektionseinheit 45 Minuten lang in einer Kaffeetasse bei 62,5 °C in Wasser getaucht. Nach der Amplifikation wird die Detektionseinheit aus dem Becher genommen und das Stück Klebeband oben entfernt, gefolgt von der Zugabe von 1 µL SYBR Green zur kolorimetrischen Detektion. Eine schematische Darstellung des Gesamtprozesses und der Schritte der Plattform ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Das Zusatzvideo S1 zeigt den gesamten Prozess des Geräts von der Vorbereitung des Geräts bis zur kolorimetrischen Erkennung von Amplifikaten.

Flüssigkeitskontrollventile werden eingesetzt, um die Probenvorbereitung durch sequentielle Freisetzung der Reagenzien aus der Puffereinheit in die Mischeinheit durchzuführen, ohne dass eine grundlegende Laborausrüstung erforderlich ist. Jedes Ventil besteht aus einer Edelstahlkugel, die am Boden einer Puffervertiefung platziert ist, um zu verhindern, dass das Reagenz nach unten fließt, bis es gewünscht wird. Die Kugel ragt 1,5 mm vom Boden der Puffereinheit hervor, so dass der Stift in der Mischeinheit die Kugeln anhebt und den Reagenzien ermöglicht, nach unten zu fließen, wenn der Stift mit den Kugeln ausgerichtet ist, wie in Abb. 2 dargestellt. Dieser Ventilmechanismus ist im Wesentlichen das Gleiche wie zuvor berichtet28,29, allerdings durch horizontales Gleiten in der vorherigen Arbeit und nicht durch Rotation in dieser Arbeit. Um ein Verrutschen der Kugel und ein Auslaufen während des Transports zu verhindern, wird zwischen der Kugel und dem Reservoir eine lösliche Verbindung auf Wachsbasis hergestellt. Zuerst wird ein Stück Wachs (Akrowax™ 130, Akron, OH, USA) in einem kleinen Becher heißgeschmolzen, anschließend wird eine Kugel in das geschmolzene Wachs getaucht. Die mit einer dünnen Wachsschicht versehene Kugel wird sofort in das Reservoir gelegt, sodass das Wachs aushärtet und eine lösbare Verbindung entsteht, die unerwünschte Bewegungen verhindert.

Jede 25-μL-LAMP-Mischung enthält 2,5 μL 10-fach isothermen Amplifikationspuffer, 8 U Bst 2.0 WarmStart® DNA-Polymerase, 2,5 μL 10-fach konzentrierte Primermischung und eine Endkonzentration von 1,4 mM dNTPs und 6 mM MgSO4. Das 25-μL-Volumen wurde mit nukleasefreiem Wasser (nicht mit Diethylpyrocarbonat oder DEPC behandelt) aufgefüllt. Mit Ausnahme des nukleasefreien Wassers und der dNTPs von ThermoFisher Scientific (MA, USA) wurden die anderen Reagenzien im LAMP-Mix von New England Biolabs (NEB) (Ipswich, MA, USA) bezogen. Die 10-fache Primermischung enthält 16 μM Forward Inner Primer (FIP) und Backward Inner Primer (BIP), 2 μM Forward Outer Primer (oft als F3 bezeichnet) und Backward Outer Primer (oft als B3 bezeichnet) sowie 8 μM Loop Primer Forward (LF). ) und Primer rückwärts schleifen (LB); Ihre Sequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Die Primer wurden von Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA) gekauft und ihre Sequenzen wurden anhand der Literatur ausgewählt30. Wenn eine 50-μl-LAMP-Mischung anstelle der 25-μl-Mischung verwendet wurde, wurden die Volumina aller Reagenzien verdoppelt, wobei die Endkonzentration gleich blieb. Um eine unspezifische Amplifikation und mögliche falsch positive Ergebnisse zu verhindern, wurden den LAMP-Reaktionen Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) und dUTP zugesetzt, um eine Verschleppungskontamination zu verhindern. UDG wird häufig verwendet, um Verschleppungskontaminationen zu verhindern, ohne die Empfindlichkeit bei LAMP- und anderen Nukleinsäureamplifikationstests zu beeinträchtigen31,32,33.

Um LAMP ohne Anschluss an eine Steckdose zu erreichen, haben wir, wie bereits berichtet, einen handelsüblichen, batteriebetriebenen Kaffeebecher (Ember™ Travel Mug, Ember Technologies, Inc., Westlake Village, CA) als Wasserbad gewählt28,29 . Bevor die Detektionseinheiten in den Ember™-Becher mit Wasser von 62,5 °C gestellt wurden, wurden sie mit zwei Stücken Klebeband (Fellows®) versiegelt, um den unteren und oberen Teil abzudecken und so ein Auslaufen und Verdunsten zu verhindern. Nach 45-minütiger Inkubation wurden die Detektionseinheiten zur kolorimetrischen Detektion herausgenommen, was durch Zugabe von 1,0 μl 10.000-fach konzentriertem SYBR green I in Dimethylsulfoxid (ThermoFisher Scientific) zu jeder Detektionseinheit erfolgte. Wir verwendeten SYBR-Grün, einen Fluoreszenzfarbstoff, für den kolorimetrischen Nachweis von Amplikons; Der Farbwechsel kann mit bloßem Auge sichtbar gemacht oder mit einer Smartphone-Kamera aufgezeichnet werden. Um die Visualisierung zu erleichtern, wurde eine ULAKO-Taschenlampe mit blauer LED (Leuchtdiode) (Amazon, WA, USA), die mit einer AA-Batterie betrieben wurde, verwendet, um die grüne Fluoreszenz zu beobachten, wenn E. coli vorhanden war. Bei Bedarf können die Ergebnisse auch durch Gelelektrophorese überprüft werden. Beachten Sie, dass LAMP eine Reihe von Amplifikaten unterschiedlicher Größe produziert; daher gibt es keine spezifische Gelbande wie bei PCR34. Wir wählen SYBR-Grün, da es die Amplikons direkt erkennt, während andere Farbstoffe wie Calcein35, Hydroxynaphtholblau36 (HNB) oder Phenolrot37 die Nebenprodukte der LAMP-Amplifikation erkennen. Andere Farbstoffe wie SYTO-9 sind mit bloßem Auge schwer zu erkennen, wenn sie in einer niedrigen Konzentration vorliegen, die die LAMP-Reaktion nicht hemmt, aber sie können für die Echtzeiterkennung mit einem Instrument verwendet werden38.

Um die für den LAMP-Assay erforderliche Inkubationszeit zu untersuchen, wurden Echtzeit-LAMP-Experimente durchgeführt, indem 0,5 µL des 10-fach konzentrierten SYBR green I (ThermoFisher Scientific) zum 25 µL LAMP-Reaktionsgemisch hinzugefügt wurden. Das Fluoreszenzsignal der LAMP-Reaktion wurde mit dem Echtzeit-PCR-System QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific) ausgelesen. Wir haben verschiedene Mengen an E. coli-DNA getestet, 8 × 104, 8 × 103, 8 × 102 und 8 × 101 Kopien, die jeweils in eine 25-μL-Reaktionslösung gegeben wurden. Wir haben 3 Replikate jeder Konzentration getestet, darunter 3 No-Template-Kontrollen (NTCs).

Um die Quantifizierungsgrenze (LoQ) des LAMP-Assays zum Nachweis von E. coli zu bestimmen, wurde DNA aus E. coli DH5-α-Zellen mit dem QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) extrahiert. Die Konzentration der gereinigten DNA wurde mit einem Ultraviolett-sichtbaren Spektrophotometer auf 160 ng/µL bestimmt. Es wurden die Kopien/µL der extrahierten DNA berechnet, die anhand des Molekulargewichts des E. coli-Genoms auf etwa 3 × 107 Kopien/µL bestimmt wurden. Reihenverdünnungen dieser Stammlösung wurden mit nukleasefreiem Wasser (Fisher Scientific) durchgeführt. 1 µL gereinigte DNA der verschiedenen Konzentrationen wurde zusammen mit einem NTC in 25 µL LAMP-Reaktionen gegeben.

Die Anzahl der Kopien wurde basierend auf der Anzahl der Basenpaare in der Sequenz berechnet, die aus der NCBI GenBank (CP026085.1) ermittelt wurde und 4.833.062 Basenpaare enthält. Dann verwenden Sie die Gl. (1) Unten39 haben wir die Anzahl der Kopien der gereinigten DNA berechnet.

Umweltwasserproben wurden im Nordosten Floridas am Pellicer Creek (Kartenposition: 29,66260 N 81,26837 W), an der Mündung des Pellicer Creek (29,66431 N 81,22892 W) und an den Whitney Lab Docks (29,669249 N 81,216506 W) gesammelt. Pellicer Creek ist mit Wohngebieten verbunden und sein Wasser fließt zu oder von (je nach Gezeiten) Whitney Lab Docks, die am Atlantischen Ozean liegen. Probe Nr. 1 wurde am 30. August 2019 in den Whitney Lab Docks entnommen, während Probe Nr. 2 am 6. September 2019 an der Mündung des Pellicer Creek entnommen wurde. Beachten Sie, dass Probe Nr. 1 entnommen wurde, bevor Hurrikan Dorian das Gebiet traf, während Probe Nr. 2 wurden nach dem Hurrikan eingesammelt. Beide wurden mit einem Whatman-Glasfaserfilter und einer peristaltischen Pumpe filtriert. Die Proben Nr. 3 und Nr. 4 (drei Wiederholungen für jede Probe) wurden am 26. Mai 2021 am Pellicer Creek bzw. am Whitney Lab Docks entnommen. Eine Zusammenfassung der Informationen zu den Umweltproben finden Sie in der Ergänzungstabelle S2. Die Proben Nr. 3 und Nr. 4 wurden ungefiltert und verblindet von dem Forscher erhalten, der die Experimente zur Validierung der Plattform durchführte. Einige der Proben Nr. 3 und Nr. 4 wurden mit einem Whatman-Glasfaserfilter (0,7 µm) und einer 50-ml-Spritze filtriert und die Testleistung zwischen gefilterten und ungefilterten Proben verglichen. Alle Wasserproben wurden mit dem Gerät in Abb. 1 verarbeitet.

Um die möglichen Auswirkungen des Salzes im Meerwasser auf die Probenvorbereitung und den LAMP-Assay zu untersuchen und die Fähigkeit zur Verarbeitung einer Vielzahl von Wasserproben zu demonstrieren, haben wir die Plattform anhand von Proben getestet, die durch Dotieren von E. coli DH5-α-Zellen in entionisiertes ( DI-Wasser, das 3,5 %, 2,0 %, 0,5 % und 0,0 % (Gewichtsprozent) Natriumchlorid (NaCl) enthält. Diese Konzentrationen wurden ausgewählt, um die Salzkonzentration im Wasser von Ozeanen (3,5 %) bis hin zu Süßwasser (~ 0 %) zu simulieren. Im Wasser an verschiedenen Stellen der Flussmündungen kann eine beliebige Konzentration zwischen ihnen gefunden werden. Für jede Salzkonzentration wurden fünf Wiederholungen getestet. Um diese Proben vorzubereiten, wurden E. coli DH5-α-Zellen in einem Suspensionsmedium in ein 2-ml-Röhrchen gegeben und zentrifugiert, um ein Zellpellet zu bilden. Nach dem Entfernen des überstehenden Mediums wurde das Zellpellet in 0,4 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und durch Pulsieren gemischt. Die Probe wurde dann in vier 2-ml-Röhrchen aufgeteilt. Jedes Röhrchen wurde erneut zentrifugiert und das entionisierte Wasser verworfen, gefolgt von der Zugabe von 1 ml Wasser mit einer Salzkonzentration.

Abbildung 1 zeigt den Aufbau des Geräts zur DNA-Extraktion, Anreicherung, Reinigung und zum Nachweis von E. coli in Umweltwasserproben. Das Gerät besteht aus einer Puffereinheit oben, einer Mischeinheit in der Mitte, einer an der Unterseite der Mischeinheit eingesetzten Detektionseinheit und einem Abfallbehälter. Die Puffereinheit enthält die zur Probenvorbereitung benötigten Reagenzien; Jede Lösung wird durch Drehen der Puffereinheit über der Mischeinheit abgegeben, um die Kugelventile zu betätigen. Diese Flüssigkeitskontrollventile verhindern, dass die Reagenzien nach unten sinken, bis die Kugeln durch den Stift in der Mischeinheit angehoben werden. Diese Reagenzien werden dann gemischt und durch die Detektionseinheit geleitet, um gereinigte DNA auf dem Chromatographiepapier zu sammeln, gefolgt von der DNA-Amplifikation über LAMP. Die Reagenzien können zur Lagerung und zum Transport in der Puffereinheit vorverpackt werden, während die Vertiefungen versiegelt sind, und die Kugelventile zeigten keine Undichtigkeiten, wenn Wachs zum Fixieren der Kugeln verwendet wurde, wie zuvor gezeigt28.

Unser Gerät integriert alle notwendigen Schritte für einen Nukleinsäuretest, einschließlich Lyse, DNA-Anreicherung und -Reinigung, Amplifikation und Nachweis. Dadurch macht unsere Plattform den Probentransport vom Probenahmeort zum Labor überflüssig. Außerdem ist die Testzeit viel kürzer als bei kulturbasierten Ansätzen. Im Vergleich zu herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden, die auf festen Extraktionssäulen basieren, werden durch die DNA-Anreicherung auf einem Papierblock Schritte wie der Transfer von DNA zwischen Röhrchen weiter reduziert, mögliche Kontaminations- und Abbauprobleme vermieden und Elutionsschritte zur Extraktion der DNA aus der festen Säule entfallen. Die DNA im Papierblock unseres Geräts kann direkt für LAMP verwendet werden, was erhebliche Vorteile gegenüber der Extraktionssäulenmethode bietet, da nicht die gesamte DNA von der Säule eluiert werden kann und es zu keiner Verdünnung kommt, wenn der Elutionsschritt entfällt. Nach einem Vergleich mit kommerziell erhältlichen FTA-Karten und Glasmikrofaserpapier wurde für die DNA-Anreicherung ein unbehandeltes Zellulose-Chromatographiepapier ausgewählt, das eine etwas bessere Nukleinsäureanreicherung aus Influenzaviren zeigte40.

Um die Papiergröße in der Erkennungseinheit zu optimieren, haben wir die folgende Analyse durchgeführt. Wir haben die Probenvorbereitungszeit mithilfe von Gl. berechnet. (2). Das Volumen der Probe beträgt 1 ml, während das Gesamtvolumen der Reagenzien der Lyse-/Bindungs-/Waschpuffer 1,4 ml beträgt. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt laut Hersteller des Chromatographiepapiers 4,33 mm/min. Es ist verständlich, dass die Probenvorbereitungszeit umso kürzer ist, je größer die Oberfläche des Papierkreises ist. Die berechnete Zeit als Funktion des Papierdurchmessers ist in der ergänzenden Abbildung S2a dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die theoretische Vorbereitungszeit von 44 auf 19 Minuten verkürzt, wenn der Papierdurchmesser von 4 auf 6 mm erhöht wird. Wir beobachten auch, dass die Probenvorbereitungszeit ab einer bestimmten Papiergröße (> 7 mm) nicht mehr signifikant verkürzt wird. Wenn gleichzeitig der Durchmesser des Papierkreises zunimmt, nimmt das Volumen der LAMP-Mischung, das zur Abdeckung der gesamten Fläche erforderlich ist, proportional zur Oberfläche (oder zum Quadrat des Durchmessers) zu. Da das Volumen der LAMP-Mischung 25 µL in einer 4-mm-Vertiefung beträgt, wie wir bereits berichtet haben28,29, kann das Volumen der LAMP-Mischung, das für andere Papierkreisgrößen erforderlich ist, mithilfe von Gleichung berechnet werden. (3). Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S2b dargestellt und zeigen, dass das Volumen und damit die Kosten des LAMP-Mix erheblich ansteigen. Aus diesem Grund haben wir für den experimentellen Vergleich eine Papiergröße von 6 mm Durchmesser und ein LAMP-Mischvolumen von 50 µL gewählt.

Wir haben die Wasserproben Nr. 1 und Nr. 2 (beide gefiltert, als die Proben bereitgestellt wurden) verwendet, um die Probenvorbereitungszeit zwischen den Papierpads mit 4 mm und 6 mm Durchmesser zu vergleichen. Wir haben einen großen Unterschied festgestellt, wie in der Ergänzungstabelle S3 zusammengefasst. Die Probenahme dauerte über 131 Minuten. Die Verarbeitung dauerte mit den Papieren mit 4 mm Durchmesser 23 Minuten. für Papiere mit 6 mm Durchmesser. Diese Ergebnisse bestätigten die deutlich bessere Leistung des größeren Papierformats in unserem Gerät. Ein Nachteil der Verwendung von Papier mit 6 mm Durchmesser ist die oben erwähnte Vergrößerung des LAMP-Mischvolumens sowie die daraus resultierenden Reagenzienkosten. Wir haben auch die Probenvorbereitungszeit von zwei weiteren Probentypen mit den Papieren mit 6 mm Durchmesser verglichen: ungefilterte Wasserproben und mit Salzen versetzte destillierte Wasserproben für die Salzgehaltsexperimente. Wir haben beobachtet, dass sich die Zeit um etwa 8 Minuten verkürzt hat. von den ungefilterten Proben (31 Min.) zu den gefilterten Proben (23 Min.) und wurde von den gefilterten Proben zu den versetzten Proben (19 Min.) jeweils um etwa 4 Minuten weiter reduziert. Die Ergebnisse sind auch in der Ergänzungstabelle S3 zusammengefasst.

Wir verwendeten ein Echtzeit-PCR-Gerät, um die für den LAMP-Assay erforderliche Mindestzeit zu ermitteln. Abbildung 3a zeigt die durchschnittlichen Fluoreszenzamplifikationskurven für 4 verschiedene DNA-Konzentrationen, wobei für jede Kurve 3 Replikate verwendet werden. Alle Proben überschritten die Schwellenlinie (definiert als das Zehnfache der Standardabweichung des Hintergrundrauschens über der Basislinie) innerhalb von 35 Minuten und erreichten innerhalb von 45 Minuten ein Plateau. Aus diesem Grund haben wir als LAMP-Reaktionszeit 45 Minuten gewählt. Alle Reaktionen in Abb. 3 wurden 60 Minuten lang inkubiert, und in allen NTC-Replikaten wurde keine unspezifische Amplifikation beobachtet. Da LAMP viele komplexe Schritte umfasst, korreliert das Fluoreszenzsignal nicht mit der Ausgangsbakterienmenge. Die Schwellenwertzeit kann jedoch verwendet werden, um mit der anfänglichen Bakterienmenge zu korrelieren, wie bei PCR41. Abbildung 3b zeigt die Kalibrierungskurve zwischen der Schwellenwertzeit (die vom Gerät bereitgestellt wurde) und der Bakterienmenge, was darauf hinweist, dass ein semiquantitativer E. coli-Nachweis möglich ist.

Echtzeit-LAMP-Amplifikation mit gereinigter E. coli DH5-alpha-DNA. (a) Fluoreszenzsignal von 8 × 104, 8 × 103, 8 × 102 und 8 × 101 Bakterienkopien pro Reaktion als Funktion der Zeit. NTC, No-Template-Steuerung. (b) Kalibrierungskurve, die die Schwellenzeit (Ct) als Funktion der Kopien in jeder Reaktion zeigt (im logarithmischen Maßstab). Die Ergebnisse wurden aus 3 Replikaten jeder DNA-Probenkonzentration generiert. Die Fehlerbalken geben eine Standardabweichung an.

Wir untersuchten die Quantifizierungsgrenze des LAMP-Assays unter Verwendung von 300, 30, 3 und 1 Kopien der E. coli DH5-α-DNA und beobachteten die positiven Signale in allen 5 Replikaten von 300, 30 und 3 Kopien, wie in Abb. 4. Bei 1-Kopien-Proben haben wir jedoch nur in 1 von 3 Replikaten positive Signale beobachtet, was darauf hindeutet, dass die LoQ unseres Tests zwischen 3 und 30 Kopien liegt, ähnlich der zuvor gemeldeten Nachweisgrenze von 10 Kopien pro Reaktion30. Die Ergebnisse wurden mittels Gelelektrophorese bestätigt. Die Ergebnisse für die sich wiederholenden Experimente, die nicht in Abb. 4 enthalten sind, sind in der ergänzenden Abb. S3 dargestellt.

(a) Bilder der Reaktionsröhrchen, aufgenommen unter Raumlicht nach 45-minütigem LAMP-Assay bei 62,5 °C. Die Menge an E. coli-DNA beträgt 300 Kopien für die Positivkontrolle (P), die anderen sind auf den Röhrchen markiert: 30, 3 Kopien und 1 Kopie sowie eine Negativkontrolle (N). (b) Gleiche Röhren wie (a) unter einer blauen LED-Taschenlampe. (c) Gelelektrophorese dieser Proben in (a).

Wir haben zunächst die gefilterten Wasserproben Nr. 1 und Nr. 2 getestet, deren Gesamtkeimgehalt mit 517,2 KBE/100 ml und 270 KBE/100 ml mit dem IDEXX Colilert-System gemessen wurde. Beachten Sie, dass es sich bei Gesamtkolibakterien um eine Ansammlung verschiedener Arten von Bakterien handelt, darunter E. coli und viele andere. Nachdem wir jede Probe fünfmal getestet hatten, erhielten wir bei Probe Nr. 1 bei allen fünf Tests und bei Probe Nr. 2 bei vier von fünf Tests positive Ergebnisse. Ergänzende Abbildung S4 zeigt die Ergebnisse von 3 Wiederholungen für jede Probe.

Da die Menge an E. coli in diesen beiden Proben (Nr. 1 und Nr. 2) nicht verfügbar ist (damals wurde nur die Gesamtmenge an coliformen Bakterien gemessen), haben wir weitere Proben gesammelt: drei Probenreplikate vom Pellicer Creek (Probe Nr. 3) und drei Proben aus den Whitney Lab Docks (Probe Nr. 4). Nach der Messung der gesamten Kolibakterien und E. coli mit dem IDEXX Colilert-System wurden diese Replikate als Blindproben an die Forscher weitergegeben, die die folgenden Experimente mit dem in dieser Arbeit beschriebenen Gerät durchführten. Zuerst wurde jedes Probenreplikat zweimal getestet, und wir erhielten positive Ergebnisse aus allen sechs Tests für drei Replikate der Probe Nr. 4, aber nur zwei von sechs Tests für drei Replikate der Probe Nr. 3 und die Hälfte für die Replikate Nr. 1 und Nr. 2 und 0/2 für Replikat Nr. 3. Um die Ergebnisse zu bestätigen, testeten wir Probe Nr. 3 noch einmal und erhielten positive Ergebnisse für Replikate Nr. 1 und Nr. 2 und negative Ergebnisse für Replikat Nr. 3.

Diese Testergebnisse wurden denjenigen zur Verfügung gestellt, die Blindproben zur Verfügung gestellt hatten, und dann mit der Gesamtzahl an coliformen und E. coli-Bakterien verglichen, die mit dem IDEXX Colilert-System gemessen wurden. Zwei Datensätze korrelierten nicht genau miteinander, wie in Tabelle 1 dargestellt; Probe Nr. 3 hatte eine höhere E. coli-Konzentration als Probe Nr. 4, basierend auf dem IDEXX Colilert-System, während unser Gerät Probe Nr. 4 erfolgreicher erkannte als Probe Nr. 3. Während dieser Experimente wurde festgestellt, dass alle Replikate der Probe Nr. 3, insbesondere Replik Nr. 3, zahlreiche dunkle Partikel auf dem Papier der Detektionseinheiten hinterließen. Daher vermuteten wir, dass einige Verunreinigungen in Probe Nr. 3 die LAMP-Reaktionen gehemmt haben könnten. Zur Überprüfung haben wir die Proben Nr. 3 und Nr. 4 mit 0,7 µm Whatman-Glasfaserfiltern gefiltert, um die Partikelmaterialien zu entfernen, genau wie die Proben Nr. 1 und Nr. 2, die verarbeitet (dh zuvor gefiltert) wurden. Anschließend haben wir die gefilterten Proben zusammen mit den ungefilterten zum Vergleich getestet. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst und einige Bilder von Detektionseinheiten sind in Abb. 5 dargestellt.

Bilder von Detektionseinheiten für Probe Nr. 3 (a, b), entnommen in Pellicer Creek (P1, P2, P3 für drei Probenreplikate) und Probe Nr. 4 (c und d), entnommen in Whitney Lab Docks (W1, W2, W3) und Vergleich zwischen ungefilterten (obere Reihe) und gefilterten (mit f gekennzeichnet, untere Reihe) Proben, zusammen mit einer Positivkontrolle (links, in einem Röhrchen) und einer Kontrolle ohne Vorlage (rechts). Die Bilder in (a) und (c) wurden bei Raumlicht aufgenommen, während die Bilder in (b) und (d) unter einer blauen LED-Taschenlampe mit gelbem Kunststofffilter aufgenommen wurden.

Bei Probe Nr. 3 hatten wir eine Erfolgsquote von 100 % bei gefilterten Proben gegenüber einer Erfolgsquote von 50 % bei ungefilterten Proben. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die aus Probe Nr. 3 herausgefilterten Partikel die LAMP-Reaktionen hemmten. Bei Probe Nr. 4 ist die Erfolgsquote zwischen gefilterten und ungefilterten Proben ähnlich. Der mögliche Unterschied zwischen Probe Nr. 3 und Probe Nr. 4 besteht darin, dass Probe Nr. 3 am Pellicer Creek entnommen wurde, der mit Wohngebieten in Verbindung steht, während Probe Nr. 4 am Whitney Lab Docks am Atlantik entnommen wurde. Daher sollte für unser Gerätetestprotokoll wie bei den Proben Nr. 1 und Nr. 2 eine Filtration während der Probenahme eingesetzt werden, um dieses Problem auszuschließen. Es sollte auch beachtet werden, dass die Filtration keinen Einfluss auf die Erkennung hatte, wie Probe Nr. 4 zeigt, sowohl gefiltert als auch ungefiltert, mit einer ähnlichen Testerfolgsquote.

Um die Bedenken hinsichtlich möglicher Auswirkungen von Meerwasser auf den LAMP-Assay auszuräumen, führten wir Experimente mit Wasserproben durch, die mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen und der gleichen Menge an E. coli-Zellen versetzt wurden. Die Salzkonzentration lag zwischen 0 und 3,5 %, was Süßwasser und Meerwasser entspricht. Für jede Salzkonzentration führten wir fünf Wiederholungsexperimente durch. Für alle Salzkonzentrationen erzielten wir in entweder 4 oder 5 von 5 Tests positive Ergebnisse, wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Ergänzende Abbildung S5 zeigt die Bilder eines repräsentativen Testergebnisses. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Salzkonzentration auf oder unter dem Meeresspiegel weder einen signifikanten Einfluss auf die Probenvorbereitung noch auf die LAMP-Reaktionen hat. Beachten Sie, dass drei negative Ergebnisse in Tabelle 2 in den ersten beiden Experimenten erzielt wurden, als das Mischen vor der Aufteilung und Zugabe von E. coli-Zellen in Salzwasser nicht gründlich genug war. Nachdem das Problem behoben wurde, wurden alle Replikate erfolgreich erkannt.

Unsere Plattform mit Probenvorbereitung und LAMP ist empfindlich, wie der konsistente Nachweis von E. coli in Probe Nr. 4 (Replikat Nr. 3) zeigt, die 20 KBE/100 ml enthält, gemessen mit dem IDEXX Colilert-System. Dies deutet darauf hin, dass die Quantifizierungsgrenze (LoQ) unserer Plattform mindestens 0,2 KBE/ml beträgt, da wir 1-ml-Proben verwendet haben. Daher ist die LoQ unserer Plattform mindestens fünfmal niedriger als der von der EPA empfohlene Schwellenwert, der bei 100 KBE/100 ml7 liegt. Beachten Sie, dass die LoQ unseres LAMP-Assays selbst 3 Kopien betrug, wobei mit E. coli versetzte Wasserproben verwendet wurden, wie in Abb. 4 dargestellt.

Wir haben eine Vor-Ort-Testplattform für den Nachweis von E. coli in Umweltwasserproben entwickelt. Im Vergleich zu den meisten Geräten in der Literatur ist ein einzigartiges Merkmal unserer Plattform die Probenvorbereitung, die aus drei einfachen Schritten besteht: (1) Drehen der Puffereinheit, (2) Warten darauf, dass sich die Reagenzien vermischen und durch das Papierpad laufen, und (3) Entfernen der papierbasierten Detektionseinheit für den anschließenden Amplifikationsschritt. Die Amplifikation der angereicherten DNA wird durch Eintauchen der Detektionseinheit in eine batteriebetriebene Kaffeetasse erreicht, die auf einer konstanten Temperatur gehalten wird. Die Testergebnisse werden durch Farbveränderungen angezeigt, die mit bloßem Auge beobachtet oder mit einer Smartphone-Kamera aufgezeichnet werden können. Unsere Plattform ist benutzerfreundlich, tragbar für Tests vor Ort und weist eine niedrige Nachweisgrenze auf. Darüber hinaus kann diese Plattform leicht angepasst werden, um andere Krankheitserreger zu erkennen, indem einfach die Primersequenzen im LAMP-Assay geändert werden.

Die Plattform in dieser Arbeit folgt ähnlichen Ventilkonzepten wie im zuvor entwickelten VLEAD28 oder 2-Plex-VLEAD29, jedoch mit erheblichen Modifikationen für die aktuelle Anwendung, wie in Tabelle 3 zusammengefasst. Zu den Hauptunterschieden gehört (1) der Betriebsmechanismus, der vom Schiebemechanismus geändert wurde Rotation, (2) das Volumen und die Art der verarbeiteten Probe, (3) die Zielpathogene und (4) die Kits und Volumina der Reagenzien, die für den Probenvorbereitungsprozess aufgrund unterschiedlicher Pathogene/Proben verwendet werden. Während VLEAD auf RNA-Viren abzielt und deren RNA einfängt, zielt das Gerät in dieser Arbeit auf DNA-Bakterien ab und fängt deren DNA ein. Aufgrund der Beschaffenheit der Proben erfordert das Gerät in dieser Arbeit ein viel größeres Probenvolumen, da die in Freizeitgewässern vorhandenen E. coli viel weniger konzentriert sind als Viren in menschlichen Proben. Dies ist auch einer der Gründe, warum wir diesem Gerät ein optionales Vakuum hinzugefügt haben, um eine schnellere Zeit bis zum Ergebnis zu ermöglichen, wenn zum Zeitpunkt des Tests ein Saugmechanismus (z. B. Spritzen) verfügbar ist. Es ist absehbar, diese Plattform für abwasserbasierte Studien anzupassen, beispielsweise zur Schätzung der Prävalenz und Übertragung des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in einer Gemeinde42.

Unsere tragbare Testplattform vor Ort ist in der Lage, (1) E. coli unterhalb des Schwellenwerts von 100 KBE/100 ml mit NAAT nachzuweisen, (2) alle notwendigen Schritte einschließlich Probenvorbereitung, DNA-Amplifikation und Nachweis in eine zu integrieren auf einer einzigen Plattform, ohne dass sperrige oder hochentwickelte Laborgeräte erforderlich sind, und (3) erhalten Sie die Ergebnisse in etwa einer Stunde. Die Reagenzien unserer Plattform können zur Lagerung und zum Transport für Tests vor Ort in der Puffereinheit vorverpackt werden, und die kugelbasierten Ventile zeigen seit mehreren Wochen keine Undichtigkeiten, wenn Wachs verwendet wird, um die Kugel am jeweiligen Reservoir zu befestigen. Die LAMP-Mischung kann auch in Einwegpipetten vorgeladen und mit Eisbeuteln gelagert werden. Eine Alternative zur Kühllagerung ist die Verwendung lyophilisierter RT-LAMP-Reagenzien, die bei Raumtemperatur gelagert werden können, wie an anderer Stelle berichtet43,44. Daher kann unsere Plattform vor Ort eingesetzt werden, um die Wasserqualität vor Ort zu überwachen.

Im Vergleich zu anderen tragbaren Plattformen für den Nachweis von E. coli in Wasserproben ist unsere Plattform eine der besten in Bezug auf Zeit bis zum Ergebnis, LoQ und Einfachheit, drei wichtige Parameter für Vor-Ort-Testplattformen. Der Vergleich dieser Arbeit mit anderen Plattformen zum Nachweis von E. coli in Wasser ist in Tabelle 4 dargestellt.

Einer der Hauptgründe für die niedrige LoQ dieser Plattform ist die Verwendung eines großen Wasserprobenvolumens (1 ml). Dieses Probenvolumen schneidet im Vergleich zu anderen Plattformen gut ab, insbesondere zu solchen, die auf Mikrofluidik basieren und nur wenige Mikroliter verarbeiten können45,46. Selbst wenn ein Gerät eine einzelne Zelle erkennen kann, reicht es dennoch nicht aus, niedrigere Konzentrationen als 100 KBE/100 ml zu erkennen (da sich in 1 µL Wasser überhaupt keine Zelle befindet, es sei denn, es wird zuerst ein Konzentrationsverfahren durchgeführt). Darüber hinaus bietet unsere Plattform eine höhere Empfindlichkeit als papierbasierte Immunoassays, die nicht ausreichen, um Konzentrationen unter 100 KBE/100 ml, dem von der US-Umweltschutzbehörde EPA empfohlenen Grenzwert, nachzuweisen. Die Nachweisgrenze papierbasierter Immunoassays liegt meist über 50 KBE/ml47,48.

Andere Ansätze, beispielsweise solche, die auf enzymatischen Substraten basieren, bieten eine hohe Empfindlichkeit und sind in der Lage, ein großes Probenvolumen zu verarbeiten. Allerdings haben sie lange Durchlaufzeiten, zwischen 4 und 12 Stunden Inkubation, abhängig von der Konzentration der Proben10,11,12. Nukleinsäureamplifikationstests bieten sowohl eine schnelle Analyse als auch eine hohe Empfindlichkeit. Lin et al. entwickelte eine asymmetrische Membran zur Verarbeitung von bis zu 10 ml Wasserproben und kombinierte sie mit digitalem LAMP in den Mikroporen der Membran, mit der E. coli bereits bei 0,3 Zellen/ml innerhalb von 1 Stunde und 25 Minuten nachgewiesen werden konnte. Dennoch ist für die Amplifikation und Detektion eine Laborausrüstung erforderlich, darunter ein Fluoreszenzmikroskop25.

Die während der aktuellen Studie verwendeten Daten werden auf begründete Anfrage vom entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der University of Florida durch die Moonshot Initiative und teilweise von den US National Institutes of Health (R01AI155735) unterstützt. Wir danken David Kaplan, Thomas Bianchi, Peter Ifju und dem Rest der iCoast-Gruppe für ihre Zusammenarbeit und Hilfe.

Interdisziplinäre Mikrosystemgruppe, Abteilung für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik, University of Florida, PO Box 116250, Gainesville, FL, 32611, USA

Charles Apples, Mortise Alipanah, George Adedokun und Z. Hugh Fan

Department of Environmental Engineering Sciences, University of Florida, PO Box 116580, Gainesville, FL, 32611, USA

Elise Morrison

Abteilung für Molekulargenetik und Mikrobiologie, University of Florida, PO Box 100266, Gainesville, FL, 32610, USA

Young S. Kim & Shouguang Jin

Whitney Laboratory of Marine Bioscience, University of Florida, PO Box 116580, St. Augustine, FL, 32080, USA

Todd Z. Osborne

Abteilung für Boden-, Wasser- und Ökosystemwissenschaften, University of Florida, Postfach 110290, Gainesville, FL, 32611, USA

Todd Z. Osborne

J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, PO Box 116131, Gainesville, FL, 32611, USA

Z. Hugh Fan

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CM führte die Recherche durch, entwickelte die Methoden, kuratierte die Daten, erstellte die Zahlen und verfasste das Papier. MA und GA halfen bei der Durchführung der Forschung. YSK und SJ bereiteten Bakterienproben vor und maßen die DNA-Konzentration. EM stellte die Proben zur Verfügung, entwickelte die Methoden und stellte Ressourcen bereit. TZO akquirierte Fördermittel, stellte die Proben zur Verfügung, stellte Ressourcen zur Verfügung und überwachte die Arbeit. ZHF entwickelte das Konzept, akquirierte Fördermittel, entwickelte die Methoden, stellte Ressourcen bereit, überwachte die Arbeit und verfasste das Papier. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und zur Veröffentlichung freigegeben.

Korrespondenz mit Elise Morrison, Todd Z. Osborne oder Z. Hugh Fan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Zusatzvideo 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Manzanas, C., Morrison, E., Kim, YS et al. Molekulare Testgeräte zum Vor-Ort-Nachweis von E. coli in Wasserproben. Sci Rep 13, 4245 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 08. März 2023

Veröffentlicht: 14. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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