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Oct 25, 2023

Vergleichende Anfälligkeit für SARS

Das ISME Journal Band 17,

The ISME Journal Band 17, Seiten 549–560 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Erforschung wilder Reservoire pathogener Viren ist für deren langfristige Kontrolle und die Vorhersage zukünftiger Pandemieszenarien von entscheidender Bedeutung. Hier wurde zunächst eine vergleichende In-vitro-Infektionsanalyse an 83 Zellkulturen von 55 Säugetierarten unter Verwendung pseudotypisierter Viren durchgeführt, die S-Proteine ​​von SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV tragen. Es wurde festgestellt, dass Zellkulturen von Thomas-Hufeisennasen, Königshufeisennasen, Grünen Meerkatzen und Frettchen sehr anfällig für die pseudotypisierten Viren SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV sind. Darüber hinaus können fünf Varianten (del69-70, D80Y, S98F, T572I und Q675H) neben der Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne den Wirtstropismus von SARS-CoV-2 signifikant verändern. Eine Untersuchung der phylogenetischen Signale der Transduktionsraten ergab, dass eng verwandte Taxa im Allgemeinen eine ähnliche Anfälligkeit für MERS-CoV aufweisen, nicht jedoch für pseudotypisierte SARS-CoV- und SARS-CoV-2-Viren. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass die Expression von 95 Genen, z. B. PZDK1 und APOBEC3, häufig mit den Transduktionsraten pseudotypisierter SARS-CoV-, MERS-CoV- und SARS-CoV-2-Viren assoziiert ist. Diese Studie liefert eine grundlegende Dokumentation der Anfälligkeit, Varianten und Moleküle, die der artübergreifenden Übertragung dieser Coronaviren zugrunde liegen.

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) stellt eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und die Weltwirtschaft dar, mit mehr als 500 Millionen Infektionsfällen beim Menschen und über 6,6 Millionen Todesfällen weltweit (Stand Januar 2023). SARS-CoV- Es wurde vermutet, dass Art. 2 von Fledermäusen stammt und dann über einen tierischen Zwischenwirt auf die menschliche Population überspringt [1,2,3]. Obwohl SARS-CoV-2-ähnliche Viren wie BANAL-20-52 aus der Malaiischen Hufeisennase (Rhinolophus malayanus), RaTG13 aus der Zwischenhufeisennase (Rhinolophus affinis) und Pangolin-CoV in Malaiischen Schuppentieren (Manis) vorhanden sind avania) [4,5,6] identifiziert wurden, ist der genaue tierische Ursprung von SARS-CoV-2 derzeit noch unklar. Zwei weitere Coronaviren, die vor COVID-19 Epidemien verursachten, sind das schwere Coronavirus mit akutem respiratorischem Syndrom (SARS-CoV), das sich möglicherweise über infizierte Palmzibetkatzen von der Hufeisennase auf den Menschen ausbreitete, und das Coronavirus mit respiratorischem Syndrom im Nahen Osten (MERS-CoV), das sich über die Epidemie ausbreitete möglicherweise eine Übertragung von Fledermäusen auf den Menschen über infizierte Dromedare [7,8,9]. Obwohl die derzeitige Bedrohung sowohl durch SARS-CoV als auch durch MERS-CoV minimal ist, müssen wir wachsam sein, was die potenziellen Risiken eines Rückflusses aus ihren natürlichen Reservoiren auf den Menschen anbelangt [10, 11].

SARS-CoV-2 ist in der Lage, ein breites Spektrum an Wirten zu infizieren, darunter Hunde, Nerze, Frettchen, Otter, Hamster, Wühlmäuse, Hirsche, Hirschmäuse, Fledermäuse, kleine und große Katzen sowie mehrere nichtmenschliche Primaten [12,13,–14 ]. Es bleibt jedoch eine Herausforderung, die Anfälligkeit dieser Arten zu vergleichen, da keine standardisierten Messungen zwischen den Arten durchgeführt wurden. In diesem Zusammenhang haben mehrere Studien die SARS-CoV-2-Infektionswahrscheinlichkeit durch die Analyse von Orthologen des Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) vorhergesagt. Beispielsweise haben Damas et al. nutzten die ACE2-Sequenzen von 410 Wirbeltierarten und fanden heraus, dass bestimmte gefährdete Taxa (z. B. Rotschenkelaffe, Nasenaffen, Rhesusaffen und antarktische Zwergwale) dem höchsten Risiko für eine SARS-CoV-2-Infektion ausgesetzt waren [15]. Gleichzeitig wurden Kristallstrukturauflösung, Oberflächenplasmonresonanzanalysen und molekulardynamische Simulationen verwendet, um die Bindungsaffinität verschiedener ACE2-Orthologe an Spike-Proteine ​​zu bewerten [15,16,–17]. Diese Studien liefern zwar wertvolle Informationen über den wahrscheinlichen Wirtsbereich von SARS-CoV-2, ihre Vorhersagen erfordern jedoch eine experimentelle Validierung. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen anderer Wirtsfaktoren als ACE2, die mit der Virusinvasion einhergehen, in diesen Vorhersagen unterschätzt [15, 18, 19].

Tierinfektionsexperimente bieten die beste Möglichkeit, die Anfälligkeit, Pathogenität und Übertragbarkeit von Krankheitserregern über verschiedene Taxa hinweg zu verstehen [20,21,22,–23]. Es ist jedoch unpraktisch, In-vivo-Inokulationsstudien bei einer Vielzahl von Arten, insbesondere bei Wildtieren, durchzuführen. Alternativ könnte ein In-vitro-Infektionstest verschiedener Zelllinien wichtige Einblicke in die Infektiosität von SARS-CoV-2 liefern [24, 25]. Chu et al. untersuchten die Replikationskinetik und die zytopathischen Wirkungen von 25 Zelllinien verschiedener Spezies. Sie zeigten, dass SARS-CoV-2 sich in nichtmenschlichen Primaten-, Katzen-, Kaninchen- und Schweinezellen replizieren kann [24]. In einer anderen Studie wurden Atemwegsepithelzellen von 12 Tierarten gesammelt und es wurde festgestellt, dass sich SARS-CoV-2 in Affen- und Katzenkulturmodellen effizient repliziert [25]. Abgesehen von der Nachfrage nach zellulären Tests zur Beurteilung des potenziellen Wirtsspektrums muss auch dringend untersucht werden, wie Mutationen sowohl die Infektiosität als auch die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2 auf verschiedene Arten beeinflussen können. Die kontinuierliche adaptive Entwicklung von SARS-CoV-2 hat zur raschen Entstehung neuer Mutationen geführt; Es bleibt jedoch unbekannt, wie viele dieser Mutationen die Anfälligkeit von Tieren für SARS-CoV-2 erhöht haben.

Hier haben wir zunächst das potenzielle Wirtsspektrum von SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 anhand pseudotypisierter Viren und Zellkulturen von 55 Säugetierarten untersucht. Die Fähigkeit von Ortsmutationen in S-Proteinen, das Wirtsspektrum von SARS-CoV-2 zu beeinflussen, wurde mithilfe ortsgerichteter Mutagenese bestimmt. Anschließend verwendeten wir einen vergleichenden Transkriptomik-Ansatz, um Genexpressionen zu identifizieren, die mit der Anfälligkeit der Arten gegenüber diesen Viren verbunden sind. Diese Studie liefert neue Informationen über den plausiblen Wirtstropismus von SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2. Darüber hinaus haben wir die Expression von Wirtsfaktoren aufgedeckt, die wahrscheinlich die artübergreifende Übertragung von SARS-CoV-2 beeinflussen und das zukünftige Übergreifen dieser Coronaviren vom Menschen auf andere Arten verhindern.

Um die Reproduzierbarkeit dieser Studie zu verbessern, haben wir, wann immer möglich, gesunde junge erwachsene Männer jeder Art beprobt, um die Auswirkungen von Geschlecht, Alter, Immunität und verwandten Faktoren zu reduzieren. Um Zellen mit der höchsten Anfälligkeit zu rekapitulieren, isolierten wir die in dieser Studie verwendeten primären Zellkulturen (Tabelle S1) aus mehreren Geweben (d. h. Niere, Lunge, Gehirn, Milz und Herz) von Haustieren, Nutztieren und Wildtieren auf der Grundlage früherer Protokolle beschrieben [26]. Die Tiere wurden mit CO2 oder Pentobarbital-Kalzium (200 mg/kg) eingeschläfert. Die Kadaver wurden zerlegt und anschließend unter aseptischen Bedingungen Nieren, Lungen, Herzen, Milzen oder Gehirne entnommen. Um ein Austrocknen zu vermeiden, wurden alle Gewebe bis zur Zellextraktion in steriles PBS, ergänzt mit einer 2% igen Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco, USA), gelegt. Jedes Gewebe wurde in eine 35-mm-Schale überführt und mit einer Präparierschere in winzige Stücke zerkleinert. Gewebefragmente wurden weiter in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt, gefolgt von einem Enzymverdau mit 0,25 % EDTA-Trypsin (Gibco, USA) bei 37 °C für 30 Minuten. Während des Aufschlusses wurde die Mischung alle 10 Minuten kräftig geschüttelt. Der Trypsinverdau wurde durch die Zugabe von FBS in das konische Röhrchen gestoppt. Die Gewebefragmente enthaltende Mischung wurde 3 Minuten lang mit einer 5-ml-Pipette auf- und abpipettiert, um die Klumpen aufzubrechen. Die resultierende Lösung wurde 5 Minuten lang bei 4 °C und 250 g zentrifugiert. Anschließend wurden Pelletzellen gesammelt, resuspendiert, gezählt und in 100-mm-Petrischalen ausgesät. Alle Gerichte wurden bei 37 °C und 5 % CO2 aufgestellt. Die Zellen wurden täglich auf Zellwachstum und Kontamination überprüft. Sobald die Zellen die Konfluenz erreichten, wurden regelmäßige Zellpassagen durchgeführt. Alle Primärzellen wurden isoliert und in DMEM-F12 mit 10 % FBS, einer 1 %igen Penicillin-Streptomycin-Lösung und 20 mM HEPES kultiviert. Alle Experimente wurden in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt und von der Tierethikkommission des Instituts für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt (Genehmigungsnummer: IOZ-IACUC-2021-163).

Zelllinien einschließlich Huh-7 (Homo sapiens, Leber), A549 (Homo sapiens, Lunge), SW480 (Homo sapiens, Dickdarm), HEK-293T (Homo sapiens, embryonale Niere), Vero-E6 (Cercopithecus aethiops, Niere), Marc-145 (Cercopithecus aethiops, Niere), OK (Monodelphis Domestica, Niere), BHK-21 (Mesocricetus auratus, Niere), SP2/0 (Mus musculus, Myelomzellen), NIH3T3 (Mus musculus, Embryo), MDBK (Bos Taurus, Niere), PK-15-Zellen (Sus scrofa, Niere), MDCK-Zellen (Canis Familiaris, Niere), F81-Zellen (Felis Catus, Niere) und Mv.1.lu-Zellen (Neovison Vison, Lunge) wurden in DMEM kultiviert. HT-29-Zelllinien (Homo sapiens, Colon) wurden in RPMI-1640 (Gibco, USA) kultiviert. NEF-Zelllinien (Nackte Maulwurfsratte, Embryo) wurden in DMEM-F12 kultiviert. Die immortalisierten Fledermauszelllinien PaKi (Pteropus alecto, Niere), PaLu (Pteropus alecto, Lunge) und PaBr (Pteropus alecto, Gehirn) wurden freundlicherweise von Dr. Linfa Wang (Duke-NUS Medical School) zur Verfügung gestellt und in DMEM-F12 kultiviert . Alle Zelllinien wurden bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 unter Verwendung spezifischer Kulturmedien inkubiert, die mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco, USA), einer 1 %igen Penicillin-Streptomycin-Lösung und 20 mM Hydroxyethylpiperazinethan ergänzt waren Sulfonsäure (HEPES, Gibco, USA).

pVSV-eGFP-dG (Addgen #31842), pCAG-VSVN (Addgen #64087), pCAG-VSVP (Addgen #64088), pCAG-VSVL (Addgen #64085), pCAG-VSVG (Addgen #64084) und pCAG- T7pol-Plasmide (Addgene #59926) wurden vom Addgen erworben. Menschliche Codon-optimierte S-Gene von SARS-CoV (SARS-Coronavirus Tor2, GenBank-Zugangsnr. NC_004718.3), SARS-CoV-2 (SARS-Coronavirus 2 Wuhan-Hu-1, GenBank-Zugangsnr. NC_045512.2) und MERS -CoV (MERS-Coronavirus HCoV-EMC, GenBank-Zugangsnummer NC_019843.3) wurden synthetisiert und zur pseudotypisierten Viruserzeugung in einen pcDNA3.1-Vektor kloniert. Die konstruierten Plasmide wurden pcDNA3.1-SARS-S, pcDNA3.1-SARS2-S bzw. pcDNA3.1-MERS-S genannt. Die Expression von S-Proteinen in HEK-293T-Zellen wurde mittels Western Blot verifiziert. Die ortsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung von pcDNA3.1-SARS2-S als Matrize durchgeführt. Vorwärtsprimer wurden mit einer Tm von ~75 °C entworfen und die Mutationen waren in der Mitte zentriert, während korrespondierende Rückwärtskomplementärsequenzen als Rückwärtsprimer ausgewählt wurden. Ein Volumen von 20 μl PCR-Mix wurde vorbereitet, das 10 μl 2× Phanta Max Master Mix (Vazyme, VR China), 10 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 10 ng Template-Plasmid enthielt. Nach 20 Zyklen ortsgerichteter Mutagenese-PCR wurde das Matrizenplasmid mit DpnI-Restriktionsendonuklease (NEB, USA) verdaut. Anschließend wurde das PCR-Produkt in kompetente E. coli DH5a-Zellen (Transgen, VR China) transformiert. Einzelne Klone wurden ausgewählt und sequenziert. Alle Plasmide wurden mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen, USA) extrahiert. Um die Einführung einer Kontamination in der Zellkultur während der Erzeugung pseudotypisierter Viren zu vermeiden, wurden extrahierte Plasmide 30 Minuten lang in einem 65 °C warmen Wasserbad inaktiviert. Die Konzentrationen der Plasmide wurden mit Nanodrop2000 (Thermo Scientific, USA) quantifiziert.

Zuerst haben wir das VSVΔG*-G-Virus auf der Grundlage von Methoden gerettet, die in einer früheren Veröffentlichung entwickelt wurden [27]. Im Detail wurden HEK-293T-Zellen mit 80 % Konfluenz mit den Plasmiden pVSV-eGFP-dG, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL, pCAG-VSVG und pCAG-T7pol im Verhältnis 10:3 co-transfiziert , 5, 1, 3 bzw. 5 μg unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Litauen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die überstehende Flüssigkeit wurde 48 Stunden nach der Transfektion geerntet und die Hälfte der Flüssigkeit wurde dazu verwendet, eine zweite Platte mit HEK-293T-Zellen zu infizieren, die mit dem Plasmid pCAG-VSVG transfiziert waren. Die HEK-293T-Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie auf EGFP-Expression untersucht. Die Titration des VSVΔG*-G-Virus wurde durch die Infektion von HEK-293T-Zellen quantifiziert, gefolgt von einer Durchflusszytometrieanalyse für ein EGFP-positives Signal.

Zweitens konstruierten wir pseudotypisierte Viren mit eingebauten S-Proteinen von SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 unter Verwendung eines Protokolls, über das in früheren Untersuchungen berichtet wurde [28]. HEK-293T-Zellen mit 70–90 % Konfluenz wurden mit 15 μg Plasmiden, die für SARS-CoV-, MERS-CoV- und SARS-CoV-2 S-Proteine ​​kodieren, unter Verwendung von Lipofectamine 3000 transfiziert. Gleichzeitig wurden Plasmide, die für VSV-G-Proteine ​​kodieren, transfiziert oder simuliert -transfiziert in 293 T-Zellen als positive oder negative Kontrolle. Die transfizierten Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. 24 Stunden später wurden die Zellen mit VSVΔG*-G-Viren bei MOI = 3–4 infiziert und 2 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde der Zellüberstand verworfen und die Zellen zweimal vorsichtig mit warmem PBS gespült. Dann wurden 10 ml frisches DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, einer 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung und 20 mM HEPES, zu den Schalen gegeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. 24 Stunden später wurden diese Zellen auf ein EGFP-positives Signal überprüft und die überstehende Flüssigkeit gesammelt, zentrifugiert, filtriert und in Aliquots aufgeteilt. Alle pseudotypisierten Viren wurden bei –80 °C gelagert. Wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen wurden vermieden.

Huh-7-Zellen wurden zur Quantifizierung der generierten pseudotypisierten Viren verwendet. Im Detail wurden Huh-7-Zellen einen Tag vor der Quantifizierung kultiviert. Sobald eine Konfluenz von 80 % erreicht war, wurden die Zellen verdaut, quantifiziert und in eine 48-Well-Platte ausgesät. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit einer Reihe von 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2 und 1,6 μl pseudotypisierten Viren mit drei Replikaten infiziert. Die infizierten Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 platziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden diese Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Quantifizierung auf EGFP-positive Zellen. Pseudotypisierte Viren wurden titriert (Transducing Units, TU), indem einzelne Zellen gezählt wurden, die mit den pseudotypisierten Viren infiziert waren. Die Endkonzentration von VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS betrug 4,85 × 106 TU/ml, 5,54 × 106 TU/ml bzw. 1,14 × 107 TU/ml.

Um die Reproduzierbarkeit dieser Forschung zu verbessern, wurden P3- und P4-Passagen primärer Zellkulturen für die In-vitro-Infektion pseudotypisierter Viren verwendet. Zellkulturen wurden in Platten mit 48 Vertiefungen (10.000 Zellen pro Vertiefung) ausgesät und in DMEM-F12, ergänzt mit 10 % FBS, einer 1 %igen Penicillin-Streptomycin-Lösung und 20 mM HEPES, kultiviert. Als die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichten, wurden die Kulturüberstände verworfen. Die Zellen wurden zweimal mit einem warmen PBS-Puffer und einer 1%igen Penicillin-Streptomycin-Lösung gespült. Die Zellkulturen wurden mit pseudotypisierten Viren infiziert, einschließlich pseudotypisierter Viren, die Wildtyp- und mutierte S-Proteine, VSV-G-Glykoproteine ​​und eine Negativkontrolle (Kulturüberstand aus scheintransfizierten Zellen) trugen. Jedes Infektionsexperiment hatte drei unabhängige Wiederholungen. Die Viren wurden 24 Stunden lang in dem mit 1 % FBS und einer 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung ergänzten Kulturmedium gehalten, gefolgt von einer Mikroskopbeobachtung und einer Durchflusszytometrieanalyse auf GFP-positive Zellen. Für VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-SARS2 wurden Zellkulturen mit MOI = 0,15 infiziert (bezogen auf Huh-7-Zellen). Für VSVΔG*-MERS wurden Zellkulturen mit MOI = 0,3 infiziert (bezogen auf Huh-7-Zellen). Es wurde keine Korrelation zwischen den Transduktionsraten von VSVΔG*-noG und VSVΔG*-SARS2 (cor = −0,0637, p > 0,05), zwischen VSVΔG*-noG und VSVΔG*-SARS (cor = −0,0324, p > 0,05) beobachtet. und zwischen VSVΔG*-noG und VSVΔG*-MERS (cor = −0,0723, p > 0,05).

Da die Infektionsdosis, die den gleichen Prozentsatz an Zellen transduziert, nicht die gleiche Anzahl an Viruspartikeln widerspiegelt und die gleiche Menge an Viruspartikeln pseudotypisierter Viren, die unterschiedliche mutierte S-Proteine ​​tragen, Zellen nicht mit der gleichen Effizienz infiziert, ist dies schwierig Passen Sie pseudotypisierte Viren an die gleiche Infektionsdosis an, wenn Zellen durch pseudotypisierte Viren infiziert werden, die mutierte SARS-CoV-2-S-Proteine ​​tragen. Und obwohl wir versuchten, pseudotypisierte Viren durch RT-qPCR zu quantifizieren, stellten wir fest, dass die Ergebnisse hohe systematische Fehler enthielten, was 1) auf das Fehlen vernünftiger Referenzgene zurückzuführen war; 2) die Tatsache, dass die Effizienz der RNA-Extraktion bei verschiedenen Viren unterschiedlich ist; 3) der durch qPCR-Technologien verursachte Fehler; und 4) die Ausbeutekonzentration pseudotypisierter Viren war nicht ideal stabil. Daher verwendeten wir ein Volumen von 75 μl pseudotypisierter Viren, um jede Zellkultur in jedem Zellinfektionstest zu infizieren.

Mit pseudotypisierten Viren infizierte oder scheininfizierte Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Nachdem das Kulturmedium verworfen worden war, wurden die Zellen zweimal in warmem PBS gespült, gefolgt von einem 5-minütigen Verdau mit 0,25 % EDTA-Trypsin. Anschließend wurden die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, um Trypsin zu entfernen, und unter Verwendung eines 70-μm-Zellsiebs (BD Falcon, USA) filtriert, um Zellklumpen zu entfernen. Die fertigen Zellen wurden in einer dunklen Kammer auf Eis gelegt. Es wurden Durchflusszytometrieanalysen durchgeführt (CytoFLEX, Beckman Coulter, USA). Mit VSV△G*−G-Viren oder Negativkontrolle infizierte Zellen wurden verwendet, um die Spannung für FSC-, SSC- und FITC-Detektoren zu optimieren und die Zellpopulationen für positive oder negative Partikel zu quantifizieren. Für jeden Infektionstest wurden insgesamt mindestens 5000 Zellen eingegeben. Der Prozentsatz der Transduktionsraten wurde als Mittelwert ± SD basierend auf drei unabhängigen Replikaten angezeigt.

Die Schnittstelle zwischen der RBD des S-Proteins von SARS-CoV-2 und ACE2-Orthologen verschiedener Spezies wurde durch molekulardynamische (MD) Simulationen mit Amber 20 untersucht [29,30,–31]. Wir haben zunächst die Aminosäuresequenzen aus der NCBI-Datenbank (National Center for Biotechnology Information) oder unserem generierten RNA-seq-Datensatz heruntergeladen. Die RBD-ACE2-Kristallstruktur (PDB-ID: 6M0J) wurde von der Proteindatenbank [32] heruntergeladen und diente als Vorlage für die Erstellung von 3D-Modellen für SARS-CoV-2 S-RBD- und ACE2-Orthologe auf SWISS-MODEL [33]. . Als nächstes wurde jedes System durch einen Sprung überprüft und in einer kubischen periodischen Box aus TIP3P-Wasser solvatisiert, die 10 Å vom gelösten Stoff entfernt war. Das System wurde mit einer rationalen Anzahl von Gegenionen von Na+ oder Cl− neutralisiert, gefolgt von der Parametrisierung mit einem Amber ff14SB-Kraftfeld [34]. Als nächstes wurden 10.000 Schritte zur Energieminimierung durchgeführt, darunter 5.000 Schritte unter Verwendung der Methode des steilsten Abstiegs und 5.000 Schritte zur Minimierung des konjugierten Gradienten. Anschließend wurde jedes System im NVT-Ensemble für 0,2 ns auf 300 K erhitzt. Die Minimierungs-, Erwärmungs- und Gleichgewichtssimulationen wurden mit starken Einschränkungen (500 kcal/mol/Å2) an schweren Atomen mit dem Sander-Programm in Amber20 durchgeführt. Die 30-ns-MD-Simulationen wurden unter konstanter Temperatur bei 300 K mit NPT-Ensemble und pmemd.cuda durchgeführt. Die Systemtemperatur wurde mithilfe der Langevin-Dynamik aufrechterhalten. Der Grenzabstand zwischen der Van-der-Waals-Energie und der elektrostatischen Energie im Nahbereich betrug 10 Å. Zur Berechnung weitreichender elektrostatischer Wechselwirkungen wurde die Partikelnetz-Ewald-Methode verwendet. Für die endgültige Durchschnittsstruktur jedes RBD-ACE2-Komplexes wurden mindestens 3000 Schnappschüsse aus der Gleichgewichtskurve extrahiert. Die MM/GBSA-Methode wurde verwendet, um die freie Bindungsenergie (ΔG) zu berechnen, und die freie Bindungsenergie wurde in den Energiebeitrag jedes Rests zerlegt [35].

Wir haben anhand der Transduktionsrate zwischen den Spezies untersucht, ob eine Spike-Variante mit einem bestimmten ACE2-Rest interagiert. Für jede Spike-Variante wurden die Zelllinien/Arten mithilfe einer k-Means-Clustering-Methode in zwei Gruppen (stark bzw. niedrig infizierte Gruppen) eingeteilt. Anschließend wurde an jeder durch MD-Simulation geschätzten Position von 42 Schlüsselresten von ACE2 die Aminosäure mit der höchsten Anzahl als Hauptrest für diese Position identifiziert und ihre Häufigkeit berechnet. Abschließend wurde ein exakter Fisher-Test eingesetzt, um zu quantifizieren, ob der Hauptrückstand gleichmäßig zwischen der stark und schwach infizierten Gruppe verteilt war. Ein Rückstand mit einem p-Wert des exakten Fisher-Tests von weniger als 0,05 weist darauf hin, dass sich die Häufigkeit des Rückstands zwischen Gruppen mit hoher und niedriger Infektion deutlich unterschied. Dies deutet darauf hin, dass es möglicherweise mit einer Spike-Variante interagiert hat.

Um die Reproduzierbarkeit dieser Studie weiter zu verbessern, führten wir eine RNA-Seq-Analyse für erzeugte Zellkulturen durch. Die Gesamt-RNAs der Zellkulturen, die für die In-vitro-Infektionsanalyse verwendet wurden, wurden mit TRIzol Regent gemäß dem Benutzerhandbuch (Invitrogen, USA) isoliert. Die Qualität und Konzentration der RNA wurde vor dem Aufbau der Bibliothek mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Lexington, USA) bewertet. Für jede RNA-Probe wurde eine Bibliotheksgröße von 150 bp unter Verwendung des Bibliotheksvorbereitungskits NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit für Illumina® (NEB, USA) erstellt. Die Paired-End-Sequenzierung wurde mit Novogene Co. Ltd auf der NovaSeq 6000-Plattform „Illumina“ durchgeführt. Dies führte zu ca. 2,7 Milliarden Lesevorgängen. Wir haben IllQC_PRLL.pl im Paket „NGSQCTools“ verwendet, um minderwertige Lesevorgänge von Rohdaten zu entfernen [36]. Um die artspezifischen Orthologsätze zu generieren und Expressionswerte zu berechnen, haben wir die Referenzgenome der Arten (falls verfügbar) aus der öffentlichen Datenbank heruntergeladen. Für diejenigen ohne Referenzgenom wurde Trinity verwendet, um eine De-novo-Assemblierung von Transkripten durchzuführen [37], basierend auf zuvor generierten Leber-, Nieren- und Gehirntranskriptomen, um Transkripte zusammenzustellen [38]. Die k-mer-Größe des festen Parameters betrug 25, die minimale Contig-Länge betrug 200 und die gepaarte Fragmentlänge betrug 500. Anschließend verwendeten wir „cd-hit-est“, um die zusammengesetzten Transkripte aus verschiedenen Geweben derselben Art zu verarbeiten und zu gruppieren Sequenzen mit 90 % Ähnlichkeit und hinterlassen in jedem Cluster das längste Transkript [39, 40]. Schließlich wurde Augustus eingesetzt, um eine Genvorhersage für die deredundanten Transkripte durchzuführen und GTF-Annotationsdateien zu erhalten.

Um die menschliche Referenzsequenz zu konstruieren, verwendeten wir „gffread“ im „Cufflink“-Paket, um die menschliche CDS-Sequenz zu extrahieren, unvollständige ORF-Transkripte und Pseudogen-Transkripte herauszufiltern und das längste Transkript für jedes Gen zu extrahieren [41]. BLAST wurde verwendet, um stark repetitive und sehr ähnliche Gene mit einem E-Wert <10–6 und einer Identität >90 % als Filterschwelle zu entfernen [42]. Die Kartierungsraten im gesamten Datensatz lagen zwischen 9,63 % und 66,58 %. Schließlich wurden 18.552 einzigartige proteinkodierende Gene als Referenzsequenzen erhalten.

Das längste Transkript jedes Gens wurde extrahiert und ein reziproker „BLAST“ wurde mit den Proteinsequenzen aus den menschlichen Proben durchgeführt [43]. Der Filterschwellenwert wurde für E-Werte auf 10–6 und für Identität auf 30 % festgelegt. Zwei Gene, die am besten aufeinander abgestimmt waren, wurden als orthologe Gene definiert. Da sich das vollständige Genom und das De-novo-Genom im Vergleich erheblich unterscheiden, haben wir die CDS-Sequenz orthologer Gene als Referenzgenom verwendet und Annotationsdateien im GTF-Format für die RNA-seq-Datenkartierung generiert. STAR wurde verwendet, um einen Index zu erstellen, der auf der Sequenzgröße des orthologen Gensatzes und der Leselänge verschiedener Arten basiert. Wir haben die Standardparameter verwendet, um die RNA-seq-Daten mit dem Referenzgenom abzugleichen (44). Wir haben „featureCounts“ im Subread-Softwarepaket verwendet, um Lesevorgänge zu zählen und mehrfach übereinstimmende Lesevorgänge zu eliminieren [45].

Schließlich haben wir die Bibliotheksgröße jeder Stichprobe als Normalisierungsfaktor berechnet. Das R-Softwarepaket „edgeR“ wurde verwendet, um die Bibliotheksgröße und Genlänge (basierend auf Menschen) um log2(RPKM-TMM + 1) zu normalisieren [46, 47]. Die Probeninformationen, Kartierungsraten, die Liste der Orthologen, die Genlänge und die Expressionsniveaus sind in den Tabellen S12–S17 verfügbar.

Um Gene zu identifizieren, deren Expression mit der Transduktion von VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS verbunden ist, wurde ein verallgemeinertes lineares Modell verwendet, um die Korrelation zwischen Genexpression und Transduktionsraten zu testen. Wenn ein orthologes Gen in einer bestimmten Art nicht identifiziert wurde, wurde angenommen, dass dieses Gen in dieser Art nicht exprimiert wird (Genexpressionswert = 0). Wir haben Gene herausgefiltert, die in weniger als drei Proben exprimiert wurden. Zur Bestimmung der besten Korrelation in der Transduktionsrate jedes Gens wurden das gewöhnliche Kleinste-Quadrate-Modell, das Brownsche Modell und das Ornstein-Uhlenbeck-Modell verwendet. Da für die Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2 und VSVΔG*-SARS kein phylogenetisches Signal festgestellt wurde, wurden phylogenetische Beziehungen in den Regressionsanalysen der Transduktionsraten der beiden pseudotypisierten Viren nicht berücksichtigt. Allerdings wurde in allen Regressionsanalysen ein zweistufiges Verfahren zur Korrektur des p-Werts eingesetzt [47, 48]. Im ersten Schritt wurden die Arten, die den größten Einfluss auf die Steigung hatten (also potenzielle Ausreißer), anhand der Residuen entfernt, und dann wurde die Regression erneut durchgeführt. Wir haben den resultierenden p-Wert als p.robust definiert, um den Einfluss der Ausreißer auf die Regression zu beseitigen. Der zweite Schritt bestand darin, den Regressionsprozess für die verbleibenden Arten zu wiederholen und jedes Mal eine der verbleibenden Arten zu entfernen, bis alle verbleibenden Arten einmal entfernt wurden. Anschließend haben wir den größten (am wenigsten signifikanten) p-Wert im Prozess als p.max bewertet, um den Einfluss von Arten auf die Regression zu beseitigen. Der Grenzwert für signifikante Gene wurde auf p.robust < 0,01 und p.max < 0,05 festgelegt. Genanreicherungsanalysen wurden mit DAVID 2021 aktualisiert (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) durchgeführt [49]. Der Parameter für EASE betrug 0,3 mit dem exakten Fisher-Test.

R wurde zum Zeichnen und zur statistischen Analyse verwendet; Die Werte wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Wenn Zellkulturen mit VSVΔG*-SARS2 infiziert wurden, das das Wildtyp-S-Protein trägt, wurden die relativen Transduktionsraten auf der Grundlage der folgenden Prinzipien in vier Kategorien eingeteilt (d. h. minimale, leichte, moderate und effiziente Transduktion). Zunächst haben wir das Quantil aller Transduktionsraten aufgelistet und den Interquartilbereich (IQR) berechnet. Anschließend berechneten wir die Standardabweichung (SD) der Transduktionsraten im Bereich vom Minimum bis Q1. Dies wurde SDQ1 genannt. Eine Zellinfektion mit einer Transduktionsrate von weniger als dem Zehnfachen von SDQ1 wurde als vernachlässigbare Infektion eingestuft; eine Zellinfektion mit einer Transduktionsrate zwischen 10* SDQ1 bis Q3 wurde als leichte Infektion eingestuft; eine Transduktionsrate zwischen Q3 und Q3 + 1,5*IQR wurde als mittelschwere Infektion eingestuft; und eine Transduktionsrate von mehr als Q3 + 1,5*IQR wurde als wirksame Infektion eingestuft. Dieses Prinzip wurde auch zur Bewertung der Infektionsergebnisse von Zellkulturen durch VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS angewendet. Wenn Zellkulturen mit pseudotypisierten VSVΔG*-SARS2-Smut-Viren infiziert wurden, die mutierte S-Proteine ​​von SARS-CoV-2 trugen, wurden die Infektionsergebnisse jedes VSVΔG*-SARS2-Smut auf die relativen Transduktionsergebnisse von A549-Zellen normalisiert. Als Ausreißer wurden Mutationen postuliert, die den Tropismus von SARS-CoV-2 deutlich verstärkten.

Um die Anfälligkeit für SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV zu beurteilen, wurden GFP-kodierende pseudotypisierte Viren mit relevanten S-Proteinen, die als VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS bzw. VSVΔG*-MERS bezeichnet werden, untersucht generiert (Abb. S1). Anschließend sammelten wir Zellkulturen von 55 Säugetierarten aus 12 Ordnungen, darunter Diprotodontia (eine Art), Didelphimorphia (eine Art), Hyracoidea (eine Art), Scandentia (eine Art), Primaten (drei Arten) und Lagomorpha (eine). Arten), Rodentia (acht Arten), Eulipotyphla (eine Art), Perissodactyla (zwei Arten), Artiodactyla (drei Arten), Carnivora (sieben Arten) und Chiroptera (26 Arten) (Abb. 1, Abb. S1). Insgesamt wurden 83 Zellkulturen erhalten, darunter 64 primäre Zellkulturen, drei immortalisierte Zellkulturen und 16 Zelllinien (Tabelle S1). Von diesen Zellkulturen stammten 56 aus Nieren, in denen ACE2 reichlich exprimiert wurde; 10 stammten aus der Lunge; sieben wurden aus dem Herzen abgeleitet; und die 10 verbleibenden Zellkulturen stammten aus anderen Geweben wie dem Embryo, dem Dickdarm und der Milz (Abb. 1, Tabelle S1). Diese Zellkulturen wurden mit pseudotypisierten Viren infiziert und einer durchflusszytometrischen Analyse GFP-positiver Signale unterzogen, um ihre Transduktionsraten zu quantifizieren (Abb. S1). Insgesamt zeigten die aus den Nieren stammenden Zellkulturen relativ höhere Transduktionsraten als solche aus anderen Geweben (Abb. S2A). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den Transduktionsraten für pseudotypisierte Viren zwischen primären Zellkulturen und permanenten Zelllinien beobachtet (Abb. S2B).

In dieser Studie wurde ein phylogenetischer Baum von 55 Säugetierzellkulturen verwendet. Eine Phylogenie wurde von TIMETREE (http://www.timetree.org/) abgerufen. In roter Schrift angezeigte Taxa sind Arten, die auf der Grundlage früherer Studien auf natürliche Weise mit SARS-CoV-2 infiziert werden können, während in blauer Schrift angegebene Taxa Arten sind, die durch experimentelle In-vivo-Infektionsanalysen getestet wurden. Darüber hinaus wurden 83 Zellkulturen aus Nieren, Herz, Lunge, Gehirn und anderen Geweben gewonnen. Die Cartoon-Elemente mit schwarzen Rahmen sind Zelllinien, die aus diesen Geweben stammen. Die winzigen Cartoons wurden von BioRender (https://biorender.com/) bezogen. B Transduktionsraten (Mittelwert ± SD, n = 3) von 83 Zellkulturen, die mit VSVΔG*-SARS2-, VSVΔG*-SARS- und VSVΔG*-MERS-Viren infiziert sind. Einige Zellkulturen stammten vom gleichen Wirt. In diesem Fall werden in diesem Panel die Zellkulturen mit den höchsten Transduktionsraten angezeigt. Die grauen und schwarzen gestrichelten Linien stellen den Standard zur Definition einer moderaten bzw. effizienten Transduktion dar.

Bei der Infektion mit VSVΔG*-SARS2 zeigten die 83 Zellkulturen unterschiedliche Empfindlichkeiten mit einer Gesamttransduktionsrate von 0–26,7 % (Abb. 1, Abb. S3, Tabelle S1). Vierundvierzig Zellkulturen wurden minimal durch VSVΔG*-SARS2 transduziert (Transduktionsrate von <1,2 %). Insgesamt 32 Zellkulturen waren leicht (Transduktionsrate 1,2–3,8 %) oder mäßig (Transduktionsrate 3,8–8,8 %) durch VSVΔG*-SARS2 transduziert, einschließlich von Hunden stammender Zellkulturen (BcKi, BcLu und MDCK). Katzen (F81), Frettchen (MpuHe), Marderhunde (NpKi), Nerze (Mv.1.Lu), Spitzmäuse (TbKi) und Schweine (PK-15) (Abb. 1, Abb. S3). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass Marderhunde, Hunde, Katzen, Nerze, Frettchen, Spitzmäuse und Hamster bekanntermaßen anfällig für SARS-CoV-2 sind und asymptomatische bis mittelschwere klinische Symptome aufweisen (Tabelle S2) [22, 50]. Wir fanden heraus, dass VSVΔG*-SARS2 PK-15-Zellen infizieren kann (4,9 %) (Abb. 1), aber aus früheren experimentellen Infektionen wurden widersprüchliche Schlussfolgerungen gezogen. Mehrere Studien zeigten, dass Schweine gegen SARS-CoV-2 resistent waren [23, 51, 52], während andere Studien zeigten, dass SARS-CoV-2 Schweine infizieren und auf gemeinsam gehaltene, naive Sentinelschweine übertragen werden konnte [53, 54]. Zellkulturen mehrerer Haustiere, wie Herz- (OdHe), Lungen- (OdLu) und Nierenzellen (OdKi) des gewöhnlichen Degus (Octodon degus, ein hystricomorphes Nagetier) und Herzzellkulturen (GkHe) des Siebenschläfers (Graphiurus kelleni). , ein Glirid-Nagetier) wurden mäßig durch VSVΔG*-SARS2 transduziert (Abb. 1). Mäuse erwiesen sich als resistent gegen die SARS-CoV-2-Infektion; Zellkulturen von Mäusen (NIH3T3 und SP2/0) wurden jedoch leicht durch VSVΔG*-SARS2 transduziert (Abb. S3, Tabelle S1). Angesichts der Tatsache, dass sich SARS-CoV-2 durch serielle Passage in den Atemwegen gealterter BALB/c-Mäuse anpassen kann [55, 56], vermuteten wir, dass Tiere, die nicht anfällig für SARS-CoV-2 waren, nach der Virusentwicklung währenddessen potenzielle Wirte sein könnten wiederholte Belichtungen.

Schließlich wurde festgestellt, dass sieben Zellkulturen von Thomas-Hufeisennasen (RtKi), Königshufeisennasen, Menschen, Palmzibetkatzen, Afrikanischen Grünmeerkatzen und Frettchen sehr anfällig für VSVΔG*-SARS2 sind (Transduktionsrate von >8,8 %). Unter ihnen wurden Menschen, Palmzibetkatzen und Frettchen auf der Grundlage von In-vivo-Analysen als anfällige Wirte für SARS-CoV und SARS-CoV-2 identifiziert (Tabelle S2) [57]. Insbesondere 14,0 % von Huh-7 (menschliche Zelllinie), 11,4 % von Vero-E6 (Grüne Meerkatzen-Zelllinie), 11,9 % von Marc-145 (Grüne Meerkatzen-Zelllinie) und 10,0 % von MpuKi.2 (Frettchen). Nierenzelllinie) wurden transduziert, was bestätigte, dass diese Zelllinien sehr anfällig für SARS-CoV-2 sind, wie in früheren Studien festgestellt wurde [28, 58]. Wir stellten fest, dass Palmzibetnierenzellen (PlKi) sehr anfällig für VSVΔG*-SARS2 waren, da Palmzibetnieren als einer der Replikationswirte von SARS-CoV erkannt wurden [8, 59] (Abb. 1, Abb. S2). Wichtig ist, dass auch die Nierenzellen von Frettchen (Mustela putorius furo) (MpuKi.2) sehr anfällig für SARS-CoV-2 waren. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass Frettchen anfällig für SARS-CoV-2 sind [23, 51, 60,61,62]. Primäre Zellkulturen der Thomas-Hufeisennase und der Königshufeisennase erwiesen sich als empfindlicher gegenüber VSVΔG*-SARS2 als die menschliche Huh-7-Zelllinie (Abb. 1, Tabelle S1), was darauf hindeutet, dass sie als wahrscheinliche Wirte für SARS dienen könnten -CoV-2.

Die Maximum-Likelihood-Schätzungen von Pagels λ für die Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS betrugen 6,74 × 10−5 (phylogenetischer Signaltest: logλ = −163,95, p > 0,05), 6,33 × 10-5 (logλ = −192,22, p > 0,05) bzw. 0,74 (logλ = −174,13, log0 = 1475,26, p = 0,09 × 10−2), was darauf hinweist, dass eng verwandte Taxa im Allgemeinen eine ähnliche Anfälligkeit für VSVΔG* aufweisen -MERS, aber nicht zu VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-SARS2. Konsistent zeigte VSVΔG*-SARS ein ähnlicheres Tropismusprofil mit VSVΔG*-SARS2 (R2 = 0,61, p < 0,001, phylogenetischer generalisierter Kleinste-Quadrate-Test) als mit VSVΔG*-MERS (R2 = 0,29, p <0,001, phylogenetisch generalisierter Kleinste-Quadrate-Test). Quadrattest). Insbesondere die 83 mit VSVΔG*-SARS infizierten Zellkulturen zeigten eine Transduktionsrate von 0–38,4 % (Abb. 1). Insgesamt waren 38 Zellkulturen minimal (Transduktionsrate von 0–1,1 %), 23 leicht (1,1–3,8 %), 10 mäßig (3,8–8,9 %) und 11 stark (8,9–38,4 %) durch VSVΔG*-SARS transduziert . Zellkulturen, die die höchste Anfälligkeit für VSVΔG*-SARS zeigten, stammten von domestizierten Frettchen, wobei 38,4 % der Frettchennieren-MpuKi.2-Zellen und 31,1 % der Frettchen-MpuKi.1-Zellen transduziert wurden. Dies entspricht einer 2,6-fachen bzw. 2,0-fachen Steigerung im Vergleich zu menschlichen Zellen (Huh-7) (Abb. 1, Abb. S4, Tabelle S1). Dies ist bemerkenswert, da Frettchen als Tiermodell für SARS-CoV verwendet wurden und klinische Symptome wie Niesen, Fieber und Durchfall zeigen [63]. Die Zellkultur, die nach Frettchennierenzellen am höchsten rangierte, stammte von der Thomas-Hufeisenniere, die eine Transduktionsrate von 37,2 % aufwies, was darauf hindeutet, dass diese Art auch als wichtiger Wirt für SARS-CoV dienen könnte.

Palmzibetkatzen wurden als Replikationswirt für SARS-CoV erkannt. Unsere Ergebnisse deuten auf eine konsistente und hohe Transduktionsrate (9,1 %) für Palmzibet-PlKi-Zellen hin. Darüber hinaus zeigte VSVΔG*-SARS eine höhere Kapazität als VSVΔG*-SARS2 bei der Transduktion von Zellkulturen hochempfindlicher Arten wie RtKi (37,2 % vs. 25,5 %), PK-15 (13,4 % vs. 4,9 %), MpuKi.2 (38,4 % vs. 10,0 %), MpuKi.1 (33,3 % vs. 1,9 %) und BcKi (21,1 % vs. 3,8 %) Zellen (Abb. 1, Abb. S4). Dies impliziert, dass SARS-CoV möglicherweise leichter vom Menschen auf natürliche Wirte übertragbar ist als SARS-CoV-2.

Wir fanden heraus, dass 41 Zellkulturen minimal (Transduktionsrate zwischen 0 und 1,3 %), 21 leicht (1,3–4,3 %), 13 mäßig (4,3–10,0 %) und 8 effizient (10,0–32,9 %) durch VSVΔG* transduziert wurden. -MERS (Abb. 1, Abb. S3). Bemerkenswerterweise zeigten menschliche Zelllinien die höchste Transduktionsrate bei einer VSVΔG*-MERS-Infektion, was sich von denen bei VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-SARS2 unterschied. Darüber hinaus stammten unter den Top 10 Zellkulturen mit den höchsten Transduktionsraten sechs (MlKi, RrKi, RtKi, MsKi, PlaKi und MfiKi) von Fledermäusen (Abb. 1, Abb. S3), was darauf hindeutet, dass die verschiedenen Fledermausarten als solche dienen potenzielle Reservoirwirte für MERS-CoV. Insbesondere die Japanische Zwergfledermaus (Pipistrellus abramus) ist eine Art, die Anlass zur Sorge gibt. Sie leben in unmittelbarer Nähe menschlicher Gemeinschaften und haben das Potenzial, das Virus auf Menschen zu übertragen [64]. Und obwohl frühere Studien darauf hindeuteten, dass Frettchen gegen eine MERS-CoV-Infektion resistent sind [65], fanden wir heraus, dass 10,0 % der MpuKi.2-Zellkulturen der Frettchennieren durch das pseudotypisierte MERS-CoV-Virus transduziert wurden (Abb. 1). Darüber hinaus wird der MERS-CoV-Rezeptor DPP4 [66] in Frettchennierenzellen leicht exprimiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es andere Faktoren als DPP4 gibt, die den Eintritt von MERS-CoV unterstützen können, und dass Frettchen anfällig für SARS-CoV, SARS-CoV-2 und MERS-CoV sind.

Um zu untersuchen, ob SARS-CoV-2-S-Proteinvarianten die Anfälligkeit für SARS-CoV-2 verändern, wurden 77.125 Spike-Gene von SARS-CoV-2 aus GISAID (abgerufen am 26.10.2020) und 65 Varianten mit Rückstandshäufigkeiten abgerufen höher als 0,075 % ausgewählt wurden (Abb. 2A). Darüber hinaus wurden vierzehn Restmutationen in S-Proteinen von SARS-CoV-2-Varianten ausgewählt, die aus Proben von Mäusen, Katzen, Hunden, Nerzen und Tigern isoliert wurden, sowie S-Proteinmutationen von Fledermaus-CoV RaTG13 (GISAID: EPI_ISL_402131), Fledermaus -CoV RmYN02 (GISAID: EPI_ISL_412977) und Pangolin-CoV MP789 (GISAID: EPI_ISL_412860). Insgesamt wurden 79 pseudotypisierte Viren mit mutierten SARS-CoV-2 S-Proteinen konstruiert, gefolgt von der In-vitro-Infektion von 44 Zellkulturen (Abb. 2B).

A Die Substitutionshäufigkeit für jede Stelle wurde basierend auf S-Sequenzen analysiert, die aus der GISAID-Datenbank abgerufen wurden. B Verteilung von 79 Standortmutationen des S-Proteins. Die schwarz umrahmte Stelle bedeutet, dass diese Mutation auf der Grundlage einer vergleichenden Analyse des viralen Genoms von tierischen Wirten ausgewählt wurde. C Die gesamten normalisierten Transduktionsraten aller Mutationen in verschiedenen Zellkulturen. Die in der Abbildung gezeigten winzigen Cartoons repräsentieren Arten aus verschiedenen Säugetierordnungen. Auf der x-Achse ist der Gewebeursprung dieser Zellkulturen dargestellt. DA-3D-Struktur des S-ACE2-Komplexes, die zeigt, dass del69-70, D80Y, S98F, T572I und Q675H außerhalb der RBD der S-Proteine ​​liegen.

Wir fanden heraus, dass die meisten dieser Mutationen nur geringe Auswirkungen auf die Transduktionseffizienz pseudotypisierter VSVΔG*-SARS2-Smut-Viren in Zellkulturen hatten (Abb. 2C, Abb. S5). Wie erwartet reagierten Zellkulturen von Menschen, Affen und Fledermäusen (Huh-7, Vero-E6, Marc-145 und PabKi.1) im Vergleich zu anderen Zellkulturen empfindlicher auf pseudotypisierte Viren (Abb. 2C). Frühere Studien haben gezeigt, dass die Substitutionen N439K, N501Y, D614G und H655Y in S-Proteinen die Pathogenität und Übertragung von SARS-CoV-2 beim Menschen verstärken [67,68,–69]. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass diese Substitutionen nicht immer die Transduktionsrate fördern. Beispielsweise erhöhte H655Y die Transduktion von VSVΔG*-SARS2 in Spitzmauszellen (TbKi) (Abb. S5), während die D614G-Substitution die Fähigkeit von VSVΔG*-SARS2 zur Transduktion in nackten Maulwurfsratten-Fibroblastenzellen und in Japan deutlich reduzierte Zellen von Zwergfledermäusen (PabKi.1) (Abb. S6). Darüber hinaus reduzierte die T22I-Substitution den Tropismus von SARS-CoV-2 zu F81 (Katzennierenzelllinie) und BHK-21 (Goldhamsternierenzelllinie) deutlich. Darüber hinaus zeigten die H519N- und T716I-Substitutionen eine verringerte Fähigkeit zur Transduktion von PK-15 (Schweinenierenzelllinie) und PaKi (schwarze Flughundnierenzelllinie). Schließlich reduzierten die Substitutionen T29I, E281V und S939F den Tropismus von SARS-CoV-2 in MfuKi-Zellkulturen (Eastern Bent-Wing Bat Kidney Cell) deutlich (Abb. S5).

Es wurde festgestellt, dass mehrere Mutationen die Transduktionseffizienz von VSVΔG*-SARS2-Smut in bestimmte Zellkulturen signifikant steigern (Abb. 2C, Abb. S5). Insbesondere förderte del69-70 im S-Protein die Fähigkeit von VSVΔG*-SARS2-Sdel69-70, Fledermaus-PabKi.1-Zellen (17,8 %) zu transduzieren, und zwar auf ein Niveau, das doppelt so hoch war wie das von Huh-7-Zellen (9,8 %) (Abb. S5B). In ähnlicher Weise verursachte VSVΔG*-SARS2-SD80Y eine Transduktionsrate von 7,2 % in Goldhamsterzellen, was höher war als die von Huh-7-Zellen (6,6 %) (Abb. S5C). Wir fanden heraus, dass die Substitution S98F die Transduktionsrate in Nierenzellen von Marderhunden (62,4 %) und Nierenzellen von Ricketts großfüßigen Fledermäusen (45,0 %) im Vergleich zu Huh-7-Zellen (38,9 %) signifikant steigerte (Abb. S5D). In ähnlicher Weise erhöhte die Substitution T572I die Transduktionseffizienz von VSVΔG*-SARS2 zu Schweine-PK15-Zellen (11,3 %) im Vergleich zu Huh-7-Zellen (12,2 %) signifikant (Abb. S5E). Die Q675H-Mutation erhöhte auch die Fähigkeit des pseudotypisierten SARS-CoV-2-Virus, Nierenzellen von Fettschwanz-Rennmäusen zu infizieren, erheblich, mit einer Transduktionsrate von 13,4 % im Vergleich zu 15,7 % in Huh-7-Zellen (Abb. S5F). Bemerkenswerterweise befanden sich diese fünf Mutationen außerhalb der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des S-Proteins (Abb. 2D). Somit stützen diese Ergebnisse die Idee, dass unterschiedliche Mutationen einen einzigartigen Einfluss auf die Virusanfälligkeit bestimmter Säugetierarten haben und dass Varianten innerhalb und außerhalb der RBD-Region für den Viruseintritt und die Virusbindung gleichermaßen wichtig sind.

Molekulardynamische Simulationen mit Amber 20 sowie dem Kristallkomplex von RBD-hACE2 (PDB-ID: 6M0J) zeigen, dass die freie Bindungsenergie (ΔG) zwischen RBD und verschiedenen ACE2-Orthologen im Bereich von –64,7 bis –24,8 kcal/mol lag. ACE2s von Grünen Meerkatzen (Chlorocebus sabaeus) und Großen Hufeisennasen (Rhinolophus ferrumequinum) zeigten die höchste bzw. niedrigste freie Bindungsenergie mit SARS-CoV-2 S-RBD (Abb. S6A). Wir haben die Beiträge zur freien Energie weiter pro Rest analysiert (Abb. S6B – D). Die Ergebnisse zeigten, dass es 42 Aminosäurereste gab, die für die Wechselwirkungen zwischen RBD und ACE2 wichtig waren (Abb. S6B–E).

In dieser Hinsicht ermöglichte uns das artenübergreifende Infektionsspektrum verschiedener Spike-Varianten die Erforschung der möglichen ortsbezogenen „Wechselwirkung“ zwischen ACE2-Aminosäureresten und Spike-Varianten, die die Transduktionsrate zwischen den Arten beeinflussen können. Indem wir testeten, ob die Häufigkeit der Hauptrückstände gleichmäßig zwischen den durch jede Spike-Variante vorgeschlagenen Gruppen mit hoher und niedriger Infektion verteilt war, identifizierten wir 98 Kombinationen von Spike-Varianten und ACE2-Resten, die Kandidaten für solche potenziellen „Wechselwirkungen“ („Material und Methoden“) waren. Abb. S7, Tabelle S3). Die an diesen signifikanten Interaktionen beteiligten ACE2-Positionen mit dem höchsten Rang waren 49, 31, 354, 82, 75, 35, 353, wohingegen die Spike-Varianten mit dem höchsten Rang P26L, S254F, H519N, H146Y, A262S und T478I umfassten. Die Mehrzahl dieser Interaktionen (86,7 %) betraf die Spike-Varianten der RBD-Region (Tabelle S3). Diese Ergebnisse stützen die Möglichkeit, dass verschiedene Spike-Varianten einen einzigartigen Einfluss auf die Virusanfälligkeit haben, indem sie mit unterschiedlichen ACE2-Resten und/oder anderen intrinsischen Faktoren bei bestimmten Säugetierarten interagieren.

Es wurden transkriptomische Profile von Zellkulturen von 42 Säugetierarten erstellt und Regressionsanalysen durchgeführt, um Gene zu identifizieren, deren Expressionen signifikant mit den Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS korrelierten. Insgesamt gab es 590 Gene, deren Expressionsniveaus signifikant mit den Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2 assoziiert waren (Abb. 3A, Tabelle S4). Der am stärksten angereicherte Signalweg war die Herpes-simplex-Virus-1-Infektion (p = 4,30 × 10−23, exakter Fisher-Test), bei dem 93,6 % (59 von 63 Genen) der assoziierten Gene Zinkfingerproteine ​​sind (Abb. 3B, Tabelle S5). ). Die entsprechenden angereicherten biologischen Prozesse, die Zinkfingerproteine ​​enthalten, sind die DNA-gestützte Transkriptionsregulation (p = 2,40 × 10−12, exakter Fisher-Test) und die RNA-Polymerase-II-Promotor-Transkriptionsregulation (p = 5,10 × 10−10, exakter Fisher-Test) ( Tabelle S6). Zinkfingerproteine ​​scheinen bei Wirt-Virus-Interaktionen eine Rolle zu spielen und spielen mehrere Rollen bei der Virusreplikation, indem sie die Transkriptionsprofile der Wirtszelle regulieren [70]. Viele Zinkfingerproteine ​​korrelieren positiv mit den VSVΔG*-SARS2-Infektionsraten. Dies weist darauf hin, dass die Transkriptionsniveaus der Wirtszellen für den Eintritt von SARS-CoV-2 wichtig sind, was normalerweise auf einem Mechanismus namens „Cap Snatching“ beruht, wie er beim Influenzavirus beobachtet wird [71]. Die fünf wichtigsten Gene, die mit den Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2 in Zellkulturen assoziiert waren, waren PDZK1 (p.robust = 5,87 × 10−11), SERPINF2 (p.robust = 2,31 × 10−9), SCG5 (p. robust = 3,51 × 10−9), DEPP1 (p.robust = 4,57 × 10−9) und ABCC6 (p.robust = 2,71 × 10-8) (Abb. 3C, Abb. S8, Tabelle S4). Diese Gene verdienen eine weitere Erforschung. Beispielsweise kodiert PDZK1 für ein PDZ (PSD95/DLG/ZO-1)-Domänen enthaltendes Gerüstprotein (genannt NHERF3), das zu einer Gruppe von Proteinen gehört, die Zell-Zell-Verbindungen vermitteln und an der Koordination einer Vielzahl von Proteinen beteiligt sind Regulierungsprozesse. Eine frühere Studie zeigte, dass SARS-CoV und das neurotrope Tollwutvirus mit den PDZ-Bindungsfunktionen ihrer Hüllproteine ​​verbunden sind [72]. PDZK1 kann mit SR-B1 interagieren und den Eintritt des Hepatitis-C-Virus erleichtern [73]. Darüber hinaus bindet das ACE2 C-terminale PDZ-Erkennungsmotiv 802QTSF805 an NHERF1 und/oder NHERF3 und fördert den ACE2-vermittelten SARS-CoV-2-Zelleintritt [74, 75]. SERPINF2 kodiert für einen der Serinproteaseinhibitoren. Eine aktuelle Studie ergab, dass die SERPINF2-Expression zusammen mit mehreren anderen SERPINs (SERPINA1 und SERPINA3) im Serumspiegel von Patienten mit COVID-19 zunimmt [76]. Darüber hinaus zeigten mehrere Gene, wie MAK16 (p.robust = 1,92 × 10−5), H3Y2 (p.robust = 4,08 × 10−5) und RBMX (p.robust = 6,14 × 10−5), a signifikante negative Korrelation mit den Transduktionsraten (Abb. S8, Tabelle S4). Die Rolle von MAK16 und H3Y2 bei Virusinfektionen ist unklar, während RBMX, das X-ed-RNA-Bindungsmotivproteine ​​kodiert, auf den Eintritt von SARS-CoV-2 über Interaktionen zwischen viraler RNA und Wirtsprotein reagiert [77, 78].

AA-Venn-Diagramm mit 590 Genen, 453 Genen und 416 Genen, die signifikant mit den Transduktionsraten der pseudotypisierten VSVΔG*-SARS2-, VSVΔG*-SARS- und VSVΔG*-MERS-Viren assoziiert waren. Insgesamt 95 Gene wurden häufig mit den drei pseudotypisierten Viren in Verbindung gebracht. B Die KEGG-Signalwege, die durch diese Gene angereichert wurden und deren Expressionen mit den Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS assoziiert sind. C Diagramme mehrerer Gene, deren Expressionen mit den Transduktionsraten von VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS und VSVΔG*-MERS assoziiert waren. D Heatmap von 95 Genen, die häufig mit den drei pseudotypisierten Viren assoziiert waren. Das Ausdrucksniveau wurde durch log2(RPKM + 1) dargestellt. Die durch rote Schriftarten markierten Zellkulturen wurden effizient durch VSVΔG*-SARS2 transduziert. Blaue Balken unter dem Baum zeigen Gene an, die negativ mit der VSVΔG*-SARS2-Transduktion assoziiert waren, während die roten Balken Gene anzeigen, die positiv mit der VSVΔG*-SARS2-Transduktion assoziiert waren.

Wir identifizierten einen signifikanten Zusammenhang zwischen den Expressionsniveaus von 453 Genen, die mit der Transduktionsrate von VSVΔG*-SARS assoziiert sind, und 416 Genen, die mit der Transduktionsrate von VSVΔG*-MERS assoziiert sind. Diese Gene sind hauptsächlich in Stoffwechselwegen und Herpes-simplex-Virus-1-Infektionen angereichert, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass mehr als die Hälfte aller Genexpressionen mit der VSVΔG*-SARS2-Transduktion korrelierten (Abb. 3B, Tabellen S6–S11). Gene, deren Expression mit VSVΔG*-MERS assoziiert war, zeigten ein ähnliches Profil wie VSVΔG*-SARS2 bei der Anreicherung biologischer Prozesse, insbesondere bei der DNA-gestützten Transkriptionsregulation und der Transkriptionsregulation des RNA-Polymerase-II-Promotors. Der wichtigste biologische Prozess, der durch Gene angereichert wurde, deren Expression mit der VSVΔG*-SARS-Transduktion assoziiert war, war jedoch die Proteolyse (p = 7,7 × 10−4, exakter Fisher-Test) (Tabelle S8), was zeigt, dass die Proteasen der Wirtszellen essentiell sind für die Infektiosität pseudotypisierter SARS-CoV-Viren [79]. Darüber hinaus legt eine aktuelle Studie nahe, dass Proteasen eine zentrale Rolle im Infektionsprozess von SARS-CoV-2 spielen und dass Medikamente, die auf Proteasen abzielen, eine dosisabhängige Verringerung der SARS-CoV-2-Titer verursachen können [80]. Dies legt nahe, dass Proteasen ein häufiges Ziel für die Behandlung von SARS-ähnlichen Krankheiten sein könnten. Die Expression erkannter Rezeptoren (ACE2 und DPP4) von SARS-CoV und MERS-CoV korrelierte jedoch nicht signifikant mit den Transduktionsraten. Angesichts dieses Ergebnisses untersuchten wir die mögliche Rolle dieser verwandten Gene. Bei einer SARS-CoV-2-Infektion wurden mehrere Genantworten gefunden (z. B. HSD17B2, IGLL1) [81, 82], wohingegen die Rolle der mit der VSVΔG*-SARS-Transduktion assoziierten Gene mit dem höchsten Rang begrenzter war.

Wir haben eine Liste von 95 Genen zusammengestellt, die häufig mit den Transduktionsraten pseudotypisierter SARS-CoV-, MERS-CoV- und SARS-CoV-2-Viren assoziiert sind (Abb. 3D, Tabelle S12). Diese Liste umfasste nicht nur die oben genannten Gene, sondern auch Gene wie APOBEC3B, MYO5B und HPN (Hepsin), die möglicherweise an SARS-CoV-2-Virus-Wirt-Interaktionen beteiligt sind. Beispielsweise besteht APOBEC3B, das zu einer Familie von Proteinen in Säugetieren gehört, aus zellulären Cytosin-Desaminasen und dient als Barriere, die möglicherweise die artübergreifende Übertragung von Lentiviren verhindert [83]. Darüber hinaus kann APOBEC3 das SARS-CoV-2-Genom kontinuierlich formen, indem es Cytidin in Uridin umwandelt [84]. Im Gegensatz dazu wird MYO5B in einem Spike-RBD-induzierten Mastzell-Degranulationsmodell herunterreguliert und spielt eine Rolle beim endosomalen Transport [85]. MYO5B interagiert auch mit viralen Proteinen. Eine frühere Studie legt nahe, dass die Hemmung von MYO5-Proteinen ein wirksames Ziel für die Behandlung von COVID-19 sein könnte [85]. Diese Ergebnisse deuten im Großen und Ganzen darauf hin, dass diese gemeinsamen Gene am Eintritt und der Replikation von Viren beteiligt sind und daher weiterhin geeignete Ziele für die weitere Bewertung der Übertragungsrisiken zwischen Arten darstellen.

Hier haben wir gezeigt, dass SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV die Zellen Dutzender Säugetierarten infizieren können, was darauf hindeutet, dass es sich um generalistische Viren handelt und nicht speziell an den Menschen angepasst ist. Darüber hinaus zeigen Zellkulturen verschiedener Säugetiere unterschiedliche Anfälligkeiten für pseudotypisierte SARS-CoV-2-, SARS-CoV- und MERS-CoV-Viren. Dies impliziert, dass SARS-CoV-2 die Fähigkeit hat, nach geringfügigen oder größeren adaptiven evolutionären Veränderungen auf mehrere Arten überzugreifen und natürliche Reservoirs zu bilden. Unsere Ergebnisse verdeutlichten das Potenzial von Thomas-Hufeisennasen, Königshufeisennasen, Grünen Meerkatzen und Frettchen, als Reservoirwirte für diese Coronaviren zu dienen. Insbesondere Primärzellkulturen der Thomas-Hufeisennase und der Königshufeisennase erwiesen sich als empfindlicher gegenüber VSVΔG*-SARS2 als menschliche Zelllinien. Dies ist wichtig, da Hufeisennasen (Rhinolophidae) als Reservoir für viele zoonotische Viren gelten und man davon ausgeht, dass sie grundsätzlich infektionstolerant sind. Allerdings wurden sehr seltene Sarbecoviren sowohl bei der Thomas-Hufeisennase als auch bei der Königs-Hufeisennase gemeldet, nicht jedoch bei anderen Hufeisennasen (z. B. der Chinesischen Hufeisennase) [86]. Dies lässt nicht nur die Sorge aufkommen, dass SARS-CoV-2 vom Menschen auf diese beiden Fledermausarten übergreifen könnte, sondern räumt auch der Überwachung der Virusunverträglichkeit bei Hufeisennieren Priorität ein.

Da festgestellt wurde, dass ACE2 der funktionelle Rezeptor für das Spike-Protein von SARS-CoV und SARS-CoV-2 ist, haben Pionierstudien die Anfälligkeit verschiedener Tierarten für SARS-CoV-2 mithilfe von ACE2-Sequenzen und/oder ihrer Bindungsaffinität vorhergesagt Spike-Proteine ​​[15, 87, 88]. Während unser experimenteller Assay die Anfälligkeit mehrerer Arten (z. B. Rhesusaffen und Goldhamster) für SARS-CoV-2 bestätigte, besteht eine erhebliche Inkonsistenz zwischen den In-silico-Vorhersagen und unseren zellulären Assays. Beispielsweise wurde vorhergesagt, dass die Chinesische Spitzmaus und das Frettchen ein geringes oder gar kein Risiko für eine SARS-CoV-2-Infektion aufweisen [15], möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass ihre ACE2-Sequenzen von denen des menschlichen ACE2 abweichen. Unsere Experimente zeigten jedoch, dass beide Arten mittelschwer anfällig sind. Auch bei Fledermäusen wird im Allgemeinen ein geringes Infektionsrisiko vorhergesagt, doch unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mehrere Fledermausarten wahrscheinlich stark infiziert sind. Daher sind Studien, die die Infektionsanfälligkeit experimentell untersuchen, äußerst wertvoll für den Vergleich mit zukünftigen In-silico-Prognosen. Darüber hinaus wurden, wie in Tabelle S2 angegeben, 75 % der in unserer Studie dargestellten In-vitro-Empfindlichkeiten durch In-vivo-Inokulationstests gestützt. Unterschiede zwischen In-vitro- und In-vivo-Tests wurden bei Mäusen, Rotfuchs und Kühen beobachtet. Beispielsweise deutete ein Inokulationstest darauf hin, dass Mäuse gegen eine SARS-CoV-2-Infektion resistent sind, unsere Studie ergab jedoch, dass ihre Zellkulturen moderate Transduktionsraten aufweisen. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass Zellmodelle möglicherweise nicht der Komplexität eines gesamten Organismus entsprechen, oder auf die besonderen Herausforderungen der Übersetzbarkeit von in vitro generierten Daten in In-vivo-Modelle [57]. Dennoch können In-vivo-Tests bei der Bestimmung des Anfälligkeitsrisikos und der natürlichen Wirte von SARS-CoV-2 und anderen Sarbecoviren von In-vitro-Tests profitieren.

Wir untersuchten auch die Anfälligkeit mehrerer Säugetierarten gegenüber verschiedenen Spike-Varianten und stellten fest, dass jede Spike-Variante ein eigenes Infektionsspektrum aufwies. Insbesondere wurde gezeigt, dass mehrere Spike-Varianten (Del69-70, D80Y, S98F, T572I und Q675H), die nicht in der RBD-Region liegen, die Infektiosität von SARS-CoV-2 erhöhen. Die Variante del69-70 wurde erstmals Anfang 2020 identifiziert und ist in den letzten Jahren zu drei verschiedenen Varianten mutiert (d. h. Y453F, S493K und N501Y) [89]. Frühere Berichte haben gezeigt, dass del69-70 die Spaltung im S-Protein und die Infektiosität in der Variante SARS-CoV-2 B.1.1.7 erhöht [90, 91]. Diese Mutation kann dazu führen, dass SARS-CoV-2 auf andere Tiere übergreift, beispielsweise auf die Japanische Zwergfledermaus, die in städtischen Gebieten mit hoher menschlicher Bevölkerungsdichte lebt. Darüber hinaus wurde in unserer Studie eine Wechselwirkung zwischen ACE2-Resten und Spike-Varianten festgestellt, die möglicherweise die Infektionsraten beeinflussen. Einige dieser ACE2-Reste sind wichtig für die Schnittstelle zwischen dem SARS-CoV-RBD und ACE2. Beispielsweise sind Lys31 und Lys353 virusbindende Hotspots, die aus Salzbrücken zwischen Lys31 und Glu35 sowie zwischen Lys353 und Asp38 bestehen [92, 93]. Allerdings befanden sich die meisten Spike-Varianten in diesen vorhergesagten Interaktionen in der N-terminalen Domäne (NTD). Daher können Regionen innerhalb und außerhalb von RBD für den Viruseintritt und die Infektion von gleicher Bedeutung sein. Diesen Spike-Varianten sollte größere Aufmerksamkeit gewidmet werden, da sie (z. B. P26L, S254F, H146Y und A262S) die „NTD-Supersite“ darstellen, die von allen bekannten NTD-spezifischen neutralisierenden Antikörpern erkannt wird [94] und somit vermitteln könnte Immunflucht.

Eine Untersuchung phylogenetischer Signale zeigt, dass SARS-CoV ein ähnlicheres Tropismusprofil mit SARS-CoV-2 aufweist als mit MERS. Dies könnte daran liegen, dass SARS-CoV und SARS-CoV-2 denselben Rezeptor nutzen. Das pseudotypisierte SARS-CoV-Virus zeigte jedoch eine höhere Effizienz bei der Transduktion mehrerer Zellkulturen von Hunden, Schweinen und Frettchen, was darauf hindeutet, dass weitere Untersuchungen Spike-Varianten und andere Faktoren zwischen SARS-CoV und SARS-CoV-2 aufdecken könnten, die zu diesem Unterschied beitragen (Abb. S4). Regressionsanalysen zeigten, dass die Expression allgemein bekannter Rezeptoren und Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie den Eintritt von SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV erleichtern, nicht mit einer artenübergreifenden Infektion korreliert (Abb. S8). Insbesondere die Expressionsniveaus von ACE2 (p.robust = 0,14), FURIN (p.robust = 0,89) und TMPRSS2 (p.robust = 0,11) zeigten eine unbedeutende Korrelation mit den VSVΔG*-SARS2-Transduktionsraten (Abb. S9A– C; S9D und Tabelle S4, Tabelle S6). Im Gegensatz dazu korrelierte CTSL (p.robust = 7,4 × 10−3) signifikant mit den VSVΔG*-SARS2-Transduktionsraten.

Wir fanden heraus, dass bestimmte Zelllinien hohe Mengen an ACE2 exprimierten (z. B. Zellen, die vom Zuckersegler, der Nepalesischen Bartfledermaus und der Großen Hufeisennase stammen), diese jedoch nur minimal oder nur geringfügig durch VSVΔG*-SARS2 transduziert wurden (Abb. S9A-C). und Tabelle S1). Dies negiert jedoch möglicherweise nicht die Rolle von ACE2 bei der Bestimmung der SARS-CoV-2-Anfälligkeit bei anderen Arten, da die RNA-Expression das ACE2-Protein auf der Zelloberfläche nicht vollständig repräsentieren kann. Darüber hinaus ergaben nachfolgende Analysen des bestraften Regressionsmodells, dass Sequenzänderungen in ACE2s signifikant mit den Transduktionsraten über phylogenetisch unterschiedliche Taxa hinweg korrelieren (F = 15,78, p = 8,9 × 10−13) (Abb. S10, S11). Dies deutet darauf hin, dass eher Veränderungen in den ACE2-Sequenzen als in der Expression zu Unterschieden in der Anfälligkeit beitragen. Allerdings beträgt die Gesamtvarianz der Transduktionsraten, die durch ACE2-Sequenzänderungen erklärt wird, etwa 28,9 %. Daher sollten zukünftige Studien andere wirtseigene Faktoren untersuchen, die mit der Anfälligkeit in Zusammenhang stehen, wie beispielsweise die in dieser Studie identifizierten Gene, deren Expression signifikant mit den Transduktionsraten korreliert.

Abschließend unterstreichen unsere Ergebnisse die Tatsache, dass Zellkulturmodelle eine wichtige Methode zum Verständnis der artübergreifenden Übertragung von Sarbecoviren darstellen, indem sie das Spektrum der Säugetierwirte identifizieren, die für SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV anfällig sind, und deren Varianten.

RNA-Sequenzierungsdaten aus dieser Studie wurden in ScienceDB (https://doi.org/10.57760/sciencedb.j00001.00445) und im Genome Sequence Archive im National Genomics Data Center, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, hinterlegt , Chinesische Akademie der Wissenschaften (GSA: CRA009056) und NCBI (PRJNA906190).

Pekar JE, Magee A, Parker E, Moshiri N, Izhikevich K, Havens JL, et al. Die molekulare Epidemiologie mehrerer zoonotischer Ursprünge von SARS-CoV-2. Wissenschaft. 2022;377:960–6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Garry RF. Die Beweise bleiben eindeutig: SARS-CoV-2 ist über den Wildtierhandel entstanden. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119:e2214427119.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Worobey M, Levy JI, Serrano LM, Crits-Christoph A, Pekar JE, Goldstein SA, et al. Der Huanan Seafood Wholesale Market in Wuhan war das frühe Epizentrum der COVID-19-Pandemie. Wissenschaft. 2022;377:951–9.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. Ein Ausbruch einer Lungenentzündung im Zusammenhang mit einem neuen Coronavirus, das wahrscheinlich von Fledermäusen stammt. Natur. 2020;579:270–3.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang T, Wu Q, Zhang Z. Wahrscheinlicher Pangolin-Ursprung von SARS-CoV-2 im Zusammenhang mit dem COVID-19-Ausbruch. Curr Biol. 2020;30:1346–51.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Temmam S, Vongphayloth K, Baquero E, Munier S, Bonomi M, Regnault B, et al. Fledermaus-Coronaviren, die mit SARS-CoV-2 verwandt und für menschliche Zellen infektiös sind. Natur. 2022;604:330–6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Azhar EI, El-Kafrawy SA, Farraj SA, Hassan AM, Al-Saeed MS, Hashem AM, et al. Hinweise auf eine Übertragung des MERS-Coronavirus vom Kamel auf den Menschen. N Engl J Med. 2014;370:2499–505.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang M, Yan M, Xu H, Liang W, Kan B, Zheng B, et al. SARS-CoV-Infektion in einem Restaurant durch Palmzibet. Emerg Infect Dis. 2005;11:1860–5.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge XY, Li JL, Yang XL, Chmura AA, Zhu G, Epstein JH, et al. Isolierung und Charakterisierung eines Fledermaus-SARS-ähnlichen Coronavirus, das den ACE2-Rezeptor nutzt. Natur. 2013;503:535–8.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabir JS, Lam TT, Ahmed MM, Li L, Shen Y, Abo-Aba SE, et al. Kozirkulation von drei Kamel-Coronavirus-Arten und Rekombination von MERS-CoVs in Saudi-Arabien. Wissenschaft. 2016;351:81–4.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Menachery VD, Yount BL Jr, Debbink K, Agnihothram S, Gralinski LE, Plante JA, et al. Eine SARS-ähnliche Ansammlung zirkulierender Fledermaus-Coronaviren zeigt Potenzial für die Entstehung beim Menschen. Nat Med. 2015;21:1508–13.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou P, Shi ZL. SARS-CoV-2-Spillover-Ereignisse. Wissenschaft. 2021;371:120–2.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hale VL, Dennis PM, McBride DS, Nolting JM, Madden C, Huey D, et al. SARS-CoV-2-Infektion bei freilaufenden Weißwedelhirschen. Natur. 2022;602:481–6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McAloose D, Laverack M, Wang L, Killian ML, Caserta LC, Yuan F, et al. Vom Menschen zum Panther: Natürliche SARS-CoV-2-Infektion bei Tigern und Löwen im Bronx Zoo. mBio. 2020;11:e02220–20.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Damas J, Hughes GM, Keough KC, Painter CA, Persky NS, Corbo M, et al. Breites Wirtsspektrum von SARS-CoV-2, vorhergesagt durch vergleichende und strukturelle Analyse von ACE2 bei Wirbeltieren. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117:22311–22.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu L, Chen Q, Liu K, Wang J, Han P, Zhang Y, et al. Breites Wirtsspektrum von SARS-CoV-2 und die molekulare Basis für die Bindung von SARS-CoV-2 an Katzen-ACE2. Zellentdeckung. 2020;6:68.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fang S, Zheng R, Lei C, Wang J, Zheng R, Li M. Schlüsselreste, die die Bindungsaffinitäten von 2019-nCoV mit ACE2 in verschiedenen Spezies beeinflussen. Kurzes Bioinform. 2021;22:963–75.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Baggen J, Persoons L, Vanstreels E, Jansen S, Van Looveren D, Boeckx B, et al. Genomweites CRISPR-Screening identifiziert TMEM106B als proviralen Wirtsfaktor für SARS-CoV-2. Nasse Ginsterkatze. 2021;53:435–44.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhu S, Liu Y, Zhou Z, Zhang Z, Xiao X, Liu Z, et al. Genomweites CRISPR-Aktivierungsscreening identifiziert Kandidatenrezeptoren für den Eintritt von SARS-CoV-2. Sci China Life Sci. 2022;65:701–17.

Artikel PubMed Google Scholar

Schwedhelm P, Kusnick J, Heinl C, Schonfelder G, Bert B. Wie viele Tiere werden für die SARS-CoV-2-Forschung verwendet?: Ein Überblick über Tierversuche in der präklinischen und Grundlagenforschung. EMBO Rep. 2021;22:e53751.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkar J, Guha R. Infektiosität, Virulenz, Pathogenität, Wirt-Pathogen-Interaktionen von SARS und SARS-CoV-2 bei Versuchstieren: eine systematische Übersicht. Vet Res Commun. 2020;44:101–10.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Imai M, Iwatsuki-Horimoto K, Hatta M, Loeber S, Halfmann PJ, Nakajima N, et al. Syrische Hamster als Kleintiermodell für die SARS-CoV-2-Infektion und die Entwicklung von Gegenmaßnahmen. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117:16587–95.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi J, Wen Z, Zhong G, Yang H, Wang C, Huang B, et al. Anfälligkeit von Frettchen, Katzen, Hunden und anderen domestizierten Tieren für das SARS-Coronavirus 2. Wissenschaft. 2020;368:1016–20.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu H, Chan JF, Yuen TT, Shuai H, Yuan S, Wang Y, et al. Vergleichender Tropismus, Replikationskinetik und Zellschädigungsprofilierung von SARS-CoV-2 und SARS-CoV mit Auswirkungen auf klinische Manifestationen, Übertragbarkeit und Laborstudien von COVID-19: eine Beobachtungsstudie. Lanzettenmikrobe. 2020;1:e14–e23.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gultom M, Licheri M, Laloli L, Wider M, Strassle M, V'Kovski P, et al. Anfälligkeit gut differenzierter Atemwegsepithelzellkulturen von Haus- und Wildtieren gegenüber dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 2021;27:1811–20.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seluanov A, Vaidya A, Gorbunova V. Etablierung primärer adulter Fibroblastenkulturen von Nagetieren. J Vis Exp. 2010:e2033. https://doi.org/10.3791/2033.

Takada A, Robison C, Goto H, Sanchez A, Murti KG, Whitt MA, et al. Ein System zur Funktionsanalyse des Glykoproteins des Ebola-Virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:14764–9.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li Q, Wu J, Nie J, Zhang L, Hao H, Liu S, et al. Der Einfluss von Mutationen im SARS-CoV-2-Spike auf die virale Infektiosität und Antigenität. Zelle 2020;182:1284–94.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fall D, Belfon K, Ben-Shalom I, Brozell S, Cerutti D, Cheatham T, et al. AMBER 2020: University of California, San Francisco; 2020.

Peng C, Zhu ZD, Shi YL, Wang XY, Mu KJ, Yang YQ, et al. Computergestützte Einblicke in die Konformationszugänglichkeit und Bindungsstärke des SARS-CoV-2-Spike-Proteins an das menschliche Angiotensin-Converting-Enzym 2. J Phys Chem Lett. 2020;11:10482–8.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiao K, Zhai J, Feng Y, Zhou N, Zhang X, Zou JJ, et al. Isolierung des SARS-CoV-2-bedingten Coronavirus aus malaysischen Schuppentieren. Natur. 2020;583:286–9.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lan J, Ge J, Yu J, Shan S, Zhou H, Fan S, et al. Struktur der SARS-CoV-2-Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne, die an den ACE2-Rezeptor gebunden ist. Natur. 2020;581:215–20.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Waterhouse A, Bertoni M, Bienert S, Studer G, Tauriello G, Gumienny R, et al. SWISS-MODEL: Homologiemodellierung von Proteinstrukturen und -komplexen. Nukleinsäuren Res. 2018;46:W296–W303.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maier JA, Martinez C, Kasavajhala K, Wickstrom L, Hauser KE, Simmerling C. ff14SB: Verbesserung der Genauigkeit der Proteinseitenketten- und Rückgratparameter von ff99sb. J Chem Theory Comput. 2015;11:3696–713.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Genheden S, Ryde U. Die MM/PBSA- und MM/GBSA-Methoden zur Schätzung der Ligandenbindungsaffinitäten. Expertenmeinung Drug Discov. 2015;10:449–61.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Patel RK, Jain M. NGS QC Toolkit: ein Toolkit zur Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. Plus eins. 2012;7:e30619.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, Levin JZ, Thompson DA, Amit I, et al. Vollständige Transkriptomassemblierung aus RNA-Seq-Daten ohne Referenzgenom. Nat Biotechnol. 2011;29:644–52.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu W, Zhu P, Li M, Li Z, Yu Y, Liu G, et al. Die evolutionäre Transkriptomik zeigt, dass die Langlebigkeit bei Säugetieren hauptsächlich auf polygene und indirekte Selektion zurückzuführen ist. bioRxiv. 2023.

Li W, Godzik A. Cd-hit: ein schnelles Programm zum Clustering und Vergleich großer Mengen von Protein- oder Nukleotidsequenzen. Bioinformatik. 2006;22:1658–9.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fu L, Niu B, Zhu Z, Wu S, Li W. CD-HIT: beschleunigt für die Clusterung der Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. Bioinformatik. 2012;28:3150–2.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren MJ, et al. Die Transkriptassemblierung und -quantifizierung durch RNA-Seq deckt nicht annotierte Transkripte und Isoformenwechsel während der Zelldifferenzierung auf. Nat Biotechnol. 2010;28:511–5.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boratyn GM, Camacho C, Cooper PS, Coulouris G, Fong A, Ma N, et al. BLAST: ein effizienterer Bericht mit verbesserter Benutzerfreundlichkeit. Nukleinsäuren Res. 2013;41:W29–33.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST und PSI-BLAST: eine neue Generation von Suchprogrammen für Proteindatenbanken. Nukleinsäuren Res. 1997;25:3389–402.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: ultraschneller universeller RNA-seq-Aligner. Bioinformatik. 2013;29:15–21.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: ein effizientes Allzweckprogramm zum Zuweisen von Sequenzlesevorgängen zu genomischen Merkmalen. Bioinformatik. 2014;30:923–30.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. EdgeR: ein Bioconductor-Paket für die differenzielle Expressionsanalyse digitaler Genexpressionsdaten. Bioinformatik. 2010;26:139–40.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ma S, Upneja A, Galecki A, Tsai YM, Burant CF, Raskind S, et al. Zellkulturbasierte Profilierung bei Säugetieren zeigt, dass DNA-Reparatur und -Metabolismus entscheidende Faktoren für die Langlebigkeit einer Art sind. Elife. 2016;5:e19130.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma S, Yim SH, Lee SG, Kim EB, Lee SR, Chang KT, et al. Organisation des Säugetiermetaboloms nach Organfunktion, Abstammungsspezialisierung und Langlebigkeit. Zellmetabolismus 2015;22:332–43.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sherman BT, Hao M, Qiu J, Jiao X, Baseler MW, Lane HC, et al. DAVID: ein Webserver zur funktionalen Anreicherungsanalyse und funktionalen Annotation von Genlisten (Update 2021). Nukleinsäuren Res. 2022;28:gkac194.

Meekins DA, Gaudreault NN, Richt JA. Natürliche und experimentelle SARS-CoV-2-Infektion bei Haus- und Wildtieren. Viren 2021;13:1993.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schlottau K, Rissmann M, Graaf A, Schon J, Sehl J, Wylezich C, et al. SARS-CoV-2 bei Flughunden, Frettchen, Schweinen und Hühnern: eine experimentelle Übertragungsstudie. Lanzettenmikrobe. 2020;1:e218–e25.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weingartl HM, Copps J, Drebot MA, Marszal P, Smith G, Gren J, et al. Anfälligkeit von Schweinen und Hühnern für das SARS-Coronavirus. Emerg Infect Dis. 2004;10:179–84.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pickering BS, Smith G, Pinette MM, Embury-Hyatt C, Moffat E, Marszal P, et al. Anfälligkeit von Hausschweinen für eine experimentelle Infektion mit dem schweren Coronavirus 2 mit akutem respiratorischem Syndrom. Emerg Infect Dis. 2021;27:104–12.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meekins DA, Morozov I, Trujillo JD, Gaudreault NN, Bold D, Artiaga BL, et al. Anfälligkeit von Schweinezellen und Hausschweinen für SARS-CoV-2. bioRxiv. 2020.

Gu H, Chen Q, Yang G, He L, Fan H, Deng YQ, et al. Anpassung von SARS-CoV-2 an BALB/c-Mäusen zum Testen der Impfstoffwirksamkeit. Wissenschaft 2020;369:1603–7.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dinnon KH 3rd, Leist SR, Schafer A, Edwards CE, Martinez DR, Montgomery SA, et al. Ein an die Maus angepasstes Modell von SARS-CoV-2 zum Testen von Gegenmaßnahmen gegen COVID-19. Natur. 2020;586:560–6.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosa RB, Dantas WM, do Nascimento JCF, da Silva MV, de Oliveira RN, Pena LJ In-vitro- und In-vivo-Modelle zur Untersuchung von SARS-CoV-2, dem ätiologischen Erreger, der für die COVID-19-Pandemie verantwortlich ist. Viren. 2021;13:379.

Wang L, Fan X, Bonenfant G, Cui D, Hossain J, Jiang N, et al. Anfälligkeit für SARS-CoV-2 von Zelllinien und Substraten, die üblicherweise zur Diagnose und Isolierung von Influenza- und anderen Viren verwendet werden. Emerg Infect Dis. 2021;27:1380–92.

Lu G, Wang Q, Gao GF. Fledermaus-zu-Mensch: Spike-Merkmale bestimmen den „Wirtssprung“ der Coronaviren SARS-CoV, MERS-CoV und darüber hinaus. Trends Mikrobiol. 2015;23:468–78.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim YI, Kim SG, Kim SM, Kim EH, Park SJ, Yu KM, et al. Infektion und schnelle Übertragung von SARS-CoV-2 bei Frettchen. Zellwirtsmikrobe. 2020;27:704–9.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Richard M, Kok A, de Meulder D, Bestebroer TM, Lamers MM, Okba NMA, et al. SARS-CoV-2 wird durch Kontakt und über die Luft zwischen Frettchen übertragen. Nat Commun. 2020;11:3496.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sawatzki K, Hill NJ, Puryear WB, Foss AD, Stone JJ, Runstadler JA. Wirtsbarrieren für SARS-CoV-2, nachgewiesen bei Frettchen in einer häuslichen Umgebung mit hoher Exposition. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118:e2025601118.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martina BEE, Haagmans BL, Kuiken T, Fouchier RAM, Rimmelzwaan GF, van Amerongen G, et al. SARS-Virusinfektion von Katzen und Frettchen. Natur. 2003;425:915.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chung CU, Kim SC, Jeon YS, Han SH. Veränderungen in der Lebensraumnutzung durch weibliche Japanische Zwergfledermäuse (Pipistrellus abramus) während verschiedener Fortpflanzungsstadien, ermittelt durch Radiotelemetrie. J Environ Sci Int. 2017;26:817–26.

Artikel Google Scholar

Raj VS, Smits SL, Provacia LB, van den Brand JM, Wiersma L, Ouwendijk WJ, et al. Adenosin-Desaminase fungiert als natürlicher Antagonist für den durch Dipeptidylpeptidase 4 vermittelten Eintritt des Coronavirus mit dem Middle East Respiratory Syndrome. J Virol. 2014;88:1834–8.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang N, Shi X, Jiang L, Zhang S, Wang D, Tong P, et al. Struktur der MERS-CoV-Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne im Komplex mit dem menschlichen Rezeptor DPP4. Zellauflösung 2013;23:986–93.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Plante JA, Liu Y, Liu J, Xia H, Johnson BA, Lokugamage KG, et al. Die Spike-Mutation D614G verändert die SARS-CoV-2-Fitness. Natur. 2021;592:116–21.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou B, Thao TTN, Hoffmann D, Taddeo A, Ebert N, Labroussaa F, et al. Die Veränderung des SARS-CoV-2-Spikes D614G verbessert die Replikation und Übertragung. Natur. 2021;592:122–7.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Escalera A, Gonzalez-Reiche AS, Aslam S, Mena I, Laporte M, Pearl RL, et al. Mutationen in besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten stehen im Zusammenhang mit einer erhöhten Spike-Spaltung und Virusübertragung. Zellwirtsmikrobe. 2022;30:373–87.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang G, Zheng C. Zinkfingerproteine ​​im Wirt-Virus-Wechselspiel: Vielfältige Funktionen basierend auf ihrer Nukleinsäure-bindenden Eigenschaft. FEMS Microbiol Rev. 2021;45:fuaa059.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Walker AP, Fodor E. Zusammenspiel zwischen Influenzavirus und der Transkriptionsmaschinerie der RNA-Polymerase II des Wirts. Trends Mikrobiol. 2019;27:398–407.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

James CD, Roberts S. Virale Interaktionen mit PDZ-Domänen enthaltenden Proteinen – ein onkogenes Merkmal? Krankheitserreger 2016;5:8.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Eyre NS, Schlagzeuger HE, Beard MR. Der SR-BI-Partner PDZK1 erleichtert den Eintritt des Hepatitis-C-Virus. PLoS Pathog. 2010;6:e1001130.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang Q, Gefter J, Sneddon WB, Mamonova T, Friedman PA. Die Interaktion von ACE2 mit dem zytoplasmatischen PDZ-Protein verstärkt die SARS-CoV-2-Invasion. iScience. 2021;24:102770.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kliche J, Kuss H, Ali M, Ivarsson Y. Zytoplasmatische kurze lineare Motive in ACE2 und Integrin Beta3 verbinden SARS-CoV-2-Wirtszellrezeptoren mit Mediatoren der Endozytose und Autophagie. Sci-Signal. 2021;14:eabf1117.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

D'Alessandro A, Thomas T, Dzieciatkowska M, Hill RC, Francis RO, Hudson KE, et al. Serumproteomik bei COVID-19-Patienten: veränderter Gerinnungs- und Komplementstatus als Funktion des IL-6-Spiegels. J Proteome Res. 2020;19:4417–27.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang S., Huang W., Ren L., Ju X., Gong M., Rao J. et al. Der Vergleich viraler RNA-Wirtsprotein-Interaktome verschiedener pathogener RNA-Viren liefert Informationen zur schnellen Entdeckung antiviraler Arzneimittel für SARS-CoV-2. Zellauflösung 2022;32:9–23.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Flynn RA, Belk JA, Qi Y, Yasumoto Y, Wei J, Alfajaro MM, et al. Entdeckung und funktionelle Untersuchung von SARS-CoV-2-RNA-Wirtsprotein-Wechselwirkungen. Zelle. 2021;184:2394–411.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simmons G, Zmora P, Gierer S, Heurich A, Pohlmann S. Proteolytische Aktivierung des SARS-Coronavirus-Spike-Proteins: Schneidenzyme auf dem neuesten Stand der antiviralen Forschung. Antivir Res. 2013;100:605–14.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Meyer B, Chiaravalli J, Gellenoncourt S, Brownridge P, Bryne DP, Daly LA, et al. Durch die Charakterisierung der Proteolyse während einer SARS-CoV-2-Infektion werden virale Spaltstellen und zelluläre Ziele mit therapeutischem Potenzial identifiziert. Nat Commun. 2021;12:5553.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zolfaghari Emameh R, Nosrati H, Eftekhari M, Falak R, Khoshmirsafa M. Erweiterung der Einzelzell-Transkriptomikdaten der SARS-CoV-Infektion in menschlichen Bronchialepithelzellen auf COVID-19. Biol Proced Online. 2020;22:16.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khyber S., Guojun L., Mikhail B., Izaz A., Muhmmad D., Irina T. et al. Hat eine Hochregulierung der Genexpression bestimmter Gene während der viralen Atemwegsinfektion einen Einfluss auf die Pathogenese der SAR-CoV-2-Infektion? Acta Med Iran. 2020;58:246–8.

Google Scholar

Nakano Y, Aso H, Soper A, Yamada E, Moriwaki M, Juarez-Fernandez G, et al. Ein Interessenkonflikt: das evolutionäre Wettrüsten zwischen Säugetier-APOBEC3 und lentiviralem Vif. Retrovirologie 2017;14:1–12.

Artikel Google Scholar

Wei Y, Silke JR, Aris P, Xia X. Coronavirus-Genome tragen die Signaturen ihrer Lebensräume. Plus eins. 2020;15:e0244025.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu ML, Liu FL, Sun J, Li X, He XY, Zheng HY, et al. Die durch SARS-CoV-2 ausgelöste schnelle Degranulation von Mastzellen führt zu einer Entzündung des Alveolarepithels und einer Lungenschädigung. Signaltransduktionsziel Ther. 2021;6:428.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luk HKH, Li X, Fung J, Lau SKP, Woo PCY. Molekulare Epidemiologie, Evolution und Phylogenie des SARS-Coronavirus. Infizieren Sie Genet Evol. 2019;71:21–30.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fischhoff IR, Castellanos AA, Rodrigues J, Varsani A, Han BA. Vorhersage der zoonotischen Fähigkeit von Säugetieren, SARS-CoV-2 zu übertragen. Proc Biol Sci. 2021;288:20211651.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luan J, Lu Y, Jin Biochem Biophys Res Commun. 2020;526:165–9.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ou J, Lan W, Wu X, Zhao T, Duan B, Yang P, et al. Die Verfolgung diverser Spike-Genmutationen von SARS-CoV-2 Omicron identifiziert mehrere intervariante Rekombinationsereignisse. Signaltransduktionsziel Ther. 2022;7:138.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng B, Kemp SA, Papa G, Datir R, Ferreira I, Marelli S, et al. Wiederkehrendes Auftreten der SARS-CoV-2-Spike-Deletion H69/V70 und ihre Rolle in der Alpha-Variante B.1.1.7. Cell Rep. 2021;35:109292.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren W, Lan J, Ju X, Gong M, Long Q, Zhu Z, et al. Die Mutation Y453F im Spike-Protein von SARS-CoV-2 verstärkt die Interaktion mit dem Nerz-ACE2-Rezeptor für die Wirtsanpassung. PLoS Pathog. 2021;17:e1010053.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choudhary S, Malik YS, Tomar S. Identifizierung von SARS-CoV-2-Zelleintrittsinhibitoren durch Arzneimittelumnutzung unter Verwendung eines strukturbasierten virtuellen In-silico-Screening-Ansatzes. Frontimmunol. 2020;11:1664.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shang J, Ye G, Shi K, Wan Y, Luo C, Aihara H, et al. Strukturelle Grundlagen der Rezeptorerkennung durch SARS-CoV-2. Natur. 2020;581:221–4.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. Die Antigenkartierung der N-terminalen Domäne zeigt eine Schwachstelle für SARS-CoV-2. Zelle. 2021;184:2332–47.e16.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Wir danken Pengcheng Wang, Xuanjing Li, Yun Huang, Linfa Wang und Alice C. Hughes für die Unterstützung bei der Probenentnahme und -vorbereitung. Wir danken auch Chrissie, Sara, Jenni und Dax für ihre Unterstützung beim Schreiben dieses Manuskripts. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32070528), der National Key Research and Development Projects of the Ministry of Science and Technology of China (2021YFC2301300), der National Natural Science Foundation of China (82050002) finanziert Schlüsselprogramm der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (KJZD-SW-L11) und der Beijing Natural Sciences Foundation (JQ19022).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Meng Li, Juan Du.

Schlüssellabor für Tierökologie und Naturschutzbiologie, Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, 100101, China

Meng Li, Juan Du, Weiqiang Liu, Zihao Li, Fei Lv, Chunyan Hu, Yichen Dai, Xiaoxiao Zhang, Zhan Zhang, Gaoming Liu, Qi Pan, Xiao Wang, Pingfen Zhu und Xuming Zhou

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, 100049, China

Juan Du, Weiqiang Liu, Zihao Li, Fei Lv, Chunyan Hu, Xiaoxiao Zhang, Zhan Zhang und Qi Pan

School of Life Sciences, Universität für Wissenschaft und Technologie von China, Anhui, China

Yang Yu

Beijing Advanced Center for Structural Biology, Beijing Frontier Innovation Center, School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, 100084, Peking, China

Xu Tan

Abteilung für Anthropologie, Programm für Ökologie, Evolution und Naturschutzbiologie, University of Illinois, Urbana, IL, USA

Paul A. Garber

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XZ und ML konzipierten die Studie und gestalteten das Projekt. ML führte Experimente durch, führte die Analyse durch und schrieb das Manuskript; JD, ZL und FL bereiteten die Zellkulturen vor; WL und CH implementieren die RNA-Analyse, Datenanalyse und generierten Strukturzahlen; GL, LW., XW, QP, XT, PAG und XZ diskutierten die Ergebnisse und überarbeiteten dieses Manuskript; Alle Autoren haben zur Dateninterpretation beigetragen.

Korrespondenz mit Xuming Zhou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Li, M., Du, J., Liu, W. et al. Vergleichende Anfälligkeit von SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV bei Säugetieren. ISME J 17, 549–560 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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Eingegangen: 15. August 2022

Überarbeitet: 10. Januar 2023

Angenommen: 12. Januar 2023

Veröffentlicht: 23. Januar 2023

Ausgabedatum: April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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