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Oct 26, 2023

Bewertung früher angeborener und adaptiver Immunantworten auf den Tuberkulose-Impfstoff Mycobacterium bovis BCG und den Impfstoffkandidaten BCGΔBCG1419c

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12377 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Impfstoff Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) löst eine Immunantwort aus, die vor bestimmten Formen der Tuberkulose (TB) schützt; Da die Wirksamkeit von BCG jedoch begrenzt ist, ist es wichtig, alternative TB-Impfstoffkandidaten zu identifizieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass der BCG-Deletionsmutant und Impfstoffkandidat BCGΔBCG1419c in intravenös infizierten BALB/c-Mäusen aufgrund der verstärkten Biofilmbildung länger überlebt und sowohl BALB/c- als auch C57BL/6-Mäuse in chronischen Stadien besser vor TB-induzierten Lungenpathologien schützt Infektion im Vergleich zu BCG-Kontrollen. Der durch BCGΔBCG1419c hervorgerufene Schutz war bei C57BL/6-Mäusen auch mit geringeren Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine (d. h. IL6, TNFα) an der Infektionsstelle verbunden. Angesichts der unterschiedlichen Immunprofile von BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen während chronischer Tuberkulose haben wir uns vorgenommen, mithilfe einer mehrdimensionalen durchflusszytometrischen Analyse der Lunge und anderer Gewebe kurz nach der Immunisierung festzustellen, ob es frühe immunologische Ereignisse gibt, die diese beiden Gruppen unterscheiden . Unsere Ergebnisse zeigen eine Reihe angeborener und adaptiver Reaktionsunterschiede zwischen BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen, die damit übereinstimmen, dass letztere länger anhaltend und möglicherweise weniger entzündlich sind, einschließlich einer geringeren Häufigkeit erschöpfter CD4+-T-Helferzellen (TH) und einer höheren Häufigkeit von IL10 -produzierende T-Zellen. Diese Studien legen nahe, dass die Verwendung von BCGΔBCG1419c als alternativer Tuberkulose-Impfstoffkandidat von Vorteil sein könnte.

Tuberkulose (TB) ist eine der häufigsten Todesursachen aufgrund einer Infektionskrankheit1. Tuberkulose wird durch aerogene Übertragung von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht, einer Bakterienart, die Alveolarmakrophagen infiziert und sich über lymphatische oder hämatogene Ausbreitung in extrapulmonales Gewebe ausbreiten kann2. Tuberkulose weist ein Spektrum klinischer Manifestationen auf, die je nach Reaktion des Wirts variieren, einschließlich schwerer, aktiver, chronischer, subklinischer und latenter Formen3. Verbesserte sozioökonomische Bedingungen, öffentliche Gesundheitspraktiken und der Einsatz wirksamer medikamentöser Behandlungen haben die Tuberkuloseraten weltweit gesenkt; Allerdings blieben diese Raten hinter dem Ziel der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zurück, die Tuberkulose-Inzidenz bis 2015 umzukehren4, und liegen nicht auf dem Ziel, die WHO-Richtwerte für die Beendigung der Tuberkulose-Epidemie bis 20305 zu erreichen. Aus diesen Gründen ist es wichtig, dass dies der Fall ist ein sicherer Impfstoff, der die Tuberkuloseresistenz wirksam fördert.

Der Tuberkulose-Impfstoff Bacillus Calmette-Guerin (BCG) ist ein abgeschwächter Lebendstamm von Mycobacterium bovis, dessen menschliche Virulenz durch mehrere Passagen in künstlichen Kulturen abgeschwächt wurde. BCG wird weltweit als Neugeborenenimpfstoff gegen schwere Formen der TB6 im Kindesalter verabreicht; Allerdings ist die Verwendung von BCG bei Kindern aufgrund seiner unterschiedlichen Wirksamkeit7 sowie der Anzahl unerwünschter Ereignisse, die auf seine frühe Immunogenität zurückzuführen sind, umstritten8. Innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Impfung treten bei fast allen BCG-Empfängern leichte Nebenwirkungen auf, die von der Bildung von Papeln an der Impfstelle, die geschwürig werden oder eine Narbe hinterlassen können, bis hin zu Schwellungen der abführenden Lymphknoten reichen. Zu den schwerwiegenden unerwünschten Ereignissen gehören ausgeprägtere Formen von Hautläsionen (z. B. BCG-Lupus vulgaris), Lymphadenitis mit Eiterung und Osteitis. Aufgrund der Anzahl unerwünschter entzündlicher Ereignisse, die mit der BCG-Impfung einhergehen, und der zunehmenden Impfskepsis bei Eltern in Tuberkulose-Endemieländern9,10,11,12, die ihre Kinder nur ungern entzündlichen Impfstoffen aussetzen (unabhängig von deren Wirksamkeit), ist dies der Fall Es ist wichtig, TB-Impfstoffkandidaten zu identifizieren, die – im Vergleich zu BCG – eine geringere frühe Reaktogenität, aber eine vergleichbare oder bessere Schutzwirkung gegen Tuberkulose aufweisen.

Kürzlich wurde gezeigt, dass der Impfstoffkandidat BCGΔBCG1419c in verschiedenen Mausmodellen (BALB/c13,14, C57BL/615,16 und B6D2F1) im Vergleich zu seinem Elternstamm BCG Pasteur einen gleichen und/oder besseren Schutz gegen experimentelle Tuberkulose bietet [ C57BL/6J × DBA/2J]13), einschließlich eines BALB/c-Modells für Typ-2-Diabetiker17, während es bei Meerschweinchen wirksamer als BCG bei der Reduzierung der hämatogenen Ausbreitung 2 Monate nach der Infektion war18. Das BCG1419c-Gen von M. bovis kodiert für eine Phosphodiesteraseaktivität, die bis-(3′-5′)-zyklisches dimeres GMP (c-di-GMP) hydrolysiert, ein Molekül, das die Beweglichkeit der Bakterien verringert und die Biofilmbildung erhöht (Biofilme sind darin eingeschlossene sessile Bakterien). eine Matrix aus einer extrazellulären Polymersubstanz)19. Als Folge der BCG1419c-Deletion verfügt der Stamm BCGΔBCG1419c über eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmproduktion und bleibt in immunkompetenten Mäusen länger bestehen als BCG Pasteur nach einer intravenösen Infektion20. Wichtig ist, dass BCGΔBCG1419c-immunisierte Mäuse nach der Mtb-Infektion im Vergleich zu BCG-immunisierten Mäusen, die später mit Mtb15 infiziert wurden, auch weniger Lungenpathologien aufweisen. Interessanterweise zeigten BCGΔBCG1419c-immunisierte Mäuse 60 Tage nach der Impfung eine erhöhte Anzahl von T CD3+ CD4+- und T CD3+CD4+CD44+-Zellen in BALF, das aus C57BL/6 gewonnen wurde, im Vergleich zu parentalem BCG16. Auch in der Milz von BALB/c-Mäusen erhöhte BCGΔBCG1419c T CD3+CD4+IFNγ+- und T CD3+CD8+IFNγ+-Zellen im Vergleich zu parentalem BCG13. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass BCGΔBCG1419c in einem BALB/c-Modell von aktivem und chronischem TB13 eine unterschiedliche Präsenz von IFNγ-produzierenden T-Zellen und aktivierten Makrophagen in der Lunge fördert, während es die relative Präsenz von B-, CD8+- und dendritischen Zellen in der Lunge verändert , in einem BALB/c-Modell für TB-Typ-2-Diabetes17. Alle diese Ergebnisse zeigen, dass BCG und BCGΔBCG1419c die relative Zusammensetzung adaptiver Immunzellen vor und nach der Infektion in verschiedenen Organen und Geweben geimpfter Wirte beeinflussen.

Angesichts der Tatsache, dass BCGΔBCG1419c in mehreren Modellen experimenteller Tuberkulose ein wirksamer Impfstoff ist und BCG bei der Vorbeugung von Tuberkuloseerkrankungen, gemessen als Lungenpathologie und Ausbreitung auf die Milz, übertrifft, haben wir eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um festzustellen, ob die frühe Immunogenität von BCGΔBCG1419c vergleichbar ist oder sich davon unterscheidet hervorgerufen durch BCG, dessen nachteilige entzündliche Wirkung typischerweise innerhalb von 2–3 Wochen nach der Immunisierung beobachtet wird. Konkret immunisierten wir Wildtyp-Mäuse und einen transgenen IL10-Reporter-Mausstamm mit BCG oder BCGΔBCG1419c und führten anschließend eine tiefe Immunphänotypisierung durch, um die angeborenen und adaptiven Immunereignisse, die innerhalb der ersten 2–3 Wochen nach der Immunisierung auftreten, sowie die zellulären Ereignisse umfassend zu identifizieren Quellen von IL1021,22,23,24. Unsere Daten zeigen bisher unbekannte, frühe immunologische Ereignisse, die durch BCG hervorgerufen werden, sowie phänotypische und funktionelle Unterschiede zwischen den durch BCG und BCGΔBCG1419c hervorgerufenen Immunantworten. Die Relevanz unserer Daten für die BCG-Mechanismen der frühen Immunogenität sowie das Verständnis der Wirksamkeit von BCGΔBCG1419c werden diskutiert.

Diese Studie und die damit verbundenen Experimente wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) der Ohio State University (OSU) sowie vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der OSU genehmigt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den relevanten institutionellen Richtlinien durchgeführt und wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) berichtet.

Gefrorene Fläschchen mit dem M. bovis-BCG-Pasteur-Stamm (BCG) und seinem isogenen Derivat BCGΔBCG1419c, dem eine zyklische Di-GMP-Phosphodiesterase fehlt, die durch das Gen BCG1419c20 kodiert wird, wurden von der Colorado State University (Ft. Collins, CO) aus einer früheren Studie erhalten15 , und bei − 80 °C gelagert. Nach dem Auftauen wurde die Bakteriensuspension (1 ml) in 9 ml 7H9-Medium (ergänzt mit OADC, 0,1 % Tween 80) in ein steriles 150 × 25 mm großes Glaskulturröhrchen mit Schraubverschluss überführt; Zur Belüftung und Bewegung der Kultur wurde ein sehr kleiner, kunststoffbeschichteter Magnetrührstab hinzugefügt. Diese Bakterien/7H9-Suspension wurde auf einen Magnetrührer gegeben und 15 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert (während dieser Zeit wurde die minimale Magnetkraft ausgeübt, die zum Rühren des Rührstabs erforderlich war). Nach diesem ersten Zeitraum von 15 Tagen wurden 5 ml der Bakterien/7H9-Suspension in 50 ml synthetisches Proskauer-Beck-Medium (modifiziert nach Youmans und Karlson25, PB: 0,5 % KH2PO4, 0,5 % L-Asparagin-Monohydrat, 0,06 % MgSO4·7H2O) überführt , 0,25 % Magnesiumcitrat, 2 % Glycerin, 0,05 % Tween 80) in eine sterile Glaskulturflasche gegeben und weitere 17 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert (die Kulturen wurden während dieser Zeit sanft bei 30 U/min geschüttelt). Am Ende dieses 17-tägigen Zeitraums wurden BCG und BCGΔBCG1419c aliquotiert und in Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss bei –80 °C schnell eingefroren. Nach 5-tägigem Einfrieren bei –80 °C wurden einzelne Aliquots von BCG und BCGΔBCG1419c aufgetaut und Reihenverdünnungen auf 7H10 (ergänzt mit OADC, 0,1 % l-Asparagin) und TCA (zum Testen auf Kontamination) ausplattiert. Koloniezählungen zeigten, dass sowohl BCG- als auch BCGΔBCG1419c-Aliquots bei 5 × 104/ml lagen; TCA-Platten zeigten kein Wachstum (dh weder BCG noch BCGΔBCG1419c enthielten Verunreinigungen).

C57BL/6-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erworben; IL10-Reportermäuse (C57BL/6-Hintergrund) wurden großzügigerweise von Dr. Weiguo Cui (Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, Milwaukee WI) zur Verfügung gestellt26. Alle Mäuse wurden im University Laboratory Animal Resources (ULAR) der Ohio State University (OSU) gehalten und nach Belieben mit sterilem Wasser und Wasser versorgt. Alle Methoden und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den vom OSU Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen und Verfahren durchgeführt.

Am Tag der Immunisierung (Tag 0) wurden Aliquots von BCG und BCGΔBCG1419c aufgetaut und direkt in Tuberkulinspritzen geladen. Mäuse wurden subkutan (sc) im Nacken mit 1 × 104 KBE entweder BCG oder BCGΔBCG1419c (dh 200 µL eines 5 × 104 KBE/ml-Aliquots) immunisiert. Am 14. Tag nach der Immunisierung wurden die Halslymphknoten und die Milz von eingeschläferten IL10-Reportermäusen entnommen und für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. Am 18. Tag nach der Immunisierung wurden Blut, Milz und Lunge von eingeschläferten C57BL/6-Mäusen entnommen und für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. Wie in unseren Ergebnissen beschrieben, wurde unsere Analyse von IL10-Reportermäusen vor der von C57BL/6-Mäusen durchgeführt (Tag 14 vs. Tag 18), um zu bestimmen, ob IL10-Expressionsunterschiede den phänotypischen Unterschieden zwischen BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten C57BL/6-Mäusen vorausgehen.

Milz- und Lymphknotengewebe wurden mit dem Kolbenteil einer 1-ml-Spritze vorsichtig durch ein Maschensieb gedrückt. Die Lungen wurden nach der Kollagenase/DNase-Behandlung auf ähnliche Weise verarbeitet. Die resultierenden Zellsuspensionen wurden in ein 15-ml-Röhrchen überführt, indem sie durch einen 100-Mikron-Filter unter Verwendung von eiskaltem R10-Medium (RPMI 1640 von Gibco® Thermo Fisher, 10 % FBS, 2 mM l-Glutamin, 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin). Die Röhrchen wurden 7 Minuten lang bei 4 °C und 250 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit R10-Medium resuspendiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde das Zellpellet erneut gewaschen und mit 1 ml RBC-Lysepuffer bei Raumtemperatur inkubiert. Die RBC-Lysereaktion wurde nach 10 Minuten mit 1 ml R10-Medium gestoppt und 7 Minuten lang bei 4 °C und 250 × g zentrifugiert.

Frisch isolierte Zellen aus Milz-, Lungen- und Blutgewebe wurden in vorgewärmtes R10-Medium überführt und gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 1–2 Millionen Zellen pro ml in R10-Medium resuspendiert und in FACs-Röhrchen mit PMA/Ionomycin (Endkonzentration 2 μg/ml) in Gegenwart von GolgiPlug bei einer Endkonzentration von 10 μg/ml stimuliert; (BD Biosciences, San Jose, Kalifornien) für 12 Stunden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Am Ende der Inkubation wurde ein intrazelluläres Färbeverfahren durchgeführt. Folgende monoklonale Antikörper wurden verwendet: FITC anti-CD3 (Klon 17A2), Alexa Fluor 532 anti-CD4 (Klon RM4-5), PE anti-CD127 (Klon SB/199), PE-eFluor 610 anti-PD1 (Klon J43). ), PE-Cy5 Anti-CD11b (Klon M1/70), PerCP-Cy5.5 Anti-CD44 (Klon IM7), PerCP-eFluor 710 Anti-CXCR5 (Klon SPRCL5), PE-Cy7 Anti-CD117 (Klon 2B8) , Alexa Fluor 647 Anti-CRTH2 (Klon No3m1scz), Alexa Fluor 700 Anti-TNFα (Klon MP6-XT22), Brilliant Violet 421 Anti-CD45 (Klon 30-F11), Super Bright 436 Anti-CD62L (Klon MEL-14) , eFluor 450 Anti-Granzyme b (Klon NGZB), BD Horizon BV480 Anti-IFNγ (Klon XMG1.2), Brilliant Violet 570 Anti-CD8 (Klon 53-6.7), Brilliant Violet 605 Anti-IL17 (Klon TC11-18H10). 1), Brilliant Violet 650 Anti-Gr1 (Klon RB6-8C5), Brilliant Violet 711 Anti-CD19 (Klon 6D5), Brilliant Violet 750 Anti-CD27 (Klon LG.3A10), Brilliant Violet 785 Anti-NK1.1 (Klon PK136). Die Proben wurden mit Fixability Viability Dye (Aqua Live/Dead-Färbung) gefärbt und 15 Minuten lang inkubiert. Dann wurden die Zellen gewaschen und anschließend ein Oberflächenantikörpercocktail hinzugefügt. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen gewaschen und mit Fixierungspuffer (Kat.-Nr.: 420801 Biolegend) 20 Minuten lang fixiert und mit 1 × intrazellulärem Staining Permeabilization Wash Buffer (Kat.-Nr.: 421002 Biolegend) permeabilisiert. Empfohlene Mengen direkt konjugierter Primärantikörper zum Nachweis intrazellulärer Antigene wurden zugegeben und 25 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Alle Waschschritte wurden 6 Minuten lang bei 700 g und 4 °C durchgeführt. Alle Antikörper wurden zuvor titriert, um die optimale Konzentration zu ermitteln. Schließlich wurden nach dem Waschen und Filtern der Zellen durch FAC-Röhrchen mit Siebdeckel Proben mit einem Cytek Aurora- oder FACS Canto-Durchflusszytometer entnommen und mit FlowJo Version 10.6.1 (Becton Dickinson, Ashland, OR) analysiert.

Die Abbildungen wurden mit GraphPad Prism, Version 7, erstellt. Für statistische Analysen wurde die mitgelieferte Software verwendet. Die Balken in den Abbildungen zeigen Mittelwerte plus Standardabweichungen (SD). Die zwischen den Datenpunkten angezeigten Zahlen stellen p-Werte für die in den Abbildungen angegebenen Vergleiche dar. Vor der Durchführung statistischer Vergleiche wurde der Shapiro-Wilk-Test verwendet, um festzustellen, ob die Datenverteilung normal war. Statistische Vergleiche mit mehr als zwei Versuchsgruppen erfolgten mithilfe der Varianzanalyse (ANOVA). Alle anderen statistischen Vergleiche verwendeten den Student-t-Test. Die in jeder Abbildung gezeigten Daten sind repräsentativ für drei separate Experimente mit mindestens drei Mäusen pro Versuchsgruppe (PBS, BCG, BCGΔBCG1419c).

Um die frühen angeborenen und adaptiven Immunpopulationen zu identifizieren, die auf BCG reagieren, und um herauszufinden, welche Auswirkung die Deletion von BCG1419c auf diese Reaktionen hat, haben wir C57BL/6-Mäuse mit 104 KBE lebendem BCG Pasteur und seinem isogenen Derivat BCGΔBCG1419c immunisiert (Abb . 1A). Als Negativkontrollen dienten Mäuse, die nur mit PBS immunisiert wurden. Am 18. Tag nach der Immunisierung wurden mehrere Gewebe (Blut, Milz und Lunge) gesammelt, zu Einzelzellsuspensionen verarbeitet und mittels mehrdimensionaler Durchflusszytometrie analysiert, um phänotypische und funktionelle Unterschiede zwischen Untergruppen des angeborenen und adaptiven Immunsystems zu identifizieren (Abb. 1B).

Überblick über das Experiment. (A) Impfplan und (B) Gating-Strategie zur Identifizierung angeborener und adaptiver Untergruppen.

Um umfassend zu beurteilen, ob die Deletion von BCG1419c die BCG-induzierte Immunlandschaft bei Mäusen verändert, wurde ein 27-Farben-Durchflusszytometrie-Panel zur Charakterisierung der pulmonalen und systemischen Immunpopulationen entwickelt. Wir verwendeten konventionelle Durchflusszytometrie und t-verteilte stochastische Einbettung (tSNE)-Dimensionalitätsreduktionsdiagramme von CD45+-Zellen aus Milz, Lunge und Blut, was die Identifizierung von 19 Immunzellpopulationen ermöglichte (Abb. 2). Der Clustering-Algorithmus ermöglichte die automatische Definition von 8 Metaclustern des angeborenen Immunsystems, bei denen keine CD3- und CD19-Expression vorlag (Abb. 2A), und 11 Metaclustern des adaptiven Immunsystems, bei denen CD3- und CD19-Expression vorhanden war (Abb. 2B; dieselben tSNE-Diagramme wie in Abb . 2A, jedoch mit T- und B-Zell-Overlay). Unterschiede zwischen Lungen-, Milz- und Blutclusterverteilungen können durch Vergleich der oberen, mittleren und unteren Reihen von Abb. 2A, B sowie zwischen PBS-Kontroll-, BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen beobachtet werden (vergleiche linke, mittlere und rechte Spalte von Abb . 2). Im Hinblick auf angeborene Abstammungslinien beobachteten wir eine Verringerung der NK-Zellen-Repräsentation unter CD45+-Zellen in der Milz von BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen im Vergleich zu PBS-Kontrollen (Abb. 2A oberes Feld, rote Datenpunkte) sowie in der Lunge (Abb. 2A mittleres Feld) und Blut (Abb. 2A unteres Feld). Umgekehrt war die Repräsentation von Monozyten unter CD45+ im Blut nach BCG- und BCGΔBCG1419c-Immunisierung im Vergleich zu PBS-Kontrollen erhöht (Abb. 2A unteres Feld, hellblaue Datenpunkte). Im Hinblick auf adaptive Abstammungslinien ergab die tSNE-Analyse außerdem eine Erhöhung der B-Zellcluster in der Milz sowie erhöhte CD4+- und CD8+-T-Zellcluster in der Lunge der mit BCG oder BCGΔBCG1419c immunisierten Gruppe (Abb. 2B).

Diagrammbasiertes Clustering von PBS-, BCG- und BCGΔBCG1419c-induzierten Immunpopulationen, visualisiert durch T-verteiltes Stochastic Neighbor Embedding (tSNE). Repräsentative tSNE-Karten von CD45+-Zellen im (A) Blut, (B) Milz und (C) Lungen von Kontrollmäusen, BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. In jedem t-SNE-Diagramm sind die Cluster farblich gekennzeichnet und ihnen wird eine Abstammungsidentifikation zugewiesen, die auf den in Abb. 1B definierten Markern basiert.

Während die tSNE-Analyse eine Datenvisualisierung auf hohem Niveau ermöglicht, verwendeten wir die traditionelle Durchflusszytometrieanalyse, um die angeborenen und adaptiven Populationen, die von BCG und BCGΔBCG1419c unterschiedlich betroffen waren, genauer und quantitativ zu untersuchen. Da die tSNE-Analyse zeigte, dass die pulmonalen und systemischen Reaktionen auf die Impfung unterschiedlich waren, gab es Unterschiede zwischen Milz (linke Felder in Abb. 3, 4, 5, 6), Lunge (mittlere Felder in Abb. 3, 4, 5, 6) und Blut ( (rechte Tafeln der Abb. 3, 4, 5, 6) wurden separat betrachtet.

Häufigkeiten von Untergruppen des angeborenen Immunsystems bei BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. Die Frequenzen der Untergruppen des angeborenen Immunsystems (d. h. ILC, NK-Zellen, Monozyten und Gr1-Zellen) in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen sowie PBS-Kontrollen wurden am 18. Tag nach der Immunisierung in Milz, Lunge und Blut gemessen Häufigkeiten von (A) ILC3s, (B) ILC1s, (C) NK-Zellen, (D) Monozyten und (E) Gr1-Zellen in der Milz (linke Spalte), der Lunge (mittlere Spalte) und dem Blut (rechte Spalte), wie kontrolliert aus lebenden einzelnen CD45+-Zellen. ILCs wurden von CD3-CD19-CD127+ abgetrennt und verschiedene Untergruppen wurden entsprechend der Expression von CRTH2 vs. cKit bestimmt: ILC1, CRTH2-cKit-; ILC2, CRTH2+cKit+/−; ILC3, CRTH-cKit+. Die Kästchen stellen Daten von 3 Mäusen pro Gruppe dar; Sternchen stellen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den angegebenen Zeilen dar (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Adaptive Immununtergruppenhäufigkeiten bei BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. Die Häufigkeiten adaptiver Immununtergruppen (d. h. T- und B-Zellen) in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen sowie PBS-Kontrollen wurden am 18. Tag nach der Immunisierung in Milz, Lunge und Blut gemessen. Gezeigt sind die Häufigkeiten von (A) CD4+ T-Zellen, (B) CD8+ T-Zellen und (C) B-Zellen in der Milz (linke Spalte), der Lunge (mittlere Spalte) und dem Blut (rechte Spalte), entnommen aus lebenden einzelnen CD45+-Zellen. Die Kästchen stellen Daten von 3 Mäusen pro Gruppe dar; Sternchen stellen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den angegebenen Zeilen dar (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Häufigkeiten von CD4+-T-Zell-Untergruppen in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. Die Häufigkeit von CD4-T-Zellen (TH)-Untergruppen in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen sowie PBS-Kontrollen wurde in Milz, Lunge und Blut gemessen, basierend auf ihrer Expression von CD62L, CD44, PD1 und CXCR5 (naiv, CD62LHICD44LO; Effektor, CD62LLOCD44HI; Gedächtnis, CD62LHICD44HI; erschöpft, PD1+; follikulär, CXCR5+PD1+). Dargestellt sind die Häufigkeiten von (A) naiven TH-Zellen, (B) Effektor-TH-Zellen, (C) Gedächtnis-TH-Zellen, (D) erschöpften TH-Zellen und (E) follikulären TH-Zellen in der Milz (linke Spalte), der Lunge ( mittlere Spalte) und Blut (rechte Spalte), entnommen aus lebenden einzelnen CD45+-Zellen. Die Kästchen stellen Daten von 3 Mäusen pro Gruppe dar; Sternchen stellen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den angegebenen Zeilen dar (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Häufigkeiten von CD8+-T-Zell-Untergruppen in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. Die Häufigkeit der Untergruppen von CD8-T-Zellen (TC) in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen sowie PBS-Kontrollen wurde in Milz, Lunge und Blut gemessen, basierend auf ihrer Expression von CD62L und CD44 (naiv, CD62LHICD44LO; Effektor, CD62LLOCD44HI; Speicher, CD62LHICD44HI; erschöpft, PD1+). Dargestellt sind die Häufigkeiten von (A) naiven TC-Zellen, (B) Effektor-TC-Zellen, (C) Gedächtnis-TC-Zellen und (D) erschöpften TC-Zellen in Milz (linke Spalte), Lunge (mittlere Spalte) und Blut (rechte Spalte). ), wie aus lebenden einzelnen CD45+-Zellen abgeleitet. Die Kästchen stellen Daten von 3 Mäusen pro Gruppe dar; Sternchen stellen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den angegebenen Zeilen dar (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,005; ***p ≤ 0,0005).

Unter den angeborenen Abstammungslinien (ILC3, ILC1, NK-Zellen, Monozyten und Gr1-Zellen) veränderten sich fast alle als Reaktion auf die BCG- und/oder BCGΔBCG1419c-Immunisierung, wobei das Ausmaß zwischen Milz, Lunge und Blut variierte (Abb. 3). In allen Geweben sanken die NK-Zellfrequenzen nach der BCG- oder BCGΔ1419c-Immunisierung (Abb. 3C), während die ILC1-Frequenzen unverändert blieben (Abb. 3B). Andere Veränderungen waren gewebespezifisch: Während die Häufigkeit von Milz-ILC3s, Monozyten und Gr1-Zellen durch die Immunisierung nicht beeinflusst wurde, war ihre Häufigkeit in der Lunge von mit BCG oder BCGΔBCG1419c immunisierten Tieren verringert (Abb. 3A, D, E). Die einzigen angeborenen Frequenzen, die durch die Immunisierung positiv beeinflusst wurden, waren Blutmonozyten in mit BCGΔBCG1419c immunisierten Tieren (Abb. 3D) und Blut-Gr1-Zellen in mit BCG immunisierten Tieren (Abb. 3E). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die BCG- und BCGΔBCG1419c-Immunisierung jeweils allgemein negative Auswirkungen auf die Häufigkeit angeborener Zellen in Milz und Lunge, jedoch einzigartige Auswirkungen auf die Häufigkeit von Monozyten und Gr1-Zellen im Blut hat.

Herkömmliche αβ-T-Zellen sind für die langfristige Wirksamkeit der BCG-Impfung von entscheidender Bedeutung27,28, und obwohl B-Zellen in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit von BCG entbehrlich angesehen wurden, kann ihr Vorhandensein die T-Zell-Antwort auf Antikörper-unabhängige Weise beeinflussen29,30. Die CD4+- und CD8+-T-Zellfrequenzen in der Lunge stiegen bei mit BCG und BCGΔBCG1419c immunisierten Tieren an, mit entsprechenden Rückgängen in Milz und Blut (wahrscheinlich eine Folge der T-Zell-Umverteilung aus dem Kreislauf) (Abb. 4A, B); Über die Fähigkeit von subkutan verabreichtem BCG, die Anzahl der Lungen-T-Zellen zu erhöhen, wurde bereits berichtet31. Die Reaktion der B-Zellen auf die Immunisierung war ebenfalls gewebespezifisch: Während zwischen den Gruppen keine Unterschiede in der Lunge oder im Blut beobachtet wurden, wurden in der Milz von BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Personen im Vergleich zu PBS-Kontrollen erhöhte B-Zell-Häufigkeiten beobachtet (Abb. 4C). Insgesamt zeigen diese Daten, dass die BCG- und BCGΔBCG1419c-Immunisierung einen ähnlichen Anstieg der Lungen-T-Zell- und Milz-B-Zellfrequenzen verursacht.

Ein wichtiger Bestandteil der BCG-vermittelten Immunität ist die Fähigkeit der T-Zellen zur Gedächtnisentwicklung. Im Gegensatz zu anderen Lungeninfektionsmodellen liegt die BCG-vermittelte Immunität in T-Zellen, die einen naiven, Antigen-unerfahrenen Oberflächenphänotyp aufrechterhalten31. In Abb. dargestellt. 5 bzw. 6 sind die Häufigkeiten von CD4- und CD8-T-Zellen, die einen naiven (CD62LHICD44LO), einen Effektor- (CD62LLOCD44HI) und einen zentralen Gedächtnis- (CD62LHICD44HI) Oberflächenphänotyp aufweisen. Die Häufigkeit follikulärer TH-Zellen (d. h. Tfh-Zellen) wurde ebenfalls untersucht.

Im Vergleich zu PBS-Kontrollen exprimierten höhere Anteile an Lungen-CD4-T-Zellen in mit BCG und BCGΔBCG1419c immunisierten Mäusen entweder einen naiven Oberflächenphänotyp (Abb. 5A) oder einen Gedächtnisoberflächenphänotyp (Abb. 5C) mit entsprechenden Rückgängen in Milz und Blut. BCG und BCGΔBCG1419c lösten beide einen signifikanten Rückgang der Bluteffektor-TH-Zellen (Abb. 5B) und der Milz-Tfh-Frequenzen (Abb. 5E) aus; Interessanterweise hatten BCG und BCGΔBCG1419c jedoch unterschiedliche Auswirkungen auf den Anteil von Lungeneffektor- und erschöpften TH-Zellen: Während nur BCGΔBCG1419c einen signifikanten Rückgang der Lungeneffektor-TH-Zellfrequenzen hervorrief (Abb. 5B), löste nur BCG einen signifikanten Anstieg der erschöpften Lunge aus TH-Zellenfrequenzen (Abb. 5D). Ähnliche Muster wurden im CD8-T-Zell-(TC-)Kompartiment beobachtet: Im Lungenkompartiment lösten BCG und BCGΔBCG1419c beide eine erhöhte Häufigkeit von CD8-T-Zellen mit einem naiven Oberflächenphänotyp (und einer entsprechenden Abnahme in der Milz) sowie eine Abnahme von aus Effektor-CD8-Frequenzen in der Lunge und im Blut (Abb. 6). Insgesamt zeigen diese Daten, dass zwar sowohl BCG als auch BCGΔBCG1419c einen Anstieg des Anteils an T-Zellen hervorrufen, von denen bekannt ist, dass sie das Gedächtnis behalten, BCG-ausgelöste T-Zellen jedoch eher einen erschöpften Phänotyp aufwiesen und BCGΔBCG1419c-ausgelöste T-Zellen weniger wahrscheinlich einen erschöpften Phänotyp aufwiesen Effektor-Phänotyp.

Obwohl es kein allgemein akzeptiertes Zytokin-Korrelat für den durch BCG ausgelösten Schutz gegen M. tuberculosis-Infektionen gibt32, kann die Fähigkeit der Lymphozyten zur IFNγ-, IL17- und TNFα-Sekretion zur Wirksamkeit des BCG-Impfstoffs beitragen33. Um das frühe Zytokinprofil von BCG- und BCGΔBCG1419c-ausgelösten Lymphozyten zu vergleichen, wurden dieselben Zellpräparate, die für die Analyse des Oberflächenphänotyps verwendet wurden (Abb. 2, 3, 4, 5, 6), mit einem polyklonalen Immunogen (PMA/Ionomycin) und anschließend stimuliert Wird für die intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) der Lymphozytenkompartimente NK-Zellen (Abb. 7), CD4-T-Zellen (Abb. 8) und CD8-T-Zellen (Abb. 9) verwendet. Die Ergebnisse für jedes Fach werden unten beschrieben.

NK-Zell-Zytokinproduktion in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. C57BL/6-Mäuse wurden sc mit 104 KBE entweder BCG oder BCGΔBCG1419c oder PBS als Kontrolle immunisiert; 18 Tage später wurden mononukleäre Zellen aus Milz, Lunge und Blut präpariert und nach Stimulation mit PMA/Ionomycin für die intrazelluläre Zytokinfärbung verwendet. Gezeigt werden (A) repräsentative IFNγ-Färbung und (B) repräsentative TNFα-Färbung von unstimulierten und stimulierten mononukleären Zellen, die von NK-Zellen abgetrennt wurden; (C) Gewürzanalyse von einfach positiven (IFNγ+ und TNFα+) und doppelt positiven (IFNγ+TNFα+) NK-Zellen in Milz, Lunge und Blut.

CD4-T-Zell-Zytokinproduktion in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. C57BL/6-Mäuse wurden sc mit 104 KBE entweder BCG oder BCGΔBCG1419c oder PBS als Kontrolle immunisiert; 18 Tage später wurden mononukleäre Zellen aus Milz, Lunge und Blut präpariert und nach Stimulation mit PMA/Ionomycin für die intrazelluläre Zytokinfärbung verwendet. Dargestellt sind (A) repräsentative IFNγ-Färbung, (B) repräsentative TNFα-Färbung und (C) repräsentative IL17-Färbung von unstimulierten und stimulierten mononukleären Zellen, die von CD4-T-Zellen abgeschnitten wurden; (D) Gewürzanalyse von einfach positivem (IFNγ+, TNFα+, IL17+), doppelt positivem (IFNγ+IL17+, IFNγ+TNFα+, IL17+TNFα+) und dreifach positivem (IFNγ+, TNFα+, IL17+) CD4 T Zellen in Milz, Lunge und Blut.

CD8-T-Zell-Zytokinproduktion in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen. C57BL/6-Mäuse wurden sc mit 104 KBE entweder BCG oder BCGΔBCG1419c oder PBS als Kontrolle immunisiert; 18 Tage später wurden mononukleäre Zellen aus Milz, Lunge und Blut präpariert und nach Stimulation mit PMA/Ionomycin für die intrazelluläre Zytokinfärbung verwendet. Gezeigt werden (A) repräsentative IFNγ-Färbung und (B) repräsentative TNFα-Färbung von unstimulierten und stimulierten mononukleären Zellen, die von CD8-T-Zellen abgeschnitten wurden; (C) Gewürzanalyse von einfach positiven (IFNγ+ und TNFα+) und doppelt positiven (IFNγ+TNFα+) CD8 T-Zellen in Milz, Lunge und Blut.

Die NK-Zellfrequenzen nehmen nach der BCG- oder BCGΔBCG1419c-Immunisierung ab (Abb. 3C); Dennoch unterscheidet sich das Zytokinprofil der verbleibenden Zytokine von denen der PBS-Kontrollen, da es zu einer Expansion von IFNγ+TNFα+ NK-Zellen in Milz, Lunge und Blut von BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen kommt (Abb. 7). Mit BCGΔBCG1419c immunisierte Mäuse hatten mehr einzelne IFNγ+-Zellen und BCG-immunisierte Mäuse hatten mehr doppelte IFNγ+TNFα+-Zellen in der Lunge, während BCG einen höheren Anteil an einzelnen IFNγ+-Zellen und BCGΔBCG1419c ein ausgewogeneres Vorhandensein von einzelnem IFNγ+ und einzelnem TNFα induzierte + und doppelte IFNγ+TNFα+-Zellen im Blut.

In Abb. 8A–C sind unsere Gating-Profile zur Identifizierung und Zählung von TH-Zellen dargestellt, die in der Lage sind, IFNγ (Abb. 8A), IL17 (Abb. 8B) und TNFα (Abb. 8C) als Reaktion auf polyklonale Stimulation abzusondern. Basierend auf diesen Durchflusszytometriedaten konnten wir 7 Zytokin-produzierende TH-Zellen unterscheiden: diejenigen, die einfach positiv für ein einzelnes Zytokin waren (d. h. IFNγ+, IL17+ oder TNFα+), doppelt positiv für zwei Zytokine (IFNγ+IL17+, IFNγ+TNFα+, IL17+TNFα+) oder dreifach positiv für alle drei Zytokine (IFNγ+IL17+TNFα+). Der relative Anteil jeder Untergruppe unter den Zytokin produzierenden CD4+ TH-Zellen ist in Abb. 8D für Milz, Lunge und Blut jeder Versuchsgruppe dargestellt. Zu Studienbeginn (d. h. bei PBS-Kontrollmäusen) waren die Zytokin-produzierenden TH-Zellen in allen Geweben hauptsächlich TNFα+, mit gewebespezifischen Unterschieden, bei denen Untergruppen eine sekundäre Häufigkeit aufwiesen (Milz: IFNγ+TNFα+; Lunge und Blut: IFNγ+). . In der Milz erhöhte die BCG-Immunisierung die Repräsentation von IFNγ+IL17+TNFα+-Zellen; Interessanterweise war die Expansion von IFNγ+IL17+TNFα+ bei mit BCGΔBCG1419c immunisierten Tieren nicht so groß und ging mit einer Kontraktion von IFNγ+TNFα+ einher (Abb. 8D, obere Reihe). Eine ähnliche Kontraktion von IFNγ+TNFα+ TH-Zellen wurde im Blut im Vergleich zu BCG-immunisierten Tieren beobachtet (Abb. 8D, untere Reihe). In der Lunge führten BCG und BCGΔBCG1419c in ähnlicher Weise zu einer Expansion von IFNγ+IL17+TNFα+ und IFNγ+TNFα+ sowie einer Kontraktion von IFNγ+. IL17+TNFα+-Zellen traten im Vergleich zu PBS auch in der BCG- und BCGΔBCG1419c-Lunge auf. Insgesamt legt unsere Analyse der TH-Zell-Zytokinprofile nahe, dass die Induktion systemischer IFNγ+IL17+TNFα+- und IFNγ+TNFα+-Populationen bei BCGΔBCG1419c-immunisierten Tieren im Vergleich zu BCG-immunisierten Tieren weniger robust war, in der Lunge jedoch mit BCGΔBCG1419c-immunisierten Tieren Bei Tieren war das Vorkommen von IFNγ+IL17+- und IFNγ+TNFα+-Populationen höher als bei BCG; Allerdings war keiner der oben genannten Trends statistisch signifikant.

In Abb. 9A und B sind unsere Gating-Profile zur Identifizierung und Aufzählung von TC-Zellen dargestellt, die in der Lage sind, IFNγ (Abb. 9A) und TNFα (Abb. 9B) als Reaktion auf polyklonale Stimulation abzusondern. Im Gegensatz zu CD4-T-Zellen wurden keine IL17-exprimierenden CD8-T-Zellen nachgewiesen. In den PBS-Kontrollen waren die Zytokin-produzierenden CD8-T-Zellen in der Milz hauptsächlich TNFα+ und sekundär IFNγ+; Als Reaktion auf die BCG- und BCGΔBCG1419c-Immunisierung nahm der Anteil der CD8-T-Zellen, die TNFα+ waren, neben IFNγ+TNFα weiter zu, auf Kosten der IFNγ+CD8-T-Zellen. Ähnliche Expansionen von TNFα+- und IFNγ+-TNFα+-Zellen (und begleitende Kontraktionen von IFNγ+-CD8-T-Zellen) wurden in der Lunge und im Blut von mit BCG und BCGΔBCG1419c immunisierten Tieren beobachtet. Ähnlich wie wir es bei NK-Zellen beobachteten, hatten mit BCGΔBCG1419c immunisierte Mäuse mehr einzelne IFNγ+-Zellen und mit BCG immunisierte Mäuse mehr doppelte IFNγ+TNFα+-Zellen in der Lunge; Wie bei TH-Zellen war jedoch keiner der oben genannten Unterschiede zwischen BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Tieren statistisch signifikant.

IL10 unterdrückt die TH1/TH17-Differenzierung nach einer BCG-Immunisierung34. Am 18. Tag nach der Immunisierung tendierte BCGΔBCG1419c tendenziell (wenn auch unbedeutend) dazu, weniger IFNγ- und IL17-produzierende TH-Zellen hervorzurufen (Abb. 8D) sowie eine stärkere Abkehr vom eher proinflammatorischen „Effektor“-TH-Phänotyp (Abb. 5B); Daher haben wir vorhergesagt, dass mit BCGΔBCG1419c immunisierte Mäuse – im Vergleich zu BCG-immunisierten Mäusen – vor dem 18. Tag eine höhere Häufigkeit systemischer IL10-produzierender Zellen aufweisen würden. Um diese Vorhersage zu testen, immunisierten wir transgene VertX-Mäuse, die gleichzeitig Thy1.1 auf der Oberfläche exprimieren IL10-Expression26, die die Identifizierung von IL10-produzierenden Zellen durch Durchflusszytometrie-Färbung mit Anti-Thy1.1 ermöglicht (Abb. 10A). VertX-Mäuse wurden mit BCG oder BCGΔBCG1419c auf die gleiche Weise immunisiert wie bei C57BL/6-Mäusen; Die Milz wurde 14 Tage nach der Immunisierung entfernt. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Abb. 10 dargestellt und zeigen, dass BCGΔBCG1419c höhere Häufigkeiten von IL10+-Zellen in der Milz hervorruft (Abb. 10B) und dass ein größerer Anteil dieser IL10+-Zellen CD4+-T-Zellen und CD8+-T-Zellen waren (Abb. 10C). Insgesamt zeigen diese Daten, dass BCGΔBCG1419c eine höhere Häufigkeit von IL10-produzierenden T-Zellen hervorruft, was möglicherweise für eine geringere Entzündungsreaktion von BCGΔBCG1419c-immunisierten Tieren im Vergleich zu Wildtyp-BCG-immunisierten Tieren verantwortlich ist.

Die BCGΔBCG1419c-Immunisierung führt zu einer höheren Häufigkeit von IL10-produzierenden T-Zellen. IL10-Reportermäuse wurden sc mit 104 KBE BCG oder BCGΔBCG1419c immunisiert; 14 Tage später wurden die Splenozyten jeder Gruppe auf Thy1.1 (den Transgenreporter der IL10-Produktion) und die T-Zellmarker CD4 und CD8 gefärbt. Gezeigt werden (A) repräsentative Seitenstreuung (SSC) und Thy1.1-Färbung von BCG-immunisierten Mäusen, (B) die Häufigkeit von IL10+-Splenozyten in BCG- und BCGΔBCG1419c-immunisierten Mäusen (Mittelwert + SD; 3 Mäuse pro Gruppe) und (C) der relative Anteil der IL10+-Zellen, die CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen oder Nicht-T-Zellen sind. Sternchen stellen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den angegebenen Vergleichen (*p ≤ 0,05) dar.

BCG wurde in den frühen 1900er Jahren von Calmette und Guerin als Tuberkulose-Impfstoff entwickelt, nachdem M. bovis elf Jahre lang (ca. 230 Passagen) auf mit Galle aufgenommenen Kartoffelscheiben seriell passiert wurde35. Im Vergleich zu M. bovis war der resultierende Stamm (dh BCG) bei mehreren Tierarten avirulent und konnte keine Tuberkulose verursachen. Wir wissen jetzt, dass diese Abschwächung teilweise auf den Verlust von drei genomischen Differenzregionen (RD1, RD2 und RD3) zurückzuführen ist, die eine Reihe von Virulenzfaktoren (z. B. ESX) kodieren36. Trotz mehrerer Starts und Stopps aufgrund von Sicherheitsbedenken kamen in einer Reihe von Ländern (Großbritannien, USA, Indien) Versuche mit menschlichem BCG voran und kamen zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen hinsichtlich der Schutzwirkung, die je nach Studie zwischen 0 und 80 % liegt37. Die immer noch umstrittenen Gründe für die unterschiedliche Wirksamkeit von BCG in verschiedenen Ländern und Bevölkerungsgruppen umfassen unterschiedliche Zubereitungsmethoden, genetische Drift im Laufe der Zeit und Mykobakterien in der Umwelt, die ihrerseits einen gewissen Schutz gegen Tuberkulose bieten und somit jegliche Wirkung von BCG maskieren38. Unabhängig von den Gründen besteht nahezu allgemeine Einigkeit darüber, dass trotz des Erfolgs von BCG ein Tuberkuloseimpfstoff mit besserer Wirksamkeit erforderlich ist, um die WHO-Richtwerte für die Reduzierung der Tuberkuloseprävalenz zu erfüllen5. Man geht davon aus, dass schätzungsweise 2 Milliarden Menschen eine latente Infektion mit M. tuberculosis (LTBI) haben, was zum Teil auf die fehlende volle Wirksamkeit des aktuellen BCG zurückzuführen ist. Schätzungen zufolge werden bis zum Jahr 2050 in China, einem der Länder mit der höchsten Zahl an Tuberkulosefällen (einschließlich MDR-TB), bis zu 75 % der neuen Tuberkulosefälle auf eine Reaktivierung durch LTBI und nicht auf Neuinfektionen zurückzuführen sein. 39. Tatsächlich deutete ein Modell, das Daten aus China, Südafrika und Indien umfasst, darauf hin, dass Impfstoffe zur Vorbeugung von Krankheiten in mit M. tuberculosis infizierten Populationen bis 2050 die größte Wirkung haben würden (10 Jahre, 70 % Wirksamkeit gegen Krankheiten, Reduzierung der Inzidenzrate). 51 %, 52 % bzw. 54 % in China, Südafrika und Indien)40.

Wie viele Mykobakterienarten ist BCG in der Lage, Biofilme zu bilden, die sich auf das In-vitro-Verhalten und die In-vivo-Persistenz auswirken. Biofilme umfassen eine Gemeinschaft von Bakterien, die von einer extrazellulären Matrix umgeben sind, die von den einzelnen Arten produziert wird. Sie sind im Allgemeinen resistenter gegen Umweltstress und ermöglichen die Persistenz in Umweltreservoirs und Biomaterialien41. In vitro manifestiert sich die Bildung von Mykobakterien-Biofilmen als Häutchen an der Medien-Luft-Grenzfläche42,43, die in BCG einem definierten genetischen Programm folgen44. Häutchen weisen im Vergleich zu Planktonbakterien ein verändertes Transkriptionsprofil auf und sind mit antibiotikaresistenten Zellen oder Persistern angereichert45,46,47. Der In-vivo-Beitrag der Bildung von Mykobakterien-Biofilmen zur Lungenerkrankung ist oft Gegenstand von Debatten, da ihr Vorhandensein bei der histopathologischen Untersuchung infizierter Lungen (z. B. durch säurebeständige Färbung) nicht offensichtlich ist und die Mykobakterien-Pathogenese das intrazelluläre Überleben in alveolären Phagozyten beinhaltet (at). (zumindest in frühen Krankheitsphasen) und nicht das extrazelluläre Überleben auf Atemwegsoberflächen, was eher typisch für Pseudomonas aeruginosa und andere kanonische Biofilm-bildende Krankheitserreger ist. Allerdings weisen Mykobakterien, denen es an der Biofilmbildung mangelt – entweder aufgrund genetischer Manipulation oder natürlicher Variation –, im Allgemeinen eine abgeschwächte Virulenz auf und lösen in In-vivo-Infektionsmodellen unterschiedliche Entzündungsreaktionen aus42,48. Unser Verständnis des Zusammenhangs zwischen Biofilmbildung und mykobakterieller Pathogenese ist daher noch lange nicht vollständig.

Der Stamm BCGΔBCG1419c wurde teilweise erzeugt, um den Zusammenhang zwischen der Fähigkeit von BCG, Biofilme zu bilden, und seiner Impfstoffwirksamkeit zu testen20. Das BCG1419c-Gen kodiert für eine zyklische Di-GMP-Phosphodiesterase (PDE), die normalerweise die Funktion hat, Bis-(3′-5′)-zyklisches dimeres GMP (c-di-GMP) zu hydrolysieren, einen zweiten Botenstoff, der die Biofilmphase des Bakterienwachstums fördert49 . In Abwesenheit von BCG1419c weist die Deletionsmutante BCGΔBCG1419c bei Verwendung zur intravenösen Infektion von BALB/c-Mäusen eine veränderte Koloniemorphologie, eine höhere Biofilmproduktion und ein längeres Überleben in Lunge und Milz immunkompetenter Mäuse im Vergleich zu parentalem BCG oder komplementierten Mutanten20 auf. Im Vergleich zu BCG-immunisierten Kontrollpersonen und 6 Monate nach der MTB-Exposition weisen die mit BCGΔBCG1419c immunisierten Personen ebenfalls deutlich verringerte histopathologische Lungenwerte sowie verringerte IL6- und TNFα-Proteinspiegel in der Lunge auf15. Da IL-6 und TNF-α bei chronischen Erkrankungen zur Lungenpathologie beitragen können, deuten diese Daten darauf hin, dass die BCG1419c-abhängige Hydrolyse von c-di-GMP die langfristige TB-Reaktion geimpfter Tiere beeinflusst. Wichtig ist, dass der bakterielle Second Messenger c-di-GMP ein Ligand für den Stimulator von Interferon (IFN)-Genen (STING)-Signalweg über die Kaskade Tank-bindende Kinase-1 (TBK1)-Interferon-Regulierungsfaktor 3 (IRF3) ist führt zur Produktion von Typ-I-IFN- und NF-κB-vermittelten Zytokinen50,51. Diese STING-Agonisten haben eine potenzielle Verwendung als neuartige Impfstoffadjuvanzien gezeigt, was durch ihre immunstimulierenden Eigenschaften aufgrund ihrer Fähigkeit, antigenspezifische T-Zell- und humorale Reaktionen zu verstärken, belegt wird52,53. Aufgrund der Deletion des c-di-GMP-Phosphodiesterase-kodierenden Gens BCG1419c54,55 erwarten wir, dass der BCGΔBCG1419c-Impfstoffkandidat mehr c-di-GMP produziert und somit die Typ-I-IFN-Reaktion moduliert, um möglicherweise seine Wirksamkeit gegen Tuberkulose zu erhöhen. Darüber hinaus verfügt BCGΔBCG1419c im Vergleich zu BCG der Eltern über ein verändertes proteomisches Repertoire, einschließlich Veränderungen in zellulären und sezernierten antigenen Proteinen54, die auch zu einer unterschiedlichen Immunantwort führen könnten, die sich letztendlich positiv auf den Schutz vor Lungentuberkulose auswirkt.

Angesichts der Tatsache, dass mit BCGΔBCG1419c immunisierte Mäuse nach der Tuberkulose-Provokation weniger Lungenpathologien aufweisen, was auf eine Verbesserung zur Krankheitsprävention hindeutet, haben wir die obige Studie durchgeführt, um festzustellen, ob es frühe immunologische Ereignisse gibt, die mit den langfristigen Auswirkungen zusammenfallen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es zwar viele Ähnlichkeiten in der frühen angeborenen und adaptiven Reaktion auf BCG und BCGΔBCG1419c gibt, es aber auch bemerkenswerte Unterschiede in den angeborenen und adaptiven Kompartimenten gibt. Während bei den angeborenen Abstammungslinien sowohl BCG als auch BCGΔBCG1419c in allen untersuchten Geweben eine starke Verringerung der NK-Zellfrequenz hervorriefen (Abb. 3C), löste nur BCGΔBCG1419c einen signifikanten Anstieg der zirkulierenden Monozyten (Abb. 3D) und eine Verringerung der Lungen-Gr1-Zellen (Abb. 3E) aus. . Unter den adaptiven Abstammungslinien lösten sowohl BCG als auch BCGΔBCG1419c einen signifikanten Anstieg der Häufigkeit von CD4+-T-Zellen in der Lunge aus (Abb. 4A). Die durch BCG induzierten wiesen im Vergleich zu den durch BCGΔBCG1419c induzierten Linien eher einen erschöpften Phänotyp auf (Abb. 5D). BCGΔBCG1419c-induzierte CD4-T-Zellen zeigten auch weniger wahrscheinlich einen proinflammatorischen Effektor-Phänotyp (Abb. 5B). Wichtig ist, dass die durch BCGΔBCG1419c ausgelöste CD4- und CD8-T-Zellantwort auch eher IL10-produzierende Zellen enthielt (Abb. 10C), was der weniger entzündlichen Natur von BCGΔBCG1419c in chronischen TB-Stadien zugrunde liegen könnte, da IL10 durch Antigenpräsentation und Retention unterdrückt von mykobakteriellen Peptid:MHC-II-Komplexen in endosomalen Fraktionen (von der Zelloberfläche entfernt)56 und/oder negative Regulierung der kostimulatorischen Molekülexpression57,58. Wir haben gezeigt, dass BCGΔBCG1419c in Biofilmkulturen im Vergleich zu BCG14 der Eltern weniger DnaK, HbhA, PstS2, 35KDa-Antigen und AcpM (ein an der Mykolsäuresynthese beteiligtes Protein) produzierte, was möglicherweise zu seiner weniger entzündlichen Natur beiträgt. Es muss noch geklärt werden, ob sich die durch BCGΔBCG1419c hervorgerufene Immunantwort von der durch BCG hervorgerufenen unterscheidet, entweder aufgrund einer längeren Antigenpräsentation oder veränderter Lipidprofile, die zur Immunogenität der Mykobakterien beitragen59.

Wie bei jeder bakterienbedingten Entzündungsreaktion muss der BCG-immunisierte Wirt die Entwicklung einer robusten Immunität mit der Möglichkeit schädlicher, unspezifischer Auswirkungen einer übermäßigen Zytokinproduktion in Einklang bringen. Hier haben wir das Mausmodell verwendet, um zu zeigen, dass die frühen immunologischen Ereignisse im Zusammenhang mit der BCGΔBCG1419c-Immunisierung im Vergleich zu BCG weniger entzündlich sind. Dies ist wichtig, da die Wirksamkeit von BCGΔBCG1419c bei der Kontrolle der M. tuberculosis-Replikation in der Lunge der von BCG vergleichbar oder überlegen ist und bei Mäusen einen größeren Schutz gegen TB-assoziierte Immunpathologie bietet. Angesichts der Reaktogenität von BCG bei immunisierten Personen, die sich häufig in Fieber, Kopfschmerzen und geschwollenen Lymphknoten äußert, könnte sich das einzigartige immunologische Profil von BCGΔBCG1419c in Tuberkulose-Endemieregionen als wichtig erweisen, in denen Eltern kleiner Kinder unabhängig von der Wirksamkeit des Impfstoffs zunehmend zurückhaltend gegenüber der Verabreichung eines Impfstoffs gegen entzündliche Erkrankungen sind9 ,10,11,12.

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Diese Arbeit wurde von der Ohio State University (OSU), den National Institutes of Health (R01 AI134972 an KJO; K22 AI127072 an NPML; R01 AI121212 an RTR) unterstützt und CONACYT Grant 86396 (an MAFV und MJAS) ermöglichte den Bau des BCGΔBCG1419c Beanspruchung.

Abteilung für mikrobielle Infektion und Immunität, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Manuja Gunasena, Rajni Kant Shukla, Naiquan Yao, Oscar Rosas Mejia, Michael D. Powell, Kenneth J. Oestreich, Namal PM Liyanage und Richard T. Robinson

Landwirtschaftliche Universität Jilin, Changchun, Jilin, China

Naiquan Yao

Medizinische und pharmazeutische Biotechnologie, Zentrum für Forschung und Unterstützung in Technologie und Design des Bundesstaates Jalisco, Av. Normalistas 800, Col. Colinas de la Normal, 44270, Guadalajara, Mexiko

Michel de Jesus Aceves-Sanchez und Mario Alberto Flores-Valdez

Abteilung für Veterinärbiowissenschaften, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Namal Premierminister Liyanage

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Alle Autoren waren an der Durchführung, Analyse und Beschreibung der Experimente, des Manuskripts und der zugehörigen Abbildungen beteiligt.

Korrespondenz mit Mario Alberto Flores-Valdez, Namal PM Liyanage oder Richard T. Robinson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gunasena, M., Shukla, RK, Yao, N. et al. Bewertung früher angeborener und adaptiver Immunantworten auf den Tuberkulose-Impfstoff Mycobacterium bovis BCG und den Impfstoffkandidaten BCGΔBCG1419c. Sci Rep 12, 12377 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14935-y

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Eingegangen: 29. Oktober 2021

Angenommen: 03. Mai 2022

Veröffentlicht: 20. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14935-y

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