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Oct 26, 2023

Identifizierung von Vorfahren und SARS

Naturband 588, Seiten

Nature Band 588, Seiten 670–675 (2020)Diesen Artikel zitieren

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Die distale Lunge enthält terminale Bronchiolen und Alveolen, die den Gasaustausch erleichtern. Dreidimensionale In-vitro-Kultursysteme für die menschliche distale Lunge würden die Untersuchung von Pathologien wie interstitieller Lungenerkrankung, Krebs und der durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursachten Lungenentzündung durch die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) erheblich erleichtern. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines langfristigen Feeder-freien, chemisch definierten Kultursystems für distale Lungenvorläufer als Organoide, die aus einzelnen erwachsenen menschlichen Alveolarepithel-Typ-II- (AT2) oder KRT5+-Basalzellen stammen. AT2-Organoide konnten sich in AT1-Zellen differenzieren, und Basalzell-Organoide entwickelten Lumen, die mit differenzierten Keulen- und Flimmerzellen ausgekleidet waren. Die Einzelzellanalyse von KRT5+-Zellen in Basalorganoiden ergab eine ausgeprägte Population mitotischer ITGA6+ITGB4+-Zellen, deren Nachkommen sich weiter in eine TNFRSF12Ahi-Subfraktion aufspalteten, die etwa zehn Prozent der KRT5+-Basalzellen umfasste. Diese Subpopulation bildete Cluster innerhalb der terminalen Bronchiolen und zeigte eine angereicherte klonogene Organoid-Wachstumsaktivität. Wir haben distale Lungenorganoide mit apikaler Polarität erstellt, um ACE2 auf der freiliegenden Außenfläche zu präsentieren, was die Infektion von AT2- und Basalkulturen mit SARS-CoV-2 erleichtert und Keulenzellen als Zielpopulation identifiziert. Diese langfristige, Feeder-freie Kultur menschlicher distaler Lungenorganoide identifiziert in Verbindung mit der Einzelzellanalyse funktionelle Heterogenität zwischen Basalzellen und erstellt ein einfaches In-vitro-Organoidmodell menschlicher distaler Lungeninfektionen, einschließlich COVID-19-assoziierter Lungenentzündung.

Die distale Lunge erfüllt wesentliche Atemfunktionen, die durch entzündliche, neoplastische oder infektiöse Erkrankungen wie eine COVID-19-Pneumonie beeinträchtigt werden können. Die Untersuchung dieser Erkrankungen würde durch robuste In-vitro-Modelle auf der Basis menschlicher Zellen erleichtert. Die Identität der Stammzellen, die das distale Lungenepithel in vivo über die menschliche Lebensspanne regenerieren, wurde trotz Unterschieden zwischen diesen Spezies aus Studien an Mäusen abgeleitet1. Beim Menschen überspannen basale Stammzellen den gesamten Atemwegsbaum, während bei Mäusen Keulenzellen2 und/oder Sekretoglobin 1A1 (SCGB1A1)-exprimierende Nicht-Keulenzellen3 die distalen Bronchiolen im Laufe des Alterns erneuern. In der Gasaustauschregion erzeugen Maus-Alveolarepithelzellen vom Typ II (AT2) während der Homöostase AT1- und AT2-Zellen4,5, und als Reaktion auf schwere Verletzungen werden zusätzliche Vorläuferzellen rekrutiert3,6,7,8,9. Das Vorhandensein und/oder die Rolle fakultativer Vorläufer in der menschlichen Lunge sind unbekannt. Menschliche AT2-Zellen können in AT1-Zellen differenziert werden, aber diese Kulturen sind kurzlebig und zeigen keine langfristige Selbsterneuerung oder ermöglichen keine Expansion zur Krankheitsmodellierung4,10,11; Darüber hinaus erschweren ihre Anforderungen an Feeder-Zellen die Definition spezifischer Nischenkomponenten12,13. Wir haben eine langfristige organoide Kultur der distalen menschlichen Lunge, einschließlich AT2- und Basalstammzellen, etabliert und dieses System zur Validierung funktioneller Vorläuferzellen und zur Modellierung einer SARS-CoV-2-Infektion verwendet.

Wir haben empirisch Mediumbedingungen definiert, um die klonale Expansion distaler menschlicher Lungenvorläufer von 136 Personen in der extrazellulären Kollagen/Laminin-Matrix (ECM) zu unterstützen (Abb. 1a, Ergänzungstabelle 1). Zusammen unterstützten EGF und der BMP-Antagonist NOGGIN das Wachstum disaggregierter distaler Lungenzellen oder gereinigter Epithelfraktionen davon (Extended Data Abb. 1a – c). Einzelne Zellen (erweiterte Daten, Abb. 1d – g) expandierten entweder zu zystischen SFTPC + HTII-280 + AT2-Organoiden (Abb. 1b – e) oder zu festen KRT5 + -Organoiden, die den Basalzellmarker KRT5 exprimierten (Abb. 1b, f – h).

A. Organoidkulturen der menschlichen distalen Lunge D14 (Tag 14) enthalten zystische und feste Organoide. Unten links, Hellfeld; rechts, Hämatoxylin und Eosin (H&E). Maßstabsbalken, 100 μm. b: Whole-mount-Immunfluoreszenz mit Anti-KRT5- (Basalzellen), Anti-SFTPC- (AT2-Zellen) und Anti-SCGB1A1-Antikörpern (Keulenzellen). Maßstabsbalken, 100 μm. c–e, Alveolarorganoide auf D32. c: Zystisches AT2-Organoid. ER; Maßstabsbalken, 25 μm. d, Whole-mount-Immunfluoreszenz für Anti-SFTPC, Anti-HTII-280, Phalloidin (Ph) und DAPI; Maßstabsbalken, 50 μm. e, Anti-KI67- und DAPI-Fluoreszenz eines angrenzenden Abschnitts zu d. f–h, Basale Organoide auf D32. f, H&E; Maßstabsbalken, 50 μm. g, Whole-mount-Immunfluoreszenz für Anti-KRT5 und DAPI; Maßstabsbalken, 100 μm. h, Anti-KI67- und DAPI-Immunfärbung des angrenzenden Abschnitts zu g. i–k, Einzelzell-RNA-Seq der gesamten distalen Lungenorganoide bei D28. i, t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)-Plot von 7.285 einzelnen Zellen, die AT2-, Basal- und Clubpopulationen zeigen. j, Expression von SFTPC (AT2), KRT5 (basal) und SCGB1A1 (club). k, Merkmalsdiagramme für die Expression von SFTPC (AT2), KRT5 (Basal) und SCGB1A1 (Club). l–p, klonogene AT2-Organoidkultur. l, Hellfeldmikroskopie von AT2-Organoiden bei D180; Maßstabsbalken, 200 μm. m, H&E-Färbung aus Kultur wie in l; Maßstabsbalken, 50 μm. n, Transmissionselektronenmikroskopie des AT2-Organoids bei D32. LB, Lamellenkörper; Maßstabsbalken, 5 μm. o, p, Immunfluoreszenz des AT2-Organoids bei D32 (o); Eine Kultur auf Glas für weitere 10 Tage induziert die Differenzierung in AT1-Zellen (p). Immunfluoreszenz für Anti-HTI-56 (AT1) und Anti-HTII-280 (AT2); Maßstabsbalken, 50 μm. q, scRNA-seq-Feature-Plots von 2.780 AT2-Organoidzellen auf D89 der kumulativen Kultur.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) distaler Lungenorganoide bestätigte das Vorhandensein von Populationen von SFTPC+ AT2-Zellen, KRT5+-Basalzellen und SCGB1A1+ Club-Zellen (Abb. 1i, j, Extended Data Abb. 2). Zellen, die KRT5 und SCGB1A1 gemeinsam exprimierten, wurden sowohl in Basal- als auch in Clubzellpopulationen gefunden, was auf einen Übergangszustand hindeutet (Abb. 1j, k, Extended Data Abb. 2), der durch die Ergebnisse der SPADE14- und Monocle15-Trajektorienanalyse (Extended Data) gestützt wurde Abb. 3, Ergänzungstabelle 2).

Wir haben reine AT2-Organoide aus Mischkulturen durch Aufnahme lysosomaler Farbstoffe in Lamellenkörper erzeugt (Extended Data Abb. 4a, b, Supplementary Abb. 1). EPCAM+LysoTracker+ AT2-Zellen expandierten klonal bis zu 180 Tage (Abb. 1l, m, Erweiterte Daten Abb. 4c, d). Chemisch definiertes EGF/NOGGIN-Medium reichte für die klonale Grundproliferation von AT2-Organoiden aus, die durch die Blockierung der globalen endogenen WNT-Biosynthese abgeschwächt wurde (Extended Data Abb. 4e), was mit der Anforderung einer autokrinen WNT-Signalübertragung in Maus-AT2-Zellen 16 übereinstimmt. Das Wachstum wurde durch Zugabe von Fibroblasten-konditioniertem Medium, das Serum und WNT-Agonisten enthielt, verstärkt (Extended Data Abb. 4f). Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte Mikrovilli und Lamellenkörper, die für reife AT2-Zellen charakteristisch sind (Abb. 1n, erweiterte Daten Abb. 4g). AT2-Organoide zeigten eine Hochregulierung der AT1-Marker, wenn sie auf Glas mit Serum kultiviert wurden (Abb. 1o, p).

Einzelzell-RNA-Sequenz gemischter distaler Lungenorganoide oder gereinigter Alveolarorganoide zeigten eine gleichmäßig hohe Expression kanonischer AT2-Zellmarker in Alveolarpopulationen (Abb. 1i – k, q, erweiterte Daten Abb. 2, ergänzende Daten 1). AT2-Zelluntergruppen wurden nicht ohne weiteres beobachtet, und zellzyklusbezogene mRNAs waren nicht in einer bestimmten AT2-Unterpopulation lokalisiert (Abb. 1q, Ergänzungsdaten 1, Ergänzungstabelle 3).

Basalzellorganoide in gemischten distalen Lungenkulturen wuchsen schneller als Alveolarorganoide und bildeten zunächst feste KRT5+-Sphäroide (Abb. 1a, b, f–h). Nach einem Monat Kultur hatten jedoch etwa 50 % der Organoide einzelne oder gelegentlich mehrere Lumen (Abb. 2a, b, erweiterte Daten Abb. 5a–c) mit Keule (SCGB1A1+KRT5–) und Flimmern (AcTUB+KRT5–) entwickelt. ) Zellen, die die Innenfläche auskleiden (Abb. 2a, b). Durch Dichtesedimentation gereinigte Basalkulturen zeigten serielles klonales Wachstum, Abhängigkeit von EGF und NOGGIN sowie Kavitation, die von luminalen SCGB1A1+-Keulen- und AcTUB+-Flimmerzellen ausgekleidet war (Abb. 2c, d, Erweiterte Daten Abb. 5d – h, Zusatzvideos 1, 2). Eine ähnliche Differenzierung trat auf, als Organoide in 2D-Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) übertragen wurden (Abb. 2e).

a, b: Immunfluoreszenz, die die basale Organoiddifferenzierung in Mischkultur zeigt. Lumen sind mit acetylierten Tubulin+ (AcTUB) Flimmerzellen ausgekleidet, die den SARS-CoV-2-Rezeptor ACE2 exprimieren, denen aber KRT5 (a) und SCGB1A1+ Keulenzellen (b) fehlen. Maßstabsbalken, 20 μm. c–e, Sedimentierte basale Organoidkultur. c, Keulenzelldifferenzierung in gereinigten Basalorganoiden nach 38 Tagen in klonogener 3D-Kultur, dargestellt durch Ganzkörperfluoreszenz für Anti-SCGB1A1 (rot), Phalloidin (weiß) und DAPI (blau); Maßstabsbalken, 50 μm. d, Flimmerdifferenzierung von Organoiden wie in c. Konfokales Transmissionsbild; Maßstabsbalken, 20 μm. Weißer Kasten im Einschub, erweitert zum Hauptbild; Pfeilspitzen bezeichnen Zilien. e, Immunfluoreszenz, die AcTUB+-Flimmerzellen und SCGB1A1+-Keulenzellen in einem Organoid zeigt, das in einer 2D-ALI-Kultur replattiert wurde. Maßstabsbalken, 50 μm. f, g, Einzelzell-RNA-Seq von KRT5+-Basalzellen aus Abb. 1i. f, t-SNE-Diagramme, die die Subcluster Basal 1 und Basal 2 zeigen. Basal 1 wird in Basal 1.1 und 1.2 unterteilt, wobei letzteres die proliferativen mRNAs CDK1 und PCNA exprimiert. g, Differenzielle Genexpression in Basal-1- und Basal-2-Subclustern von insgesamt 2.303 Basalzellen. h, Basalmarker-Transkript-t-SNE-Overlays von f (log10-Anzahl eindeutiger molekularer Identifikatoren (UMI)). i, Diagramme der relativen Genexpressionskinetik von f und g über die Pseudozeit-Trajektorie (n = 3.721 Zellen). j, FACS-Isolierung von TNFRSF12Ahi- und TNFRSF12Aneg-Zellen aus gemischten distalen Lungenorganoiden, vorab auf lebenden Singuletts isoliert. k, Hellfeldbild einer Organoidkultur von Zellen aus j bei D14. l, Quantifizierung von k (Anzahl der Organoide pro 1.000 Zellen); ***P < 0,001 (P = 1,0 × 10−4), zweiseitiger Student-t-Test. Die Daten in j, k repräsentieren n = 5 unabhängige Experimente für jede TNFRSF12A-Population.

Quelldaten

Einzelzell-RNA-seq-Clustering von organoiden KRT5+-Basalzellen mehrerer Individuen identifizierte reproduzierbar zwei Populationen: Basal 1 und Basal 2 (Abb. 2f, g, Erweiterte Daten Abb. 6a, Ergänzende Daten 1). Basal 1 umfasste eine aktiv zyklische Subpopulation (Basal 1.2), die mit Proliferationsmarkern (PCNA, CDK1) und zellzyklusbezogenen Prozessen der Genzellanreicherungsanalyse (GSEA) angereichert war (Abb. 2f, g, erweiterte Daten Abb. 6a – c). , Ergänzungstabelle 3). Basal 1, aber nicht Basal 2, exprimierte kanonische Lungenbasalzell-mRNAs wie TP6317, Integrin-α6 (ITGA6) und Integrin-β4 (ITGB4, das einen Bindungspartner von ITGA618 kodiert und Mauslinien-negative epitheliale Vorläufer (LNEPs) markiert). 7 (Abb. 2h). Basal 2 war hinsichtlich der Expression von Genen im Zusammenhang mit dem Vesikeltransport, endoplasmatischen Retikulumprozessen und Plattenepithelmarkern angereichert (Abb. 2g, Ergänzungstabelle 3).

Wir untersuchten das differentiell exprimierte Basal 1-Gen TNFRSF12A (auch bekannt als Fn14, TWEAKR), das einen Membranrezeptor kodiert (Abb. 2g, h, Ergänzungstabelle 4), aufgrund seiner potenziellen Nützlichkeit für die Isolierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). seine Homologie zum intestinalen Stammzellmarker TNFRSF1919. Eine unvoreingenommene Pseudozeitanalyse ergab eine kontinuierliche Einzelzell-Trajektorie, die KRT5+-Basal-1-Zellen mit SCGB1A1+-Clubzellen verbindet, wobei TNFRSF12A-mRNA stark mit dem Proliferationsmarkergen MKI67 assoziiert ist (Abb. 2i, erweiterte Daten, Abb. 3e). Als Basal-1-Zellen, die EPCAM, ITGA6 und ITGB4 koexprimieren, in drei Fraktionen aufgeteilt wurden (die niedrige, mittlere und hohe Mengen an TNFRSF12A-mRNA exprimierten), wurde ein proliferatives Genmodul20 in der höchsten (TNFRSF12Ahi) gegenüber der niedrigsten Fraktion (TNFRSF12Alo) signifikant angereichert ( Erweiterte Daten Abb. 6d–f). Um festzustellen, ob diese Anreicherung das intrinsische Proliferationspotential widerspiegelt, haben wir die gesamten distalen Lungenorganoide durch FACS in EPCAM+ITGA6+ITGB4+ Basal-1-Zellen und dann in TNFRSF12Ahi- und TNFRSF12Aneg-Untergruppen fraktioniert (Abb. 2j). Bei der Kultivierung zeigte die TNFRSF12Ahi-Untergruppe eine 4–12-mal größere Kapazität zur Bildung klonogener Organoide als die TNFRSF12Aneg-Untergruppe (Abb. 2k, l).

Wir untersuchten die Abstammungsbeziehungen zwischen Basal 1 und Basal 2, indem wir dichtesedimentierte KRT5+-Basalorganoide durch FACS in die Populationen EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi (Basal 1) und EPCAM+ITGA6−ITGB4−TNFRSF12Aneg (Basal 2) fraktionierten (Extended Data Abb. 7a). Die klonogene Organoidbildung war in Basal 1 gegenüber Basal 2 von drei verschiedenen Individuen stark angereichert (Extended Data Abb. 7b – d). Die mit Basal 2 angereicherten Gene SPRR1B und TMSB4X (Abb. 2g, Ergänzungstabelle 3) wurden vorübergehend in Basal-1-Zellorganoiden induziert (Extended Data Abb. 7e, f), was darauf hindeutet, dass sich Basal-2-Zellen von Basal-1 unterscheiden könnten.

Das NOTCH-Zielgen HES1 war einer der am unterschiedlichsten exprimierten Loci in Basal-1-Organoiden, zu denen die Gennetzwerke NOTCH1, NOTCH2 und JAG1 umfassten (Abb. 2g, Ergänzungstabelle 3). Die Hemmung von NOTCH erhöhte die basale Organoidproliferation von TNFRSF12AhiEPCAM+ITGA6+ITGB4+-Zellen signifikant (Extended Data Abb. 7g, h), was darauf hindeutet, dass das NOTCH-Signal das Wachstum in diesen Zellen hemmt. Umgekehrt hatte der NOTCH-Agonismus keinen Einfluss auf die Proliferation, induzierte jedoch die Expression von SCGB1A1, ähnlich wie bei Zellen der oberen Atemwege21,22 (Extended Data Abb. 7i).

Die Immunfärbung von menschlichem distalem Lungengewebe zeigte TNFRSF12A+-Basalzellen, die intermittierend an den Spitzen oder Basen der Bronchiolenfurchen angereichert waren (Abb. 3a, Erweiterte Daten Abb. 8a, b); Letztere werden als Becherzellnische erkannt23. Wir fanden TNFRSF12A in verschiedenen Stroma- und Epithelzellen der Lunge, es markierte jedoch eindeutig eine geringe Population von KRT5+- und p63+-Basalzellen (Abb. 3a, Erweiterte Daten Abb. 8a – c). Die TNFRSF12A+-Untergruppe der KRT5+-Basalzellen hatte in vivo einen höheren Mitoseindex als die gesamten KRT5+-Zellen (Abb. 3b, c), was mit den Ergebnissen der organoiden scRNA-seq (Abb. 2i) übereinstimmt. Die FACS-Analyse menschlicher distaler Lungenzellen bestätigte, dass TNFRSF12A in 10,9 % der Basalzellen exprimiert wurde (Extended Data Abb. 8d, oben).

a, links, Anti-KRT5- und Anti-TNFRSF12A-Immunfluoreszenz der menschlichen distalen Lunge. Der gelb umrandete Bereich wird mit (Mitte) und ohne (rechts) DAPI erweitert. Maßstabsbalken, 100 μm. b, Immunfluoreszenz der TNFRSF12A+-Basalzellproliferation im distalen Atemweg, die KRT5, TNFRSF12A, KI67 und DAPI zeigt. Maßstabsbalken, 100 μm. c, Mitoseindex von TNFRSF12A+KRT5+-Zellen aus b; drei unabhängige Experimente. K5+, gesamt KRT5+; K5+T+, TNFRSF12A+KRT5+. Boxplots stellen das erste Quartil, den Median und das dritte Quartil dar; Whiskers zeigen Minimum und Maximum an. **P < 0,01 (P = 4,4 × 10−3), zweiseitiger Student-t-Test. d, Hellfeld- und Anti-KRT5-Immunfluoreszenz von FACS-isolierten TNFRSF12Aneg- und TNFRSF12Ahi-Organoidkulturen bei D14; Maßstabsbalken, 500 μm. e, Quantifizierung von d (Anzahl der Organoide pro 1.000 Zellen); Die Daten repräsentieren n = 5 unabhängige Experimente für jede TNFRSF12A-Population. Boxplots stellen das erste Quartil, den Median und das dritte Quartil dar; Whiskers zeigen Minimum und Maximum an. P = 1,1 × 10−3, zweiseitiger Student-t-Test. f, H&E und Anti-KRT5, Anti-TNFRSF12A, Anti-SCGB1A1 und Anti-AcTUB-Immunfärbung von Organoiden aus der TNFRSF12Ahi-Fraktion von FACS-sortierten EPCAM+ITGA6+ITGB4+ distalen Lungenzellen. Maßstabsbalken, 50 μm. g, H&E und Anti-SCGB1A1- und Anti-AcTUB-Immunfluoreszenz von 2D-ALI-Kulturen aus Basalzellorganoiden aus TNFRSF12Ahi-Basalzellen wie in f. Maßstabsbalken, 50 μm.

Quelldaten

Bei einer prospektiven Kultur direkt aus der menschlichen Lunge ohne ein Organoid-Zwischenprodukt zeigten FACS-isolierte EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi-Zellen (TNFRSF12Ahi Basal 1-Zellen; Extended Data Abb. 8d, unten) einen 15-fachen Anstieg der KRT5+-Organoidbildung im Vergleich zu EPCAM +ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Aneg-Zellen (TNFRSF12neg Basal 1-Zellen; Abb. 3d, e). TNFRSF12Ahi-Basalorganoide differenzierten auch in SCGB1A1+ Club- und AcTUB+ Flimmerzellen in längerer Kultur (Abb. 3f) oder wenn sie als 2D-ALI-Monoschichten gezüchtet wurden (Abb. 3g).

Das Influenzavirus H1N1 infizierte eifrig distale Lungenorganoide, die ebenfalls Influenzarezeptoren exprimierten (Extended Data Abb. 9a–d), ähnlich wie proximale Atemwegsorganoide24,25. Die Infektion von Organoiden mit Influenza H1N1 PR8 wurde durch Nukleosidanaloga gehemmt, was mit früheren Studien26 übereinstimmt (Extended Data Abb. 9e), und das Screening verschiedener Klassen antiviraler Verbindungen im 48-Well-Format ergab eine unterschiedliche Aktivität (Extended Data Abb. 9f), was darauf hindeutet Dieses System könnte für die skalierbare Entdeckung von Therapeutika genutzt werden.

Bei einer COVID-19-Pneumonie führt eine schwere SARS-CoV-2-Infektion der distalen Lunge zu Alveolarschäden und Atemversagen27. Organoid scRNA-seq zu Zeitpunkten vor der Flimmerdifferenzierung identifizierte die Expression des SARS-CoV-2-Rezeptors ACE2 und der Prozessierungsprotease TMPRSS2-mRNAs vorwiegend in Club- und AT2-Zellen (Extended Data Abb. 10a), was mit der Expression von ACE2 im KRT5− differenzierten Inneren übereinstimmt Lumenzellen (Abb. 2a). Um den Zugang von SARS-CoV-2 zu ACE2-exprimierenden Lumenzellen zu erleichtern, haben wir eine apikale Suspensionskultur-Polarisationsmethode28 an distale Lungenorganoide angepasst (Extended Data Abb. 10b). Innerhalb von 48 Stunden in der Suspension reorganisierten sich die Organoide in apikal nach außen gerichtete Epithelsphäroide mit Mikrovilli, apikalen Übergängen und beweglichen Zilien, die der Außenseite des Organoids zugewandt waren. Die Differenzierung nach außen gerichteter Flimmerzellen beschleunigte sich über fünf Tage und schritt über Wochen voran (Abb. 4a, Erweiterte Daten Abb. 10c – f, Zusatzvideo 3). Basale Organoide mit apikalem Ausgang zeigten auch eine Zunahme der nach außen gerichteten Keulenzellen mit apikalen sekretorischen Körnchen (Abb. 4a, erweiterte Daten, Abb. 10g), und AT2-Organoide mit apikalem Ausgang zeigten eine Differenzierung in AT1-Zellen (erweiterte Daten, Abb. 10h – j). . Entscheidend ist, dass sich ACE2 in apikalen Organoiden in apikalen Zellmembranen auf der äußeren Organoidoberfläche befindet (Abb. 4b, erweiterte Daten Abb. 10k).

a, Immunfluoreszenz zum Vergleich der Polarisation und Oberflächenlokalisierung von SCGB1A1+-Keulenzellen (grün) und AcTUB+-Zilienzellen (weiß) nach ECM-eingebettetem nichtpolarisiertem Wachstum (links) oder apikaler Suspensionskultur (rechts). b: Querschnitte eines apikal nach außen gerichteten Basalorganoids wie in einem mit Anti-ACE2, Anti-SCGB1A1 und DAPI gefärbten Beispiel. c, Quantitative PCR für ungespleißte genomische SARS-CoV-2-RNA (gRNA, links) und gespleißte sgRNA (rechts) in apikalen distalen Lungenorganoiden, 72 Stunden nach der Infektion (hpi), normalisiert auf U3-snoRNA; n = 2 unabhängige Experimente. d, Anti-dsRNA-Immunfluoreszenz von apikal nach außen gerichteten humanen distalen Lungenorganoiden, entweder scheininfiziert oder mit SARS-CoV-2 infiziert, 48 hpi. e, Immunfluoreszenz für SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein (NP) in infizierten oder scheininfizierten apikalen Organoiden bei 96 hpi. f, Immunfluoreszenz von SARS-CoV-2-infizierten apikalen AT2-Organoiden mit den angegebenen Antikörpern bei 96 hpi. g, Immunfluoreszenz-Kolokalisation von SARS-CoV-2 NP und SCGB1A1 in apikal nach außen gerichteten basalen Organoiden der distalen Lunge bei 96 hpi. h, Immunfluoreszenz, die die Zelltypspezifität in SARS-CoV-2-infizierten apikalen Organoiden zeigt. Inf, mit SARS-CoV-2 infizierte Zelle. In c–h befanden sich die Organoide vor der Infektion 6–10 Tage (basal) oder 3 Tage (AT2) in Suspension. Maßstabsbalken, 20 μm, außer f, h (10 μm).

SARS-CoV-2 infizierte apikal nach außen gerichtete gemischte distale Lungenorganoide, wobei die Induktion von ungespleißter genomischer SARS-CoV-2-RNA ähnliche Werte wie die reichlich exprimierte kleine nukleoläre U3-RNA erreichte (Abb. 4c, links). Darüber hinaus zeigten infizierte Organoide replikationsspezifische SARS-CoV-2-gespleißte subgenomische RNA (sgRNA; Abb. 4c, rechts) und die Produktion infektiöser Virionen mit VeroE6-Zellplaquebildung (35 PFU ml−1 aus Organoidlysaten und 65 PFU ml− 1 aus organoiden Überständen). In mit SARS-CoV-2 infizierten Basalorganoiden trat 48 Stunden nach der Infektion doppelsträngige RNA (dsRNA) auf (Abb. 4d) und 96 Stunden nach der Infektion SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein (NP) (Abb. 4e). Ungefähr 10 % der AT2-Organoide zeigten eine ausgeprägte SARS-CoV-2-NP-Expression in SFTPC+-Zellen; Die übrigen Organoide waren frei von Infektionen (Abb. 4f). In ähnlicher Weise infizierte SARS-CoV-2 etwa 10 % der basalen Organoide. In insgesamt 2.621 Basalzellen der distalen Atemwege, die Kulturen von vier Personen repräsentieren (Ergänzungstabelle 5), wurde im Gegensatz zur Infektion der oberen Atemwege keine SARS-CoV-2-Infektion in KRT5+-Basal- oder AcTUB+-Zilienzellen nachgewiesen (Odds Ratio 0, P < 0,05). Flimmerzellen der Atemwege durch SARS-CoV-2 in 2D-ALI-Kultur29,30. SARS-CoV-2-NP- und dsRNA-Immunfluoreszenz waren jedoch hauptsächlich in SCGB1A1+-Keulenzellen vorhanden (Abb. 4g, h), die stark mit NP- oder dsRNA-positiven Zellen assoziiert waren und 79 % der NP- oder dsRNA-positiven Zellen ausmachten (Odds Ratio 19,33, P < 0,0001); 21 % der infizierten Zellen fehlten SCGB1A1 (Abb. 4g, h, Ergänzungstabelle 5). Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass AT2-Zellen direkt mit SARS-CoV-2 infiziert wurden, und legen nahe, dass Keulenzellen eine Zielpopulation der distalen Lunge sind.

Wir haben Langzeitkulturen menschlicher distaler Lungenorganoide zur Entdeckung von Vorläufern und zur Modellierung von Infektionskrankheiten eingesetzt. Unsere Erkenntnisse stützen sich auf frühere Kurzzeit- und Feeder-abhängige Lungenkulturmethoden für Erwachsene4,10,11 und stellen eine Alternative zu Techniken dar, die die Differenzierung induzierbarer pluripotenter Stammzellen beinhalten31,32,33,34. Organoide enthielten zwei verwandte Subtypen menschlicher distaler Lungenbasalzellen KRT5+ – Basal 1 und Basal 2. Bemerkenswert ist, dass die TNFRSF12A-exprimierende Basal 1-Fraktion eine angereicherte klonogene Vorläuferaktivität aufwies, was einen funktionellen Präzedenzfall für einen proliferationsangereicherten Basalzellsubtyp darstellte. Obwohl TNFRSF12A keineswegs ausschließlich in Basalzellen vorkommt, lokalisiert es sich innerhalb der Basalschicht häufig in einer postulierten Nische in den Basen und Spitzen der Atemwegsfurchen23, was die neueren Vorstellungen erweitert, dass das Lungenepithel eine räumliche Spezialisierung aufweist35. Es ist möglich, dass TNFRSF12A oder analoge Marker Basalzell-Vorläufer-Untergruppen in anderen Geweben unterscheiden könnten. Unsere Organoide ermöglichen auch die einfache Erforschung einer SARS-CoV-2-Infektion der distalen Lunge, die für die COVID-19-assoziierte Lungenentzündung relevant ist27, und implizieren SCGB1A1+-Keulenzellen als Ziel, deren Infektion schützende Lungenglykosaminoglykane gefährden und einen Teufelskreis der Infektion auslösen könnte. Im Gegensatz zu 2D-ALI-Lungenstudien konnten wir keine Infektion von Flimmerzellen beobachten29,30; Dies könnte alternative Kulturbedingungen erfordern. SCGB1A1-negative Populationen wurden ebenfalls infiziert und werden derzeit weiter untersucht; Beispielsweise exprimieren transiente sekretorische Zellen der Bronchien ACE2 und TMPRSS236.

Insgesamt kann die Einzelzellanalyse von Organoidkulturen, wie hier beschrieben, eine allgemeine Strategie zur Identifizierung und funktionellen Validierung von Stammzellenkandidaten in langsam proliferierenden Geweben darstellen. Die Kultur von Vorläufern für alle distalen Lungenepithellinien des Erwachsenen, einschließlich Alveolen, sollte im Wesentlichen die Modellierung von Krankheiten wie neoplastischen und interstitiellen Lungenerkrankungen ermöglichen12 und Anwendungen im Bereich Tissue Engineering und Präzisionsmedizin ermöglichen. Schließlich soll dieses Organoidsystem vielfältige Untersuchungen pulmonaler Krankheitserreger ermöglichen, darunter auch die SARS-CoV-2-Infektion der distalen Lunge, die mit fulminantem Atemversagen einhergeht.

Weitere experimentelle Details finden Sie in den ergänzenden Methoden. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Die Experimente waren nicht randomisiert und die Forscher waren hinsichtlich der Zuordnung während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind.

Alle in dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurden vom Institutional Review Board der Stanford University School of Medicine genehmigt und gemäß Protokoll Nr. durchgeführt. 28908. Die standardmäßige Einverständniserklärung für die Forschung wurde von allen Patienten, die an dieser Studie teilgenommen haben, vor der Gewebebeschaffung schriftlich eingeholt und alle Experimente folgten den relevanten Richtlinien und Vorschriften. Peripheres Lungengewebe innerhalb von 1 cm der viszeralen Pleura wurde aus weggeworfenem chirurgischem Gewebe aus Lobektomien gewonnen. Bei Patienten mit Verdacht auf Lungenkrebs wurden Fälle mit klinischer T4-Erkrankung (6. Auflage des American Joint Cancer Committee) (z. B. Merkmale wie Bronchialinvasion oder parenchymale Satellitenknötchen/Metastasen) zurückgestellt. Normales Gewebe wurde vom Lungenrand entfernt, der anatomisch am weitesten von den tastbar klar definierten Läsionen entfernt liegt, oder im Fall von Pneumonektomien von unbeteiligten Lungenlappen. Proben mit Tumoren mit schlecht definierten Rändern wurden zurückgestellt. Das Gewebe wurde entweder frisch verarbeitet oder über Nacht bei 4 °C gelagert und am nächsten Morgen verarbeitet.

Um distale Atemwegszellen zu isolieren, wurde Lungenparenchym aus 1 cm Entfernung von der viszeralen Pleura mechanisch mit einer Castro-Schere dissoziiert, gewaschen und mit 5 Einheiten pro ml Schweine-Elastase (Worthington), 100 Kunitz-Einheiten pro ml DNase I (Worthington) und Normocin ( InvivoGen) und in zwei Gewebevolumina Lungenorganoidmedium resuspendiert, bestehend aus fortgeschrittenem DMEM/F12 (Invitrogen), ergänzt mit 10 mM Nicotinamid, N-Acetylcystein, 1× B27-Ergänzung minus Vitamin A, rekombinantem humanem NOGGIN (100 ng ml−1). , R&D Systems), rekombinanter humaner EGF (50 ng ml−1, R&D Systems) und TGF-β-Inhibitor A83-01 (100 nM, Tocris). Dieses Lungenorganoidmedium wurde für alle Experimente verwendet, mit Ausnahme der in Abb. 4f der erweiterten Daten gezeigten. Das Gewebe wurde dann 1 Stunde lang bei 37 ° C geschüttelt und die resultierende Zellsuspension durch 100–40 μm-Zellsiebe filtriert und einer Ammoniumchlorid-Lyse roter Blutkörperchen unterzogen. Das Zellpellet wurde dann gewaschen und in 10 Volumina Basalmembranextrakt II mit reduziertem Wachstumsfaktor (Trevigen) resuspendiert. Zellen in der Matrix wurden dann in 24-Well-Platten in 50-μl-Tröpfchen ausplattiert und warmes Medium hinzugefügt, nachdem die Tröpfchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur erstarrt waren. Das Medium wurde alle 3–4 Tage gewechselt und die Organoide wurden alle 3–4 Wochen passagiert durch Dissoziation mit TrypLE. Die Passage basierte auf der ECM-Haltbarkeit und -Integrität und der geschätzten Organoidkonfluenz, beurteilt anhand des geschätzten Organoidvolumens im Verhältnis zum Volumen des ECM-Tröpfchens. Distale Lungenorganoide konnten etwa 6 Monate lang passagiert werden, wobei basale Organoide zunächst alle 2 Wochen 6–7 Verdoppelungen aufwiesen. Alveoläre Organoide dehnten sich mit einer anfänglichen Rate von 3–4 Verdoppelungen alle 2 Wochen langsamer aus, überwogen jedoch nach mehreren Monaten gegenüber basalen Organoiden. Berechnet aus den anfänglichen Zellteilungsraten betrugen die Obergrenzen der Basal- und Alveolarexpansion 219 (524.288-fach) bzw. 216 (65.536-fach). Um eine Kontamination durch bösartige Zellen auszuschließen, wurden Langzeitkulturen von einem zertifizierten Pathologen systematisch auf das Vorliegen einer Dysplasie oder eines Karzinoms untersucht. Darüber hinaus wurden fünf Organoid-Langzeitkulturen (2–6 Monate) einer gezielten Next-Generation-Sequenzierung unterzogen, um pathogene Nukleotidvarianten auszuschließen (siehe unten). Ausführliche Informationen finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Die distale Lunge wurde wie oben dissoziiert und alle Inkubationsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Wir inkubierten 107 Zellen mit Fc Block (Biolegend 422301) und verdünnten sie 10 Minuten lang 1:100 in FACS-Puffer (2 mM EDTA und 0,2 % fötales Kälberserum in 1 × PBS, pH 7,4). Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang mit APC-konjugierten Anti-CD45-Antikörpern in einer Konzentration von 1 μg ml−1 in FACS-Puffer gemischt, gewaschen und zwei Runden der Depletion mit Magnetkügelchen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Miltenyi: Anti-Human-Fibroblast) unterzogen 130-050-601, Anti-CD31 130-091-935, Anti-APC 130-090-855, LS-Säule 130-042-401). Unmarkierte Zellen wurden dann bei 300 g zentrifugiert und mit einem Cocktail aus 1 μg ml−1 PerCP-Cy5.5-Anti-EPCAM-Antikörper und Zombie-Aqua-Lebensfähigkeitsfärbung (Biolegend 423101), verdünnt 1:400 aus der Stammkonzentration in FACS-Puffer, markiert.

Zur Kryokonservierung und Wiederherstellung wurden ECM-Tröpfchen durch Pipettieren in drei Volumina PBS mit 5 mM EDTA dissoziiert und dann 1 Stunde lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 300 g pelletiert und in Gefriermedium (fötales Kälberserum (Gibco), 10 % v/v DMSO) resuspendiert, in Kryoröhrchen und dann in Mr. Frosty-Behälter (Thermo Fisher) gegeben und bei –80 °C gelagert über Nacht, gefolgt von der Überführung in die Dampfphase von flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung. Organoide wurden durch schnelles Auftauen in einem 37 °C warmen Wasserbad gewonnen, gefolgt von Waschen in Organoidmedium und Ausplattieren in ECM mit Organoidmedium plus 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 (Tocris).

Distale Atemwegszellen wurden wie oben isoliert und plattiert, mit den folgenden Ausnahmen: Beim Elastaseverdau von Lungengewebe wurde fortgeschrittenes DMEM/F12 anstelle von organoidem Medium verwendet, und die Zellen wurden seriell verdünnt und durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert und mit einem Hämozytometer gezählt . Eintausend lebensfähige Epithelzellen (durch Trypanblau-Ausschluss, Größe und Morphologie) pro μl ECM wurden pro 5 μl Matrigel-Tröpfchen pro Vertiefung ausplattiert. Das Basismedium bestand aus organoidem Medium ohne A83-01, EGF, NOGGIN, WNT3A oder RSPO1. EGF (endgültige 50 ng ml-1, F&E), NOGGIN (endgültige 100 ng ml-1, F&E), WNT3A (endgültige 100 ng ml-1, F&E), RSPO1 (endgültige 500 ng ml-1, Peprotech) oder PORCUPINE Inhibitor C59 (letzte 1 μM, Biogems) wurden einzeln oder in Kombination zum Basismedium hinzugefügt. Die Bilder wurden zehn Tage nach der Primärplattierung mit einem Umkehrlichtmikroskop bei 5-facher Vergrößerung aufgenommen. Jede Bedingung wurde in vierfacher Ausfertigung ausplattiert und die Organoidbildung wurde mithilfe des Plugins „Partikel analysieren“ (Schwellenwert, 4902 Pixel) in ImageJ quantifiziert (siehe ergänzende Methoden).

Lungenorganoidkulturen von einzelnen Individuen wurden 4 Wochen nach der Primärplattierung dissoziiert und einer tröpfchenbasierten scRNA-Seq mit der 10x Genomics Single Cell 3′-Plattform mit einem 5-Nukleotid-UMI gemäß dem Protokoll des Herstellers unterzogen. Zellerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt37. Für die scRNA-seq-Analyse in Abb. 1k wurde ein modifizierter Kruskal-Wallis-Rangsummentest durchgeführt, um die Bedeutung der differentiellen Markergenexpression für AT2- (SFTPC), Basal- (KRT5) und Club-Zellen (SCGB1A1) mit allen P zu bestimmen < 0,001. Hauptkomponentenanalyse, t-SNE, unbeaufsichtigtes graphbasiertes Clustering, statistische Tests und die Pseudozeit-Trajektorie für alle scRNA-seq-Analysen werden in den ergänzenden Methoden und ergänzenden Daten 1 beschrieben.

LysoTracker+ AT2-Zellen38 aus unfraktionierten Organoiden wurden durch FACS gereinigt und zwei Monate lang mit einer Passage kultiviert. Diese wurden dissoziiert und einer tröpfchenbasierten scRNA-Seq mit der 10x Genomics Chromium Single Cell 3′-Plattform v2 gemäß dem Protokoll des Herstellers unterzogen. Die Bibliothek wurde mittels Paired-End-Sequenzierung (26 bp Read 1 und 98 bp Read 2) mit einem einzelnen Probenindex (8 bp) auf einem Illumina NextSeq 500 sequenziert. Die Datenvorverarbeitung und die Hauptkomponentenanalyse wurden mit CellRanger v1.2 durchgeführt. Die anschließende Analyse wird in „Ergänzende Methoden und ergänzende Daten 1“ beschrieben.

Organoidkulturen wurden in ECM mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) fixiert, dehydriert, in Epoxidharz eingebettet und mit einem JEOL-Transmissionselektronenmikroskop (Modell JEM1400) mit einem LaB6-Emitter bei 120 kV sichtbar gemacht.

Organoide wurden mit 2 % Paraformaldehyd bei 4 °C über Nacht fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten (10–20 μm), wie zuvor beschrieben37. Die Schnitte wurden entparaffiniert und zur histologischen Analyse mit H&E gefärbt. Antikörper, die für die immunzytochemische Färbung nach Standard-Färbeprotokollen39 verwendet werden, sind in den ergänzenden Methoden aufgeführt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Leica-SP8-Mikroskop aufgenommen.

Die RNA-in-situ-Hybridisierung wurde wie beschrieben durchgeführt40 und Sondensequenzen sind in den ergänzenden Methoden bereitgestellt.

Intakte, nicht infizierte Organoide wurden in 2 % Paraformaldehyd in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) (4 % Paraformaldehyd für infizierte Organoide) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fixiert, mit PBS mit 100 mM Glycin gewaschen und in 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert in PBS für 1 Stunde, dann in Färbepuffer (4 % BSA, 0,05 % Tween-20 in PBS pH 7,4, 10 % Ziegen-/Eselserum) für eine weitere Stunde inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit primärem Antikörper für 24 Stunden bei Raumtemperatur in Färbepuffer. Ganze Bestände wurden dann mit PBS-T gewaschen und mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern, Phalloidin und DAPI, 4 Stunden lang bei Raumtemperatur in Färbepuffer inkubiert. Nach weiteren Wäschen wurden die gesamten Halterungen in Eindeckmedium (Vectashield, Vector Laboratories) getaucht und auf Kammerdeckgläsern montiert, um sie in vier Kanälen mit den konfokalen Mikroskopen Zeiss LSM 700 oder 900 abzubilden. Das 3D-Rendering konfokaler Bildstapel wurde mit der Volocity Image Analysis-Software (Quorum Technologies Inc., Guelph, Ontario) durchgeführt. Für Abb. 4h, die fünf Farben erforderte, wurden Zilien durch Anfärben mit zwei fluoreszierenden Sekundärantikörpern und Zusammenführen der kolokalisierten Voxel zu einem pseudogefärbten Kanal mithilfe der Volocity-Software unterschieden. Die Lektinfärbung (FITC-Sambuca Nigrin, Vector Labs FL-1301; Biotin-Maackia Amurensis, Vector Labs FL-1301) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt, nachdem die Organoide 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 0,1 % Paraformaldehyd in PBS fixiert wurden durch Blockierung mit Avidin/Biotin (Vector Labs SP-2001). Biotin-Maackia Amurensis-Lektin wurde mit Streptavidin-PE-Konjugat (Thermo Fisher SA10041) markiert und nach dem Waschen wurde die Lektinfärbung in einem Keyence BZ-X700 abgebildet.

Zehn Organoidkulturen wurden mithilfe eines kommerziellen gezielten Resequenzierungsassays mit End-to-End-Abdeckung von 131 Krebsgenen und Begleitsoftware (TOMA COMPASS Tumor Mutational Profiling System, Foster City, CA) sequenziert, um das Vorhandensein onkogener Mutationen in Langzeit-Organoiden zu bestimmen Kulturen. Bibliotheken wurden auf einem Illumina NextSeq 500 sequenziert. Nicht-synonyme Varianten sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt. Variantenaufrufdateien werden in den Ergänzungsdaten 2 bereitgestellt.

Organoidkulturen wurden innerhalb von 2–3 Wochen nach der primären Ausplattierung mit 1 U ml−1 neutraler Protease (Worthington, Cat LS02100) und 100 KU DNase I in Lungenorganoidmedium dissoziiert. Basale Organoide wurden dann durch Schwerkraftsedimentation gesammelt und der Überstand wurde entweder abgesaugt oder zur stromabwärtigen Verwendung gesammelt. Basale Organoide wurden dann mit einem benutzerdefinierten Ficoll-Paque-Gradienten (4 Vol. Ficoll-Paque zu 1 Vol. PBS) weiter fraktioniert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Organoidpellet in 10 ml PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen resuspendiert, durch Schwerkraftsedimentation gesammelt und wie oben beschrieben in ECM ausplattiert.

Organoide wurden mit TrypLE dissoziiert, gefolgt von einer Neutralisierung mit 10 % Volumen fötalem Kälberserum, DNase bei 100 KU ml-1 ausgesetzt, mit Lungenorganoidmedium gewaschen und dann mit 100 Zellpelletvolumina Lungenorganoidmedium mit 10 nM LysoTracker Red DND- inkubiert. 99 (Thermo Fisher L7528) bei 37 °C für 30 Minuten. Die Zellen wurden dann gewaschen und wie oben beschrieben in FACS-Puffer resuspendiert, mit Fc-Block inkubiert und dann auf Eis mit einem Markierungscocktail bestehend aus 1 μg ml−1 PerCP-Cy5.5-Anti-EPCAM-Antikörper und Zombie-Aqua-Lebensfähigkeitsfärbung (Biolegend) inkubiert 423101) 1:400 aus der Stammkonzentration im FACS-Puffer verdünnt. EPCAMhi- und LysoTrackerhi-Zellen wurden in Lungenorganoidmedium mit 10 μM Y-27632 (Tocris 1254) sortiert und 24 Stunden lang in ECM und Lungenorganoidmedium mit Y-27632 kultiviert, gefolgt von Lungenorganoidmedium ohne Y-27632. Das Wachstum reiner AT2-Organoide wurde durch die Zugabe von 1:1 Vol.:Vol. serumhaltigem konditioniertem L-Zell-Medium (L-WRN CM), das WNT3A, R-SPONDIN3 und NOGGIN enthielt und mit rekombinantem EGF41 ergänzt wurde, verstärkt. Die vollständige Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Alle FACS-Antikörper wurden von Biolegend erworben. Qualitativ identische Ergebnisse konnten auch mit der FACS-Reinigung von Anti-HTII-280 (AT2-Marker, Terrace Biotech) anstelle von LysoTracker erzielt werden. AT2-Organoidzellen wurden durch TrypLE-Dissoziation von ECM und Aussaat auf Kammerglas-Deckgläschen in AT1-Zellen transdifferenziert, gefolgt von einer Kultivierung mit fortgeschrittenem DMEM/F12 und 5 % fötalem Kälberserum42.

FACS EPCAM+-Stroma-abgereicherte Organoide bei D14 wurden mit Lentivirus bei einer geschätzten MOI von 0,9 infiziert, wie zuvor beschrieben43 mit lentiviralen Vektoren der dritten Generation (PGK-GFP T2A Puro, SBI-Kat.-Nr. CD550A-1; mCherry, modifiziert aus pLentiCRISPRv1 (Addgen-Nr . 49545) zum Einbau einer EF-1a-mCherry P2A Puro-Kassette, ein Geschenk von Paul Rack). Sechsundneunzig Stunden nach der Infektion wurden Organoide 48 Stunden lang mit Puromycin in einer Konzentration von 600 ng ml-1 behandelt, um auf transduzierte Zellen zu selektieren. Zwei Wochen nach der Selektion wurden GFP-exprimierende Organoide oder mCherry-exprimierende Organoide in einzelne Zellen dissoziiert und im Verhältnis 1:1 gemischt und nach 28 Tagen jeder Passage als monochromatisch oder gemischt bewertet. Der gleiche Ansatz wurde für gereinigte AT2- und Basalkulturen nach entsprechenden Isolierungsstrategien aus einer anfänglichen FACS-gereinigten, EPCAM+-, Stroma-abgereicherten Organoid-Starterkultur angewendet.

Adultes menschliches Lungengewebe wurde wie oben beschafft und dissoziiert, die Zellen wurden jedoch wie oben mit Zombie Aqua Live:Dead-Färbung markiert, mit FACS-Puffer gewaschen und dann über Nacht bei 4 °C in 2 % PFA in PBS fixiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung des oben beschriebenen Whole-Mount-Verfahrens gefärbt, wobei auf das Waschen mit PBS-Glycin verzichtet wurde. Fixierte und permeabilisierte Zellen wurden dann mit einer 1:400-Verdünnung von Alexa Fluor 647-konjugiertem Maus-Anti-Human-Cytokeratin-5-Antikörper (Abcam) 24 Stunden lang bei 4 °C in Permeabilisierungspuffer inkubiert. Die Zellen wurden dann mit FACS-Puffer gewaschen und mit PE-konjugiertem Maus-Anti-Human-TNFRSF12A-Antikörper (Klon ITEM-4, Biolegend) 30 Minuten lang auf Eis markiert, gefolgt von Waschen und Analyse auf einem BD Aria Fusion-Gerät. Die vollständige Gating-Strategie und die qPCR-Validierung des ITEM-4-Antikörpers sind in der ergänzenden Abbildung 1 aufgeführt.

Einzelzellsuspensionen aus frischer menschlicher distaler Lunge oder primärer Organoidkultur nach etwa 4 Wochen Kultur wurden wie oben dissoziiert, mit Fc Block (BioLegend) behandelt und in FACS-Puffer mit Zombie Aqua 1:400, 1 μg ml–1 inkubiert PerCP-Cy5.5-Anti-Human-EpCAM (CD326), 1 μg ml-1 APC-Anti-Human-ITGA6 (CD49f), 2 μg ml-1 FITC-Anti-Human-ITGB4 (CD104) und 1 μg ml-1 PE-Anti- menschliches TNFRSF12A (CD266). Dreißig Minuten nach der Markierung wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und nach EPCAMhi, ITGA6/ITGB4hi, TNFRSF12Ahi und TNFRSF12Aneg sortiert. Die vollständige Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Mehr als 5.000 Zellen wurden in Eppendorf-Röhrchen mit Lungenorganoidmedium und 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 sortiert. Alle FACS-Antikörper wurden von Biolegend gekauft.

Die Zellen wurden in ECM ausgesät und in Lungenorganoidmedium mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 getaucht. Die Aussaatdichte für FACS-isolierte Zellen aus Organoidkulturen betrug 1.000 Zellen pro Vertiefung bei einer Dichte von 100 Zellen pro μl ECM. Die Aussaatdichte für FACS-isolierte Zellen aus frischer menschlicher distaler Lunge betrug 3.000 Zellen pro Vertiefung bei einer Dichte von 300 Zellen pro μl ECM. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt, um den ROCK-Inhibitor zu entfernen, danach wurde es alle 72 Stunden gewechselt. Die Organoidbildung wurde 14 Tage nach dem Ausplattieren von zwei unabhängigen Beobachtern manuell quantifiziert.

Unfraktionierte Kulturen, die AT2-, Basal- und Clubzelltypen enthielten, wurden nach 2–3 Wochen dreifach mit dem H1N1-Stamm PR8 infiziert, der nach 24-stündiger Vorbehandlung mit antiviralen Verbindungen so modifiziert war, dass er GFP bei der Virusreplikation exprimierte44. ECM wurde durch Zugabe von 5 mM EDTA in PBS dispergiert, gefolgt von Waschen und Inokulation mit PR8-H1N1-GFP-Reportervirus bei einer geschätzten MOI von 1 in Medium, das entweder Vehikel oder antivirale Mittel enthielt. Nach 12 Stunden (ein Influenza-Infektionszyklus) wurde die intakte organoide GFP-Expression entweder durch Fluoreszenzmikroskopie mit einem automatischen Keyence BZ-X700-Mikroskop sichtbar gemacht oder in einzelne Zellen dissoziiert und mit 0,1 % PFA in PBS fixiert, gefolgt von einer FACS-Quantifizierung der GFP+-Zellen ( Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Antivirale Dosis-Wirkungs-Kurven wurden mithilfe einer nichtlinearen Regressionskurvenanpassung mit vier Parametern mit GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA) erstellt. Der H1N1-Tropismus wurde auf ähnliche Weise wie oben bewertet, mit der Ausnahme, dass Ficoll-sedimentierte Basalzellfraktionen im Vergleich zu nicht-basalen Fraktionen in einzelne Zellen dissoziiert, gezählt und mit einer geschätzten MOI von 1 in organoidem Medium für 1 Stunde bei 37° infiziert wurden C, gefolgt von Waschen und erneuter Aussaat in ECM, 16-stündiger Kultivierung und anschließender Dissoziation und FACS wie oben.

In 50 μl ECM-Tröpfchen eingebettet gezüchtete Lungenorganoide wurden wie beschrieben28 mit Modifikationen in eine Suspensionskultur überführt. Kurz gesagt, in ECM eingebettete Organoide wurden vorsichtig durch Pipettieren mit sterilen LoBind-Spitzen (Eppendorf 22493008) entfernt und in konische 15-ml-LoBind-Röhrchen (Eppendorf 30122216) gegeben, die eiskaltes 5 mM EDTA in PBS enthielten. Pro ECM-Tröpfchen wurden fünf Milliliter EDTA-Lösung verwendet (3 ECM-Tröpfchen pro konischem 15-ml-Röhrchen) und 1 Stunde lang bei 4 °C auf einer rotierenden Plattform rotiert. Die Organoide wurden 3 Minuten lang bei 4 °C und 200 g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde in Wachstumsmedium in Gewebekulturplatten mit sechs Vertiefungen und extrem geringer Befestigung (Corning Costar 3471) resuspendiert. Suspendierte Organoide wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 für verschiedene Zeiträume (Bereich 0–30 Tage) inkubiert, um die apikale Polarität, Ciliogenese und Differenzierung zu charakterisieren und um apikale Organoide für Infektionsexperimente mit SARS-CoV-2 vorzubereiten.

VeroE6-Zellen wurden von ATCC als mykoplasmenfreie Bestände erhalten und in ergänztem DMEM mit 10 % FBS gehalten. SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020) wurde in VeroE6-Zellen in DMEM mit 2 % FBS passagiert. Die Titer wurden durch Plaque-Assay an VeroE6-Zellen unter Verwendung von Avicel (FMC Biopolymer) und Kristallviolett (Sigma) bestimmt, die virale Genomsequenz wurde verifiziert und alle Infektionen wurden mit dem Passage-3-Virus durchgeführt. Die Organoide wurden gezählt und 6–8 Tage lang in Suspensionsmedium gegeben und dann in Virusmedium oder einem gleichen Volumen Scheinmedium bei einer MOI von 1 relativ zur Gesamtzahl der Organoidzellen in der Probe resuspendiert und dann bei 37 °C unter 5 % inkubiert. CO2 für 2 Stunden. Anschließend wurden die Organoide in Suspension in Lungenorganoidmedium ausplattiert (apikale Organoide). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden apikale Organoide mit Lungenorganoidmedium und PBS gewaschen und in TRIzol LS (Thermo Fisher), frisch hergestelltem 4 % PFA in PBS oder 250 μl Lungenorganoidmedium resuspendiert. In Lungenorganoidmedium resuspendierte Zellen wurden durch Einfrieren bei –80 ° C lysiert. Kulturüberstände wurden in TRIzol LS konserviert oder direkt zu Plaque-Assay-Monoschichten hinzugefügt. Alle SARS-CoV-2-Arbeiten wurden in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II unter BSL3-Bedingungen an der Stanford University durchgeführt.

RNA aus SARS-CoV-2-infizierten Organoiden wurde durch Zugabe von 750 μl TRIzol (Thermo Fisher Scientific), 5-minütiger Inkubation bei 55 °C und anschließender Zugabe von 150 μl Chloroform extrahiert. Nach dem Mischen jeder Probe durch 7-sekündiges Vortexen wurden die Proben 5 Minuten lang bei 25 °C inkubiert und dann 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde vorsichtig von jeder Probe entfernt, mit zwei Volumina 100 % Ethanol gemischt und unter Verwendung eines RNA Clean & Concentrator-25-Kits (Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Alle RNA-Proben wurden mit DNase (Turbo DNA-free Kit, Thermo Fisher Scientific) behandelt. Der Brilliant II SYBR Green QRT-PCR 1-Step Master Mix (VWR) wurde zur Umwandlung von RNA in cDNA und zur Amplifikation spezifischer RNA-Regionen auf dem Echtzeit-PCR-Nachweissystem CFX96 Touch (Bio-Rad) verwendet. Die reverse Transkriptionsreaktion wurde 30 Minuten lang bei 50 °C und 10 Minuten lang bei 95 °C durchgeführt, gefolgt von einer zweistufigen qPCR mit 95 °C für 10 Sekunden und 55 °C für 30 Sekunden, insgesamt 40 Zyklen. Zwei Primersätze wurden verwendet, um entweder nicht gespleißte genomische SARS-CoV-2-RNA (gRNA) über die Nukleotidpositionen 14221–14306 oder gespleißte SARS-CoV-2-sgRNA30 zu amplifizieren. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt.

Eine optimale Färbung des menschlichen distalen Lungengewebes wurde mit Proben erreicht, die innerhalb von 30 Minuten nach der primären chirurgischen Resektion in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert wurden. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C in Fixiermittel inkubiert, auf 30 % Saccharose übertragen und in das OCT eingebettet. Gefrorene Schnitte wurden auf 10 μm geschnitten, 30 Minuten lang bei 70 °C einer Citrat-basierten Antigengewinnung (Vector Labs) unterzogen und dann wie oben beschrieben 1 Stunde lang mit 10 % Ziegenserum in IF-Waschpuffer blockiert. Für Abb. 3a wurde Maus-Anti-TNFRSF12A (Klon ITEM-4, Biolegend) und für Abb. 3b, f und Extended Data Abb. 845 polyklonales Kaninchen-Anti-TNFRSF12A (ThermoFisher PA5-20275) verwendet.

Lebende Organoide wurden zwischen zwei Deckgläsern in einer Betrachtungskammer (Lab-Tek II Zweikammer-Deckglas) gehalten und mit einem Nikon TE2000E-Mikroskop unter Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DIC) mit einem 63-fachen Objektiv gefilmt. Die Proben wurden während der Bildgebung bei 37 °C und 5 % CO2 aufbewahrt. Digitale Videos wurden mit einer hochauflösenden Hamamatsu-Digitalkamera ORCA-285 gesammelt und mit der OpenLab 5.5.2-Software (Improvision) gerendert. Nach der Aufnahme wurden die Proben fixiert und gefärbt, ohne sie aus den Kammern zu entfernen, und zur Immunfluoreszenzmikroskopie in das konfokale Mikroskop übertragen.

Sofern nicht anders angegeben, sind alle Daten repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente, wobei jedes unabhängige Experiment mit einer Organoidkultur durchgeführt wurde, die von einem Individuum stammt. Die Grenzen des Boxplots erstrecken sich über das erste bis dritte Quartil, horizontale Linien stellen Medianwerte dar und Whisker stellen Minima oder Maxima des Datenbereichs dar, oder im Fall von Ausreißern das 1,5-fache des Interquartilbereichs, wobei Ausreißer durch Datenpunkte dargestellt werden. Die t-Tests waren zweiseitig und die P-Werte werden als *P < 0,05, **P ≤ 0,01 und ***P ≤ 0,001 bezeichnet. Ausführliche Informationen finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

scRNA-seq-Datensätze wurden in Gene Expression Omnibus mit dem Zugangscode GSE106850 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Skripte zur Durchführung von Analysen von scRNA-seq-Daten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Benutzerdefinierter Code ist auf GitHub verfügbar (https://github.com/ameen-salahudeen/lung_organoid).

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Wir danken den Mitgliedern der Kuo- und Desai-Labors für Diskussionen; die Stanford Tissue Bank, J. Shrager, M. Berry und W. Trope für die Gewebegewinnung; S. Plevritis zur Flugbahnanalyse; und die Stanford Stem Cell FACS Facility, P. Chu, A. McCormick, D. Mendoza, F. de la Vega und J. Zengel für technisches Fachwissen. SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281 wurde beim CDC hinterlegt und über BEI Resources, NIAID, NIH bezogen. Folgende Stipendien unterstützen Autoren: AAS: AP Giannini, ECOG-ACRIN, P. Carbone, Stanford Cancer Institute; SSC: Stipendium des Stanford Medical Scientist Training Program T32 GM007365-44; JZ: Stanford Graduate Fellowship.; SMdlO: CIRM-Brücken. Die finanzielle Unterstützung ist wie folgt: AR: NIH-Zuschuss T32 AI007502-23; RAF: Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2286-17); VvU: Rubicon-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (452181214); CS und JZ: NSF DMS 1712800 und der Stanford Discovery Innovation Fund; KCG und MMD: Howard Hughes Medical Institute; CAB: Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Grant 1016687. Diese Arbeit wurde auch von CIRM DISC2-09637 an CJK und TJD unterstützt: Bill and Melinda Gates Foundation OPP1113682 an CJK, MRA und CAB; Novo Nordisk Foundation Challenge Grant für MRA und MM-C.; Mathers Foundation Covid Fund an KCG; und NIH gewährt K08DE027730 an AAS, U19AI057229 an MMD, R56AI111460 an JSG, 5R01HL14254902 an TJD, DK11572802 an CJK und KCG, R01AI157155 an RSB und U19AI116484, U01DK085527 , U01CA217851, U01CA176299 und U01DE025188 an CJK. CAB ist Tashia und John Morgridge Faculty Scholar und Chan Zuckerberg Biohub Investigator. TJD ist der von der Familie Woods gestiftete Fakultätsstipendiat für pädiatrische translationale Medizin. CJK ist Maureen Lyles D'Ambrogio-Professorin für Medizin.

Ameen A. Salahudeen

Aktuelle Adresse: Abteilung für Hämatologie und Onkologie, Abteilung für Medizin, University of Illinois am Chicago College of Medicine, Chicago, IL, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ameen A. Salahudeen, Shannon S. Choi

Abteilung für Hämatologie, Abteilung für Medizin, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Ameen A. Salahudeen, Shannon S. Choi, Sean M. de la O, António JM Santos, Jihang Ju, Arpit Batish, Tatsuya Usui, Daniel J. Hart und Calvin J. Kuo

Abteilung für Infektionskrankheiten und geografische Medizin, Abteilung für Medizin, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Arjun Rustagi und Catherine A. Blish

Stanford University School of Engineering, Fakultät für Elektrotechnik, Stanford, CA, USA

Junjie Zhu

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Vincent van Unen, Lisa E. Wagar, Jeffrey S. Glenn, Mark M. Davis und Manuel R. Amieva

Stanford Institute of Immunity, Transplantation and Infection, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Vincent van Unen, Lisa E. Wagar und Mark M. Davis

Stanford ChEM-H, Stanford University, Stanford, CA, USA

Ryan A. Flynn

Fakultät für Chemie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Ryan A. Flynn

Abteilung für Pädiatrie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Mar Margalef-Català & Manuel R. Amieva

10x Genomics, Pleasanton, CA, USA

Grace XY Zheng, Jessica M. Terry, Phillip Belgrader, Solongo B. Ziraldo und Tarjei S. Mikkelsen

Abteilung für Epidemiologie, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Caitlin E. Edwards und Ralph S. Baric

Abteilung für Molekular- und Zellphysiologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Vincent Luca & K. Christopher Garcia

Abteilung für biomedizinische Datenwissenschaft, Fachbereich Medizin, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Benedict Anchang & Chiara Sabatti

Abteilung für Lungen-, Allergie- und Intensivpflege, Abteilung für Medizin, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Monica Nagendran & Tushar J. Desai

Abteilung für Gastroenterologie, Abteilung für Medizin, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Khanh Nguyen & Jeffrey S. Glenn

Abteilung für Biochemie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Pehr B. Harbury

Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

K. Christopher Garcia und Mark M. Davis

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Ralph S. Baric

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA

Catherine A. Blish

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AAS und SSC konzipierten, gestalteten und führten Experimente durch, analysierten Daten und verfassten das Manuskript. AR hat SARS-CoV-2-Infektionen konzipiert und durchgeführt. JZ, VvU und CS konzipierten und interpretierten Einzelzell-RNA-Seq-Studien. RAF führte eine qRT-PCR durch. MM-C., SMdlO, AJMS, TU, DJH, JJ und AB führten eine Organoidkultur und -analyse durch. LEW und MMD haben FACS-Panels entwickelt. VL und KCG steuerten die DLL4-E12-Mutante bei. BA führte eine SPADE-Analyse durch. KN und JSG haben Influenza-Studien entworfen und durchgeführt. GXYZ, JMT, PB, SBZ und TSM haben Einzelzell-RNA-Seq-Experimente entworfen und durchgeführt. CEE und RSB berieten bei SARS-CoV-2-Studien. MN und PBH stellten In-situ-Hybridisierungsprotokolle zur Verfügung. MRA, CAB, TJD und CJK konzipierten und gestalteten Experimente, analysierten Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Catherine A. Blish, Tushar J. Desai oder Calvin J. Kuo.

CJK, AAS, SSC, CAB, AR, MRA, MM-C., SMdlO und TU sind als Erfinder im vorläufigen Patent 63/053.079 aufgeführt, das die Methoden in diesem Dokument beschreibt. CJK ist Gründer von Surrozen Inc. Alle anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Informationen zum Peer-Review Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Schematische Darstellung der Kulturinitiierung aus der distalen menschlichen Lunge. b, Hellfeldmikroskopische Auswertung der erforderlichen exogenen Wachstumsfaktoren und automatisierte Organoidquantifizierung nach Tag 10 einer chemisch definierten Organoidkultur mit bestimmten rekombinanten Wachstumsfaktoren, N = Noggin, E = EGF, W = WNT3A, R = RSPO1, n = 4 pro Bedingung, Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, * = P < 0,05, zweiseitiger Student-T-Test, Maßstabsbalken = 500 μm. c, oben, Reinigungsschema zur Isolierung von Epithelzellen aus der distalen menschlichen Lunge mit negativer MACS-Kügelchendepletion von CD45+-hämatopoetischen Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten, gefolgt von einer positiven FACS-Selektion für EPCAM+-Epithel. Unten links zeigt ein repräsentatives FACS bei erneuter Analyse eine EPCAM+-Reinheit von >99,9 % (orange) im Vergleich zu ungefärbten Kontrollen (grau). Unten rechts: Proliferation von EPCAM+-Zellen, gereinigt aus distalen Lungenkulturen nach Tag 10 der Organoidkultur mit bestimmten Wachstumsfaktoren, N = Noggin, E = EGF, W = WNT3A, R = RSPO1, n = 3 pro Bedingung, Daten sind Mittelwerte ± Sem , ** = P < 0,01, zweiseitiger Student-T-Test. d: Konfokale Zeitrafferübertragungsbilder von festen und zystischen Organoiden, die aus einzelnen dissoziierten menschlichen distalen Lungenzellen stammen, Maßstabsbalken = 100 μm. z. B. Klonalitätsmischungsstudien. e, Schema der Mischstudien von Lentivirus-GFP- und Lentivirus-mCherry-exprimierenden Zellen zur Bestimmung der Klonalität. f, Repräsentative Live-Fluoreszenzbildgebung der resultierenden grünen und roten Organoide aus (e), Maßstabsbalken = 500 μm. g, Quantifizierung roter, grüner oder chimärer distaler Lungenorganoidkulturen von zwei Individuen (1, 2) nach anfänglicher und serieller Passage (P1 = Passage 1).

Quelldaten

a–c: Unbeaufsichtigtes Clustering der Gesamtzellpopulationen zeigt Konsistenz in den am häufigsten differenziell exprimierten Genen, die Basalzellen (KRT5/6), Clubzellen (SCGB1A1) und AT2-Zellen (SFTPC) entsprechen. Der Epithelanteil dieser Kulturen betrug etwa 90–99 % aller Zellen, der Rest waren entweder Fibroblasten (VIM+) oder mononukleäre Zellen (HLA-DR+, wahrscheinlich Alveolarmakrophagen). d–f, t-SNE-Visualisierung und Violindiagramme für Markergene, die jeder Population entsprechen. Beachten Sie, dass eine einzigartige Population, die mit SPRR-Genen angereichert ist, von denen beschrieben wurde, dass sie Plattenepithelmetaplasie markieren, ausschließlich in der Organoidkultur von Lunge 3 gefunden wurde, die von einer Person stammte, die aktiv rauchte.

a, SPADE-Diagramm gepoolter Zellen, wobei jeder Punkt Zellzustände darstellt, die auf demselben oder benachbarten Zweigen eines minimalen Spannbaums stärker zusammenhängen. Hinweis: AT2-Zellen befinden sich auf einem Zweig distal zu Basal- und Keulenzellen, was darauf hindeutet, dass es keine Abstammungshierarchie zwischen AT2-, Basal- und Keulenzellen gibt. b: SPADE-Diagramme gepoolter scRNA-seq-Proben nach Ausschluss von AT2-, VIM+- und HLA-DR+-Zellen unterstützen Abstammungsbeziehungen zwischen Basal- (blau) und Club-Populationen (rot) durch Club-Zellzweige, die von Basalzellen ausgehen. c, SPADE-Diagramme von Basal 1, Basal 2 und Clubpopulationen. d, Links: Die Genexpression von SCGB1A1 zeigt eine höhere Expression in Club- und Basalzelllinien (links) im Vergleich zu KRT5 (Mitte). Rechts, mittlere Genexpression von TNFRSF12A, die einen hohen (orangefarbenen Umriss) und einen niedrigen (blauen Umriss) innerhalb der Basalzellzweige zeigt und auf eine mögliche Abstammungsbeziehung schließen lässt. e, Monokel-3-Pseudozeit-Trajektorienanalyse einzelner Zelltranskriptome von Basal 1, verbunden mit Keulenzellen, dargestellt mit UMAP (Zellzahl, n = 3.721), gefärbt durch (links) Zellcluster und (rechts) Pseudozeitgradienten.

a, links, konfokale Bilder eines lebenden AT2-Organoids nach 67 Tagen Kultur, markiert mit Hoescht-Kernfärbung und LysoTracker Red DND-99. Oben rechts: Isolierung gereinigter AT2-Organoide. Repräsentative FACS-Diagramme, die die LysoTracker Red AT2-Reinigung aus unfraktionierten Organoidkulturen zeigen. Unten rechts zeigt die Immunfärbung des Zytospins von LysoTracker-sortierten AT2-Zellen eine hohe Reinheit (100/100 Zellen SPC+ SCGB1A1-KRT5); Maßstabsbalken = 50 μm). b, Schema der FACS-Isolierung von AT2-Zellen aus humanen gemischten distalen Lungenorganoiden als EPCAM+LysoTracker+ AT2-Zellen, gefolgt von einer klonogenen Organoid-Langzeitkultur. c, Repräsentatives Bild klonaler Mischstudien von stromadepletierten, EPCAM+LysoTracker+, lentiviral markierten AT2-Zellen, die das Vorhandensein von vollständig mCherry+ oder GFP+, aber nicht chimären Organoiden zeigen, durchgeführt wie in Extended Data Abb. 1e-g, Passage 1 nach lentiviraler Infektion , Maßstabsbalken = 200 μm. d, Quantifizierung roter, grüner oder chimärer AT2-Organoidkulturen wie in (c) von zwei Individuen (1, 2) nach anfänglicher und serieller Passage (P1 = Passage 1). e, AT2-Organoidproliferation mit unterschiedlichen Kombinationen rekombinanter Nischenfaktoren und PORCUPINE-Inhibitor C59 (1 mM), NOGGIN (N), EGF (E), WNT3A (W), R-SPONDIN1 (R). n = 3 pro Bedingung, Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung, * = P < 0,05, *** = P < 0,001, zweiseitiger Student-t-Test. f, Hellfeldmikroskopie zum Vergleich der reinen AT2-Organoid-Wachstumssteigerung in chemisch definierten Lungenorganoidmedien (EN) mit serumhaltigen L-Zell-konditionierten Medien, die WNT3A, NOGGIN und R-SPONDIN3 (L-WRN CM) enthalten, ergänzt mit rekombinantem EGF, ein Experiment . Maßstabsbalken = 200 μm. g: Transmissionselektronenmikroskopisches Bild eines repräsentativen AT2-Organoids nach 28 Tagen Kultur. Beachten Sie apikale Mikrovilli (schwarze Pfeile) und Lamellenkörper (rote Pfeile); Maßstabsbalken = 10 μm.

Quelldaten

a–c: Basale Organoide bilden in Mischkulturen nach und nach innere Lumen, was nicht mit Apoptose verbunden ist. a, KRT5 IF, Tag 26 Kultur, Maßstabsbalken = 200 μm. B. Lumenquantifizierung, d12- versus d26-Kultur, Einzelbestimmung. c, Fehlen von Apoptose im inneren Lumen des d26-Basalzellorganoids, gespaltene Caspase IF, aus Abb. 2b, Maßstabsbalken = 20 μm. d, e, Isolierung gereinigter Basalzellorganoide durch differenzielle Sedimentation in Ficoll. d, Schema und Anreicherung auf >90 % KRT5+-Zellen, gemessen durch intrazelluläre KRT5-FACS sedimentierter basaler Organoidzellen; Maßstabsbalken = 100 μm. e, serielle Zeitraffermikroskopie sedimentierter Basalorganoide zeigt spontane Kavitation innerhalb von zwei Wochen nach der Passage oder innerhalb von vier Wochen nach Kulturbeginn; Maßstabsbalken = 25 μm. f, g: Klonale Mischstudien von stromabgereicherten, Ficoll-gereinigten und lentiviral markierten Basalorganoidzellen, die vollständig mCherry+ oder GFP+, aber keine chimären Organoide wie in Extended Data Abb. 1f, Passage 1 nach lentiviraler Infektion, Maßstabsbalken = 200 μm zeigen . f, Repräsentative klonale Mischbildstudie. g, Quantifizierung. h, Wachstumsfaktorbewertung für Basalorganoide nach d14-Sedimentation, enzymatischer Dissoziation und klonogener Kultur. Das Wachstum wurde durch den PORCUPINE-Inhibitor C59 (1 μM) nicht beeinträchtigt. n = 4 pro Bedingung, Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung, *** = P < 0,001, zweiseitiger Student-t-Test.

Quelldaten

a: Die hochauflösende Clusteranalyse identifiziert eine reproduzierbare aktive Basalzellsubpopulation mit deutlich höherer Expression von mRNAs für TNFRSF12A, den NOTCH-Signalwegmarker HES1 und den Proliferationsmarker MKI67. Modifizierter Kruskal-Wallis-Rangsummentest, zwei Tail-p-Werte: TNFRSF12A 4,15 × 10−8; HES1 2,4 × 10−10; MKI67 3,4 × 10−3. b: Feinauflösungs-Clustering von KRT5+-Populationen identifiziert zwei Basal 1-Subcluster, Basal 1.1 und 1.2. c, Genontologie PANTHER-Überrepräsentation unterschiedlich exprimierter Gene, angereichert mit Basal 1.2 im Vergleich zu 1.1, zeigt, dass die Mehrheit der Basal 1.2-Prozesse den Zellzyklus involvieren (Sternchen). Die vollständige Analyse finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. d, Violindiagramm der scRNA-seq-Analyse für Abb. 2f – h, das die KRT5-mRNA-Expression unter dreifach EPCAM+ITGA6+ITGB4+-mRNA-exprimierenden Einzelzellen zeigt (lila, d. h. Tandem-mRNA-Expression von). alle drei Gene) im Vergleich zum Rest der Zellen (grau), P < 0,001 zweiseitiger Kruskal-Wallis-Rangsummentest. e, t-SNE-Visualisierung der TNFRSF12A- und ITGA6-Expression von d unter Zellen mit EPCAM+ITGA6+ITGB4+-Genexpression und Unterteilung nach hoher (oberstes Quartil, orange), mittlerer (rosa) und niedriger (unteres Quartil, Marineblau) mRNA-Expression. f: Die proliferationsassoziierte Genexpression wird zunehmend für scRNA-seq-Zellfraktionen in EPCAM+ITGA6+ITGB4+-Zellen angereichert, die für niedrige, mittlere oder hohe Expression von TNFRSF12A-mRNA geschichtet sind, wie in e. Die Daten in f stellen Zellpopulationsfraktionen aus einem einzelnen Experiment dar. *** = P < 0,001, zweiseitiger Chi-Quadrat-Test.

a, Isolierung von Basal 1 und Basal 2 durch differenzielle Sedimentation von KRT5+-Zellen, gefolgt von FACS-Sortierung von EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12A+ (Basal 1) versus EPCAM-ITGA6-ITGB4-TNFRSF12A- (Basal 2). b: Intrazelluläre FACS-Messung der KRT5-Proteinexpression in den Basal-1- und Basal-2-Fraktionen von a. c, Repräsentatives Hellfeld der Organoidkulturen von Tag 14 aus a, b. d, Quantifizierung von 3 unabhängigen Experimenten aus a–c, Boxplot stellt erstes Quartil, Median, drittes Quartil dar und Whiskers stellen Minimum und Maximum dar. *** P < 0,001, zweiseitiger Student-T-Test. e, qPCR-Messung von zwei unterschiedlich hochregulierten Basal-2-Genen aus den drei scRNA-seq-biologischen Replikaten (Extended Data Abb. 6, SPRR1B, TMSB4X) nach längerer Kultur von FACS-isolierten Basal-1-Zellen. Bei den Daten handelt es sich um relative Mittelwerte ± Standardabweichung von Kulturen aus drei unabhängigen Experimenten, ** = P < 0,01, zweischwänziger Student-T-Test. f, RNA-FISH, der TMSB4X- und SPRR1B-Zelltranskripte in Organoiden zeigt, die aus Basal-1-Zellen stammen (Pfeile), Maßstabsbalken = 25 μm. g, KRT5-Immunfärbung und SFTPC- und SCGB1A1-RNA-FISH von FACS-isolierten TNFRSF12Ahi-Basal-1-Zellen unter Vehikel, NOTCH-Agonismus (JAG1-Peptid) oder NOTCH-Antagonismus mit dem Delta-ähnlichen Ligandenmutanten 4 (DLL4E12; E12) oder dem Gamma-Sekretase-Inhibitor DBZ; Maßstabsbalken = 50 μm. h, Fluoreszenzquantifizierung der Resazurin-Farbstoffreduktion zur Abschätzung der relativen Zellproliferation in g, Daten sind auf Vehikel (V) normiert und stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus fünf unabhängigen Experimenten dar, * P < 0,05, zweiseitiger Student-T-Test. i, Quantifizierung der SCGB1A1- und SFTPC-Genexpression durch RNA FISH im Zusammenhang mit NOTCH-Agonismus oder -Antagonismus aus drei unabhängigen Experimenten, ** P < 0,01, *** P < 0,001, zweiseitiger Student-T-Test. Die Hochregulierung der SFTPC-mRNA ging nicht mit der Produktion von Lamellenkörpern oder SFTPC-Proteinen einher (Daten nicht gezeigt).

Quelldaten

a, b, Immunfärbung von KRT5 und TNFRSF12A in menschlichen distalen Atemwegen von zwei Personen, Maßstabsbalken = 100 μm. c, Immunfärbung von KRT5, TNFRSF12A und p63 im distalen Atemweg des Menschen, Maßstabsbalken = 100 μm. d, FACS-Analyse aus frisch fixierter menschlicher distaler Lunge mit Anti-KRT5 (intrazellulär) und monoklonalem Anti-TNFRSF12A (Zelloberfläche) (oben) oder sequentielle FACS-Isolierung aus frisch dissoziierter menschlicher distaler Lunge von EPCAM+ITGA6+ITGB4+-Zellen, gefolgt von Fraktionierung in TNFRSF12Ahi- oder TNFRSF12Aneg-Teilmengen (unten), vorab auf lebende Singuletts abgetrennt und für Kulturexperimente in Abb. 3d – g verwendet.

a, b: Distale Lungenorganoidmodellierung einer H1N1-Influenza-Infektion. a, Zusammengeführte Transmissions- und GFP-Konfokalbilder von gereinigten Basalorganoiden (links) und gereinigten AT2-Organoiden (rechts) 12 Stunden nach der Infektion mit dem PR8-GFP-H1N1-Influenzavirus, quantifiziert durch FACS für % GFP+-Zellen. Das Balkendiagramm stellt den mittleren Prozentsatz infizierter Zellen aus drei technischen Replikaten dar, P = 0,57, Chi-Quadrat-Test. Maßstabsbalken = 50 μm. b, Quantifizierung des viralen Genoms über die Zeit von gemischten distalen Lungenorganoid-Kulturüberständen, die einer Erstinfektion mit Wildtyp H1N1 bei einer geschätzten Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 ausgesetzt waren, qRT-PCR, Daten stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung c dar , d, Lektinfärbung mit Lektinen von M. amurensis (a2-3) und S. nigra (a2-6) oder Negativkontrollen ohne Lektin zur Charakterisierung von Sialinsäureresten, die als Oberflächenmoleküle für den Eintritt in die Wirtszelle des Influenzavirus dienen. AT2-Organoide (c) und Basalorganoide (d). Maßstabsbalken = 25 μm. e, Dosis-Wirkungs-Kurven für zwei verschiedene Klassen antiviraler Medikamente auf Influenza-Infektiosität und -Replikation. Das Nukleosidanalogon FdC zeigte eine dosisabhängige Aktivität mit einem IC50-Wert von 340 nM im Vergleich zum Neuraminidase-Inhibitor Zanamivir, der nur die Virusausscheidung, nicht aber die Infektiosität und Replikation beeinträchtigt. n = 3 pro Bedingung, die Daten stellen den Mittelwert ± SEM f dar, Fluoreszenzmikroskopaufnahme des Multiwell-Screenings ausgewählter verschiedener antiviraler Wirkstoffe nach einer H1N1-PR8-GFP-Organoidinfektion im 48-Well-Format. FdC = Nukleosidanalogon 2'-Desoxy-2'-fluorcytidin. Cpd = Verbindungsnummer.

Quelldaten

a, scRNA-seq-Diagramme der ACE2- und TMPRSS2-Genexpression in ECM-eingebetteten gemischten distalen Lungenorganoiden wie in Abb. 1a – h. b, Diagramm der ECM-Entfernung und Suspensionskultur, die zu einer apikalen Polarität der Lungenorganoide führt. c, Repräsentative konfokale Mikroskopie, die die Reorganisation von Mikrofilamenten (Phalloidin) und acetylierten Mikrotubuli (AcTUB) nach der ECM-Entfernung zeigt. Maßstabsbalken = 10 μm. d–f, Polarisation und beschleunigte Ziliardifferenzierung von apikal nach außen gerichteten basalen Organoiden. d, Konfokale 3D-Schnitte (obere Felder) und Oberflächenrekonstruktionen (untere Felder) von apikal nach außen gerichteten Lungenorganoiden an verschiedenen Tagen nach der ECM-Entfernung. Am Tag 0 (d0) ist die Organisation von Mikrofilamenten (grün, Phalloidin) und Mikrotubuli (rot, acetyliertes Tubulin) nicht polarisiert, während Verbindungsstränge (ZO-1, weiß) polarisiert sind. Am zweiten Tag in Suspension (d2) bildet ZO-1 (weiß) Verbindungsringe in der apikalen Peripherie jeder Zelle, die der Außenseite der Organoide zugewandt ist, und das Aktin-Zytoskelett bildet Mikrovilli (grün), die nach außen zeigen (Polarität nach außen). Außerdem beginnen einige Zellen bei d2 mit der Mikrotubuli-Polarisierung. Am 5. Tag (d5) haben viel mehr Zellen bewegliche Flimmerhärchen, die nach außen zeigen. Reife bewegliche Zilien können mehrere Wochen lang beobachtet werden, beispielsweise am 14. Tag (d14). e, konfokale 3D-Rekonstruktion eines in ECM eingebetteten Organoids, das hauptsächlich aus basalen Stammzellen besteht (KRT5+, weiß). f: Wenn in der Suspensionskultur die apikale Polarität hergestellt wird und die Ziliogenese beginnt, werden KRT5+-Basalzellen unter dem polarisierten Epithel gefunden. g, SCGB1A1+ Club-Zellen mit apikaler Polarität sind auf der Außenfläche vorhanden. In allen Panels sind die Kerne mit DAPI blau gefärbt und die Organisation der Aktin-Mikrofilamente mit Phalloidin (grün) sichtbar gemacht. Maßstabsbalken = 10 μm. h–j, Eine längere Suspensionskultur von AT2-Organoiden (Tag 10 nach der Suspension) induziert eine Polarisation nach apikal nach außen und eine AT1-Differenzierung. h, Optische Schnitte durch aus Alveolarzellen gewonnene Organoide nach 10 Tagen in Suspensionskultur zeigen eine verringerte Häufigkeit von AT2-Zellen, während einzelne quaderförmige Zellen beginnen, den AT1-Marker HTI-56 (rot) zu exprimieren, ein Transmembranprotein, das für die apikale Membran von Alveolartyp 1 spezifisch ist Pneumozyten (AT1). Maßstabsbalken = 10 μm. i, j, Seitenansichten von Alveolarorganoiden nach 10 Tagen Suspensionskultur zeigen dünne AT1-Zellen mit nach außen gerichteten Phalloidin-reaktiven apikalen Verbindungskomplexen (apikal nach außen) (i) und Expression von HTI-56 auf der apikalen Membran (j). Maßstabsbalken = 10 μm. k, Repräsentative konfokale Mikroskopie-Immunfluoreszenz eines apikal nach außen gerichteten menschlichen Basalorganoids nach 10 Tagen in Suspension, das den SARS-CoV-2-Rezeptor ACE2 (grün), Zilien (AcTUB, rot) und DAPI (blau) exprimiert. Maßstabsbalken = 20 μm.

Gating-Strategien. a, EPCAM+Lysotracker+ Gating-Strategie zur Reinigung von AT2-Zellen. Die Reinheit wurde mit 100/100 sortierten Zellen bestätigt, die positiv auf SFTPC-Protein gefärbt waren (entsprechend Extended Data Abb. 4a). b, EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi/neg-Gating-Strategie. Die Reinheit wurde mit 100/100 gepoolten sortierten Zellen bestätigt, die positiv auf KRT5-Protein gefärbt waren (entsprechend Abb. 2j-k). c, Gating-Strategie zur Analyse von KRT5+-Zellen und entsprechenden TNFRSF12A+-Populationen in Zellen, die frisch aus der distalen menschlichen Lunge dissoziiert wurden (entsprechend Extended Data Abb. 8d). d, RT-PCR-Korrelation von TNFRSF12A und anderen mRNAs aus Zellen, sortiert durch FACS in die Fraktionen TNFRSF12A neg, med und hi (Abb. 3d). e, Gating-Strategie zur Abschätzung der H1N1-PR8-GFP-Infektiosität in menschlichen Lungenorganoiden (entsprechend Extended Data Abb. 9a).

Klinische Demografie von 136 in dieser Studie verwendeten Lungengewebespendern. Jede Zeile entspricht einer einzelnen Person, von der eine normale Lunge gewonnen wurde, und die Spalten entsprechen Merkmalen wie Alter, Geschlecht und anatomischer Lage der Lunge.

Für die SPADE-Analyse verwendete Gene. Gene wurden in SPADE basierend auf einer graphbasierten Cluster-Annotation von Zellen aus der scRNA-seq-Analyse von drei Individuen verwendet. Vollständige SPADE-Details finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) der am häufigsten differenziell exprimierten Gene aus scRNA-seq-Populationen. Die Populationen entsprechen Basal 1, Basal 2, Basal 1.1, Basal 1.2 und Cluster 1 der gereinigten AT2-scRNA-seq-Datensätze. Die am häufigsten differenziell exprimierten Gene für jede Population sind in jeder Registerkarte aufgeführt. Fett gedruckt = Gene, die für die GSEA-Analyse verwendet werden (Panther-Überrepräsentationstest, mit Bonferroni-Korrektur, p-Werte sind zweiseitig).

Liste der Basal-1-Membranprotein-Gene. Die Gene wurden durch Ontologieanalyse der am stärksten differenziell exprimierten Basal-1-Gene mit der GO-Bezeichnung 0031224 (intrinsische Komponente der Membran) identifiziert.

Analyse der SARS-CoV-2-Infektion in Lungenorganoidkulturen. Positiv infizierte Zellen wurden durch dsRNA- und SARS-CoV-2-NP-Färbung unter KRT5+-Basalzellen, SCGB1A1+-Keulenzellen und AcTUB+-Zilienzellen mittels konfokaler Mikroskopie quantifiziert. Die statistische Analyse (Chi-Quadrat-Test oder exakter Fisher-Test) wurde wie angegeben durchgeführt.

Next-Generation-Sequenzierung von fünf distalen Lungenorganoidkulturen. Zusammenfassung und Anmerkungen nicht-synonymer Varianten mit einer Allelfrequenz > 0,10 für 130 Krebsgene unter Verwendung des TOMA Tumor Profiling System (TOMA, Foster City, CA).

Reagenzientabellen. Einzelne Tabellen der organoiden Medienkomponenten, Immunfärbungs- und Fluoreszenzmikroskopie-Reagenzien, RT-PCR-Reagenzien, RT-PCR-Primer und RNA-Hybridisierungssonden, die in dieser Studie verwendet wurden.

Leitfaden zur Lungenorganoid-scRNA-seq-Analyse. scRNA-seq-Analyse für Lunge 1, 2, 3 und gereinigte AT2-Organoide im .rmd- und .html-Format.

Sequenzierung der Lungenorganoidkultur. Next-Generation-Sequencing-Daten für jede der fünf distalen Lungenorganoidkulturen (TOMA Tumor Profiling System) werden im Variant Call Format bereitgestellt.

Differenzierte Basalorganoide haben funktionelle Zilien, Teil 1. Video der konfokalen Transmissionsmikroskopie schlagender Zilien (25-fache Vergrößerung).

Differenzierte Basalorganoide haben funktionelle Zilien, Teil 2. Hellfeldmikroskopisches Video schlagender Zilien (10-fache Vergrößerung).

Apikal nach außen differenzierte Basalorganoide verfügen über funktionelle Zilien. DIC- und konfokale 3D-Mikroskopievideo von beweglichen Zilien in apikal nach außen gerichteten basalen Organoiden am 5. und 14. Tag der Suspensionskultur.

Nachdrucke und Genehmigungen

Salahudeen, AA, Choi, SS, Rustagi, A. et al. Identifizierung von Vorläufern und SARS-CoV-2-Infektion in menschlichen distalen Lungenorganoiden. Natur 588, 670–675 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

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Eingegangen: 08. November 2017

Angenommen: 18. November 2020

Veröffentlicht: 25. November 2020

Ausgabedatum: 24. Dezember 2020

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

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