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Oct 27, 2023

Doppelte Blockade beider PD

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2472 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Darmkrebs ist eine schwach immunogene Erkrankung. Diese Eigenschaft kann mithilfe von ICD wiederhergestellt werden. ICD-Induktoren können jedoch auch die Expression der inhibitorischen Checkpoint-Rezeptoren CD47 und PD-L1 auf Tumorzellen induzieren, wodurch CRC-Tumoren hauptsächlich gegen die Abtötung von CD8-T-Zellen und die Makrophagen-vermittelte Phagozytose resistent werden. In dieser Studie untersuchten wir die therapeutische Wirkung des Oxaliplatin- und FOLFOX-Regimes in Kombination mit blockierenden Antikörpern gegen CD47 und PD-L1. Die Behandlung mit FOLFOX und Oxaliplatin führte in vitro und in vivo zu einem Anstieg der CD47- und PD-L1-Expression auf CT-26-Zellen. Die Kombination blockierender Antikörper gegen CD47 und PD-L1 mit FOLFOX führt zu einer signifikanten Steigerung der Überlebensrate und einer Verringerung der Tumorgröße. Dieses dreifache Kombinationsschema führt auch zu einer signifikanten Verringerung von Treg und MDSC und einem signifikanten Anstieg der CD8 + INF-γ + -Lymphozyten und des M1/M2-Makrophagen-Verhältnisses in der Tumormikroumgebung. Unsere Studie zeigte, dass die Dreifachkombinationstherapie mit FOLFOX, CD47 und PD-L1 ein wirksames Behandlungsschema im Tumormodell von CT-26-Mäusen ist und möglicherweise als Potenzial für eine Übertragung in die Klinik in Betracht gezogen wird.

Trotz jahrelanger fortgeschrittener Forschung bleibt Darmkrebs (CRC) eine der häufigsten und aggressivsten Formen solider Tumoren. Als erste Behandlungslinie bei fortgeschrittenem Darmkrebs wird FOLFOX (5-Fluorouracil plus Oxaliplatin) routinemäßig als kombiniertes Chemotherapieschema eingesetzt. Allerdings schränkt die erworbene Arzneimittelresistenz ihre Antitumorwirkung ein; Daher werden Chemotherapieschemata nicht mit heilender Absicht verabreicht1,2.

Obwohl die Blockierung der Achse „Programmiertes Zelltodprotein-1 (PD-1)/programmierter Todesligand-1 (PDL-1)“ zu einem Paradigmenwechsel in der Krebsimmuntherapie führte und großes Potenzial in der Krebsbehandlung zeigte, kann sie nicht auf alle Arten von Krebserkrankungen verallgemeinert werden Krebserkrankungen3,4. Aktuelle Studien betonen die Bedeutung der Immunkontextstruktur der Tumormikroumgebung für die heterogene Reaktion auf die Immun-Checkpoint-Blockade (ICB)5. CRC, insbesondere mikrosatellitenstabile (MSS), gehören zu den Tumoren, die aufgrund ihrer geringen Immunogenität und der geringen Anzahl tumorinfiltrierter CD8+-T-Zellen schlecht auf die Checkpoint-Therapie ansprechen4,6,7. CRC-Patienten mit Mikrosatelliteninstabilität (MSI) zeigten eine höhere Anzahl vorbestehender tumorinfiltrierter CD8+-T-Zellen und ein besseres Ansprechen auf eine Anti-PD-1-Therapie7,8.

Eine Möglichkeit, die schlechte Immunogenität von Tumoren und die Infiltration von CD8+-T-Zellen zu verbessern, besteht darin, den immunologischen Zelltod-Induktor (ICD) als Chemotherapeutikum zu verwenden1,9,10. Es wurde gezeigt, dass sowohl die FOLFOX-Therapie als auch Oxaliplatin die ICD wirksam induzieren, obwohl sie die Checkpoint-Rezeptor-Expression sowohl in Tumorzellen als auch in Lymphozyten erhöhen1,11. Unter den Checkpoint-Rezeptoren werden sowohl PD-L1 als auch CD47 nach der Behandlung mit FOLFOX und Oxaliplatin bei Patienten überexprimiert1.

Die Hochregulierung von CD47, ein Mechanismus, der dazu führt, dass Krebszellen ihr „Selbstgefühl“ steigern, spielt eine wichtige Rolle bei der Hemmung der Phagozytose von Tumorzellen durch Makrophagen und dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus führt eine Erhöhung seiner Expression zur Blockierung der Kreuzpräsentation durch DCs12,13. Eine höhere Expression von CD47 wird bei zahlreichen Krebsarten beobachtet, die mit einer schlechteren Prognose und einem Anstieg der Mortalität verbunden sind. Die Blockierung von CD47/Signalregulationsprotein α (SIRPα) ist eine neue Ära in der Krebsimmuntherapie14. Mehrere klinische Studien untersuchen den klinischen Nutzen dieses angeborenen Immun-Checkpoint-Rezeptors, wobei einige Phase-I-Studien veröffentlicht wurden15,16. Es wird jedoch erwartet, dass Monotherapien, die CD47/SIPR-α blockieren, nicht als heilende Behandlung wirken, und die Kombination der Therapie angeborener mit adaptiven ICBs und Chemotherapien steht im Fokus14,17,18,19.

In der aktuellen Studie wollten wir das Potenzial einer Kombinationstherapie mit Oxaliplatin (OXP) als wirksamem ICD-Induktor und der Freisetzung schadensassoziierter molekularer Muster (DAMPs), die als intrinsischer Impfstoff wirken, mit Anti-CD47- und Anti-PD-Inhibitoren untersuchen. L1. Wir gehen davon aus, dass DCs und Makrophagen durch die Bereitstellung eines „Iss mich“-Signals und die Blockierung des „Iss mich nicht“-Signals durch den ICD-Induktor bzw. die Blockierung von CD47 Tumorzellen phagozytieren und eine Immunantwort induzieren würden. Im Effektorarm von CD8+ T-Zellen verstärkt die Blockierung von PD-L1 deren Effektorfunktion und zerstört Tumorzellen. Anhand des CT-26-Mausmodells untersuchen wir den Ersatz von Oxaliplatin durch FOLFOX in der von uns entwickelten Kombinationstherapie weiter, um die Quelle potenzieller Synergien zu ermitteln. Unsere Daten zeigten, dass FOLFOX in einer Kombination aus Anti-CD47 und Anti-PD-L1 bei CT-26-tumortragenden Mäusen zu einer signifikanten Steigerung der Überlebensrate und einer Verringerung der Tumorgröße führte.

Um zu beurteilen, ob das OXP- und FOLFOX-Regime die Expression von CD47 und PD-L1 in CT-26-Zellen in vitro beeinflusst, analysierten wir deren Expression mit dem Durchflusszytometer nach der Behandlung mit Chemotherapeutika. Sechs Stunden nach der Behandlung der Zellen mit OXP oder FOLFOX im Zellkulturmedium wurden die Zellen aus den Vertiefungen entnommen und mit einem Durchflusszytometer analysiert. Sowohl das OXP- als auch das FOLFOX-Regime erhöhen die Expression von CD47 und PD-L1 auf der CT-26-Zelloberfläche (Abb. 1A–F). FOLFOX erhöht sogar die Expression von CD47 und PD-L1 stärker als OXP (P < 0,0001).

FOLFOX und OXP erhöhten die CD 47- und PD-L1-Expression auf der Zelloberfläche von CT-26-Zelllinien. (A–D) Gating-Strategien zur Analyse der CD47- und PD-L1-Zelloberflächenexpression in der CT-26-Tumorzelllinie nach Behandlung mit OXP und FOLFOX. (E) CT-26-Tumorzellen wurden mit OXP oder FOLFOX behandelt und die CD47-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. (F) Tumorzellen wurden mit OXP oder FOLFOX behandelt und die PD-L1-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung des OXP- und FOLFOX-Regimes auf die CD47- und PD-L1-Expression in vivo (Abb. 2A – G). Mäuse, die einen CT-26-Tumor trugen, wurden entweder mit OXP oder FOLFOX behandelt, und 3 Tage nach der Behandlung wurden die Mäuse eingeschläfert und Einzelzellen wurden aus der Tumormasse gewonnen. Das FOLFOX-Regime und OXP erhöhten die PD-L1-Expression in aus Mäusen extrahierten Tumorzellen signifikant (P < 0,0001 bzw. P = 0,048). Darüber hinaus erhöht FOLFOX, wie in Abb. 2C gezeigt, im Vergleich zu OXP auch die PD-L1-Expression. Die CD47-Expression stieg nur signifikant an, wenn Mäuse mit FOLFOX behandelt wurden (P < 0,0001), aber OXP konnte die CD47-Expression nicht signifikant steigern.

Wirkung von FOLFOX und OXP auf die Zelloberflächenexpression von CD47 und PD-L1 in CT-26-inokulierten Tumoren. (A–E) Gating-Strategien zur Analyse der CD47- und PD-L1-Zelloberflächenexpression im CT-26-Tumor bei Mäusen nach Behandlung mit OXP und FOLFOX. (F) CT-26-Tumorzellen wurden mit OXP oder FOLFOX behandelt und die CD47-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. (G) Tumorzellen wurden mit OXP oder FOLFOX behandelt und die PD-L1-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Als nächstes wollten wir feststellen, ob die Kombination einer Therapie mit Anti-CD47-, Anti-PD-L1- und immunologisch tödlichen Chemotherapeutika (OXP oder FOLFOX) im Vergleich zu einer Chemotherapie oder einer Bikombinationstherapie mit Chemotherapie und Checkpoint-Blockern eine Antitumorreaktion hervorrufen könnte. Als das Tumormodell für CT-26-Mäuse etabliert wurde, erhielt jede Gruppe entsprechende therapeutische Wirkstoffe. Der detaillierte Zeitplan für die Injektion von Chemotherapeutika und/oder Anti-CD47- und Anti-PD-L1-Medikamenten ist in Abb. 3A zusammengefasst. Um Nebenwirkungen und mögliche Toxizität unseres Kombinationsschemas zu überwachen, wurden die Mäuse während der Studie gewichtet. In keiner der Therapiegruppen wurde ein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet (Abb. 3B).

Die Kombination von FOLFOX, Anti-CD47 und Anti-PD-L1 zeigte das beste Potenzial im syngenen CT-26-Tumormodell. (A) Detaillierter Zeitplan für die Injektion therapeutischer Wirkstoffe. (B) Veränderungen im durchschnittlichen Körpergewicht (g) tumortragender Mäuse in der Kontrollgruppe und in verschiedenen behandelten Gruppen. (C) Überleben der Mäuse in Tagen, wobei das mittlere Überleben angezeigt wird. Die Signifikanz wurde durch den Log-Rank-Test (MantelCox) bestimmt; n = 5 Mäuse pro Gruppe. (D) BALB/c-Mäusen mit CT-26-Tumor wurde das entsprechende Therapieschema gemäß dem angegebenen Zeitplan injiziert. Das Tumorvolumen wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen. (E–K) Tumorvolumen jeder Maus in allen Therapiegruppen.

Die Kombination von Anti-CD47 und Anti-PD-L1 mit einer OXP- oder FOLFOX-Therapie führte zu einer signifikanten Steigerung der Überlebensrate von Mäusen, die drei Kombinationstherapien erhielten, im Vergleich zu beiden Monotherapien mit Chemotherapeutika und einer Bikombinationstherapie (Anti-CD47 oder Anti-PD-L1 mit). OXP) (Abb. 3C). Diese Daten werden auch durch die Daten zur Zeit bis zum Erreichen des Endpunkts (TTE) und zur prozentualen Verzögerung des Tumorwachstums (TTG) in Tabelle 1 gestützt. Die Analyse der Tumorgröße zeigte auch, dass Mäuse, die Anti-CD47, Anti-PD-L1 und FOLFOX erhielten, den langsamsten Tumor aufwiesen Wachstumsrate (Abb. 3D–K).

Um mögliche Faktoren zu ermitteln, die bei Mäusen mit CT-26-Tumoren zu einer besseren therapeutischen Reaktion auf die Dreifachkombinationstherapie führten, untersuchten wir den Treg- und CD8+/INF-γ+-T-Zellengehalt in Milz und Lymphknoten. Das Profilieren von Immunzellen in tumordrainierenden Lymphknoten zeigte keine signifikante Veränderung zwischen den Therapiegruppen (ergänzende Abbildung S1). In der Milz führte die Monotherapie mit OXP und FOLFOX zu einem Anstieg der Treg-Population, obwohl dieser Anstieg der Treg-Population nicht signifikant war. Die Kombination von OXP mit weder Anti-CD47 noch Anti-PD-L1 hat keinen signifikanten Einfluss auf die Treg-Population. Sowohl das Triple-Combining-Regime senkte den Treg-Gehalt im Vergleich zur OXP- als auch zur FOLFOX-Monotherapie signifikant (Abb. 4A, B). CD8+/INF-γ+ T-Zellen nehmen auch in der Milz von Mäusen zu, die OXP oder FOLFOX + Anti-CD47 und Anti-PD-L1 erhielten, im Vergleich zu Mäusen in der Kontrollgruppe und Mäusen, die OXP oder FOLFOX erhielten. Darüber hinaus erhöhte FOLFOX + Anti-CD47 und Anti-PD-L1 die CD8+/INF-γ+ T-Zellen im Vergleich zu OXP + Anti-PD-L1 (Abb. 4C, D).

Die Kombination der Therapie mit OXP oder FOLFOX mit Anti-CD47 und Anti-PD-L1 führte zu einer Verringerung des Treg in CD4+-Zellen und zu einer Zunahme von CD8+/INF-γ+-Zellen in der CD45+-Population in der Milz. (A) Gating-Strategie für die Treg-Analyse in der Milz. (B) OXP und FOLFOX erhöhten Treg in CD4+-Zellen, dieser Anstieg war jedoch nicht signifikant. Sowohl OXP als auch FOLFOX in Kombination mit Anti-CD47 und Anti-PD-L1 verringerten den Treg in CD4+-Zellen, und dieser Rückgang war signifikant im Vergleich zu Mäusen, die nur OXP oder FOLFOX erhielten. (C) Gating-Strategie für die CD8+/INF-γ+-Analyse in der CD 45+-Milzpopulation. (D) Sowohl OXP als auch FOLFOX in Kombination mit Anti-CD47 und Anti-PD-L1 erhöhten CD8+/INF-γ+ in der CD45+-Population. Dieser Anstieg war im Vergleich zu den meisten anderen Therapiegruppen signifikant.

Basierend auf den oben genannten Beweisen ist es sehr wahrscheinlich, dass die Kombinationstherapie zu einer Veränderung der Tumormikroumgebung zugunsten der Aktivierung des Immunsystems führte. Deshalb untersuchten wir die Veränderung verschiedener Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung nach Behandlungen. Die Treg-Anzahl pro Gramm Tumor stieg nur nach einer Monotherapie mit Chemotherapien an, dieser Anstieg des Treg-Gehalts war jedoch bei Mäusen, die FOLFOX erhielten, signifikant. Bei gleichzeitiger Verabreichung von Anti-CD47 und Anti-PD-L1 mit OXP und FOLFOX kommt es im Vergleich zur Monotherapie mit Chemotherapeutika zu einer Verringerung des Tumor-Treg-Gehalts. Dieser Rückgang des Treg-Gehalts war jedoch nur bei Mäusen signifikant, die FOLFOX + Anti-CD47 und Anti-PD-L1 erhielten, im Vergleich zu Mäusen, die FOLFOX allein erhielten (Abb. 5A).

Immunzellanalyse in der Tumormikroumgebung von Mäusen, die einen CT-26-Tumor tragen. (A) Treg-Zahl pro Gramm Tumor. Nach der Behandlung sowohl mit OXP als auch mit dem FOLFOX-Regime stieg die Treg-Zahl in der Tumormikroumgebung an, war jedoch nur in der FOLFOX-Behandlungsgruppe signifikant. Die Kombination von Anti-CD47 und Anti-PD-L1 mit FOFOX führt zu einer signifikanten Verringerung von Treg pro Gramm Tumor im Vergleich zu Mäusen, die nur FOLFOX erhielten. (B) CD8+T-Zellenzahl pro Gramm Tumor. OXP und FOLFOX und FOLFOX veränderten die Anzahl der CD8+T-Zellen nicht, aber in Gruppen, die im Rahmen ihrer Behandlung Anti-CD47 erhielten, stieg die Anzahl der CD8+T-Zellen pro Gramm Tumor signifikant an. (C) MDSC-Anzahl pro Gramm Tumor. (C) OXP und FOLFOX erhöhten die MDSC-Zahl, waren jedoch nur in der FOLFOX-Empfängergruppe signifikant, als wir Anti-CD47 in der Kombinationstherapie hinzufügten. Dies führte zu einer signifikanten Verringerung der MDSC-Zahl im Vergleich zu Mäusen, die OXP, FOLFOX und OXP + PD erhielten -L1. D, M1/M2-Makrophagen-Verhältnis in der Tumormikroumgebung. Durch die Zugabe von Anti-CD47 zu den Kombinationsschemata wird das M1/M2-Makrophagen-Verhältnis im Vergleich zu anderen Gruppen erhöht.

CD8+-T-Zellen pro Gramm Tumor nahmen im Anti-CD47-Stil zu; Fast jede Therapiegruppe, die Anti-CD47 im Rahmen des Therapieschemas erhielt, zeigte einen signifikanten Anstieg der CD8+-T-Zellen im Vergleich zu Gruppen, die es nicht erhielten (Abb. 5B). MDSC pro Gramm Tumor stieg auch nach OXP- und FOLFOX-Behandlungen signifikant an. Darüber hinaus erhöhte die FOLFOX-Monotherapie den MDSC-Gehalt in Tumoren im Vergleich zur OXP-Monotherapie. Dieser Anstieg der MDSC pro Gramm Tumor wurde durch die Verwendung von Anti-CD47 im Einklang mit seiner Wirkung auf den Treg-Gehalt im Tumor umgekehrt (Abb. 5C). Wir untersuchen auch die Wirkung eines Therapieschemas auf das M1/M2-Verhältnis in der Tumormikroumgebung. Eine FOLFOX- oder OXP-Monotherapie beeinflusst das M1/M2-Verhältnis in einem Tumor nicht wesentlich. Aber bei Mäusen, die Anti-CD47 in Form einer Bikombinationstherapie mit OXP und einer Trikombinationstherapie mit OXP oder FOLFOX erhielten, stieg das M1/M2-Verhältnis signifikant an (Abb. 5D).

In dieser Studie untersuchten wir das Potenzial der Kombination einer Chemotherapie mit der Blockierung sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immun-Checkpoint-Rezeptoren im CT-26-Mausmodell. In mehreren veröffentlichten Berichten wurde betont, wie wichtig es ist, sowohl angeborene als auch adaptive Checkpoint-Blocker zu kombinieren. Der Grundgedanke hinter der Kombination angeborener mit adaptiven Checkpoint-Blockern besteht darin, DC-, Makrophagen- und T-Zell-Reaktionen gegen Tumorzellen zu orchestrieren20,21. Sowohl OXP- als auch FOLFOX-Therapien gelten als wirksame ICD-Induktoren und werden in der Klinik zur Routinebehandlung von CRC-Patienten eingesetzt.

In Übereinstimmung mit zahlreichen Studien, die über einen Anstieg der Checkpoint-Rezeptoren nach einer Chemotherapie berichteten, stellen wir einen Anstieg der CD47- und PD-L1-Expression nach der Behandlung mit OXP und FOLFOX fest11,22. Aufgrund der Toxizität der OXP- und FOLFOX-Chemotherapie konnte die In-vitro-CD47- und PD-L1-Expressionsanalyse erst sechs Stunden nach der Behandlung der CT-26-Zellen beurteilt werden. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkung erhöhte sich die PD-L1-Expression sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Experimenten sowohl durch OXP als auch durch FOLFOX, und nach der Behandlung mit OXP und FOLFOX wurde in vitro ein Anstieg der CT-26-Zelloberflächenexpression von CD47 festgestellt. Bei tumortragenden Mäusen induzierte nur FOLFOX einen Anstieg der CD47-Expression, und obwohl die OXP-Behandlung die CD47-Expression auf der Oberfläche von CT-26-Zellen steigerte, war dieser Anstieg unbedeutend. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die enzymatische Verdauung einen Einfluss auf die Expression von Zelloberflächenmarkern hat; Daher kann das Fehlen eines signifikanten Anstiegs der CD47-Expression durch OXP auf einen teilweisen Verlust von CD47 nach der enzymatischen Verdauung des Tumors zurückgeführt werden23,24. An der Erhöhung der Checkpoint-Rezeptor-Expression nach Chemotherapien könnten mehrere Mechanismen beteiligt sein. In einer aktuellen Studie haben Samanta et al. berichteten über einen HIF-abhängigen Mechanismus für einen Anstieg der PD-L1- und CD47-Expression nach Behandlung mit Chemotherapeutika11. Darüber hinaus erhöhen ICD-Induktor-Chemotherapien die Infiltration von T-Zellen und das von infiltrierten Lymphozyten sezernierte INF-γ. Dieser Anstieg der Infiltration von Effektorzellen und der INF-γ-Sekretion lässt darauf schließen, dass es sich um einen weiteren Faktor handelt, der die inhibitorische Checkpoint-Expression erhöht, wie z. B. PD-L1 und CD47 auf Tumorzellen25,26,27,28.

Sowohl Anti-CD47 als auch Anti-PDL-1 wurden in Kombination mit verschiedenen Chemotherapieschemata eingesetzt und zeigten vielversprechende Ergebnisse bei Mäusen und in klinischen Studien. Unsere Studie ist jedoch die erste, die mögliche Synergien durch die Kombination von dreifacher Chemotherapie und Immuntherapie untersucht. OXP in Kombination mit Anti-CD47 und Anti-PD-L1 erhöhte die Überlebensrate von Mäusen und verringerte das Tumorwachstum im Vergleich zu OXP allein. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einem Anstieg der Expression von CD47 und PD-L1 nach der OXP-Behandlung, was zu einer Unterdrückung der Aktivierungsphase und der Effektorphase der Immunantwort führt. Durch den Einsatz von Anti-CD47 und Anti-PD-L1 konnten wir das negative Checkpoint-Signal unterdrücken und eine Immunantwort gegen den Tumor inszenieren. In Kombination mit Anti-CD47 und Anti-PD-L1 zeigte FOLFOX sogar noch mehr Potenzial. Der Grund für diese Beobachtung könnte eine stärkere DAMP-Freisetzung durch Tumorzellen nach einer Chemotherapie mit FOLFOX gegenüber OXP sein, was von Dosset et al.1 berichtet wurde.

Wie erwartet hatten unsere Behandlungsprotokolle einen erheblichen Einfluss auf das Immunzellprofil in der Milz und der Tumormikroumgebung. In der Milz erhöhten sowohl die OXP- als auch die FOLFOX-Therapie die Treg-Frequenz; Dieser Anstieg war jedoch statistisch nicht signifikant. Aber wenn wir Anti-CD47 und Anti-PD-L1 in Kombination mit OXP oder FOLFOX verwendeten, führte dies zu einer signifikanten Verringerung der Treg-Häufigkeit im Vergleich zur Behandlung mit OXP und FOLFOX allein. Wir konnten diesen Rückgang von Treg nicht beobachten, als Mäuse mit OXP in einem Doppelwirkstoff in Kombination mit Anti-CD47 oder Anti-PD-L1 behandelt wurden. In der Mikroumgebung des Tumors folgte die Änderung der Treg-Anzahl pro Gramm Tumor dem gleichen Muster wie die Änderung der Treg-Häufigkeit in der Milz. Aber nur FOLFOX hat statisch signifikante Änderungen vorgenommen. Sowohl Anti-PD-L1 als auch Anti-CD47 konnten in früheren Studien die Treg-Funktion unterdrücken und die Treg-Anzahl in Tumor- und Lymphorganen reduzieren29,30. In unserer Studie wurde ihre positive Wirkung nur beobachtet, wenn Anti-CD47 und Anti-PD-L1 in einer Dreifachkombination mit Chemotherapeutika eingesetzt wurden.

Wir haben gezeigt, dass die Infiltration von CD8+-T-Zellen in der Tumormikroumgebung von Mäusen, die Anti-CD47 als eines ihrer Behandlungsschemata erhielten, signifikant zunahm. In neueren Studien führte die CD47/SIPR-α-Blockade zu einem Anstieg der Häufigkeit und Funktion von CD8+-T-Zellen in der Tumormikroumgebung30,31. Liu et al. berichteten, dass bei der CD47-Blockade die antitumorale Wirkung vom Cross-Priming von CD8+-T-Zellen durch DC-Zellen abhängt32. Ein Anstieg der CD8+-T-Zellzahl pro Gramm Tumor in der aktuellen Studie untermauert den Überlebensvorteil und die Verringerung der Tumorgröße, mit der Ausnahme, dass wir den Vorteil im Überleben von Mäusen, die OXP und Anti-CD47 erhielten, nicht beobachteten. OXP und Anti-CD47 konnten den Treg-Gehalt in der Milz und der Tumormikroumgebung nicht reduzieren; Dieses Versagen könnte der Grund dafür sein, dass wir bei dieser Behandlungsstrategie trotz eines Anstiegs der CD8+-T-Zellen keine therapeutische Reaktion sahen.

Neben ihrer zytotoxischen Wirkung erhöhen Chemotherapeutika die MDCS-Häufigkeit durch die Wirkung von Entzündungsmediatoren, einschließlich GM-CSF, G-CSF, IL1β, IL6 und CCL233,34. Wir analysieren auch die MDSC-Anzahl pro Gramm Tumor und das M1/M2-Verhältnis in der Tumormikroumgebung. Die MDSC-Anzahl pro Gramm Tumor stieg nach einer Monotherapie sowohl mit OXP als auch mit FOLFOX. Wenn wir der Kombinationstherapie Anti-CD47 hinzufügen, kehrt sich dieser Anstieg der MDSCs um und die MDSC-Anzahl pro Gramm Tumor nimmt ab. In Übereinstimmung mit unserer Studie Wu et al. berichteten auch über einen Rückgang der MDSC-Population nach der Behandlung mit Anti-CD4735. M2-Makrophagen spielen eine wichtige Rolle beim Fortschreiten des Krebses, indem sie eine immunsuppressive Mikroumgebung für das Tumorwachstum bereitstellen36. Zhang et al. berichteten über die Repolarisation von M2-Makrophagen zu M1 nach einer Anti-CD47-Behandlung37. In unserer Studie an drei Mäusegruppen, die Anti-CD47 in Kombinationsbehandlungen erhielten, war das M1/M2-Makrophagen-Verhältnis erhöht.

Unsere Ergebnisse bestätigten das Konzept der Verwendung sowohl angeborener als auch adaptiver Checkpoint-Blocker in Kombination mit Chemotherapeutika. Basierend auf zahlreichen Studien scheinen unter verschiedenen Chemotherapeutika diejenigen mit ICD-Induktionsfähigkeit am besten für Kombinationstherapien mit Checkpoint-Inhibitoren geeignet zu sein. Wenn nicht für alle Krebsarten, so scheint es zumindest im CT-26-Tumormodell, dass die Blockierung sowohl der CD47- als auch der PD-L1-Achse für die beste therapeutische Reaktion erforderlich ist.

Die monoklonalen IgG-Anti-Maus-CD47- und IgG-Anti-Maus-PD-L1-Blockade-Antikörper (Klon: MIAP301 bzw. 10F.9G2) wurden von Bioxcell (NH, USA) bezogen. PerCP Ratten-Anti-Maus-CD4-Antikörper (RM4-5-Klon), PE-markierter Ratten-Anti-Maus-CD8a-Antikörper (53-6.7-Klon), PE-markierter Ratten-Anti-Maus-CD25-Antikörper (PC61-Klon), Alexa-Mehl® 488 markiert Ratten-Anti-Maus-Foxp3-Antikörper (MF-14-Klon), Alexa Fluor® 488 Anti-Maus-CD47 (MIAP301), PE-Anti-Maus-CD274 (B7-H1, PD-L1)-Antikörper (10F.9G2-Klon), PerCPanti-Maus /humaner CD11b-Antikörper (M1/70-Klon), Alexa Fluor® 488 Anti-Maus-CD80-Antikörper (16-10-A1-Klon), PE-Anti-Maus-CD206 (MMR)-Antikörper (C068C2-Klon), APC-markierter Anti-Maus-CD45-Antikörper (30F11-Klon), NIR-Zombie-Die (zur Lebend-/Tot-Unterscheidung) sowie geeignete Isotyp-Kontrollantikörper und ein True-Nuclear™-Transkriptionsfaktor-Pufferset wurden von Biolegend (CA, San Diego) erworben. Kollagenase Typ I wurde von Gibco (NY, USA) gekauft. DNase Typ I wurde von Roche (USA) bezogen. Die restlichen chemischen Lösungsmittel und Reagenzien waren von chemischer Qualität.

Um die Wirkung von OXP und FOLFOX auf die Zelloberflächenexpression von CD47 und PD-L1 zu bestimmen, wurde die Zelllinie CT-26 (Pasture Institute, Teheran, Iran) in RPMI 1560 Gibco (NY, USA) mit 10 % FBS Gibco (NY) gezüchtet , USA), Penicillin und Streptomycin, dann auf eine Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen entweder mit 50 µM OXP (Sobhan, Teheran, Iran) oder 50 µM OXP (Sobhan, Teheran, Iran) plus 10 µM 5-Fluorouracil (FOLFOX-Regime) (Alhavi, Teheran, Iran) behandelt. Die für die In-vitro-Studie verwendete Konzentration des Chemotherapeutikums basierte auf früheren Studien, die zu einer maximalen ICD-Induktion führten1. Sechs Stunden nach der Behandlung von CT-26-Tumorzellen mit Chemotherapeutika wurden die Zellen geerntet, mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern angefärbt und mit dem BD FACSlyric-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, USA) auf Zelloberflächenexpression von CD47 und PD-L1 analysiert.

Sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden vom Pasteur Institute, Thran, Iran, gekauft und in ordnungsgemäßem Zustand gehalten. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften sowie den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Die Tierstudie wurde auch vom Institutionellen Ethikausschuss und dem Forschungsbeirat der Shahid Beheshti University of Medical Sciences mit der Ethikcodenummer IR genehmigt. SBMU. MSP.REC.1396.370. Ein detailliertes Verfahren zur Tumorinduktion ist zuvor beschrieben38,39. Kurz gesagt, 106 CT-26-Tumorzellen wurden in die rechte Flanke jeder BALB/c-Mäuse injiziert. Als der Tumor 150 mm3 erreichte, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip auf der Grundlage ihres Tumorvolumens wie folgt in Behandlungsgruppen eingeteilt: Kontrolle (Mäuse erhielten Placebo), OXP (Mäuse erhielten Oxaliplatin, 6 mg/kg), FOLFOX (Mäuse erhielten Oxaliplatin, 6 mg). /kg + 5FU, 50 mg/kg + Flavinin 90 mg/kg), OXP + Anti-CD47 (100 µg pro Maus), OXP + Anti-PD-L1 (200 µg pro Maus), OXP + Anti-CD47 + Anti -PD-L1 und FOLFOX + Anti-CD47 + Anti-PD-L1. Die für das OXP- und FOLFOX-Regime verwendete Dosis und der Zeitplan basierten auf früheren Studien mit maximaler ICD-Induktion und geringster Zytotoxizität1. Wir begannen mit der Injektion von Chemotherapeutika, nachdem die Tumore 150 mm3 erreicht hatten (7 Tage nach der Tumorimpfung). Der detaillierte Zeitplan für die Injektion therapeutischer Wirkstoffe ist in Abb. 3A dargestellt. Die Tumorgröße von Mäusen, die einen CT-26-Tumor trugen, wurde alle drei Tage mit digitalen Messschiebern gemessen und das Tumorvolumen als a × b2/2 berechnet, wobei a der größte Durchmesser und b der kleinste Durchmesser ist. Die Messungen der Tumorgröße wurden fortgesetzt, bis die Tumorgröße 2000 mm3 erreichte. Die detaillierte Berechnung der Zeit bis zum Erreichen des Endpunkts (TTE), der Verzögerung des Tumorwachstums (%TGD) und der verlängerten Lebensdauer (ILS) jeder Maus wurde in unseren früheren Studien beschrieben40,41.

Zweiundzwanzig Tage nach der Tumorinokulation (7 Tage nach der letzten Injektion in therapeutischen Gruppen) wurden drei Mäuse aus jeder Gruppe durch CO2-Erstickung unter Isofluran-Euthanasie getötet und ihre austretenden Lymphknoten, Milz und Tumore wurden auf die Immunzellpopulation analysiert . Im Fall der Drainage von Lymphknoten und Milz wurde die Häufigkeit von Treg- und CD8+/INF-γ+-T-Zellen in der CD45+-Lebendzellpopulation analysiert. Für die Einzelzelltrennung verwendeten wir ein 70-µm-Zellsieb (SPL, Südkorea) und alle Färbeverfahren für die Durchflusszytometrie basierten auf den Anweisungen des Herstellers. Zur Tumoranalyse haben wir den Tumor mit 2 mg/ml Kollagenase Typ I und 10 IU/ml DNase Typ I im RPMI-Medium verdaut. Nach 90-minütiger Verdauung wurden die einzelnen Zellen mit einem 70-µm-Zellsieb von der Zellsuspension abgetrennt. Um die Wirkung von Oxaliplatin und FOLFOX auf die Zelloberflächenexpression von CD 47 und PD-L1 Invivo zu analysieren, wurde deren Expression im CD45-Lebendzelltor analysiert. Wir analysierten auch die genaue Population von T-reg, CD8+/INF-γ+ T-Zellen, MDCS und M1/M2-Makrophagen in der Tumormikroumgebung. Um die genaue Anzahl der infiltrierten Zellen zu quantifizieren, haben wir die abgetrennten Zellen pro Gramm Tumor berechnet. Mithilfe der Häufigkeit jeder Zellpopulation im Tor der lebenden Zelle konnten wir die Häufigkeit jeder Zellpopulation entsprechend der Anzahl spezifischer Zellen pro Gramm Tumor ändern. Die für jede Zellpopulation verwendete Gating-Strategie ist in den entsprechenden Abbildungen zusammengefasst.

Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism-Software (CA, USA) durchgeführt. Für Zweigruppenvergleiche wurden der t-Test und der Mann-Whitney-Test verwendet. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde der einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA-Test verwendet. Alle Unterschiede wurden auf dem Niveau von p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01) als statistisch signifikant angesehen. Die Überlebensanalyse erfolgte mit einem Mantel-Cox-Test. Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor, Seyed Amir Jalali, per E-Mail ([email protected]) erhältlich.

Dosset, M. et al. PD-1/PD-L1-Signalweg: Ein adaptiver Immunresistenzmechanismus gegenüber einer immunogenen Chemotherapie bei Darmkrebs. OncoImmunology 7, 1–14 (2018).

Artikel Google Scholar

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Dieser Artikel wurde aus der Dissertation von Herrn Reza Alimohammadi an der School of Medicine der Shahid Beheshti University of Medical Sciences (Registrierungsnummer: 364) entnommen. Genehmigungs-ID der Ethikkommission: IR. SBMU. MSP.REC.1396.370. Diese Arbeit wurde von der Shahid Beheshti University of Medical Sciences (Fördernummer: 10244) unterstützt.

Abteilung für Immunologie, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Teheran, 198571-7443, Iran

Reza Alimohammadi, Esmail Mortaz, Nariman Mossafa und Seyed Amir Jalali

Gruppe Tumorimmuntherapie und Mikroumgebung (TIME), Abteilung für Onkologie, Luxembourg Institute of Health (LIH), Luxemburg-Stadt, Luxemburg

Ghanbar Mahmoodi Chalbatani

Abteilung für Immunologie, Medizinische Fakultät, Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran

Masoumeh Alimohammadi

Abteilung für Immunologie, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Medizinische Universität Mashhad, Mashhad, Iran

Haniyeh Ghaffari-Nazari

Abteilung für Immunologie, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Tarbiat-Modares-Universität, Teheran, Iran

Arezou Rahimi

JJP Biologics, Warschau, Polen

Louis Bean

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Die Autoren RA & SAJ haben die Studie entworfen. RA hat ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Experiment entworfen und durchgeführt. RA, GMC, MA, HG und AR führten die In-vitro- und In-vivo-Experimente durch. RA, MA & AR haben das Manuskript geschrieben. RA, MA, EM, NM, LB, SAJ und AR haben das Manuskript bearbeitet. SAJ stellte die Mittel für das Projekt bereit.

Korrespondenz mit Seyed Amir Jalali.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alimohammadi, R., Mahmoodi Chalbatani, G., Alimohammadi, M. et al. Die doppelte Blockade von PD-L1 und CD47 verstärkt die therapeutische Wirkung von Oxaliplatin und FOLFOX im Tumormodell von CT-26-Mäusen. Sci Rep 13, 2472 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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Eingegangen: 24. August 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 11. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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