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Mar 17, 2023

Streptozotocin induziert durch die Aktivierung des p53-Signals eine Schädigung des proximalen Nierentubulus

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8705 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Streptozotocin (STZ), ein Krebsmedikament, das hauptsächlich zur Behandlung neuroendokriner Tumoren (NETs) im klinischen Umfeld eingesetzt wird, wird über den Glukosetransporter GLUT2 in die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse oder proximale tubuläre Epithelzellen eingebaut. Allerdings wurden seine zytotoxischen Wirkungen auf Nierenzellen unterschätzt und die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben unklar. Wir haben hier gezeigt, dass DNA-Schäden und die anschließende p53-Signalübertragung für die Entwicklung einer STZ-induzierten tubulären Epithelschädigung verantwortlich sind. Wir haben bei mit STZ behandelten NET-Patienten eine Schädigung der tubulären epithelialen DNA festgestellt. Unvoreingenommene Transkriptomanalysen von STZ-behandelten tubulären Epithelzellen in vitro zeigten die Aktivierung des p53-Signalwegs. STZ induzierte in vivo in dosisabhängiger Weise DNA-Schäden und aktivierte die p53-Signalübertragung, was zu reduzierten Membrantransportern führte. Die pharmakologische Hemmung von p53 und Natrium-Glucose-Transporter 2 (SGLT2) milderte die STZ-induzierte Epithelschädigung. Die zytotoxischen Wirkungen von STZ auf Pankreas-β-Zellen blieben jedoch bei mit SGLT2-Inhibitor behandelten Mäusen erhalten. Die vorliegenden Ergebnisse belegen die proximale tubuläre spezifische Zytotoxizität von STZ und die zugrunde liegenden Mechanismen in vivo. Da die zytotoxischen Wirkungen von STZ gegen β-Zellen durch Dapagliflozin nicht beeinträchtigt wurden, hat die Vorbehandlung mit einem SGLT2-Inhibitor Potenzial als vorbeugende Maßnahme bei Nierenschäden bei NET-Patienten, die mit STZ behandelt werden.

Streptozocin/Streptozotocin (STZ), ein Glukoseanalogon, wird als Antikrebsmedikament aus Alkylierungsmitteln klassifiziert und ist eine der Hauptklassen zytotoxischer Arzneimittel, die hauptsächlich zur Behandlung neuroendokriner Tumoren (NETs) eingesetzt werden1,2. STZ wird über den Glukosetransporter Typ 2 (GLUT2) in die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse eingebaut und fördert dadurch DNA-Schäden, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), mitochondriale Dysfunktion und die anschließende Apoptose3,4,5. Basierend auf den Ergebnissen klinischer Studien wird die Kombination von STZ und 5-Fluorouracil häufig zur Behandlung von Patienten mit gut differenzierten NETs6,7 eingesetzt.

Aufgrund der hohen Expression von GLUT2 in Leber und Nieren treten in diesen Organen häufige Nebenwirkungen von STZ auf2,8. Neben einer Nierenfunktionsstörung treten bei mit STZ9 behandelten Patienten manchmal Hypophosphatämie und renale Glykosurie auf. Nicht-diabetische Glykosurie oder Hypophosphatämie aufgrund von Hyperphosphaturie wird durch einen Rückgang der Natrium-Glukose-Transporter bzw. Natrium-Phosphat-Co-Transporter verursacht, die überwiegend an der apikalen Membran proximaler tubulärer Epithelzellen exprimiert werden. Da der Verlust oder die Abnahme der Bürstensaummembrantransporter eine erste Reaktion einer akuten Nierenverletzung ist10,11,12,13, kann Glykosurie oder Hypophosphatämie nach der STZ-Behandlung die latente Verletzung des proximalen Tubulus widerspiegeln, die im klinischen Umfeld unterschätzt oder ignoriert wird.

In experimentellen Bereichen wird STZ häufig als diabetogenes Mittel zur Zerstörung von β-Zellen der Bauchspeicheldrüse eingesetzt, was zur Entwicklung von Typ-1-Diabetes führt14,15. Bei Analysen der Nierenphänotypen bei STZ-induzierten Typ-1-Diabetikermäusen besteht jedoch ein potenzielles Problem in der Nierentoxizität, die durch die Verabreichung von STZ14,15,16 hervorgerufen wird. Ein weiteres Problem besteht darin, dass die Anfälligkeit für STZ je nach Nagetiertyp und genetischem Hintergrund unterschiedlich ist15. Daher kann die Optimierung der Dosis oder des Verabreichungsplans von STZ dessen Nephrotoxizität verhindern15; Es ist jedoch schwierig festzustellen, ob die Nierenphänotypen bei STZ-induzierten Mäusen mit Typ-1-Diabetes auf hohen Blutzucker oder direkte Zytotoxizität durch STZ16 zurückzuführen sind.

Angesichts des zunehmenden Einsatzes von STZ zur Behandlung von NETs ist ein detaillierteres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Nierentoxizität durch STZ von entscheidender Bedeutung, um deren Nebenwirkungen zu verhindern. Obwohl bereits über experimentelle Ergebnisse zur STZ-induzierten Nephrotoxizität berichtet wurde16,17,18,19, bleiben die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen unklar. In der vorliegenden Studie führten wir eine unvoreingenommene Transkriptomik an STZ-behandelten tubulären Epithelzellen in vitro und in in vivo-Experimenten durch, wobei der Schwerpunkt auf DNA-Schäden und der anschließenden p53-Signalübertragung lag.

Wir untersuchten zunächst die Nierenphänotypen von acht NET-Patienten, die in unserer Einrichtung mit STZ behandelt wurden. Das Durchschnittsalter und der Serumkreatinspiegel betrugen 62,0 ± 10,9 Jahre bzw. 0,87 ± 0,12 mg/dl (Ergänzungstabelle 1). Ein Patient entwickelte nach der STZ-Behandlung aufgrund der chirurgischen Resektion eines Bauchspeicheldrüsentumors Diabetes. Im Vergleich zum Blutzuckerspiegel zum Zeitpunkt der Urinsammlung zeigten 7 von 8 Patienten einen unzureichend positiven Uringlukosespiegel. Fünf von sieben Patienten und sechs von sieben Patienten wiesen niedrige Serumphosphat- bzw. niedrige Harnsäurewerte auf (Ergänzungstabelle 1). Bei 2 Patienten wurde die Nierenhistologie untersucht. PAS- und Masson-Trichrom-Färbung zeigten eine mäßige interstitielle Fibrose und tubuläre Verletzung, die durch den Verlust des Bürstensaums und abgeflachte tubuläre Epithelzellen gekennzeichnet war (Abb. 1). Da DNA-Schäden eine der wichtigsten Pathophysiologien unter den durch STZ induzierten zytotoxischen Wirkungen darstellen, führten wir eine Immunfärbung für γH2AX durch, einen Marker für DNA-Schäden. Die γH2AX-Färbung zeigte bei Patienten eine positive Kernfärbung in tubulären Epithelzellen, nicht jedoch bei der unverletzten Kontrolle (Abb. 1).

DNA-Schäden in tubulären Epithelzellen bei Patienten mit neuroendokrinen Tumoren (NET), die mit STZ behandelt wurden. Mikroskopische Bilder menschlicher Nierenbiopsieproben, die einer Immunfärbung auf γH2AX sowie PAS- und Masson-Trichrom-Färbung unterzogen wurden. Die Anzahl der γH2AX + tubulären Epithelien wurde in hochvergrößerten Bildern von drei Patienten mit dünner Basalmembranerkrankung als gesunde Kontrollgruppe und zwei mit STZ behandelten NET-Patienten (Nr. 1 und Nr. 2) gezählt. Die Daten sind Mittelwerte ± SD. Balken = 50 μm.

Wir untersuchten die zytotoxische Reaktion auf STZ in NRK52E-Zellen und stellten fest, dass STZ die Lebensfähigkeit der Zellen dosisabhängig verringerte (Abb. 2a). qPCR ergab, dass STZ die Expression des proximalen tubulären Verletzungsmarkers Havcr1 (kodierend für Kim-1) nicht erhöhte, die Expression einiger reifer tubulärer Epithelmarker Slc34a1 und Lrp2 (kodierend für NaPi2a bzw. Megalin) jedoch leicht reduzierte (Abb. 2b). . Um die verantwortliche Zellsignalisierung für die Zytotoxizität von STZ zu identifizieren, untersuchten wir anschließend Unterschiede im Transkriptom zwischen NRK52E-Zellen, die 24 Stunden lang mit 10 mM STZ oder Vehikel behandelt wurden, anhand der RNA-Sequenz. Eine unbeaufsichtigte Analyse der Genexpression ergab 266 von 18.930 Genen, die eine unterschiedliche Expression zwischen zwei Gruppen aufwiesen (falscherkennungsratenkorrigierter p-Wert < 0,05, absolute Faltungsänderung > 2) (Abb. 2c).

Hochregulierung der p53-Signalübertragung in STZ-behandelten tubulären Epithelzellen. (a) Die Anzahl lebensfähiger NRK-52E-Zellen wurde 24 Stunden nach der STZ-Behandlung dosisabhängig reduziert. (b) qPCR von RNA für die repräsentativen Marker verletzter und gesunder Tubuli. (c) Die RNA-Sequenz von STZ-behandelten NRK-52E-Zellen. Hervorgehobene Gene sind signifikant unterschiedlich exprimierte Gene, die im p53-Signalweg enthalten sind. (d) Anreicherungsanalyse der KEGG-Signalwege für unterschiedlich exprimierte Gene zwischen unbehandelten und STZ-behandelten Zellen. Die 10 signifikant angereicherten KEGG-Pfade werden vorgestellt. (e) Western Blot von Proteinlysaten aus NRK-52E-Zellen für γH2AX, Phospho-p53, gespaltene Caspase-3 und GAPDH. Repräsentative Bilder von n = 3. (f) Die optischen Dichten der γH2AX-, Phosphor-p53- und gespaltenen Caspase-3-Banden wurden gegen die von GAPDH normalisiert. In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests in (b) durchgeführt und Dunnetts Post-hoc-Test wurde für mehrere Vergleiche in (f) verwendet. * p < 0,05.

Wir haben die Genexpression mithilfe des KEGG-Signalwegs (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) kommentiert und 12 signifikant angereicherte Pfade identifiziert (Schwellen-p-Wert <0, 05) (Abb. 2d). Der p53-Signalweg war in STZ-behandelten Zellen am stärksten hochreguliert (Abb. 2d, ergänzende Abb. 1). Western Blot von Zelllysaten ergab, dass STZ die γH2AX-Expression und die p53-Phosphorylierung dosisabhängig hochregulierte (Abb. 2e, f).

Um zu untersuchen, ob STZ in vivo eine tubuläre Schädigung hervorruft, injizierten wir Mäusen verschiedene Konzentrationen von STZ. 24 Stunden nach der STZ-Injektion sanken die Blutzuckerspiegel (Abb. 3a) und die Plasmainsulinspiegel stiegen bei Mäusen, die mit der höheren STZ-Dosis behandelt wurden (Abb. 3b), was auf die Insulinfreisetzung als Folge des Absterbens von β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse schließen lässt . Obwohl sich Serum-BUN zwischen den Versuchsgruppen nicht unterschied (Abb. 3c), zeigten die Nieren von Mäusen, die eine einzige STZ-Injektion erhielten, eine tubuläre Schädigung, die durch den Verlust des Bürstensaums gekennzeichnet war, der bei Mäusen, die mit einer höheren Dosis behandelt wurden, schwerwiegender war Dosis STZ (Abb. 3d). qPCR der gesamten Nieren-RNA ergab eine verminderte Expression der reifen tubulären Epithelmarker Slc5a2 (kodierend für SGLT2) und eine erhöhte Expression von Havcr1 in STZ-behandelten Mäusen (Abb. 3e). Wir haben auch eine Verringerung der Immunfärbung für Megalin bei STZ-behandelten Mäusen bestätigt (Abb. 3d).

Dosisabhängige tubuläre Schädigung durch STZ in vivo. (a) Abnahme des Blutzuckerspiegels bei Mäusen, die mit 200 mg/kg STZ behandelt wurden. (b) Die Plasmainsulinspiegel waren in den STZ-Behandlungsgruppen mit hoher Dosis höher. (c) Die BUN-Werte unterschieden sich nicht zwischen den Versuchsgruppen. (d) Mikroskopische Bilder von Nierengewebe mit PAS-Färbung und Immunfärbung für Megalin zeigten eine Zunahme der Tubuli mit dem Verlust des Bürstensaums und eine Abnahme der Megalin-Expression bei STZ-behandelten Mäusen. (e) qPCR von RNA aus Nierengewebe für die repräsentativen Marker verletzter und gesunder Tubuli (Natriumtransporter der apikalen Membran). In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Post-hoc-Tests von Dunnett durchgeführt, der für mehrere Vergleiche verwendet wurde. N = 5 bis 7 Mäuse pro Gruppe. * p < 0,05, Bar = 50 μm in (c).

Wir untersuchten die Schädigung der tubulären epithelialen DNA und die anschließende p53-Aktivierung in vivo. Die Immunfärbung auf γH2AX ergab eine positive Kernfärbung im Nierengewebe von Mäusen, die mit der höheren STZ-Dosis behandelt wurden (Abb. 4a). Die Lokalisierung der positiven Färbung beschränkte sich auf die Nierenrinde und nicht auf das Nierenmark (Abb. 4a, b, ergänzende Abb. 2). Die Immunfluoreszenzfärbung mit Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), einem proximalen Tubulusmarker, zeigte, dass die meisten γH2AX-positiven Zellen zusammen mit LTL gefärbt wurden, während die Immunfluoreszenzfärbung mit Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA), einem Sammelrohrmarker, zeigte, dass γH2AX-positive Zellen selten waren gleichzeitig mit DBA gefärbt (Abb. 4c). Dies weist darauf hin, dass STZ-induzierte DNA-Schäden überwiegend in den kortikalen proximalen Tubuli auftreten. Um STZ-induzierte DNA-Schäden zu bestätigen und die Art der DNA-Schäden in den Nieren aufzuklären, führten wir einen Comet-Assay des gesamten Nierengewebes durch. Das Kometenschweifmoment unter alkalischen Bedingungen (ein alkalischer Komet) spiegelt DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) und Einzelstrangbrüche (SSB) wider, während das unter neutralen Bedingungen (ein neutraler Komet) nur DNA-DSB20 widerspiegelt. Die alkalischen Kometenschweifmomente stiegen in Nierenzellen von STZ-behandelten Mäusen dosisabhängig an (Abb. 4a, d). Auch die neutralen Kometenschweifmomente nahmen in den Nierenzellen von STZ-behandelten Mäusen dosisabhängig zu; Allerdings war der Unterschied zwischen diesen Gruppen bei neutralen Kometenschweifmomenten geringer (Abb. 4d). Dieses Ergebnis legt nahe, dass DNA-DSB und SSB nach dosisabhängiger Verabreichung von STZ in den Nieren auftraten. Wir haben auch die dosisabhängige Hochregulierung der γH2AX-Expression und der p53-Phosphorylierung in gesamten Nierenlysaten von STZ-behandelten Mäusen bestätigt (Abb. 4e, f).

Dosisabhängige DNA-Schädigung durch STZ in vivo. (a) Mikroskopische Bilder von Nieren, die auf γH2AX immungefärbt sind, und repräsentative Bilder des Comet-Assays von Nierenzellen, die 24 Stunden nach der STZ-Behandlung aus Mäusen isoliert wurden. (b) Getrennte Quantifizierung von nuklearen γH2AX-positiven Zellen in der Nierenrinde und im Mark. (c) Immunfluoreszenzbilder von γH2AX und dem proximalen tubulären Epithelmarker (LTL) oder Sammelrohrmarker (DBA) bei STZ-behandelten Mäusen. (d) Eine quantitative Analyse (alkalischer Komet: jeweils n = 100, neutraler Komet: jeweils n = 50). (e) Western Blot von Nierengewebelysaten für γH2AX, Phospho-p53 und GAPDH. Repräsentative Bilder von n = 3. (f) Die optischen Dichten der γH2AX- und Phospho-p53-Banden wurden gegen die von GAPDH normalisiert. N = 5 bis 7 Mäuse pro Gruppe. In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Post-hoc-Tests von Dunnett durchgeführt, der für mehrere Vergleiche verwendet wurde. * p < 0,05, Bar = 50 μm in (a) und 25 μm in (c).

Um die STZ-induzierte tubuläre Verletzung in der subakuten Phase in vivo zu bewerten, verlängerten wir den Beobachtungszeitraum auf 7 Tage nach der STZ-Injektion (Abb. 5a). Um eine durch hohen Blutzucker verursachte tubuläre Verletzung zu unterscheiden, verabreichten wir Insulin Glargin, um den Blutzuckerspiegel bei Mäusen mit STZ-Injektion zu senken (Abb. 5a, b). Bei mit STZ behandelten Mäusen nahm der Plasmainsulinspiegel leicht ab, es gab jedoch keine statistische Signifikanz (Abb. 5c). Serum-BUN unterschied sich nicht zwischen den Versuchsgruppen (Abb. 5d). Sieben Tage nach der Einzeldosis-STZ-Injektion (150 mg/kg) zeigten die Nieren von Mäusen tubuläre Verletzungen mit Verlust des Bürstensaums; Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen der STZ-Injektion mit oder ohne Insulin beobachtet (Abb. 5e). Die Immunfärbung auf γH2AX ergab eine positive Kernfärbung in STZ mit oder ohne Insulin (Abb. 5e, f). qPCR der gesamten Nieren-RNA ergab eine leicht verminderte Expression reifer tubulärer Epithelmarker (Slc5a2, Slc34a1 und Lrp2) und keine signifikante Veränderung der Expression von Havcr1 bei STZ-behandelten Mäusen (Abb. 5g). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die STZ-induzierte tubuläre Schädigung unabhängig vom Blutzuckerspiegel in der subakuten Phase auftrat.

Blutzucker unabhängig von tubulärer Verletzung durch STZ. (a) Experimentelles Schema. Zwei Tage nach der STZ-Behandlung (150 mg/kg) wurde Insulin Glargin in einer Menge von etwa 200 mg/dl verabreicht, um den Blutzuckerspiegel zu kontrollieren, und die Mäuse wurden am 7. Tag getötet. (b) Der Blutzuckerspiegel stieg bei mit STZ behandelten Mäusen an. wurden jedoch durch die Verabreichung von Insulin glargin verringert. (c,d) Die Plasmainsulinspiegel (c) und BUN-Spiegel (d) unterschieden sich nicht zwischen den Versuchsgruppen. (e) Mikroskopische Bilder von mit PAS gefärbtem und auf γH2AX immungefärbtem Nierengewebe zeigten bei STZ-behandelten Mäusen mit oder ohne Insulin glargin einen Anstieg der Tubuli mit dem Verlust des Bürstensaums und nuklearer γH2AX-positiver Zellen. (f) Getrennte Quantifizierung von nuklearen γH2AX-positiven Zellen in der Nierenrinde und im Mark. (g) qPCR von RNA aus Nierengewebe für die repräsentativen Marker verletzter und gesunder Tubuli. In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Post-hoc-Tests von Dunnett durchgeführt, der für mehrere Vergleiche verwendet wurde. N = 4 bis 5 Mäuse pro Gruppe. * p < 0,05, Bar = 50 μm in (e).

Basierend auf der Hochregulierung der p53-Signalübertragung bei STZ-induzierten tubulären Verletzungen untersuchten wir die präventive Wirkung der pharmakologischen Hemmung von p53 durch Pifithrin-α (Abb. 6a). Frühere Studien haben gezeigt, dass Phlorizin, ein SGLT2-Inhibitor, STZ-induzierte tubuläre Verletzungen verhindert19. Daher untersuchten wir auch, ob die Vorverabreichung von Dapagliflozin, einem selektiven SGLT2-Inhibitor, STZ-induzierte DNA-Schäden und nachfolgende tubuläre Verletzungen hemmte (Abb. 6a). Die Blutzuckerwerte und BUN-Werte unterschieden sich zwischen den Versuchsgruppen nicht signifikant (Abb. 6b, d). Bei mit STZ behandelten Mäusen stiegen die Plasmainsulinspiegel an (Abb. 6c). Wir haben auch DNA-Schäden in den Nieren untersucht. Die Immunfärbung für γH2AX ergab, dass die STZ-induzierte positive Kernfärbung durch Dapagliflozin, nicht jedoch durch Pifithrin-α, verbessert wurde (Abb. 6e, f). Der Kometentest zeigte, dass der Anstieg der alkalischen und neutralen Kometenschweifmomente durch Dapagliflozin leicht abgeschwächt wurde (Abb. 6g, h). Wir bestätigten auch, dass die STZ-induzierte Hochregulierung der γH2AX-Expression durch Dapagliflozin verbessert wurde, nicht jedoch durch Pifithrin-α. Im Gegensatz dazu wurde die STZ-induzierte p53-Phosphorylierung durch Pifithrin-α und Dapagliflozin verbessert (Abb. 6i, j).

Pharmakologische Hemmung der p53-Signalübertragung und SGLT2 verbesserte STZ-induzierte DNA-Schäden in vivo. (a) Experimentelles Schema. Pifithrin-α wurde gleichzeitig mit STZ (150 mg/kg) verabreicht. Dapagliflozin wurde 2 Stunden vor STZ verabreicht. Mäuse wurden 24 Stunden nach der Verabreichung von STZ getötet. N = 5 bis 11 Mäuse pro Gruppe. (b) Die Blutzuckerwerte waren in allen Versuchsgruppen ähnlich. (c) Die Plasmainsulinspiegel waren in den STZ-Behandlungsgruppen höher. (d) Die BUN-Werte unterschieden sich nicht zwischen den Versuchsgruppen. (e) Mikroskopische Bilder von mit γH2AX immungefärbtem Nierengewebe. (f) Getrennte Quantifizierung von nuklearen γH2AX-positiven Zellen in der Nierenrinde und im Mark. (g) Repräsentative Bilder des Kometentests von aus Mäusen isolierten Nierenzellen und (h) eine quantitative Analyse (alkalischer Komet: jeweils n = 100, neutraler Komet: jeweils n = 50). (i) Western Blots von Nierengewebelysaten für γH2AX, Phospho-p53 und GAPDH. Repräsentative Bilder von n = 3. (j) Die optischen Dichten der γH2AX- und Phosphor-p53-Banden wurden gegen die von GAPDH normalisiert. In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Post-hoc-Tests von Dunnett durchgeführt, der für mehrere Vergleiche verwendet wurde. * p < 0,05, Bar = 50 μm in (e).

In einer histologischen Analyse zeigte die PAS-Färbung der Nieren, dass die STZ-induzierte tubuläre Schädigung durch Pifithrin-α und Dapagliflozin gelindert wurde (Abb. 7a). Die Immunfärbung für Megalin zeigte, dass Pifithrin-α und Dapagliflozin die Expression von Megalin in STZ-behandelten Mäusen konservierten (Abb. 7a). qPCR ergab eine Abnahme der Expression reifer tubulärer Epithelmarker (Slc5a2, Slc34a1 und Lrp2), die sich bei Mäusen, die mit Pifithrin-α oder Dapagliflozin behandelt wurden, nicht veränderte (Abb. 7b). Allerdings war die erhöhte Expression von Havcr1 durch STZ bei Mäusen, die mit Pifithrin-α oder Dapagliflozin behandelt wurden, leicht abgeschwächt (Abb. 7b).

Die pharmakologische Hemmung der p53-Signalübertragung und SGLT2 verbesserte die STZ-induzierte tubuläre Schädigung in vivo. (a) Mikroskopische Bilder von mit PAS gefärbtem und auf Megalin immungefärbtem Nierengewebe. (b) qPCR von RNA aus Nierengewebe für die repräsentativen Marker verletzter und gesunder Tubuli (Natriumtransporter der apikalen Membran). In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Post-hoc-Tests von Dunnett durchgeführt, der für mehrere Vergleiche verwendet wurde. N = 5 bis 11 Mäuse pro Gruppe. * p < 0,05, Balken = 50 μm in Bildern der PAS-Färbung und 100 μm in Bildern der Immunfärbung für Megalin in (c).

Im Hinblick auf die zukünftige klinische Anwendung dieser renoprotektiven Arzneimittel gegen STZ-induzierte Nierenschäden untersuchten wir die Auswirkungen der gleichzeitigen Verabreichung von STZ und Pifithrin-α oder Dapagliflozin auf Pankreas-Inselzellen. Die Immunfärbung auf γH2AX ergab in allen mit STZ behandelten Versuchsgruppen eine positive Kernfärbung innerhalb der Inseln (Abb. 8a). Der Prozentsatz der γH2AX + -Zellen war in den mit STZ behandelten Gruppen ähnlich (Abb. 8b). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die vorbeugende Wirkung von Dapagliflozin auf DNA-Schäden in den Nieren beobachtet wurde, nicht jedoch in der Bauchspeicheldrüse, die kein SGLT2 exprimiert.

STZ induzierte eine DNA-Schädigung der Pankreasinseln. (a) Mikroskopische Bilder der Bauchspeicheldrüse, immungefärbt auf γH2AX. Pfeilspitzen zeigen γH2AX+-Kerne an. (b) Separate Quantifizierung von nuklearen γH2AX-positiven Zellen in Pankreasinseln. In allen Gruppen handelt es sich bei den Daten um Mittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Post-hoc-Tests von Dunnett durchgeführt, der für mehrere Vergleiche verwendet wurde. N = 5 bis 11 Mäuse pro Gruppe. * p < 0,05, Bar = 50 μm in (a).

Die vorliegende Studie untersuchte die Mechanismen, die einer STZ-induzierten tubulären Schädigung zugrunde liegen, in vitro und in vivo. Eine transkriptomische Analyse zeigte, dass die p53-Signalübertragung in STZ-behandelten tubulären Epithelzellen aktiviert wurde. STZ induzierte dosisabhängig DNA-Schäden in tubulären Epithelzellen und war auf die Nierenrinde beschränkt. Die pharmakologische Hemmung von p53 und SGLT2 reduzierte die durch STZ verursachte tubuläre Schädigung, während die zytotoxischen Wirkungen von STZ auf die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse erhalten blieben. Darüber hinaus waren in Nierenbiopsieproben von mit STZ behandelten NET-Patienten tubuläre DNA-Schäden erkennbar. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Mechanismen, die dem Eintritt von STZ in Zellen zugrunde liegen, zwischen proximalen tubulären Epithelzellen und Pankreas-β-Zellen unterschiedlich waren, was zu der unterschiedlichen Reaktion auf STZ bei gleichzeitiger Verabreichung eines SGLT2-Inhibitors oder p53-Inhibitors beitrug.

Unsere In-vivo-Ergebnisse zeigten eine STZ-induzierte tubuläre Schädigung, einschließlich des Verlusts von Transmembrantransportern, der unabhängig vom Blutzucker war. Die ersten Phänotypen einer proximalen tubulären Verletzung sind der Verlust der Zellpolarität, ein Stillstand des Zellzyklus und eine Abnahme der Membrantransporter wie NaPi2a und SGLT210,13. Wenn der Blutzuckerspiegel so hoch wird, dass er die Reabsorptionskapazität der proximalen Tubuli überschreitet, beginnt im Allgemeinen eine Glykosurie aufzutreten, typischerweise 250–300 mg/dl Blutzucker bei gesunden, nicht-diabetischen Kontrollpersonen21. Bei unseren NET-Patienten gab es keine Hinweise darauf, dass der Blutzuckerspiegel ausreichend erhöht war, um das Auftreten einer Glykosurie zu verursachen, was auf eine Anomalie der tubulären Reabsorptionskapazität hindeutet. Darüber hinaus wurde die latente Verletzung des proximalen Tubulus unterschätzt, obwohl frühere Erkenntnisse zur diabetischen Nephropathie mithilfe eines STZ-induzierten Typ-1-Diabetesmodells gewonnen wurden14,1516. Frühere Studien zeigten, dass es nach der Verabreichung von STZ zu einem Stillstand des Zellzyklus sowie zu einer Abnahme der SGLT2-Expression kam22,23,24. Basierend auf der kompensatorischen Hochregulierung von SGLT2 zur Erhöhung der Glukose-Reabsorption in anderen diabetischen Mausmodellen23 deutet die Herunterregulierung von SGLT2 nach der Verabreichung von STZ auf eine latente proximale tubuläre Verletzung hin.

Unsere unvoreingenommene Transkriptomik ergab, dass die p53-Signalübertragung in STZ-behandelten tubulären Epithelzelllinien hochreguliert war. Wir fanden auch heraus, dass STZ die Phosphorylierung von p53 dosisabhängig in vivo und in vitro induzierte. Bemerkenswert ist, dass im Gegensatz zu früheren Berichten, die die Hochregulierung von p53 in Nieren- und Lebergewebe in der chronischen Phase nach der STZ-Behandlung25, 26 zeigten, festgestellt wurde, dass p53 in der akuten Phase nach der STZ-Verabreichung in den tubulären Epithelien hochreguliert war. p53, ein Tumorsuppressorprotein, ist eine Schlüsselkomponente der zellulären Reaktion auf Stress, einschließlich DNA-Schäden, Onkogenexpression, Hypoxie, ROS und Nährstoffmangel27. Nach seiner Phosphorylierung wandert p53 in den Zellkern und aktiviert transkriptionell eine breite Palette von Genen, die mit dem Zellzyklus, der Apoptose, der Autophagie und dem Stoffwechsel zusammenhängen27. Wir entdeckten DNA-Schäden in tubulären Epithelzellen in dosisabhängiger Weise und zeigten, dass sie unabhängig vom Blutzuckerspiegel eine Woche nach der STZ-Injektion anhielten. Frühere Studien identifizierten aktiviertes p53 in tubulären Epithelzellen als Phänotyp des STZ-induzierten Typ-1-Diabetes28. Allerdings könnten STZ-induzierte DNA-Schäden und nicht hoher Blutzucker zu diesen Phänotypen beigetragen haben.

Beim Vergleich der in vivo durch Cisplatin und STZ induzierten DNA-Schäden war der auffälligste Unterschied die histologische Verteilung der verletzten Regionen im Nierengewebe. Der durch Cisplatin geschädigte tubuläre Bereich ist hauptsächlich im äußeren Streifen der äußeren Medulla lokalisiert, an dem sich das S3-Segment der proximalen Tubuli befindet29. Im Gegensatz dazu zeigten die vorliegenden Ergebnisse, dass STZ-induzierte tubuläre Verletzungen in dieser Region selten festgestellt wurden, während sie vor allem im äußeren Kortex auftraten, in dem sich die S1- und S2-Segmente der proximalen Tubuli befinden. Dies stützt unsere Theorie, dass STZ über GLUT2 und SGLT2 in Zellen gelangt, die vorwiegend im S1/2-Segment der proximalen Tubuli exprimiert werden.

Basierend auf der Hochregulierung der p53-Signalübertragung bei STZ-induzierten tubulären Verletzungen ist die pharmakologische Hemmung von p53 eine mögliche präventive Strategie. Frühere Studien haben gezeigt, dass die aktivierte p53-Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei Nierenschäden in verschiedenen Krankheitsmodellen spielt, einschließlich Cisplatin-Nephrotoxizität und Ischämie-Reperfusions-Schaden30,31,32,33,34,35,36. Allerdings sind die Auswirkungen der pharmakologischen Hemmung oder genetischen Deletion von p53 auf Nierenschäden komplex36,37. Frühere Studien zeigten, dass die Hemmung von p53 nicht immer vorteilhaft war, sondern tatsächlich Gewebeschäden oder Fibrose verschlimmerte37,38. Die Art des Verletzungsmodells und die Tierart können zu den beobachteten Unterschieden bei der Reaktion der p53-Hemmung auf Nierenschäden beitragen37. Bei einer STZ-induzierten Nierenschädigung stellten wir fest, dass Pifithrin-α den DNA-Schaden nicht linderte; Es verbesserte jedoch leicht die Expression von Nierenschädigungsmarkern. Daher schien Pifithrin-α die STZ-Aufnahme durch tubuläre Epithelzellen nicht zu verhindern, wohingegen die nachfolgende durch die p53-Aktivierung vermittelte tubuläre Schädigung bis zu einem gewissen Grad abgeschwächt wurde.

Einer der wichtigsten limitierenden Faktoren im Zusammenhang mit der Verwendung von Krebsmedikamenten ist ihre Zytotoxizität in normalen Geweben, und die Nieren sind das häufigste Zielorgan8. Obwohl der Serumkreatininspiegel bei der Mehrzahl der mit STZ behandelten Patienten nicht anstieg, deutet eine unzureichende Glukoseausscheidung im Urin auf eine latente Verletzung des proximalen Tubulus hin. Insgesamt zeigten die vorliegenden Ergebnisse und frühere Erkenntnisse eine deutliche Verringerung der SGLT2-Expression bei STZ-behandelten Mäusen19,23, was zur Glukoseausscheidung im Urin beitragen könnte, während der Blutzuckerspiegel nicht ausreichend anstieg. Um die Nephrotoxizität von Krebsmedikamenten zu minimieren, besteht ein möglicher Ansatz darin, die Aufnahme des Medikaments in die Nierenzellen zu reduzieren, wobei eine renaltubuläre spezifische Blockade ideal ist. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen zeigten die vorliegenden Ergebnisse, dass die pharmakologische Hemmung von SGLT2 die Nephrotoxizität von STZ19 teilweise hemmte, während seine zytotoxischen Wirkungen auf Pankreas-β-Zellen, die kein SGLT2 exprimieren, erhalten blieben. Daher hat eine Vorbehandlung mit SGLT2-Inhibitoren Potenzial als spezifischer prophylaktischer Ansatz bei Nierenschäden.

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens gab es Diskrepanzen zwischen experimentellen In-vivo- und In-vitro-qPCR-Ergebnissen, insbesondere bei der Expression von Transmembrantransportern in den tubulären Epithelien. Eine Erklärung ist, dass in tubulären Epithelien unter Kulturbedingungen manchmal ein Verlust der Zellpolarität und ein damit einhergehender Verlust der Expression von Membrantransportern, einschließlich SGLT2, beobachtet wird39,40. Daher kann die In-vitro-Expression dieser Moleküle unterschätzt werden. Zweitens konnten wir die p53-Aktivierung im menschlichen Nierengewebe bei NET-Patienten nicht nachweisen, obwohl die p53-Aktivierung ein häufiges nachgeschaltetes Signal für DNA-Schäden nach verschiedenen Beleidigungen ist. Schließlich haben wir zwar gezeigt, dass Dapagliflozin STZ-induzierte DNA-Schäden in tubulären Epithelien in vivo lindert, seine genauen Mechanismen, insbesondere ob STZ tatsächlich über SGLT2 in die Zellen gelangt, sind jedoch nicht direkt aufgeklärt. Während STZ über GLUT2, einen bidirektionalen Glukosetransporter, in die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse gelangt, ist die Richtung des GLUT2-vermittelten STZ-Transports in den proximalen tubulären Epithelien in unseren Experimenten unklar und erfordert weitere Untersuchungen in der Zukunft.

Zusammenfassend zeigte die vorliegende Studie die Nephrotoxizität von STZ in vitro, in vivo und in Nierenbiopsieproben von NET-Patienten auf. DNA-Schäden und die anschließende Aktivierung von p53 in tubulären Epithelzellen sind für die STZ-induzierte Nephrotoxizität verantwortlich. SGLT2-Inhibitoren verhinderten in vivo DNA-Schäden in tubulären Epithelzellen, während die Zelltoxizität gegenüber Pankreas-β-Zellen erhalten blieb. Dies legt nahe, dass eine Vorbehandlung mit einem SGLT2-Inhibitor eine attraktive präventive Option für die unerwünschten Ereignisse von STZ am Nierengewebe bei NET-Patienten ist. Da die STZ-induzierte Nephrotoxizität in experimentellen Umgebungen außerdem unterschätzt wurde, muss die Nierenschädigung bei STZ-induziertem Typ-1-Diabetes sorgfältig untersucht werden.

Wir haben retrospektiv 8 NET-Patienten aufgenommen, die mit STZ an der Kyoto Prefectural University of Medicine behandelt wurden. Alle klinischen Merkmale, einschließlich Alter, Geschlecht, Komplikationen und Laborergebnisse, wurden aus Krankenakten entnommen und in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Menschliche Nierenproben wurden von 2 Patienten durch Nierenbiopsie entnommen. Als Kontrolle analysierten wir Nierengewebe eines Patienten mit einer Erkrankung der dünnen Basalmembran, die hauptsächlich das Glomerulusgewebe und nicht das Tubulusgewebe betraf. Patienteninformationen wurden vor der Analyse anonymisiert und deidentifiziert. Das gesamte Protokoll der vorliegenden Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki entworfen. Aufgrund des retrospektiven Designs und des geringen Risikos für die Patienten genehmigte die Ethikkommission die Verwendung der folgenden Opt-out-Methode. Auf das Erfordernis einer mündlichen Einwilligung nach Aufklärung wurde verzichtet und die Einwilligung nach Aufklärung wurde durch allgemein zugängliche Informationen sowie einfache Opt-out-Modi eingeholt. Die vorliegende Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission des Universitätskrankenhauses der Kyoto Prefectural University of Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer: ERB-C-2169, ERB-C-2210).

Männliche C57BL/6-Wildtyp-Mäuse wurden von Shimizu, Inc. (Kyoto, Japan) gekauft. Das STZ-Verletzungsmodell wurde durch eine intraperitoneale Injektion von STZ (Cayman Chemical, MI, USA) in 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5, in einer Konzentration von 100, 150 oder 200 mg/kg Körpergewicht in männliche Mäuse im Alter induziert von 8–10 Wochen. Mäuse wurden 1 oder 7 Tage nach der STZ-Injektion eingeschläfert. Für Vergleiche zwischen den Gruppen wurden Wurfgeschwister-Kontrollmäuse verwendet. Allen mit Insulin behandelten Gruppen wurde Insulin Glargin (Wako, Osaka, Japan) subkutan injiziert und dann auf die Menge eingestellt, die ihren Nüchternblutzucker auf dem gleichen Niveau hielt (± Insulin Glargin 2–6 Einheiten/kg).

Um p53 in vivo zu hemmen, wurden 2,2 mg/kg Pifithrin-α (ab120478, Abcam plc., Cambridge, UK) unmittelbar vor der STZ-Injektion wie zuvor beschrieben intraperitoneal injiziert41. Um SGLT2 in vivo zu hemmen, wurden 1,0 mg/kg Dapagliflozin (Selleck Biotech Co., Houston, USA) gelöst und mit 75 % normaler Kochsalzlösung (0,9 % w/v NaCl) verdünnt und 1 Stunde vor der STZ-Behandlung per Sonde verabreicht. Körpergewicht und Blutzuckerspiegel wurden um 17:00 Uhr nach 8-stündigem Fasten gemessen. Der Blutzuckerspiegel wurde mit einem Glukometer (Glutest Every, Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd., Aichi, Japan) gemessen. Die Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert, zu den angegebenen Zeitpunkten eingeschläfert und anschließend wurden Blutproben aus der unteren Hohlvene entnommen. Für weitere Analysen wurden Nieren und Bauchspeicheldrüse in Proben geschnitten.

Alle Experimente wurden vom Experimental Animals Committee der Kyoto Prefectural University of Medicine genehmigt und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und den Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen des Science Council of Japan sowie den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Normale Rattennierenepithelzellen (NRK 52E-Zellen) wurden von der JCRB Cell Bank erhalten. Die Zellen wurden in DMEM (Wako, Osaka, Japan), das 1 % Penicillin und Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) und 5 % FBS (Invitrogen) enthielt, bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luft kultiviert. Die Zellen wurden vor der Zellzählung 24 Stunden lang mit 1, 5, 10 oder 30 mM STZ, gelöst in Dimethylsulfoxid, behandelt. Die Anzahl der Zellen wurde mit einem automatischen ADAM-MC-Zellzähler (Digital Bio, Japan) gezählt, der mit der Propidiumiodid-Färbemethode zur Färbung toter Zellen arbeitet.

Der Serumblut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) wurde mit geeigneten enzymatischen Methoden gemessen (A667-00, Serotec, Hokkaido, Japan). Die Insulinkonzentrationen im gesammelten Plasma wurden mit einem Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Kanazawa, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Die Mäuse wurden betäubt und getötet, und die Bauchspeicheldrüse und die Nieren wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entfernt. Zur Herstellung von Paraffinschnitten wurden die Bauchspeicheldrüse und die Nieren vom Applied Medical Research Laboratory (Osaka, Japan) mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. In Paraffin eingebettetes Maus- und menschliches Gewebe wurde in 4 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Periodic Acid-Schiff (PAS)-Färbung wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt.

Nach der Entparaffinierung wurden Paraffinschnitte von Mäusen und Menschen in Citrat-gepufferte Lösung (pH 6,0) gegeben und 5 Minuten lang gekocht, um Antigene zu gewinnen. Endogene Peroxidase wurde 20 Minuten lang mit 3,0 % Wasserstoffperoxid in Methanol gequencht. Die Proben wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 3 % BSA in PBS blockiert und mit Primärantikörpern inkubiert (Ergänzungstabelle 2). Die Schnitte wurden mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierten Sekundärantikörper (ab236469, Abcam) markiert. Für die Farbreaktion wurde das chromogene Diaminobenzidin-Substrat (K3468, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) verwendet, gefolgt von einer Gegenfärbung mit Hämatoxylin. Alle Schnitte wurden mit einem Eclipse E600-Mikroskop (Nikon, Tokio, Japan) und einem BZ-X700/BZ-X710-Mikroskop (Keyence Corporation, Osaka, Japan) beobachtet. γH2AX-positive Zellen wurden aus drei von zehn aufeinanderfolgenden, nicht überlappenden kortikalen und medullären Feldern in jeder Niere unter starker Vergrößerung (n = 3) quantifiziert. Diese drei Felder wurden blind und zufällig ausgewählt.

Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden gefrorene Schnitte 5 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100 in PBS rehydriert und permeabilisiert. Die Proben wurden mit 3 % BSA in PBS blockiert und nacheinander mit den in der Ergänzungstabelle 2 gezeigten Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Alexa Fluor 594-konjugierten Sekundärantikörpern (Ergänzungstabelle 2). Die nukleare Gegenfärbung wurde mit DAPI oder DRAQ5 (DR50050; BioStatus, Leicestershire, UK; 1:2000) durchgeführt, gefolgt von der Montage in Prolong-Gold (Thermo Fisher Scientific). Die Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie (FV1000; Olympus, Tokio, Japan) erhalten.

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) und Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA) aus der Rinde von Nieren oder NRK-52E-Zellen extrahiert. Zweihundert Nanogramm Gesamt-RNA wurden zur Synthese von cDNA unter Verwendung eines PrimeScript RT-Reagenzienkits mit gDNA Eraser (Takara Bio) revers transkribiert. Der Echtzeitnachweis von PCR-Produkten wurde mit KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x) Universal (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) und einem Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara Bio Inc.) durchgeführt. Die Genexpression wurde unter Verwendung von β-Actin als interner Kontrolle quantifiziert. Die Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

NRK52E-Zellen, eine proximale tubuläre Epithelzelllinie der Ratte, wurden in den STZ-Gruppen vor der RNA-Extraktion 24 Stunden lang mit 10 mM STZ behandelt. RNA-Proben wurden der NGS-Kerneinrichtung des Genome Information Research Center am Forschungsinstitut für mikrobielle Krankheiten der Universität Osaka zum Bibliotheksaufbau und zur Sequenzierung zur Verfügung gestellt. Die Bibliotheksvorbereitung wurde unter Verwendung eines TruSeq-Strang-mRNA-Probenvorbereitungskits (Illumina, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina HiSeq 2500-Plattform im 100-bp-Single-End-Modus durchgeführt. Sequenzierte Lesevorgänge wurden mit STAR v 2.7.10a (https://github.com/alexdobin/STAR/) auf die Referenzgenomsequenzen der Ratte (Rnor6) abgebildet und eindeutig zugeordnete Lesevorgänge wurden durch die Funktion featureCounts im Subread-Paket (https:/) gezählt. /subread.sourceforge.net).

Datenanalysen wurden mit der R-Software Version 4.1.2 (https://www.R-project.org/) durchgeführt. Das Paket „edgeR“ wurde für eine Differenzialausdrucksanalyse42 verwendet. Gene mit einem FDR < 0,05 und einer absoluten log2-fachen Änderung > 1 wurden als signifikant differenziell exprimierte Gene angesehen. Das fgsea-Paket wurde für eine Gen-Set-Anreicherungsanalyse verwendet. Die Signalweganalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) wurde unter Verwendung von iDEP Version 0.93 (http://bioinformatics.sdstate.edu/idep93/) mit durchgeführt allgemein anwendbare Methode zur Gen-Set-Anreicherung für die Pathway-Analyse (GAGE)43.

Gesamtzell- oder Gewebeextrakte wurden unter Verwendung von Lysepuffer 17 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) erhalten. Die Proteine ​​wurden durch 5-minütiges Erhitzen auf 95 °C denaturiert und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine ​​auf Polyvinylidendifluoridmembranen (Immobilon-P IPVH00010: Millipore, MA, USA) übertragen. Nach einstündigem Blockieren in 5 % fettfreier Milch oder 3 % BSA in TBS/0,1 % Tween20 bei Raumtemperatur wurde die Membran über Nacht bei 4 °C mit dem primären Antikörper (Ergänzungstabelle 2) inkubiert. Nach dem Waschen mit TBS/0,1 % Tween20 wurden sekundäre Peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper hinzugefügt (7074S; Cell Signaling Technology, Boston, MA; 1:3000 bei Raumtemperatur). Chemilumineszenz wurde mit einem ECL-Select-Western-Blot-Nachweisreagenz (RPN2235: GE Healthcare UK Ltd, Amersham Place, England) oder Clarity Max Western-ECL-Substrat (1.705.062: Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) nachgewiesen. Die Signalintensitäten wurden mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) ausgewertet.

Der Comet-Assay wurde mit dem Comet Assay Kit (Abcam ab238544) wie zuvor beschrieben41,44 durchgeführt. Kurz gesagt, Mäusenieren wurden entnommen und in einer kleinen Menge eiskaltem PBS mit 20 mM EDTA zerkleinert. Der Überstand wurde durch ein 35-μm-Zellsieb geleitet. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet mit 1 × 105 Zellen/ml in eiskaltem PBS suspendiert. Die Proben wurden mit Kometen-Agarose im Verhältnis 1/10 (v/v) gemischt und dann auf Glasobjektträger übertragen, die mit einer Kometen-Agarose-Basisschicht bedeckt waren. Nach der Inkubation mit vorgekühltem Lysepuffer wurden die Objektträger einer Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophorese wurde in alkalischer Elektrophoreselösung für den alkalischen Kometentest und in TBE-Elektrophoreselösung für den neutralen Kometentest durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Objektträger mit dem DNA-Farbstoff Vista Green inkubiert. Die Bilder wurden durch Epifluoreszenzmikroskopie (IX71; Olympus, Tokio, Japan) unter Verwendung des FITC-Filters erhalten. Zehn Bilder (5–15 Zellen pro Bild) wurden zufällig aufgenommen und das Schwanzmoment (Schwanzlänge × Schwanz % DNA/100) von 100 Zellen pro Gruppe wurde mithilfe der Comet Score-Analysesoftware (TriTek Corp.) berechnet.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler (SE) ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit dem ungepaarten t-Test für Vergleiche zweier Variablen und einer Varianzanalyse sowie dem Post-hoc-Test von Dunnett für Vergleiche mehrerer Variablen durchgeführt. P-Werte von < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

RNA-seq-Daten für alle Proben wurden im Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE215337 hinterlegt. Sicheres Token für den Prüferzugriff: gzanqiemjhyhdyl.

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Abteilung für Nephrologie, Graduate School of Medical Science, Medizinische Universität der Präfektur Kyoto, 465 Kajii-cho, Kamigyo-ku, Kyoto, 602-8566, Japan

Kunihiro Nakai, Minato Umehara, Atsushi Minamida, Hiroko Yamauchi-Sawada, Yasuto Sunahara, Yayoi Matoba, Natsuko Okuno-Ozeki, Itaru Nakamura, Tomohiro Nakata, Aya Yagi-Tomita, Noriko Uehara-Watanabe, Tomoharu Ida, Noriyuki Yamashita, Michitsugu Kamezaki, Yuhei Kirita, Keiichi Tamagaki und Tetsuro Kusaba

Abteilung für Chirurgische Pathologie, Graduate School of Medical Science, Medizinische Universität der Präfektur Kyoto, Kyoto, Japan

Eiichi Konishi

Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Graduate School of Medical Science, Medizinische Universität der Präfektur Kyoto, Kyoto, Japan

Hiroaki Yasuda

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Graduate School of Medical Science, Medizinische Universität der Präfektur Kyoto, Kyoto, Japan

Satoaki Matoba

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NK und TK entwarfen die Studie, führten die Experimente durch, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. YK analysierte die Daten. MU, AM, HY-S., YS, YM, NO-O., IN, TN, AY-T., NU-W., TI, NY, MK, EK, HY, SM und KT trugen zur Diskussion bei .

Korrespondenz mit Tetsuro Kusaba.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nakai, K., Umehara, M., Minamida, A. et al. Streptozotocin induziert durch die Aktivierung des p53-Signals eine Schädigung des proximalen Nierentubulus. Sci Rep 13, 8705 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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Eingegangen: 24. November 2022

Angenommen: 24. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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