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Oct 21, 2023

Der Triglyceridkreislauf ermöglicht die Modifikation gespeicherter Fettsäuren

Naturstoffwechsel Band 5,

Nature Metabolism Band 5, Seiten 699–709 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Der Triglyceridkreislauf ist der Prozess des kontinuierlichen Abbaus und der Neusynthese von Triglyceriden in Zellspeichern. Wir zeigen in 3T3-L1-Adipozyten, dass Triglyceride einem schnellen Umsatz und einer Neuanordnung von Fettsäuren mit einer geschätzten Halbwertszeit von 2–4 Stunden unterliegen. Wir entwickeln eine Rückverfolgungstechnologie, die den Metabolismus mehrerer Fettsäuren gleichzeitig und quantitativ verfolgen kann, um den Triglycerid-Substratzyklus direkt und mit molekularer Artenauflösung zu untersuchen. Unser Ansatz basiert auf Alkinfettsäuretracern und Massenspektrometrie. Der Triglyceridkreislauf ist mit der Modifikation der freigesetzten Fettsäuren durch Verlängerung und Entsättigung verbunden. Durch Kreislauf und Modifikation werden gesättigte Fettsäuren langsam in einfach ungesättigte Fettsäuren und Linolsäure in Arachidonsäure umgewandelt. Wir kommen zu dem Schluss, dass der Triglyceridkreislauf gespeicherte Fettsäuren für Stoffwechselveränderungen zugänglich macht. Der Gesamtprozess erleichtert zelluläre Anpassungen des gespeicherten Fettsäurepools, um den sich ändernden Bedürfnissen der Zelle gerecht zu werden.

Der Triglycerid/Fettsäure-Kreislauf (TG/FA) ist der Prozess des teilweisen oder vollständigen Abbaus von gespeichertem Fett, um freie FAs freizusetzen, die anschließend zur Resynthese eines neuen TG-Moleküls verwendet werden. Einerseits kann es auf der Ebene des gesamten Körpers stattfinden, wo aus dem Fettgewebe freigesetzte freie FAs in der Leber wieder zu TGs verestert werden können, was zu einer Umverteilung der gespeicherten Energie im Organismus führt1. Andererseits findet es auch intrazellulär statt, als typischer „vergeblicher“ Substratkreislauf, der Energie verbraucht, ohne dass es zu einer Nettosynthese von biologischem Material kommt2. Der intrazelluläre Substratkreislauf im Allgemeinen ist sowohl konzeptionell als auch experimentell eine wissenschaftliche Herausforderung. Auf der konzeptionellen Seite stellt sich die Frage, ob die positiven Effekte von Substratkreisläufen die energetischen Kosten überwiegen könnten oder ob Substratkreisläufe eine unvermeidbare Unvollkommenheit komplexer Netzwerke darstellen. Die frühe Forschung zum TG/FA-Zyklus betonte dessen regulatorische Rolle, insbesondere bei der Anpassung an schnelle Änderungen im Energieverbrauch3,4, während die energetischen Kosten des Zyklus als gering angesehen wurden5. In den letzten Jahren ist das Interesse an diesem Zyklus jedoch gestiegen, weil angenommen wurde, dass er wesentlich zur Thermogenese im Fettgewebe beitragen könnte6,7. Ein besseres Verständnis der thermogenen Signalwege könnte zu neuen Strategien zur Beeinflussung des Energieverbrauchs führen, die möglicherweise im Kampf gegen die globale Adipositas-Pandemie nützlich sein könnten8,9.

Einschränkungen in der experimentellen Technologie sind ein großes Hindernis für ein besseres Verständnis des TG/FA-Zyklus. Bei Verwendung herkömmlicher Isotopenmarkierung stellt die genaue und direkte Bestimmung der Zyklenrate und -wege eine Herausforderung für die Stoffwechselverfolgung dar, da Edukte und Produkte möglicherweise bereits nach einer Zyklenrunde nicht mehr zu unterscheiden sind (Abb. 1a). Daher sind die bestehenden Methoden zur Untersuchung des TG/FA-Zyklus eher indirekt. Ratiometrische Bestimmungen des [3H]FA- und [14C]Glucose-Einbaus mit paralleler Bestimmung der Glycerinfreisetzung10 oder ähnliche Strategien mit stabilen Isotopen3 lieferten Informationen über den Grad der FA-Veresterung und -Umesterung, aus denen sich der Zyklus zumindest relativ ableiten ließ. Andere Methoden verwenden die Markierung [2H]H2O oder [18O]H2O. Die Anreicherung dieser Isotope in TG lieferte Informationen über die Totalsynthese und den Umsatz von TG11. Es fehlt jedoch ein direktes Verfolgungsexperiment, das zeigt, dass ein definierter zellulärer TG-Pool 1 durch Wiederverwendung der FAs von Pool 1 zu einem neuen Pool 2 führen würde, wie in Abb. 1b dargestellt. Dies würde ein Markierungsexperiment mit einer umfassenden multiparallelen Verfolgung aller möglichen markierten TG-Moleküle erfordern, was eine enorme technische Herausforderung darstellt. Wir haben kürzlich eine Rückverfolgungstechnologie entwickelt, die auf Alkin-markierten FAs mit Click-Chemie-Reportern und Massenspektrometrie (MS)12,13 basiert. Es vereint alle für die Untersuchung des TG/FA-Zyklus notwendigen Merkmale: hohe Sensitivität, eindeutige Spezifität und insbesondere einfache Unterscheidung einfach und mehrfach markierter Lipidspezies12.

Der TG-Zyklus besteht aus dem permanenten Abbau von TG-Molekülen und der damit einhergehenden Resynthese. a, Schematische Darstellung von Abbau und Resynthese. Blaue Linien symbolisieren FAs und die schwarze horizontale Linie das Glycerin-Rückgrat. Der TG-Zyklus muss mindestens den Abbau zu DG umfassen, kann aber auch einen weiteren Abbau zu MG oder freiem Glycerin umfassen. Alle freigesetzten FAs sollen einen gemeinsamen Pool speisen, der zu Acyl-CoAs aktiviert wird und für die erneute Acylierung verwendet werden kann. Glycerin unterliegt in Adipozyten keiner erneuten Acylierung und wird in das Medium abgegeben. b, Beim Zyklus gleichen TGs mit mehr als einem markierten FA (rote Linien) ihre Markierung mit dem unmarkierten (blauen) Pool aus, wodurch sich die Markierung von mehrfach markierten zu einfach markierten Spezies verschiebt. Mit der in der vorliegenden Studie entwickelten speziellen Technologie kann dieser Prozess mit molekularer Auflösung über die Zeit verfolgt werden.

Im Folgenden werden wir diese Technologie anwenden, um direkte Beweise für den TG/FA-Zyklus zu liefern, die Halbwertszeit von TG im Zyklusprozess abzuschätzen und zu zeigen, dass der TG-Zyklus für die Homöostase des gespeicherten FA-Pools notwendig ist.

Bei einem konventionellen Rückverfolgungsexperiment wird eine einfach markierte Substanz einem System hinzugefügt und ihre Metaboliten werden über die Zeit verfolgt, wobei eine klare logische Zuordnung der markierten Metaboliten zur ursprünglichen Markierung erfolgt. Adipozyten sind jedoch der vielfältigen Mischung von FAs ausgesetzt, die aus der Nahrung stammen und eine große Bandbreite an Längen und Doppelbindungszahlen aufweisen, die in den gespeicherten TGs gemischte Spezies bilden. Um die Synthese und den Umsatz von TG zu verfolgen, sollte ein ebenso vielfältiger Satz verschiedener FAs als Tracer verwendet werden, was anschließend eine eindeutige Identifizierung der Markierung in jedem möglichen Metaboliten erfordern würde. Folglich wird die maximale Komplexität des Markierungsgemisches durch die mögliche analytische Unterscheidung begrenzt. Um mit nur drei Verbindungen einen breiten Bereich an Länge und Ungesättigtheit abzudecken, kombinieren wir ein gesättigtes mittelkettiges Alkin-FA, ein gesättigtes langkettiges Alkin-FA und ein mehrfach ungesättigtes langkettiges Alkin-FA (Alkin-PUFA). Um die drei FAs bei der gleichzeitigen Verfolgung eindeutig zu unterscheiden, verwenden wir einen ungeraden und einen geraden Alkin-FA in Kombination mit einem dritten Alkin-FA, der zusätzlich eine stabile Isotopenmarkierung trägt. Die beiden ersteren würden, wenn sie metabolisch mit endogenen FAs mit gerader Nummer kombiniert würden, zu unterscheidbaren Metaboliten mit ungerader bzw. gerader Nummer führen. Metaboliten des dritten Tracers konnten anhand der Isotopenmarkierung leicht unterschieden werden. Dementsprechend kombinierten wir das ungeradkettige Medium FA 11:0;Y (Abb. 2a; Nomenklatur der Alkinlipide siehe Methoden) mit dem geradkettigen Alkin-PUFA 18:2;Y und dem isotopenmarkierten gesättigten Lang- Kette FA 13C9-16:0;Y. Wir kombinieren diese dreifache Mehrfachmarkierung außerdem mit der zuvor etablierten vierfachen Probenmultiplexing-Strategie12. Dies spart Zeit und Kosten und verbessert gleichzeitig die Vergleichbarkeit der Daten, was zu einer umfassenden qualitativen und quantitativen Charakterisierung markierter Lipidspezies führt (Extended Data Abb. 1).

a, Strukturen der zur Markierung verwendeten FA;Ys. b, Einbeziehung von FA;Y pro Lipidklasse für drei verschiedene Eingabe-FA;Ys. Die Zahlen sind pmol pro Lipidklasse und Vertiefung. c, Total eingebautes FA;Y in den Hauptlipidklassen nach Markierung mit der 11/16/18-Kombination, wie in Abb. 1b beschrieben. Die Zahlen sind pmol des jeweiligen FA;Y pro Vertiefung. Alle Werte sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung, n = 4.

Um die Trennung der MS-Signale festzustellen, die von den verschiedenen FA;Ys stammen, und um die gegenseitige Beeinflussung der drei FA;Ys zu untersuchen, haben wir differenzierte 3T3-L1-Adipozyten mit den drei FA;Ys einzeln und in allen möglichen Kombinationen markiert (Extended Data Abb . 2), wie im Folgenden als „Kalibrierungsexperiment“ bezeichnet. Als nächstes analysierten wir das Verteilungsmuster jeder einzelnen identifizierten Spezies über die acht Markierungskombinationen und ordneten die Spezies dem jeweiligen Alkin-FA zu. Das Verfahren wird in Extended Data Abb. 3 ausführlicher dargestellt und erläutert. Die Zuordnungen aus dem Kalibrierungsexperiment wurden in LipidXplorer Molecular Fragment Query Language (MFQL)-Suchdateien übersetzt, die optimiert wurden, um eine maximale Abdeckung von Zuordnungen bei gleichzeitigem Ausschluss der zu erreichen mehrdeutige Arten. Diese Strategie wurde erweitert, um andere Lipidklassen zu analysieren und zuzuordnen, einschließlich mehrfach markierter Arten, die mehr als ein markiertes FA enthalten. Wichtig ist, dass auch für doppelt markiertes TG;Y2 eine saubere Signaltrennung erreicht wurde (Extended Data Abb. 4). Die abschließende vollständige Analyse umfasste acht Lipidklassen, die die quantitativ relevanten Produkte der FA-Assimilation darstellen, nämlich Sterolester (CE), Ceramid (Cer), Diglycerid (DG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidyl Ethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (PI) und TG. Diese Analyse umfasste sowohl einfach als auch mehrfach markierte Arten. Letzteres war besonders wichtig für das markierte TG;Yn. Eine Mischung aus 16 markierten internen Standards ermöglichte die Quantifizierung von pmol-Mengen. Nach der Optimierung der erforderlichen 131 MFQL-Suchdateien betrug die Laufzeit einer Multi-Labeling-Analyse nur 5–10 Minuten, abhängig von der Anzahl der Proben und der Hardwareleistung. Für das Kalibrierungsexperiment lieferte die Analyse 406 markierte Lipidspezies. Die markierten TGs dominierten mit 127 einfach markierten, 128 doppelt markierten und 10 dreifach markierten Arten, gefolgt von markierten PCs (46 Arten) und DGs (40 Arten). Alle drei Alkin-FA-Markierungen waren gut vertreten, mit 121 Spezies für FA 11:0;Y, 181 für FA 16:0;Y und 179 für FA 18:2;Y. Da jede Probe vierfach gemultiplext wurde, lieferte eine einzelne, auf dem MS-Gerät analysierte Probe bis zu 1.600 markierte Arten, die jeweils eindeutig identifiziert und quantifiziert wurden.

Alle drei Alkin-FAs (Abb. 2a) wurden in ähnlichen Mengen in die Zellen eingebaut (Abb. 2b), unabhängig davon, ob sie einzeln oder in Kombinationen angewendet wurden. Dies deutete darauf hin, dass die FA-Aufnahme- und Veresterungsmaschinerie in unserem Experiment nicht gesättigt war. Die saubere Trennung der Produkte der drei FA;Ys, wie durch das quantitative Identifikationsmuster in Abb. 2b belegt, ist eine Voraussetzung für die anschließende Analyse der Markierungsverteilung in den dreifach markierten Zellen (Abb. 2c). Das mittelkettige FA 11:0;Y hatte eine klare Präferenz für TG und DG, während die beiden langkettigen FA;Ys sowohl in Phospholipiden als auch in neutralen Lipiden gefunden wurden. Innerhalb der Phospholipide war das mehrfach ungesättigte FA 18:2;Y häufiger anzutreffen als das gesättigte FA 16:0;Y. Innerhalb der TGs bevorzugte FA 11:0;Y die einfach markierten TGs, während die anderen FA;Ys gleichermaßen in einfach und doppelt markierten TG-Spezies gefunden wurden.

Mit der neuen Methode führten wir eine zeitaufgelöste Analyse des Lipidumsatzes in 3T3-L1-Adipozyten durch. Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit allen drei Input-FA;Ys, jeweils bei 50 µM, markiert, gefolgt von Chase-Zeiten von 0, 6, 24 und 48 Stunden. Nach der Jagd wurden die Zelllipide extrahiert und auf markierte Spezies analysiert. Der vollständige quantifizierte Satz identifizierter Lipide sowie einige Anmerkungen finden Sie in den Zusatzdaten 1 im Excel-Format. Die Gesamtmengen der Markierung in den Hauptlipidklassen wurden bestimmt (Abb. 3). Das insgesamt eingebaute FA;Y war im Laufe der Zeit für FA 16:0;Y ungefähr konstant, zeigte einen moderaten Anstieg für FA 18:2;Y, zeigte jedoch einen starken Rückgang für das mittelkettige FA 11:0;Y (Abb. 3b). ).

a, Grundlegender Aufbau eines Pulse-Chase-Experiments. Kreise symbolisieren die Vertiefungen der 24-Well-Platte, die differenzierte 3T3-L1-Adipozyten enthalten. Die Zahlen 16.11.18 beziehen sich auf die C-Anzahl des Eingangs FA;Y (Abb. 2), der 1 Stunde lang bei 50 µM verwendet wurde. Nach der Inkubation wurden die Medien entfernt und für die angegebene Zeit durch Chase-Medien ersetzt. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und die Lipide in Gegenwart interner Standards extrahiert. Extrahierte Lipide wurden mit den rechts angezeigten C175-7x-Reportermolekülen durch Klickreaktion umgesetzt, die Proben gepoolt und anschließend durch Multiplex-MS1/MS2 analysiert. Identifizierte markierte Arten wurden quantifiziert, zusammengefasst und über die Verfolgungszeit für die Gesamtmenge (b) und getrennt für TG (c), DG (d), PA (e), PC (f), PE (g) und PI (h) aufgetragen ). In den Feldern b–e sind die Summen einfach und mehrfach markierter Arten dargestellt. Für PE (g) wurden keine doppelt markierten Spezies nachgewiesen; Für PI (h) gab es sehr schwache Signale doppelt markierter Spezies, die aufgrund des Fehlens eines internen PI;Y2-Standards nicht quantifiziert werden konnten. Alle Werte sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung, n = 11–12. Fehlerbalken, die kleiner als die Symbolgröße sind, werden der Übersichtlichkeit halber weggelassen.

Beachten Sie, dass diese und die folgenden Zahlen das ursprüngliche FA;Y sowie mögliche Metaboliten von Verlängerungs-, Entsättigungs- oder teilweisen Abbaureaktionen umfassen. Wie für ein Adipozytenmodell erwartet, wurden die meisten markierten FAs in TG eingebaut (Abb. 3c). Passend zu seinem Gesamtverlust zeigte auch FA 11:0;Y in TG;Y einen starken Rückgang, während die Menge an langkettigem FA;Y in TG;Y konstant blieb (FA 16:0;Y) oder zunahm (FA 18:2;Y) während der Verfolgungsjagd. Etwa die Hälfte dieses Anstiegs könnte durch den Anstieg der Gesamtmenge (Abb. 3b) und der größte Teil des Rests durch einen Fluss von FA;Y von markiertem DG (Abb. 3d) und PC (Abb. 3f) zu erklärt werden beschriftet mit TG.

Als nächstes analysierten wir die Verteilung von FA;Y innerhalb der drei TG;Yn-Pools durch parallele Verfolgung von >200 Arten. Während des Verfolgungszeitraums fanden wir einen massiven Anstieg einfach markierter TG;Y1-Arten, insbesondere solcher, die langkettige FA;Ys enthielten (Abb. 4a), mit einem gleichzeitigen starken Rückgang aller drei FA;Ys in Doppel- und dreifach markierte TG; Yn-Spezies (Abb. 4b, c). Dieses Verhalten ist auch direkt in den Originalspektren zu erkennen, die die Alkin-markierten Neutrallipide durch ihren Neutralverlust (NL) von 73,1 m/z visualisieren (Extended Data Abb. 5). Die Kinetik dieser Abnahmen war für doppelt und dreifach markierte TG;Yn-Spezies unterschiedlich. Nach 6 Stunden waren noch 46,7 ± 4,1 % der anfänglichen TG;Y2 vorhanden (Abb. 4b), im Gegensatz zu 36,5 ± 3,5 % der anfänglichen TG;Y3 (Abb. 4c). Bezüglich der Abnahme von TG;Y3 gab es einen sehr geringen relativen Unterschied zwischen den drei Eingabe-FA;Ys; bezüglich TG;Y2 nahm das mittelkettige FA;Y etwas schneller ab (Restmenge nach 6 h: FA 11:0;Y, 44,0 %; FA 16:0;Y, 47,6 %; FA 18:2;Y, 49,0). % als die beiden langkettigen Tracer. Für alle drei FA;Ys zusammen wurden die Daten als Anteil des gesamten FA;Y aufgetragen, der in TG;Y1, TG;Y2 und TG;Y3 vorkommt (Abb. 4d). Sie zeigen die Umverteilung von FA;Y von dreifach und doppelt markierten Spezies hin zu einfach markiertem TG;Y1. Der TG-Zyklus ist die einzige konsistente Erklärung für diese Beobachtung. Der einfachste Zyklus würde aus der TG-Hydrolyse unter Bildung von DG + FA und der anschließenden erneuten Acylierung zu TG bestehen (Abb. 4e). Die obere Reihe zeigt die Situation nach der 1-stündigen Markierungsperiode. Während der Pulsmarkierung machen die eingegebenen FA;Ys (rot) einen Großteil der gesamten FA aus, die für die TG-Synthese verwendet wird, was zu einem großen Anteil mehrfach markierter TG-Spezies führt. In Zahlen ausgedrückt enthielt der markierte TG;Yn-Pool am Ende des Pulses 94 pmol TG;Y3, 1.017 pmol TG;Y2 und 3.030 pmol TG;Y1, angegeben als schwarze Zahlen über den oberen Symbolen (Abb. 4e). . Darüber hinaus gibt es einen unmarkierten Pool endogener TG von 138.000 ± 7.000 pmol, der aus der Lipidomik unmarkierter TG in denselben Proben erhalten wurde. Nach einer theoretischen binominalen Äquilibrierung kann die Verdünnung der Markierung für einen vollständigen TG → DG → TG-Zyklus berechnet werden (blaue Zahlen), was einen Rückgang von TG;Y2 um 55 % und einen Anstieg von TG;Y1 um 45 % vorhersagt, was nahe bei liegt die Situation bei der 6-Stunden-Verfolgungszeit. Abbildung 4f zeigt eine alternative Möglichkeit zur Darstellung der Daten. Die Linien stellen die theoretische Binominalverteilung der Gesamt-FA;Y über die drei Klassen von TG;Yn als Funktion des Anteils von FA;Y an der Gesamt-FA des TG-Pools dar. Für jeden der vier experimentellen Zeitpunkte haben wir nun die Position der Daten entlang der x-Achse bestimmt, die am besten zu einer Binominalverteilung passen würde. Für den Puls allein ergibt sich daraus ein Gesamtanteil von FA;Y am gesamten synthetisierten TG;Yn von 26 %. Diese Zahl zeigt an, dass während des Markierungszeitraums das markierte FA;Y 26 % aller FAs beitrug, die zu TG acyliert wurden. Ohne TG-Zyklus würden die relativen Mengen der drei markierten TG;Yn-Spezies über die Zeit konstant bleiben. Die experimentellen Daten deuten jedoch darauf hin, dass sich das markierte FA;Y mit zunehmender Verfolgungszeit vom kleinen ursprünglichen Pool auf zunehmende Poolgrößen ausbreitet, die einem Markierungsgehalt von 12 %, 5 % und 3,5 % entsprechen. Dieser zyklische Verdünnungsprozess erklärt auch, warum TG;Y3 schneller verschwand als TG;Y2. Sofern TG-abbauende Enzyme nicht die Anzahl der Dreifachbindungen in einer TG-Spezies erkennen könnten, wofür es bisher keine Hinweise gibt, würden sowohl TG;Y2 als auch TG;Y3 mit der gleichen Geschwindigkeit abgebaut. Die offensichtlichen Unterschiede in der Abbaukinetik sind auf die unterschiedlichen Statistiken der Reacylierung von DG;Y1 und DG;Y2 zu TG;Y2 bzw. TG;Y3 zurückzuführen. Quantitativ zeigten diese Daten, dass die Verfolgungszeit von 6 Stunden etwa 1,5 t1/2 entsprach, was auf eine t1/2 von etwa 4 Stunden hindeutet. Als nächstes fragten wir, ob der beobachtete Zyklus von einer bestimmten FA-Markierungskombination abhängt und ob die Alkinmarkierung als solche die Ursache für das Zyklusphänomen sein könnte (Abb. 4g – j). Daher haben wir ein Pulse-Chase-Experiment wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch mit unterschiedlichen FA-Kombinationen, nämlich FA 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (Abb. 4g) oder FA 16:0 ;Y/18:2;Y/19:1;Y (Abb. 4i). Das FA 19:1;Y wurde bereits in Hepatozyten12,13 verwendet und ist ein gutes Analogon von Ölsäure. Die letztgenannte FA-Kombination ist eine weitgehende Nachahmung der natürlichen FA-Zusammensetzung der untersuchten Zellen hinsichtlich Kettenlänge und Doppelbindungszahl (siehe Ergänzungstabelle 1 für eine detaillierte Analyse der durchschnittlichen C-Atom- und Doppelbindungszahlen für die in Abb. gezeigten Markierungsexperimente). . 4g–j). Der Vergleich der Daten beider FA-Kombinationen (Abb. 4g, i) zeigt, dass der Zyklus unabhängig von der Anwesenheit eines mittelkettigen FA ist und mit sehr ähnlicher Kinetik erfolgt. Bitte beachten Sie, dass diese Experimente eine höhere kinetische Zeitauflösung haben und die Kinetik des vorherigen Experiments bestätigen. Wir haben auch analoge Pulse-Chase-Experimente mit isotopenmarkiertem FA anstelle von Alkin-markiertem FA durchgeführt. Kombinationen waren FA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] (Abb. 4h) und FA 16:0[13C16]/18:2[13C18]/19:1[D8] (Abb. 4j). Die Analyse isotopenmarkierter Proben ist anspruchsvoll, da der Isotopenmarkierung die überlegene analytische Empfindlichkeit und Spezifität fehlt, die die Alkin-Tracer auszeichnen. Zur Veranschaulichung: Erweiterte Datenabbildungen. 6 und 7 zeigen einen Vergleich der Primärspektren aus den Experimenten in Abb. 4g,h. Mit Alkin markierte TG-Spezies trennen sich gut von der Masse des nicht markierten Materials (Erweiterte Daten, Abb. 6a, b), und eine genauere Betrachtung zeigt, dass die wichtigsten markierten Spezies mit den dominanten endogenen Spezies identisch sind (siehe kommentiertes Spektrum im Ergänzungsspektrum 1). Im Gegensatz dazu ist es unvermeidbar, dass die isotopenmarkierten TGs Teil des überfüllten Bereichs von m/z 700–900 werden (Extended Data Abb. 7a). Zumindest der Peak der dominanten markierten TG 43:1 konnte in der Mischung direkt identifiziert werden, die anderen Arten waren jedoch visuell nicht identifizierbar. Ein Äquivalent der NL73-Suche nach alkinmarkierten Spezies existiert für die isotopenmarkierten Spezies nicht, aber die TGs, die das markierte FA 11:0[D3] enthielten, konnten mithilfe einer NL-Suche nach dem Verlust dieses FA zusammen mit identifiziert werden Ammoniak, also bei NL m/z 206,2. Eine solche Analyse wurde durchgeführt (Extended Data Abb. 7b) und ergab ein vernünftiges Spektrum. Anschließend wurde ein gleichwertiger LipidXplorer-Suchalgorithmus verwendet, um die markierten TGs zu identifizieren und zu quantifizieren. Entsprechende Suchen wurden auch für die anderen isotopenmarkierten FAs durchgeführt. Obwohl dies notwendig ist, um die erforderliche Spezifität zu erreichen, bedeutet dies, dass jede Gruppe isotopenmarkierter TGs im Gegensatz zur einheitlichen Quantifizierung der Alkin-markierten Spezies durch einen unterschiedlichen Neutralverlust quantifiziert wird, was zu einer möglichen quantitativen Verzerrung in den Daten führt. Schließlich konnten wir 105 isotopenmarkierte TG-Spezies identifizieren (gegenüber 270 alkinmarkierten TG-Spezies), gerade genug für Berechnungen für einfach, doppelt und dreifach markierte TGs (Abb. 4h, j). Diese Daten zeigten, dass der TG-Zyklus für isotopen- und alkinmarkierte Spezies auf die gleiche Weise und mit vergleichbarer Kinetik abläuft.

a–c, Zeitlicher Verlauf der Mengen der drei Input-FA;Ys in einfach- (a), doppelt- (b) und dreifach markiertem (c) TG;Yn im Pulse-Chase-Experiment. d, Relative prozentuale Verteilung des gesamten FA;Y über die markierten Klassen von TG;Yn. e, Darstellung des TG-Zyklus und seiner Auswirkung auf die Verteilung der Markierung zwischen einfach und mehrfach markierten Pools. Die schwarzen Zahlen sind pmol der jeweiligen Molekülformen zum Zeitpunkt 0, abgeleitet aus den Daten in den Feldern a–d, und stellen die Summe aller drei FA;Ys dar. In denselben Proben wurde auch die Menge an unmarkiertem TG;Y0 gemessen. Die blauen Zahlen sind vorhergesagte Werte für einen Zyklus der TG-Deacylierung, gefolgt von einer stochastischen Reacylierung. Beachten Sie, dass diese Berechnung von diskreten Schritten während des Zyklus ausgeht, was in Wirklichkeit nicht der Fall ist, da Abbau und Resynthese gleichzeitig erfolgen. f, Die Kurven zeigen die theoretisch berechnete binominale Markierungsverteilung innerhalb der Pools von TG;Y1, TG;Y2 und TG;Y3 als Funktion des Anteils von FA;Y aller FAs (unmarkiert und markiert; drei pro TG-Molekül) in der Gesamtpool von TG;Yn. Die Symbole sind die aus dem Experiment abgeleiteten Messwerte. Die Position der Symbole und die entsprechenden Zahlen 3,5 %, 5 %, 12 % und 26 % geben den Punkt an, an dem die gemessenen Daten am besten zu den berechneten Kurven passen. Alle gemessenen Datenwerte wurden auf Gesamt-FA;Y in TG;Y normiert, um deren Schwankungen auszugleichen. g–k, Unter Verwendung der Datendarstellung wie in Panel d wird der TG-Zyklus in separaten Pulse-Chase-Experimenten verglichen. Alle Experimente wurden mit einer kürzeren maximalen Chase-Zeit von 24 Stunden und kürzeren minimalen Chase-Zeiten von 2 und 4 Stunden durchgeführt. FA-Markierungskombinationen sind FA 11:0/16:0/18:2 mit Alkin- (g) oder Isotopenmarkierung (h) und 16:0/18:2/19:1 mit Alkin- (i) oder Isotopenmarkierung (j). , wie in den Tafeln angegeben. Alle Daten sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung, n = 11–12 (g–j, n = 4). Fehlerbalken, die kleiner als die Symbolgröße sind, werden der Übersichtlichkeit halber weggelassen.

Als nächstes vertieften wir die Analyse, indem wir auf die Ebene der Lipidspezies vordrangen. Die Analyse der TG;Y1-Spezies nach Markierung mit FA 18:2;Y (Abb. 5a) zeigte, dass innerhalb dieser Lipidklasse einige Spezies relativ konstant waren (Abb. 5a, offener Pfeil) und andere (Abb. 5a, geschlossener Pfeil). ) stieg stärker als der allgemeine Trend (Abb. 5a, gesamt).

a, Zeitlicher Verlauf der relativen Häufigkeit von TG;Y1-Arten nach Markierung mit FA 18:2;Y. Die relativen Mengen aller TG;Y1-Arten des Pulse-Chase-Experiments sind farbcodiert dargestellt. Jede Zeile repräsentiert eine Art. b, MS2-Analyse einer Art (offener Pfeil) zur Verfolgungszeit 48 Stunden. Der Vorläuferpeak bei m/z 1.025,8 wurde weggelassen. Die vier Reihen von Fragmentpeaks zeigen die FA-Zusammensetzung 16:1_18:1_18:2;Y. c, MS2-Analyse einer Art (geschlossener Pfeil) zum Verfolgungszeitpunkt 48 Stunden. Der Vorläuferpeak bei m/z 1.021,8 wurde weggelassen. Die drei Reihen von Fragmentpeaks zeigen die FA-Zusammensetzung 16:1_16:1_20:4;Y. Beachten Sie, dass in b und c die tatsächlich eingebauten FA;Ys direkt anhand der Spitzenmassen identifiziert und in Rot gedruckt werden. In a sind die Zahlen nach der Farbintensität (Min.–Max. des gesamten Datenblocks) kodiert, abgeleitet aus Durchschnittswerten, n = 12. Detaillierte statistische Daten dieses Experiments sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Durch MS2-Analyse wurde die konstante Spezies (Abb. 5b) als TG 52:4;Y identifiziert, die unmarkierte FAs 16:1 und 18:1 zusammen mit FA 18:2;Y enthielt. Im Gegensatz dazu wurde die zunehmende Spezies (Abb. 5c) als TG 52:6;Y identifiziert, die zwei nicht markierte FAs 16:1 und ein markiertes FA 20:4;Y enthielt, was auf den Metabolismus des markierenden FA;Y selbst durch Verlängerung hinweist Entsättigung. Dies wurde durch direkte Suchen in den ursprünglichen Spektraldaten (Extended Data Abb. 8 für FA 20:4;Y und Extended Data Abb. 9 für FA 18:2;Y) und eine detaillierte statistische Analyse (Ergänzungstabelle 2) bestätigt. Daher haben wir mithilfe spezieller LipidXplorer-MFQL-Dateien systematisch die MS2-Spektren aller einfach markierten TG;Y1-Spezies nach metabolisch verarbeiteten FA;Ys durchsucht, die alle eindeutig identifiziert und quantifiziert wurden. TG;Y1 wurde ausgewählt, weil (1) seine Spektren die klarsten Informationen über die FA;Y1-Identität enthielten und (2) es den Großteil des markierten Materials enthielt, insbesondere zu späteren Verfolgungszeiten. Daten aus beiden FA-Kombinationen, 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y und 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y, wurden analysiert. Die Ergebnisse, normalisiert auf den Prozentsatz der Gesamtmenge in TG;Y1, zeigten, dass in beiden FA-Kombinationen die stärkste Modifikation im mehrfach ungesättigten FA 18:2;Y auftrat (Abb. 6a,b), das verlängert und entsättigt wurde, um FA 18 zu ergeben :3;Y, FA 20:3;Y und FA 20:4;Y als die bekanntesten Produkte. Das gesättigte FA 16:0;Y wurde etwas weniger modifiziert (Abb. 6c,d), hauptsächlich durch Entsättigung und Verlängerung, wodurch FA 16:1;Y und FA 18:1;Y entstanden. FA 11:0;Y wurde teilweise abgebaut, was FA 7:0;Y und 9:0;Y ergab, und teilweise zu FA 13:0;Y und 15:0;Y verlängert (Abb. 6e). FA 19:1;Y wurde teilweise zu FA 17:1;Y abgebaut und in sehr geringem Maße auch zu FA 21:1;Y verlängert. Im Allgemeinen war die Modifikation in der FA-Kombination 16:0;

3T3-L1-Zellen wurden mit der FA-Kombination 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (a,c,e) oder 16:0;Y/18:2;Y/19:1 markiert ;Y (b,d,f) für 1 Stunde, gefolgt von Verfolgungsperioden zwischen 6 und 48 Stunden, wie angegeben. FA-Fragmentpeaks, wie in Abb. 5b, c dargestellt, wurden in allen einfach markierten TG; Y1-Arten nachgewiesen, identifiziert und quantifiziert. Diagramme zeigen den Anteil jedes Metaboliten zu den vier Zeitpunkten. Metaboliten von FA 18:2;Y sind in den Tafeln a und b, von FA 16:0;Y in Tafeln c und d, von FA 11:0;Y in Tafel e und von 19:1;Y in Tafel f dargestellt. Alle Zahlen werden auf die Summe des jeweiligen FA;Y in TG;Y1 zum jeweiligen Verfolgungszeitpunkt normiert, um Änderungen im Gesamt-TG;Y1 auszugleichen. Die Ordinaten werden geteilt, um die Abnahme der Input-FA;Ys und die Zunahme ihrer Metaboliten in einem Panel anzuzeigen. Alle Zahlen sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung, n = 11–12. Fehlerbalken, die kleiner als die Symbolgröße sind, werden der Übersichtlichkeit halber weggelassen.

Der beobachtete Anstieg der Doppelbindungen und der Kettenlänge war nicht auf TG;Y1 beschränkt. Bei den Phospholipiden kann die Umwandlung von FA 18:2;Y zu FA 20:4;Y nicht so direkt verfolgt werden wie bei den TGs, da die Phospholipide in MS2 kein markiertes FA;Y-Fragment freisetzen. Dennoch stieg die Anzahl der Seitenketten-C-Atome und der Doppelbindungen für die drei Hauptphospholipidklassen stetig an, mit zunehmenden Chase-Zeiten in beiden FA-Kombinationen (Extended Data Abb. 10a). Dieser Befund schließt aus, dass der Anstieg von FA 20:4;Y im TG;Y1 durch FA 20:4;Y angetrieben würde, das aus dem PC;Y1-Pool freigesetzt wird.

Schließlich führten wir Pulse-Chase-Experimente an primären weißen und braunen Adipozyten der Maus durch. In beiden Systemen gab es eindeutig einen TG-Zyklus mit Raten, die mit denen in 3T3-L1-Adipozyten vergleichbar waren (Abb. 7, schwarze Dreiecke). Die teilweise Hemmung der Beta-Oxidation mit 30 µM des CPT1-Inhibitors Teglicar14, dessen halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) mit 40 µM bestimmt wurde (Lit. 15), führte zu einem offensichtlichen Anstieg der Zyklusraten (Abb. 7, blau). Quadrate) in beiden Adipozytentypen. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Vorstellung, dass der Zyklus sowohl die anfängliche Spaltung von TG als auch die Neusynthese eines TG-Moleküls erfordert. Wenn das ursprünglich freigesetzte FA jedoch durch Beta-Oxidation abgebaut wird, wird aus unmarkiertem DG weniger markiertes TG;Y1 produziert, und folglich werden die scheinbare Effizienz und die Zyklusrate verringert.

a,b: Weiße (a) und braune (b) Adipozyten wurden 1 Stunde lang mit der FA-Kombination 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y markiert, gefolgt von Verfolgungsperioden zwischen 6 und 48 Stunden h, wie angegeben. Die Diagramme zeigen die Verteilung der Summe der drei FA;Ys über die TG;Y1-, TG;Y2- und TG;Y3-Pools, normalisiert auf die Gesamtmenge an FA;Y im gesamten TG;Yn-Pool. Alle Werte sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung, n = 4 (n = 12 für eine Verfolgungszeit von 0 Stunden). Blaue Symbole zeigen das Vorhandensein des CPT1-Inhibitors Teglicar während der Chase-Perioden an, schwarze Symbole zeigen dessen Abwesenheit an.

Eine detaillierte und quantitative Analyse des TG-Zyklus war bisher aufgrund des Fehlens einer geeigneten Methode nicht möglich. Die für dieses Projekt entwickelte Multilabel-Multiplex-Tracing-Methode ermöglichte eine solche Studie, wie sie hier vorgestellt wird. Die verwendete Strategie zur Markierungsunterscheidung unter Verwendung von drei Alkin-FA-Tracern (ungerade/gerade FA;Y plus ein isotopenmarkiertes FA;Y) funktionierte gut, selbst im anspruchsvollen System von Adipozyten mit einem beträchtlichen Hintergrund endogener ungerader FAs16. Der beträchtliche Längenunterschied von sieben Kohlenstoffatomen zwischen den ungeraden und geraden FA;Ys erwies sich als hilfreich für die Unterscheidung markierter Arten. Die 13C9-Markierung des dritten FA;Y schloss jegliche relevante Interferenz mit den beiden anderen FA;Ys aus. Für noch schwierigere biologische Systeme oder für die zukünftige Hinzufügung eines vierten Tracers wäre die Herstellung anderer isotopenmarkierter FA;Ys, beispielsweise durch Einbau einiger D-Atome in ein einfach ungesättigtes FA;Y, eine interessante Option. Wichtig ist, dass unsere Methodik nicht auf bestimmte FA-Kombinationen oder Zelltypen beschränkt ist. Neben den Tracern 11:0/16:0/18:2 und 16:0/18:2/19:1 dieser Studie haben wir auch die Kombination 12:0/16:0/19:1 erfolgreich getestet Adipozyten sowie alle diese Kombinationen in frisch isolierten Hepatozyten.

Der direkte Nachweis des TG-Zyklus in 3T3-L1-Adipozyten eröffnet mehrere Diskussionspunkte. Die erste Frage ist, ob die Daten andere Erklärungen zulassen würden. Dies kann grundsätzlich verneint werden. Das entscheidende Argument ergibt sich aus der Beobachtung, dass innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Verfolgung sowohl für FA 16:0;Y als auch für FA 18:2;Y ein starker Anstieg des einfach markierten TG;Y1 festgestellt wird. Die Freisetzung von Markierungen aus doppelt und dreifach markierten Arten ist die einzige Quelle, die diesen Anstieg erklären kann. Am Beispiel von FA 16:0;Y kommt es zu einem Anstieg der Markierung in TG;Y1 um 461 pmol und einer entsprechenden parallelen Abnahme von TG;Y2 und TG;Y3 um 449 pmol. Im Gegensatz dazu summiert sich der gesamte Rückgang bei allen anderen Lipidklassen auf 99 pmol, was nicht ausreicht, um den Anstieg von TG;Y1 zu erklären. Die entsprechenden Zahlen für 18:2;Y zeigen einen Anstieg von TG;Y1 um 468 pmol, eine kombinierte Abnahme von TG;Y2 und TG;Y3 um 360 pmol und in allen anderen Lipidklassen um 56 pmol. Auch hier deuten die Zahlen darauf hin, dass 76 % des Anstiegs von TG;Y1 auf TG;Y2 und TG;Y3 zurückzuführen sind, was per Definition TG-Zyklus ist.

Der zweite Punkt betrifft den Weg des TG-Zyklus. Das absolute Minimum ist ein TG/DG-Zyklus, wie dargestellt (Abb. 1 und 4e), aber es könnte auch ein längerer Zyklus geben, der einen weiteren Abbau zu Monoacylglycerin (MG) oder zu freiem Glycerin mit sich bringen würde. Tatsächlich ist die Glycerinfreisetzung durch Fettgewebe ein klassischer Indikator für die TG-Hydrolyse17 und wurde zur Schätzung des TG-Zyklus3 verwendet. Neuere Untersuchungen sowohl an 3T3-L1-Zellen als auch an primären Adipozyten zeigten, dass freigesetztes Glycerin auch aus der Glykolyse stammen kann18,19, was die Vorstellung in Frage stellt, dass die Glycerinfreisetzung ein quantitativer Indikator für die TG-Hydrolyse ist. Derzeit können unsere Daten nicht zwischen den möglichen Formen des TG-Zyklus unterscheiden und auch keinen Rückschluss auf die Identität der beteiligten enzymatischen Aktivitäten geben. Die Tatsache, dass die Daten gut einer binominalen Etikettenverteilung entsprechen, weist auf die stochastische Natur des Prozesses hin. Für tiefere mechanistische Informationen sind mehr Daten zu kürzeren Verfolgungsperioden sowie Inhibitor- und Genablationsstudien erforderlich, die gegen Kandidatenenzyme gerichtet sind. Solche Daten sollten in die mathematische Modellierung eingespeist werden, die nicht nur TG;Yn, sondern auch die Bezeichnungen DG;Yn, MG;Y, PA;Y und PC;Y umfassen muss.

Ein dritter diskussionswürdiger Punkt ist die Geschwindigkeit und die energetischen Kosten des Kreislaufs. Aus dem Abbau von TG;Y3 können wir eine Halbwertszeit von TG in einem TG/DG-Zyklus von 4 Stunden abschätzen. Bei dieser Rate und ohne Berücksichtigung der Positionsspezifität der Zyklusreaktionen würde jeder FA in TG einmal am Tag umgesetzt werden, was energetische Kosten von 1 ATP pro Tag hätte. Bei einem Nettoenergiegehalt von 106 ATP pro Palmitatmolekül würde die Speicherung von TG pro Tag etwa 1 % seines Energiegehalts in 3T3-L1-Adipozyten kosten. Bei der Übertragung auf Fettgewebe scheint dies eine große Zahl zu sein, denn das würde bedeuten, dass ein 50 kg schweres Fettdepot allein durch den TG-Zyklus um 0,5 kg pro Tag schrumpfen würde. Es ist wahrscheinlich, dass der TG-Zyklus im weißen Fettgewebe mit seinen größeren Lipidtröpfchen langsamer erfolgt als in 3T3-L1-Zellen, die Tröpfchen mit einem typischen Durchmesser von 5–10 µm aufweisen, da einige der relevanten Stoffwechselreaktionen an der Tröpfchenoberfläche stattfinden .

Abschließend muss die Frage nach den biologischen Vorteilen des Radfahrens gegenüber einer statischen Speicherung diskutiert werden. Das klassische Lehrbuchargument für Substratzyklen ist die verbesserte regulatorische Flexibilität durch die Erhöhung der Regulationsamplitude eines Paares entgegenwirkender Enzyme gegenüber einem einzelnen, unidirektional wirkenden Enzym. Dies scheint auch für den TG-Zyklus zuzutreffen, da ein Großteil des verringerten TG-Verbrauchs nach Beendigung der körperlichen Aktivität auf eine erhöhte Umesterung statt auf eine verringerte Esterhydrolyse zurückzuführen ist3. Eine weitere Funktion könnte in der UCP1-unabhängigen Thermogenese im weißen Fettgewebe liegen20,21.

Unsere Daten weisen auf einen dritten wichtigen Aspekt hin: die Zusammensetzung des gespeicherten FA-Pools in den TGs. Die Daten zeigen, dass jedes der drei markierenden FAs ein spezifisches Schicksal hat: Ein Großteil von 82 % des eingebauten mittelkettigen FA 11:0;Y ging innerhalb von 48 Stunden aus den Zellen verloren, vermutlich durch bevorzugte Oxidation. Etwa 10 % des Rests wurden modifiziert, hauptsächlich durch Verlängerung und Entsättigung, was FA 15:1;Y und 17:1;Y ergab. Nach 48 Stunden waren nur noch 16 % des ursprünglichen FA 11:0;Y vorhanden. Nach der gleichen Zeit waren noch 100 ± 13 % der Alkinpalmitinsäure 16:0;Y vorhanden und 88 % davon blieben in ihrer ursprünglichen Form. Modifikationen erzeugten größtenteils entsättigte FA 16:1;Y und 18:1;Y. Der PUFA 18:2;Y zeigte keinen nennenswerten Materialverlust. Etwa 20–30 % der ursprünglichen FAs wurden modifiziert, hauptsächlich zu FA 20:3;Y und 20:4;Y, dem Äquivalent von Arachidonsäure und ihrer Vorstufe. Zusammenfassend zeigen diese Daten (1) eine schnelle Clearance mittelkettiger FAs, (2) eine langsame Entsättigung gesättigter FAs zur Bildung von Äquivalenten Palmitoleinsäure und Ölsäure und (3) einen Metabolismus von Linolsäureäquivalenten zu Arachidonsäure. Alle drei Prozesse sind potenziell vorteilhaft für die Zelle oder den Organismus. Mittelkettige FAs sind als Membranbestandteile nutzlos oder sogar potenziell gefährlich. Ihre Entfernung beseitigt ein potenzielles Problem und ihre Umwandlung in langkettige einfach ungesättigte FAs liefert nützliche Membranbausteine. Palmitinsäure ist ein reichlich vorhandener Nahrungsbestandteil, hohe Palmitatkonzentrationen in Lipiden korrelieren jedoch mit mehreren widrigen Umständen22. Eine langsame Entsättigung zu nützlichen einfach ungesättigten FAs würde die Gefahr einer Palmitatanreicherung in gespeicherten TGs verringern und negative Auswirkungen von freigesetztem Palmitat auf die Mobilisierung von gespeichertem Fett verhindern. Arachidonat ist ein wichtiger FA mit einzigartigen Enzymen beim Membranlipidumsatz23,24 und spielt eine Schlüsselrolle als Vorläufer für Eicosanoide bei der Entzündungssignalisierung. Ein dauerhafter Arachidonsäurespiegel ist für das Leben von Säugetieren von entscheidender Bedeutung, wie zahlreiche experimentelle Studien an Mäusen und der absolute Bedarf an Arachidonsäure in der Säuglingsernährung belegen25. Die Umwandlung der reichlich vorhandenen Linolsäure in Arachidonsäure bei Säugetieren ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der in Hepatozyten abläuft26. Unsere Daten legen nahe, dass Fettgewebe andere Organe bei diesem Prozess unterstützen könnte.

Ohne TG-Zyklus würden alle drei FA;Ys nach dem Einbau in TG völlig unverändert bleiben, da alle beobachteten FA-Modifikationen oder Abbauwege Coenzym-A-Ester von freiem FA (FA-CoA) als Substrat benötigen. Daher erfordert die fortlaufende FA-Modifikation die wiederholte Freisetzung von FAs aus TG in Verbindung mit ihrer Reaktivierung durch Acyl-CoA-Synthetasen im TG-Zyklusweg. Die gleiche Logik gilt auch für die Entfernung beschädigter FAs, beispielsweise durch Peroxidation, aus dem TG-Pool. In einem statischen Becken würde sich beschädigtes Material ansammeln; TG-Cycling ermöglicht den Zugang zu beschädigten FAs für den anschließenden Abbau. Zusammenfassend betonen unsere Experimente die wesentliche Funktion des TG-Zyklus zur Überwachung und Aufrechterhaltung der Zusammensetzung des gespeicherten FA-Pools in Adipozyten.

Um Verwechslungen zwischen normalen Lipid-Doppelbindungen und der terminalen Dreifachbindung der Alkinmarkierung zu vermeiden, behandeln wir die Dreifachbindung als Funktionalisierung der FA und kennzeichnen sie mit dem Suffix „;Y“. Dies folgt der Strategie der LipidMaps-Nomenklatur27, die in der jüngsten Aktualisierung noch kein System zur Angabe von Dreifachbindungen enthält28. Die hier verwendete Nomenklatur wurde mit einer Gruppe interessierter Wissenschaftler, die an der neuesten Aktualisierung der LipidMaps-Nomenklatur beteiligt waren, diskutiert und vereinbart und wurde bereits in unseren jüngsten Veröffentlichungen verwendet. Das Y macht die Dreifachbindung in der Abkürzung sichtbar und sorgt dafür, dass die korrekte Anzahl an Doppelbindungen in der Abkürzung erhalten bleibt. Daraus ergibt sich FA 18:2;Y für das terminale Alkin-FA mit 18 C-Atomen und zwei Doppelbindungen, das in dieser Studie als Linolsäureäquivalent verwendet wird. Dadurch ist sowohl die Funktionalisierung mit einer Dreifachbindung als auch die biochemische Äquivalenz zu Linolsäure leicht zugänglich. Für Lipidklassen verwenden wir auch das Suffix Y, d. h. PC;Y und TG;Y bezeichnen Phosphatidylcholin und Triacylglycerin, die jeweils ein Alkin-FA (FA;Y) enthalten. Das Vorhandensein von zwei FA;Ys in einem doppelt markierten TG-Molekül ergibt TG;Y2, und das von drei FA;Ys in einem dreifach markierten Molekül ergibt TG;Y3. In Namen von Glycerolipid-Arten wird das „Y“ neben der Doppelbindungsnummer platziert, zum Beispiel ist TG 52:3;Y ein sehr häufiges Produkt der Kennzeichnung mit FA 18:2;Y. Wenn dementsprechend die Identität des anderen FA im TG;Y bekannt ist, könnte das Molekül zu TG 18:2;Y_16:0_18:1 werden, und, wenn die Positionen bekannt wären, zu TG 16:0/18:2;Y/ 18:1.

FA 11:0;Y wurde von TCI Deutschland erhalten und FA 18:2;Y wurde wie beschrieben synthetisiert29. FA 19:1[D8] wurde durch Wittig-Reaktion zwischen Carboxyoctyltriphenyphosphoniumbromid und Decanal[D8] synthetisiert. Letzteres wurde aus Decatetraenal30 durch Deuterierung mit Deuteriumgas und Wilkinson-Katalysator in CH3OD hergestellt. 13C9-FA 16:0;Y wurde in einer mehrstufigen chemischen Synthese erhalten. Kurz gesagt, kommerzieller U-13C-markierter gemischter FA-Methylester wurde mit cis-1,4-Diacetoxy-2-buten in Gegenwart von Nitro-Grela als Metathesekatalysator umgesetzt. Aus der erhaltenen Mischung wurde 13C9-11-Acetoxyundec-9-ensäuremethylester gereinigt. Die Doppelbindung wurde mit H2/Pd reduziert und der Acetylester mit HCl in Methanol gespalten. Der resultierende 13C9-11-Hydroxyundecansäuremethylester wurde gereinigt und mit Pyridiniumchlorchromat in Dichlormethan zum entsprechenden Aldehyd, 11-Oxoundecansäuremethylester, oxidiert. Dies wurde mit dem aus Dioxolanylpropyltriphenylphosphoniumbromid erhaltenen Wittig-Reagens gekoppelt. Die resultierende Doppelbindung wurde mit H2/Pd reduziert. Die Schutzgruppe am terminalen Aldehyd wurde mit Toluolsulfonsäure in feuchtem Aceton entfernt, um 13C9-15-Oxopentadecansäuremethylester zu erhalten. Die letzte terminale Dreifachbindung wurde durch Reaktion mit Bestmann-Ohira-Reagenz eingeführt und der Methylester mit KOH in Tetrahydrofuran/Wasser gespalten, um das Endprodukt in einer Menge von etwa 100 mg zu erhalten. Die MS-Analyse ergab eine Reinheit von etwa 87 %. Die Hauptverunreinigungen sind jeweils 4–5 % 13C10-17:0;Y und 13C12-19:0;Y. Diese Verunreinigungen, die wahrscheinlich auf Doppelbindungswanderungen in der anfänglichen Metathesereaktion zurückzuführen sind, stören die Analyse nicht, da die daraus resultierenden MS-Peaks leicht von denen zu unterscheiden sind, die 13C9-16:0;Y enthalten.

Interne Standards waren diejenigen, die in den vorherigen Studien12,31 verwendet wurden, mit zusätzlichen Standards zur Überwachung von TG;Y3, PA;Y2, PC;Y2 und PE;Y2. Zu jeder Probe wurde eine Mischung mit den internen Standards hinzugefügt (Zusammensetzung und Mengen siehe Ergänzungstabelle 3). Die internen Standards für jede Lipidklasse werden in unterschiedlichen Mengen bereitgestellt, um den unterschiedlichen Häufigkeiten der jeweiligen Klassen Rechnung zu tragen. Ziel ist es, Standardintensitäten zu haben, die im typischen Bereich der Probenintensitäten für die gleiche Lipidklasse liegen.

3T3-L1-Preadipozyten (ATCC CL-173) wurden in Wachstumsmedium (DMEM 4,5 g l-1 Glucose, 10 % FCS plus Penicillin/Streptomycin) kultiviert, in Platten mit 48 Vertiefungen ausgesät und nach 24 Stunden durch Zugabe von 1 µM zur Differenzierung induziert Rosiglitazon, 10 µg ml-1 Insulin, 10 µM Dexamethason und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin für 3 Tage, gefolgt von einer Kultur in Wachstumsmedium nur mit Insulin für 2–4 Tage, mit Medienwechsel jeden zweiten Tag. Die Differenzierung wurde regelmäßig anhand des Auftretens sichtbarer Lipidtröpfchen im Phasenkontrastmikroskop überwacht.

Die Mäuse wurden in der Tierhaltung des Bonn Life and Medical Sciences Institute gehalten und gezüchtet. Die Mäuse hatten freien Zugang zu Standardfutter und Wasser für Nagetiere. Die Tiere wurden in einem 12:12-Hell/Dunkel-Zyklus bei 23 ± 1 °C gehalten. Alle Tierstudien wurden gemäß den deutschen Tierschutzgesetzen durchgeführt. Tierversuche wurden vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, Deutschland, 81-02.04.2021.A166 genehmigt. Primäre Adipozyten wurden aus 8–12 Wochen alten C57BL/6-Mäusen isoliert. Präpariertes weißes Leistenfettgewebe und braunes interskapulares Fettgewebe von 2–3 verschiedenen Mäusen wurden in DMEM (Invitrogen), das 0,5 % BSA und Kollagenase NB46 enthielt, bei 37 °C verdaut und dann 10 Minuten lang bei 1.000 U/min zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde resuspendiert und unter Verwendung eines 100-μm-Zellsiebs filtriert. Die filtrierte Lösung wurde in einem T175-Kulturkolben in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % Amphotericin B (weißes Adipozyten-Wachstumsmedium (WA)), ausgesät und bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit WA-Wachstumsmedium bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt, bis die Zellen Konfluenz erreichten, und die Zellen wurden anschließend kryokonserviert.

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 48 Vertiefungen in Wachstumsmedium ausplattiert. Die Zellen wurden im Wachstumsmedium bis zur Konfluenz gezüchtet. Nach der Konfluenz wurden die Präadipozyten innerhalb von 48 Stunden (Tag 0 bis Tag +2) induziert, indem das Medium gegen WA-Induktionsmedium (DMEM mit 5 % FBS, 1 % P/S, 1 nM T3, 0,172 µM Insulin, 50 mg ml) ausgetauscht wurde 1 l-Ascorbat, 1 mM d-Biotin, 17 mM Pantothenat, 1 µM Rosiglitazon, 0,25 µM Dexamethason und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxantin). Vom Tag +2 bis zum Tag +12 wurden die Zellen in WA-Erhaltungsmedium (DMEM mit 5 % FBS, 1 % P/S, 1 nM T3, 0,172 µM Insulin, 50 mg ml-1 l-Ascorbat, 1 mM d-Ascorbat) gehalten. Biotin, 17 mM Pantothenat), Auffrischung jeden zweiten Tag. Die Zellen wurden am Tag +12 für Experimente verwendet.

Für das Kalibrierungsexperiment wurde das Kulturmedium 1 Stunde lang durch Wachstumsmedium ersetzt, das FA;Ys enthielt, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben, jeweils in einer Konzentration von 50 µM. Die Medien wurden entfernt und dann wurden die Zellen gewaschen und die Lipide zur weiteren Analyse extrahiert. Für das Pulse-Chase-Experiment wurden die Zellen 1 Stunde lang mit Wachstumsmedium markiert, das jeweils 50 µM der drei FA; Die Medien wurden entfernt, die Zellen einmal gewaschen und dann entweder zur Lipidextraktion und -analyse verarbeitet (kein Chase) oder für die Chase-Zeiten, wie angegeben, frisches Wachstumsmedium hinzugefügt. Nach dem Chase wurden die Medien entfernt und die Zellen gewaschen und zur Extraktion und Analyse verarbeitet.

Zellen auf Multiwell-Schalen wurden einmal mit warmem Medium und einmal mit eiskaltem PBS und einmal schnell mit 155 mM Ammoniumacetat gewaschen, wobei darauf geachtet wurde, die Flüssigkeit nach dem letzten Waschen so vollständig wie möglich zu entfernen. In jede Vertiefung werden 500 µl Extraktionsmischung (490 µl MeOH/CHCl3 5:1, 10 µl interne Standardmischung mit Alkin-markierten Standardlipiden und einem nichtalkinen internen Standard für TG (TG 50:1[D4])) gegeben Die oben angegebene Lösung wurde hinzugefügt und die gesamte Platte wurde 1 Minute lang in einem Ultraschallbad behandelt. Die Extrakte einschließlich der Zellreste wurden in 1,5-ml-Original-Eppendorf-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert, um das Protein zu pelletieren. Die Überstände wurden in frische Röhrchen überführt. Nach Zugabe von 400 µl CHCl3 und 600 µl 1 % AcOH in Wasser wurden die Proben 30 Sekunden lang geschüttelt und 5 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Die obere Phase wurde entfernt und die untere Phase in ein frisches Röhrchen überführt und 20 Minuten bei 45 °C im Speed-Vak getrocknet. CHCl3 (8 µl) wurde zugegeben und die Röhrchen kurz gevortext. Zu jedem Röhrchen wurden 40 µl Click-Mix hinzugefügt (hergestellt durch Mischen von 10 µl 100 mM C175-7x in 50 % MeOH (als Aliquots bei –80 °C gelagert) mit 200 µl 5 mM Cu(I)AcCN4BF4 in AcCN und 800 µl Ethanol), gefolgt von 5-minütiger Ultraschallbehandlung und 16-stündiger Inkubation bei 40 °C.

Zu den mit C175-7x geklickten Proben wurden 100 µl CHCl3 pro Probe hinzugefügt und Multiplex-Proben gepoolt. Dem Pool wurden 600 µl Wasser zugesetzt und die Pools kurz geschüttelt und 2 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Die obere Phase wurde entfernt und die untere Phase wie oben im Speedvac getrocknet. Sprühpuffer (2-Propanol/Methanol/Wasser 8:5:1 + 10 mM Ammoniumacetat) (200–1.000 µl) wurde zugegeben, die Röhrchen 5 Minuten lang beschallt und die gelösten Lipide mittels MS analysiert.

Massenspektren wurden auf einem Thermo Q-Exactive Plus-Spektrometer aufgezeichnet, das mit einer standardmäßigen HESI-Ionenquelle (Heated Electrospray Ionization) ausgestattet war, und zwar unter Verwendung einer Direktinjektion aus einer Hamilton-Spritze, die von einer Spritzenpumpe angetrieben wurde, unter der Steuerung der Tune-Instrumentensteuerungssoftware. Um Totvolumina zu minimieren, wurde der Spritzenanschluss ohne Verbindungsschläuche direkt mit der HESI-Quelle verbunden. Die Proben wurden mit einer Durchflussrate von 10 µl min−1 in Sprühpuffer mit den folgenden Parametern gesprüht: Hüllgas 6, Hilfsgas 2, Spülgas 0, Gasheizung aus, Sprühspannung positiver Modus 4,1 kV, Ionentransferkapillartemperatur 280 ° C.

MS1-Spektren wurden als segmentierte Scans mit Fenstern von m/z 100 zwischen m/z 300 und 1.400 für 1,2 Minuten aufgezeichnet, gefolgt von MS2-Spektren durch datenunabhängige Erfassung für 19 Minuten unter Verwendung von Einschlusslisten von m/z 305,373 bis 1.400,119 bei m/z. z 1,0006-Intervalle, um sich an die typischen Massendefekte von Lipiden bei den jeweiligen Massen anzupassen. Typische Scanparameter waren für MS1-Scans: automatisches Verstärkungskontrollziel 3 × 106, maximale Ionenzeit 800 ms, Auflösung 280.000, Spitzenmodusschwerpunkt; für MS2-Scans: Ziel mit automatischer Verstärkungsregelung 2 × 105, maximale Ionenzeit 700 ms, Auflösung 280.000, kein spektrales Multiplexing, dynamische erste Masse, Isolationsfenster m/z 0,4, gestufte normalisierte Kollisionsenergie 10, 35, 40, Schwerpunkt des Spektrumdatentyps . Darüber hinaus wurde ein zweiter Scan für doppelt geladene Spezies im Scanbereich von m/z 300–700 durchgeführt, mit MS2-Scans von m/z 300,8052 bis 700,0648 in Intervallen von m/z 0,5002 und einem Isolationsfenster von m/z 0,4. Dreifach geladene Spezies (TG;Y3 und PC;Y2) wurden mithilfe einer gezielten Einschlussliste gescannt, die alle theoretischen Kombinationen von FA;Y mit einem Isolationsfenster von m/z 0,3 umfasste.

Rohdateien wurden mit MSConvert in .mzml-Dateien konvertiert und mit LipidXplorer32 analysiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung markierter Lipide wurden MFQL-Dateien geschrieben, die die Spezies anhand des Vorhandenseins eines Peaks identifizieren, der den erwarteten Massen der markierten Lipidklasse in Kombination mit den charakteristischen Neutralverlusten entspricht. Einzelheiten und Beispiele finden Sie in den Zusatzinformationen und in der Referenz. 12. Eine vollständige Suche umfasste 44 MFQL-Dateien für einfach geladene Arten, 69 für doppelt geladene und 18 für dreifach geladene Arten. Für die Suche nach FA-Modifikationen in TG;Y-Arten wurde ein weiterer Satz von 20 MFQL-Dateien verwendet. Die anschließende Datenverarbeitung erfolgte mittels Standard-MS-Excel-Berechnung.

Die eigentlichen Pulse-Chase-Experimente wurden genauso durchgeführt wie oben für Alkin-markierte FAs beschrieben, mit der Ausnahme, dass mit schweren Isotopen markierte FAs anstelle der FA;Ys verwendet wurden. Lipidextrakte wurden direkt mit MS1/MS2 ohne Klickreaktion und ohne Multiplexing analysiert. Für alle isotopenmarkierten TGs wurden mfql-Suchalgorithmen geschrieben, die die TGs anhand einer Kombination aus der unfragmentierten Masse der Ammoniumaddukte in MS1 ​​und den kombinierten neutralen Verlusten der isotopenmarkierten FAs plus Ammoniak in MS2 identifizieren. Diese MS2-Peaks wurden auch zur Quantifizierung relativ zum entsprechenden MS2-Fragment des internen Standards TG 50:1[D4] verwendet. Für die FA-Kombination 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] umfasste die Suche einfach und doppelt markierte Spezies mit 40–56 C-Atomen und für FA 16:0[13C16 ]/18:2[13C18]/19:1[D8], Spezies mit 48–57 C-Atomen. Dreifach markierte Arten wurden mithilfe einzelner gezielter Suchdateien identifiziert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Primäre MS-Daten-.raw-Dateien und die LipidXplorer-Import-.sc-Dateien sowie Excel-Berechnungsblätter sind ab dem Veröffentlichungsdatum des Artikels in einem öffentlich zugänglichen Archiv verfügbar: https://doi.org/10.22000/925. Die kommentierte LipidXplorer-Ausgabedatei, die alle primären Identifikationen, Rohintensitäten und pmol-Berechnungen des zeitaufgelösten Experiments enthält, das zu den Abbildungen führt. 3, 4a–f und 6a,c,e werden als Zusatzdaten 1 übermittelt.

LipidXplorer .mfql-Suchdateien, die die in dieser Veröffentlichung verwendeten Suchalgorithmen enthalten, sind ab dem Veröffentlichungsdatum des Artikels in einem öffentlich zugänglichen Archiv verfügbar: https://doi.org/10.22000/925.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert – Projekt-IDs: SFB 1454 Projektnummer 432325352, TH 780/4-1 Multiparallele Lipidverfolgung, TH 780/5-1 SPP 2306 Ferroptose zu CT; KU 2374/3-1 bis LK; und durch die Exzellenzstrategie Deutschlands – EXC2151 – Fördernr. 390873048 an CT

LIMES Life and Medical Sciences Institute, Universität Bonn, Bonn, Deutschland

Klaus Wunderling, Jelena Zurkovic, Fabian Zink, Lars Kuerschner & Christoph Thiele

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KW, JZ und FZ konzipierten und führten Experimente durch und analysierten Daten. LK entwarf Abbildungen und trug zur Manuskriptorganisation und zum Verfassen von Texten bei. CT konzipierte das Projekt, führte die chemische Synthese durch, schrieb den MFQL-Code, analysierte Daten, entwarf Abbildungen und schrieb den Text.

Korrespondenz mit Christoph Thiele.

Die Universität Bonn (Inhaber) und CT (Erfinder) haben ein Patent angemeldet (EP3587382, US-Patentanmeldung 17/254,922), das große Teile der Alkin-Lipid-MS-Nachverfolgungstechnologie abdeckt, die den methodischen Kern dieser Veröffentlichung bildet.

Nature Metabolism dankt Guanghou Shui, Douglas Mashek und Zheng Ouyang für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin für Handhabung: Isabella Samuelson, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Das Beispiel ist ein TG 50:2;Y1 mit FA 13C9-16:0;Y aus einer Multiplex-Probe. Nach der Klickreaktion einzelner Proben mit einem der verwandten C175-7x-Reagenzien (Thiele et al., 2019) wurden die gepoolten Proben mittels MS2 des Vorläuferpeaks bei m/z 1010,92 analysiert. Dieser gemeinsame Vorläufer unterliegt einer Fragmentierung durch Neutralitätsverlust der vier isotopischen Trialkylamine, um die Peakreihe bei m/z 937,83 zu ergeben. Zusätzlicher neutraler Verlust von Fettsäuren durch Eliminierung führt zu zwei Peakreihen bei m/z 683,61 und 655,58. Der Unterschied zur Serie bei 937,83 identifiziert die beiden unmarkierten FAs im TG-Molekül. Wenn das untersuchte TG-Molekül zwei identische unmarkierte FAs enthält, ist in diesem Massenbereich nur eine Peakserie zu sehen (siehe Abb. 5b, c als Beispiel). Der Einschub zeigt die typische Multiplex-Peakstruktur, die durch die Trialkylaminverluste von 73, 75, 76 und 77 Da entsteht und eine klare Zuordnung zu den einzelnen Proben im Multiplex-Pool ermöglicht. Die Peakreihe bei m/z 363,34 ist das Signal des klickreagierten FA;Y nach dem Neutralverlust von 73,09, das als freies FA aus dem TG-Molekül freigesetzt wurde. Diese Peakreihe enthält Informationen darüber, ob der ursprüngliche Input FA;Y in unveränderter Form für die TG-Synthese verwendet wurde oder einer vorherigen Modifikation, beispielsweise durch Verlängerung, Entsättigung oder teilweisen Abbau, unterzogen wurde.

Kreise symbolisieren die Vertiefungen der 24-Well-Platte, die differenzierte 3T3-L1-Adipozyten enthalten. Die Nummern 16.11.18 beziehen sich auf die obige Eingabe FA;Y, die 2 Stunden lang bei 50 µM verwendet wurde. Nach der Inkubation wurden die Medien entfernt, die Zellen gewaschen und die Lipide in Gegenwart interner Standards extrahiert. Extrahierte Lipide wurden mit den rechts angegebenen C175-7x-Reportermolekülen durch Klickreaktion umgesetzt. Nach der Reaktion wurden die Proben gepoolt, sodass ein Pool die vier Multiplex-Replikate mit identischem Input, aber unterschiedlichen Click-Reportern enthielt, die dann mit MS1 und MS2 analysiert wurden, gefolgt von der Datenverarbeitung mit der Software LipidXplorer (Herzog et al., 2011).

Das Diagramm zeigt alle markierten TG;Y1-Spezies, die FA 11:0;Y oder FA 18:2;Y von 35–58 Kohlenstoffatomen (#C) in den FA-Ketten enthalten, mit pmol (a) oder relativen (b) Farbmengen. codiert. Jede Zeile repräsentiert eine Art. Im ersten Schritt wurde für jede Art analysiert, ob sie das erwartete typische Markierungsmuster für FA 11:0;Y (zum Beispiel 1 →) oder FA 18:2;Y (2 →) oder ein gemischtes Muster (3 →) aufweist. Im zweiten Schritt wurden die Arten dem jeweiligen Eingabe-FA;Y zugeordnet oder nicht zugeordnet (c). Die pmol-Menge dieser Zuweisungen aus den dreifach markierten Proben ist unten rechts zusammengefasst, was darauf hinweist, dass etwa 95 % des markierten Materials zugeordnet wurden. Beachten Sie, dass entgegen den ursprünglichen Erwartungen zahlreiche Arten mit geraden Nummern FA 11:0;Y und zahlreiche Arten mit ungeraden Nummern FA 18:2;Y zugeordnet wurden. Der Grund dafür ist die relativ hohe Häufigkeit endogener ungeradzahliger FAs, meist 15:0, 15:1, 17:0 und 17:1, in 3T3-L1-Adipozyten (Crown et al., 2015). Die Zahlen werden nach der Farbintensität (Min.-Max. pro Datenblock) kodiert, abgeleitet aus Durchschnittswerten, n = 4.

Pikomol- (links) und relative (rechts) Mengen von 100 doppelt markierten TG;Y2 werden angezeigt, wobei jeder Block AF eine Kombination von FA;Y in den Artensuchalgorithmen darstellt und jede Spalte eine Kombination von Eingabe-FA;Y darstellt, wie unter angegeben die Spitze. Jede Zeile steht für eine definierte TG;Y2-Art. Die Zahlen werden nach der Farbintensität (Min.-Max. pro Datenblock) kodiert, abgeleitet aus Durchschnittswerten, n = 4.

Bei den vier Spektren handelt es sich um neutrale Verlustspektren mit m/z 73,1, die die mit C175-73 markierten neutralen Lipide für Puls- und Chase-Zeiten zeigen, wie in den Tafeln angegeben. Im oberen Bereich sind die Spektrenbereiche, die Peaks für TG;Y1, TG;Y2 und TG;Y3 enthalten, mit schwarzen Balken gekennzeichnet. Bitte beachten Sie den allmählichen Signalabfall von TG;Y3 und TG;Y2 und den parallelen Anstieg von TG;Y1. Innerhalb des TG;Y1 ist der selektive Verlust von Arten, die FA 11:0;Y enthalten, deutlich zu erkennen.

3T3-L1-Zellen wurden 1 Stunde lang mit Alkin-FA (11:0;Y, 16:0;Y, 18:2;Y, jeweils bei 50 µM) markiert und Lipidextrakte wurden mit C175-7x-Reagenzien angeklickt. MS2-Spektren wurden aufgezeichnet und mit der Ionenkartenfunktion der Themo Xcalibur-Software wurden Fragmentierungsspektren rekonstruiert. Panel a ist ein MS2-Spektrum des Neutralverlusts von 0 Da. In diesen Experimenten erfolgt die Fragmentierung bei drei verschiedenen Energien, von denen die niedrigste nicht zur Fragmentierung führt. Daher enthalten alle MS2-Spektren einen starken Peak des unfragmentierten Vorläuferions, den NL 0-Peak. Wichtige endogene, nicht markierte Arten sind blau markiert, Alkin-markierte Arten rot. Tatsächlich handelt es sich bei Panel a um ein gesamtes MS1-Spektrum. Panel b ist das neutrale Verlustspektrum bei m/z 73,1, das die Alkin-markierten neutralen Lipide zeigt, die an C175-73 angeklickt sind. Panel c zeigt das Vorläuferionenspektrum für das Fragment m/z 284,23, das [FA 11:0;Y + (C175-73) – NL 73,1] ist, spezifisch für TG;Y1, das FA 11:0;Y enthält.

3T3-L1-Zellen wurden 1 Stunde lang mit mit schwerem Isotop markiertem FA (11:0, 16:0, 18:2, jeweils bei 50 µM) markiert und die Lipide extrahiert. Spektren wurden aufgezeichnet und mit der Ionenkartenfunktion der Themo Xcalibur-Software wurden Fragmentierungsspektren rekonstruiert. Panel a ist das MS2-Spektrum des Neutralverlusts von 0 Da, äquivalent zu einem gesamten MS1-Spektrum. Panel b zeigt das neutrale Verlustspektrum für das Fragment m/z 206,2, das FA 11:0[D3] + NH3 ist, spezifisch für TG, das FA 11:0[D3] enthält. Kommentar: Es ist offensichtlich, dass die Isotopenmarkierungsdaten in Extended Data Abb. 7 nicht die Qualität der Klickmarkierung in der entsprechenden Extended Data Abb. 6 erreichen. Die markierten Peaks in der Isotopenmarkierung neigen dazu, im Hintergrund zu verschwinden Die Intensität des NL-Spektrums in Panel b beträgt nur 12 % der in den entsprechenden Extended Data Abb. 6c, obwohl es sich tatsächlich um eine Multiplex-Probe handelt, die viermal die gleichen Informationen enthält (zusätzliche Signale bei m/z NL 75,1, 76,1 und 77,1). Darüber hinaus sind die Daten in Extended Data Abb. 7b komplexer als die in Extended Data Abb. 6c, da sie nicht nur die einfach markierten Arten, sondern auch alle Kombinationen von FA 11:0[D3] mit sich selbst und dem anderen enthalten markierte Fettsäuren. Im Gegensatz dazu ist Extended Data Abb. 6c ein sauberes Spektrum von TG;Y1 mit FA 11:0;Y, da doppelt und dreifach markierte Spezies in unterschiedlichen Bereichen des Spektrums liegen und unterschiedliche Fragmentierungspräferenzen zeigen.

Rohe MS2-Spektren von Proben des Pulse-Chase-Experiments wurden nach dem Fragment m/z 398,28, Toleranz 0,01 Da, durchsucht, das charakteristisch für das Vorhandensein von FA 20:4;Y in TG;Y1 ist. Die Tafeln zeigen die resultierenden Vorläuferionenspektren; alle werden im gleichen Maßstab für maximale Intensität dargestellt. Hauptarten sind: TG 52:6;Y bei m/z 1021,8, TG 52:5;Y bei m/z 1023,8, TG 54:6;Y bei m/z 1049,8, TG 54:5;Y m/z 1051,8 .

Rohe MS2-Spektren von Proben des Pulse-Chase-Experiments wurden nach dem Fragment m/z 374,27, Toleranz 0,01 Da, durchsucht, das charakteristisch für das Vorhandensein von FA 18:2;Y in TG;Y1 ist. Die Tafeln zeigen die resultierenden Vorläuferionenspektren; alle werden im gleichen Maßstab für maximale Intensität dargestellt. Hauptarten sind: TG 50:4;Y bei m/z 997,8, TG 50:3;Y bei m/z 999,8, TG 50:2;Y bei m/z 1001,8, TG 52:4;Y bei m/z 1025,8, TG 52:3;Y bei m/z 1027,8.

Differenzierte 3T3-L1-Adipozyten wurden mit FA-Kombinationen wie angegeben für 1 Stunde markiert, gefolgt von Chase-Perioden wie angegeben. Die Zellen wurden gewaschen und Lipide extrahiert, mit den C175-7x-Reportern eine Klickreaktion durchgeführt und mittels Multiplex-MS1/MS2 analysiert. a: Die Häufigkeit markierter Spezies mit 2–5 Doppelbindungen (# db) und 34–38 C-Atomen (# C) in den FA-Ketten wurde berechnet und als Prozentsatz der Gesamtzahl der 18:2;Y-markierten Lipide ausgedrückt der jeweiligen Phospholipidklasse. Die Zahlen werden durch die Intensität der Farbe kodiert, abgeleitet aus Durchschnittswerten, n = 12. b,c, Relative prozentuale Verteilung des gesamten FA;Y über die markierten Klassen von TG;Yn. Die Daten sind durchschnittlich. +/- StdDev, n = 11-12. Beachten Sie, dass die Daten in Tafel b mit denen in Abb. 4d identisch sind.

Ergänzende Tabellen 1–3, Spektrum 1 und Methoden.

Verarbeitete und kommentierte massenspektrometrische Datendatei, die die Quelldaten für Abb. 3 und Teile der Abb. enthält. 4, 5 und 6.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wunderling, K., Zurkovic, J., Zink, F. et al. Der Triglyceridkreislauf ermöglicht die Modifikation gespeicherter Fettsäuren. Nat Metab 5, 699–709 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

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Eingegangen: 13. April 2022

Angenommen: 27. Februar 2023

Veröffentlicht: 3. April 2023

Ausgabedatum: April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

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Naturstoffwechsel (2023)