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Oct 20, 2023

TRPV3

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 88 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Vanilloid 3 mit transientem Rezeptorpotential (TRPV3) gehört zur TRP-Ionenkanal-Superfamilie und fungiert als nichtselektiver Kationenkanal, der für Kalzium hochpermeabel ist. Dieser Kanal wird stark in den Keratinozyten der Haut exprimiert und ist an der Wärmeempfindung, dem Juckreiz, der Wundheilung und der Sekretion mehrerer Zytokine beteiligt. Frühere Studien zeigten, dass Anoctamin1 (ANO1), ein Calcium-aktivierter Chloridkanal, durch Calciumeinstrom über TRPV1, TRPV4 oder TRPA1 aktiviert wurde und dass diese Kanalinteraktionen für TRP-Kanal-vermittelte physiologische Funktionen wichtig sind. Wir fanden heraus, dass ANO1 von normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten (NHEKs) exprimiert wurde. Wir beobachteten, dass ANO1 Ströme bei der TRPV3-Aktivierung von NHEKs und Hautkeratinozyten von Mäusen vermittelte. Mithilfe eines In-vitro-Wundheilungstests beobachteten wir, dass entweder ein TRPV3-Blocker, ein ANO1-Blocker oder ein Medium mit niedrigem Chloridgehalt die Zellmigration und -proliferation durch p38-Phosphorylierung hemmte, was zum Stillstand des Zellzyklus führte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Chlorideinstrom durch ANO1-Aktivität die Wundheilung durch Keratinozyten fördert.

TRP-Kanäle (Transient Receptor Potential) bestehen bei Säugetieren aus sechs verwandten Proteinfamilien. Zu diesen Familien gehören TRPA (Ankyrin), TRPC (kanonisch), TRPM (Melastatin), TRPML (Mucolipin), TRPP (Polycystin) und TRPV (Vanilloid). Bei den meisten handelt es sich um nichtselektive Kationenkanäle, die für Kalzium hochpermeabel sind1. In Epithelzellen des Plexus choroideus aktiviert der Kalziumeinstrom durch TRPV4 einen kalziumaktivierten Chloridkanal (CaCC), der als Anoctamin1 (ANO1 oder TMEM16A) bezeichnet wird und vermutlich zur Sekretion von Liquor cerebrospinalis führt2. Es wurde auch berichtet, dass andere Epithelzellen sowohl TRPV4- als auch ANO1-Kanäle besitzen. Beispielsweise werden diese Ionenkanäle sowohl von Azinuszellen der Speicheldrüse als auch der Tränendrüse gemeinsam exprimiert, und die Speichel- und Tränensekretion könnte durch funktionelle Interaktion zwischen TRPV4 und ANO13 beschleunigt werden. Somit haben TRP-Kanal/ANO1-Komplexe unterschiedliche Funktionen, obwohl jeder TRP-Kanal unabhängig arbeitet. Daher kann man Kanalfunktionen nicht untersuchen, ohne ihre Wechselwirkungen zu untersuchen, wenn ein TRP-Kanal und ANO1 von denselben Zellen gemeinsam exprimiert werden.

TRPV3 ist ein wärmeempfindlicher TRP-Kanal und die Kalziumdurchlässigkeit ist etwa zehnmal höher als die von Natrium4. Obwohl TRPV3 Berichten zufolge im gesamten Körper exprimiert wird, ist seine physiologische Bedeutung nicht genau verstanden. Frühere Studien zeigten, dass TRPV3 zu Juckreiz, Wärmegefühl und Wundheilung in Keratinozyten beiträgt5,6,7,8,9. Darüber hinaus beschleunigt die TRPV3-Aktivierung, die durch Zellsignale stromabwärts des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors verstärkt wird, die wärmeabhängige Wundheilung in oralen Epidermiszellen5. In Hautkeratinozyten zeigte eine frühere Studie, dass TRPV3 über EGFR-abhängige Signalwege zur Zellproliferation beiträgt5,6,7,8,9.

Die Wundheilung der Haut hängt von der Zellmigration und Zellproliferation ab. Obwohl einige Wachstumsfaktoren und Interleukine an der Wundheilung beteiligt sind9,10, könnten auch Ionenkanäle auf den Plasmamembranen von Keratinozyten wichtig sein. Beispielsweise handelt es sich bei Ano1 Berichten zufolge um ein mit Karzinomen in Zusammenhang stehendes Gen11,12, und eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass ANO1 an der Proliferation von Prostataepithelzellen bei benigner Prostatahyperplasie13 sowie an HaCaT-Zellen, einer speziellen Zelllinie von Keratinozyten14, beteiligt war. Darüber hinaus reduzierte die ANO1-Hemmung die Zellmigration in einigen Krebszellen12,15,16. Allerdings ist die physiologische Funktion von ANO1 in normalen Hautkeratinozyten nicht klar, obwohl viele Epithelzellen sie exprimieren17. Hier zeigen wir, dass ANO1 in normalen menschlichen Keratinozyten exprimiert wird und dass diese Kanäle an der Wundheilung beteiligt sind. Diese Studie zeigt die Bedeutung von ANO1 für die Zellmigration und -proliferation in normalen Keratinozyten.

Das Ausmaß der endogenen Genexpression von TRP-Kanälen und ANOs in NHEKs ist unklar. Um die Expressionsmuster zu klären, führten wir eine RT-PCR-Analyse kultivierter NHEKs durch (Abb. 1a und ergänzende Abb. 11). Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass die Proteine ​​TRPV1, TRPV3, TRPV4 und TRPV6 in Keratinozyten exprimiert wurden18. Hier beobachteten wir mRNAs von TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV6, ANO1, ANO4, ANO9 und ANO10 (Abb. 1a und ergänzende Abb. 11). Obwohl ANO2 auch als CaCC fungiert, wurde in NHEKs keine diskrete Bande mit dem vorhergesagten Molekulargewicht nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde die ANO1-Proteinexpression durch Western Blot beobachtet (Abb. 1b). Darüber hinaus zeigten die Ströme bei Verwendung einer hohen intrazellulären Calciumkonzentration (500 nM freies Calcium) mit NHEK-Zellen eine langsame Aktivierungskinetik während Schrittimpulsen und eine langsame Deaktivierungskinetik bei der Rückkehr zum Haltepotential sowie eine Gleichrichtung nach außen, charakteristische Eigenschaften von ANO119 (Suppl . Abb. 1). Diese Ergebnisse deuten auf eine signifikante Expression von ANO1 in NHEKs hin. Zusätzlich führten wir Calcium-Imaging-Experimente mit Fura-2 durch, um die funktionelle Expression von TRP-Kanälen zu untersuchen. Während Kampfer (10 mM, ein TRPV3-Agonist) und GSK1016790A (300 nM, ein TRPV4-Agonist) offensichtlich einen intrazellulären Kalziumanstieg in allen Zellen induzierten, induzierten Capsaicin (300 nM bis 3 µM, ein TRPV1-Agonist) und Menthol (100 µM, ein TRPM8-Agonist). ), Allylisothiocyanat (AITC, 100 µM oder 1 mM, ein TRPA1-Agonist), Probenecid (100 µM, ein TRPV2-Agonist) oder 1-Oleoyl-Acetyl-sn-Glycerin (OAG, 90 µM, ein TRPC6-Agonist) produzierten nicht klare Antworten (Abb. 1c und ergänzende Abb. 2).

eine RT-PCR von TRPs und ANOs in NHEKs. Unbeschnittene Gelbilder sind in Suppl dargestellt. Abb. 11. b Western Blot von ANO1 in NHEKs. Die vorhergesagte Bandengröße von ANO1 beträgt 114 kDa. c, d Calcium-Bildgebung in NHEKs. Cam Camphor, ein TRPV3-Agonist; GSK GSK1016790A, ein TRPV4-Agonist; Ca2+ (−) Calciumfreie Badlösung. e Vergleich der Strom-Spannungs-Beziehungen. Die rote Linie zeigt die Strom-Spannungs-Beziehung des Basalstroms in NHEKs unter Verwendung einer Standardbad- und Pipettenlösung. Die blaue Linie zeigt die Strom-Spannungs-Beziehung in TRPV6-exprimierenden HEK293T-Zellen unter Verwendung einer Standardbadlösung und einer NMDG-Cl-Pipettenlösung. Das Haltepotential betrug –60 mV und alle 5 s wurden Rampenimpulse von –100 bis +100 mV für eine Dauer von 300 ms angelegt.

Wir führten auch Calcium-Imaging-Experimente mit einem kalziumfreien extrazellulären Medium durch, da angenommen wird, dass die intrazellulären Kalziumkonzentrationen bei der Entfernung von extrazellulärem Kalzium in Zellen, die TRPV6 exprimieren, das konstitutiv aktiv sein kann, verringert werden. Die intrazellulären Calciumkonzentrationen unterschieden sich jedoch nicht in Gegenwart oder Abwesenheit von extrazellulärem Calcium (Abb. 1d). Darüber hinaus wurde in NHEKs kein typischer TRPV6-vermittelter Strom mit Gleichrichtung nach innen beobachtet (Abb. 1e). Basierend auf diesen Erkenntnissen kamen wir zu dem Schluss, dass TPRV6 in NHEKs nicht funktionell exprimiert wird. Diese Ergebnisse zeigten, dass in NHEKs die aktivsten TRP-Kanäle TRPV3 und TRPV4 waren. Allerdings wurde in RT-PCR-Experimenten die Expression anderer TRP-Kanäle vermutet. Somit könnte ANO1 durch Calciumeinstrom über TRPV3 oder TRPV4 in Zellen aktiviert werden, die diese Ionenkanäle koexprimieren. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, uns in dieser Studie auf die Interaktion zwischen TRPV3 und ANO1 zu konzentrieren, da ihre Interaktion in der Literatur keine Beachtung gefunden hatte.

Wir führten Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente mit HEK293T-Zellen durch, die TRPV3 und ANO1 heterolog exprimierten, um deren funktionelle Interaktion zu untersuchen. Zur Identifizierung von Chloridströmen durch ANO1 wurden NMDG-Cl-Bad- und Pipettenlösungen verwendet, da bekannt ist, dass NMDG die Poren von Kationenkanälen nicht durchdringt. Wir verwendeten Kampfer als TRPV3-Agonisten, da ein früherer Bericht zeigte, dass andere TRPV3-Agonisten, 2-APB und Carvacrol, ANO1-Ströme hemmten20. Unter diesen Bedingungen wurden Chloridströme deutlich in Zellen beobachtet, die sowohl menschliches TRPV3 (hTRPV3) als auch menschliches ANO1 (hANO1) exprimierten, jedoch nicht in Zellen, die hTRPV3 oder hANO1 allein exprimierten (Abb. 2a, b). Die Ströme wurden als Chloridströme interpretiert, die durch hANO1 fließen und durch Kalzium, das über hTRPV3 in die Zellen gelangt, aktiviert wurden. Die Ströme wurden sogar mit intrazellulärer 1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (BAPTA) (5 mM) beobachtet, einem relativ schnellen Calciumchelatbildner. Da Kalzium in Gegenwart hoher BAPTA-Konzentrationen schnell chelatisiert wird, kommt es zu einem Anstieg der Kalziumkonzentrationen nur in der Nähe von Kalziumkanälen21. Somit könnte eine TRPV3-ANO1-Wechselwirkung in einer lokalen Calcium-Nanodomäne auftreten. Da frühere Studien nahelegten, dass sowohl TRPV1 als auch TRPV4 physikalisch mit ANO12,3,22 interagierten, führten wir Immunpräzipitations- und Western-Blot-Experimente unter Verwendung von Anti-ANO1- und Anti-TRPV3-Antikörpern mit Extrakten aus HEK293T-Zellen durch (Abb. 2c und ergänzende Abb. 11). . TRPV3- und ANO1-Proteine ​​wurden in Zellen, die beide Proteine ​​exprimierten, gemeinsam immunpräzipitiert, während es in den Extrakten von Zellen, die mit hANO1-cDNA, hTRPV3-cDNA oder pcDNA3.1-Plasmid allein transfiziert waren, keine TRPV3-Banden gab, was auf die physikalische Wechselwirkung von hTRPV3 mit hANO1 hinweist. Diese Ergebnisse legen eine funktionelle und physikalische Interaktion zwischen hTRPV3 und hANO1 im heterologen Expressionssystem nahe.

a Eine repräsentative Spur der durch Kampfer induzierten Ströme in HEK293T-Zellen, die sowohl hTRPV3 als auch hANO1, hANO1 allein oder hTRPV3 allein exprimieren. Alle Daten wurden mit einem NMDG-Cl-Bad und Pipettenlösungen gesammelt. Das freie Calcium in der Pipettenlösung betrug 100 nM. Das Haltepotential betrug –60 mV und alle 5 s wurden Rampenimpulse von –100 bis +100 mV für eine Dauer von 300 ms angelegt. b Vergleich der Spitzenströme von (A) bei −60 mV (Mittelwert ± SEM, N = 6). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test bestimmt. c Immunpräzipitation von ANO1 oder TRPV3 und Western Blot von TRPV3 in HEK293T-Zellen, transfiziert mit TRPV3- und ANO1-cDNAs, Ano1 allein, TRPV4 allein oder pcDNA3.1. Unbeschnittene Gelbilder sind in Suppl dargestellt. Abb. 11.

Bei allen NHEKs wurde bei der Anwendung von Kampfer ein Anstieg des intrazellulären Kalziums beobachtet (Abb. 1c). Daher führten wir Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in NHEKs durch. Kampferinduzierte Chloridströme wurden in 148 mM chloridhaltiger Badlösung beobachtet (Abb. 3a). Das Umkehrpotential der Chloridströme verschob sich zu positiven Potentialen, als die extrazelluläre Chloridkonzentration auf 4 mM geändert wurde (Abb. 3b, c). Dieses Ergebnis zeigte, dass Chlorid ein Hauptionenträger der durch Kampfer induzierten Ströme war. Darüber hinaus führten wir eine Kalziumbildgebung in der kalziumfreien Badlösung durch, um den Beitrag des intrazellulären Kalziumspeichers zum durch Kampfer verursachten intrazellulären Kalziumanstieg zu bewerten (Abb. 3d). Die Freisetzung von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum trug nicht wesentlich zum Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentrationen in NHEKs bei, da der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentrationen in der kalziumfreien Badlösung gering war. Diese Interpretation wurde in den Patch-Clamp-Experimenten bestätigt, bei denen die durch Kampfer induzierten Ströme in der extrazellulären kalziumfreien Lösung sehr gering waren (Abb. 3e). Daher hängen durch TRPV3-Agonisten induzierte Chloridströme durch ANO1 in NHEKs hauptsächlich vom Kalziumeinstrom durch TRPV3 aus extrazellulären Regionen ab. Als wir außerdem untersuchten, ob TPRV4 zu den durch Kampfer induzierten Strömen beiträgt, stellten wir fest, dass 10 mM Kampfer hTRPV4 nicht aktivierte und dass HC067047, ein selektiver Inhibitor von TRPV4, den durch 10 mM Kampfer induzierten Strom in NHEK nicht unterdrückte (Suppl. Abb. 3). Dies schloss die Möglichkeit aus, dass Kampfer TPRV4 unspezifisch aktiviert, und klärt die Beteiligung von TRPV3 weiter. Die durch Kampfer induzierten Chloridströme wurden sowohl durch Ani9, einen starken ANO1-Inhibitor (Abb. 3f), als auch durch Dyclonin, einen TRPV3-Inhibitor 23, 24 (Suppl. Abb. 4), gehemmt. Darüber hinaus zeigten die durch Kampfer induzierten Ströme eine langsame Aktivierungskinetik bei positiven Potentialen mit nach außen gerichteten Gleichrichtungseigenschaften und eine langsame Erholung nach Schrittimpulsen, Daten, die mit ANO1-Kanälen übereinstimmen18 (Suppl. Abb. 5). Diese Ergebnisse unterstützen die TRPV3-ANO1-Interaktion in NHEKs weiter.

a, b Repräsentative Spuren von Kampfer-induzierten Strömen in NHEKs unter Verwendung einer NMDG-Cl-Badlösung mit 148 mM Chlorid (a) oder einer NMDG-Aspartat-Badlösung mit 4 mM Chlorid (b). Die Pipettenlösung enthielt 140 mM NMDG-Cl und 100 nM freies Calcium. Das Haltepotential betrug –60 mV und alle 5 s wurden Rampenimpulse von –100 bis +100 mV für eine Dauer von 300 ms angelegt. c Vergleich der Strom-Spannungs-Beziehungen der Ströme an den Pfeilspitzen in (a, b). d Calcium-Bildgebung von NHEKs nach Kampferanwendung mit und ohne (Ca2+ (−)) extrazelluläres Calcium. e Vergleich der durch Kampfer induzierten Spitzenströme bei −60 mV in einer NMDG-Cl-Badlösung mit 2 mM (Ca2+ (+)) oder ohne (Ca2+ (−)) extrazellulärem Kalzium (Mittelwert ± SEM, N = 5). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test bestimmt. f Kampferinduzierter Strom mit einem ANO1-Inhibitor, Ani9, unter Verwendung einer NMDG-Cl-Badlösung mit 148 mM Chlorid.

Um die TRPV3-ANO1-Wechselwirkung weiter zu bestätigen, führten wir Patch-Clamp-Experimente mit Schwanzhaut-Keratinozyten von WT- und TRPV3-/-Mäusen durch. Wir beobachteten durch Kampfer induzierte große Chloridströme in WT-Keratinozyten, während solche Ströme in TRPV3-defizienten Keratinozyten in den NMDG/Chlorid-Pipetten- und Badlösungen nie beobachtet wurden (Abb. 4a – c). Darüber hinaus wurden die durch Kampfer induzierten Ströme durch Ani9 gehemmt (Abb. 4d). Diese Daten unterstützen eindeutig die TRPV3-ANO1-Interaktion.

a, b Repräsentative Spuren von 10 mM Kampfer-induzierten Strömen in primären Keratinozyten, die aus WT-Mäusen (a) und TRPV3-/--Mäusen (b) isoliert wurden. Alle Aufnahmen wurden mit Standard-NMDG-Cl-Bad- und Pipettenlösungen (mit 100 nM freiem Calcium in der Pipette) durchgeführt. Das Haltepotential betrug –60 mV und alle 3 s wurden Rampenimpulse von –100 bis +100 mV für eine Dauer von 300 ms angelegt. c Vergleich der Strom-Spannungs-Beziehungen. N entspricht 5 für WT (schwarz) und 4 für TRPV3−/− (grau) Keratinozyten. Fehlerbalken zeigen SEM an. d Vergleich der Dichten der durch Kampfer induzierten Ströme in WT- (schwarz) und TRPV3-/--Keratinozyten (grau) bei +60 und –60 mV (Mittelwert ± SEM). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test bestimmt. e Eine repräsentative Spur von 10 mM Kampfer-induzierten Strömen mit Ani9-Hemmung in einem WT-Keratinozyten. Eine repräsentative Spur von 10 mM Kampfer-induzierten Strömen mit Ani9-Hemmung in einem WT-Keratinozyten. Das Haltepotential betrug –60 mV und alle 3 s wurden Rampenimpulse von –100 bis +100 mV für eine Dauer von 300 ms angelegt.

Frühere Studien zeigten, dass TRPV3 durch Keratinozyten zu Juckreiz und Wärmeempfindungen sowie zur Wundheilung beiträgt5,6,7,8. Es wird stark vermutet, dass die TRPV3-Aktivierung die Wundheilung in der Mundhöhle beschleunigt5. Darüber hinaus ähneln die grundlegenden histologischen Eigenschaften der Mundhöhle denen der Haut im Vergleich zu anderen Schleimhäuten im Körper25. Darüber hinaus könnte ANO1 an der Gewebeentwicklung nach der Geburt beteiligt sein26 und es ist bekanntermaßen ein positiver Regulator der Migration und Proliferation in Krebszellen11,12,15,16. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die TRPV3-ANO1-Interaktion die Migration und/oder Proliferation von NHEKs und den Prozess der Wundheilung beeinflussen könnte.

Um die Beteiligung von ANO1 an der Wundheilung zu untersuchen, analysierten wir die Wirkung eines anderen ANO1-Blockers, T16Ainh-A01 (T16A). Die Bewertung umfasste einen Kultureinsatz zur Quantifizierung der Zellaktivität (Abb. 5). In diesen Experimenten wurden NHEKs in einem Kultureinsatz bis zu einer nahezu 100-prozentigen Konfluenz kultiviert, wobei die Zellen in Räume zwischen Zellclustern wanderten (Abb. 5a). NHEKs wanderten normalerweise etwa 12 Stunden lang nach dem Entfernen des Einsatzes in die offenen Räume, einen durch den Einsatz getrennten Bereich. Auf diese Weise füllten Migration und Ausbreitung das Gebiet innerhalb von 24 Stunden zu mehr als 80 %. Die Zellmigration und/oder -proliferation wurde durch Dyclonin, einen selektiven Inhibitor von TRPV3 (Suppl. Abb. 6), signifikant gehemmt, nicht jedoch durch HC067047, einen selektiven Inhibitor von TRPV4 (Suppl. Abb. 7). Darüber hinaus wurde die Zellmigration und/oder -proliferation in T16A (5 µM) enthaltendem Medium offensichtlich gehemmt, ohne die ANO1-Proteinspiegel zu beeinflussen (Abb. 5b, c und ergänzende Abb. 8, 11). Wichtig ist, dass die Hemmung nach dem Auswaschen von T16A verloren ging. Diese Beobachtungen legten nahe, dass der T16A-Effekt nicht auf Zelltod oder irreversiblen Zellschaden zurückzuführen war. Darüber hinaus hemmte Ani9 auch die Zellmigration und/oder -proliferation (Suppl. Abb. 9). Die Tatsache, dass die Zellmigration und/oder -proliferation sowohl durch TRPV3- als auch durch ANO1-Inhibitoren verringert wurde, weist stark darauf hin, dass die TRPV3-ANO1-Wechselwirkung an der Migration und/oder Proliferation von NHEKs beteiligt ist. Wir analysierten die Zellmigrationsgeschwindigkeit mithilfe von Zeitrafferaufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop und die Zellproliferation mithilfe eines MTT-Assays (Abb. 5d – f). Die Migrationsgeschwindigkeit wurde nach der Anwendung von T16A verringert und die Verringerung hielt während der gesamten Hemmung von ANO1 an (Abb. 5d). Darüber hinaus erholte sich die Migrationsgeschwindigkeit nach dem Auswaschen von T16A auf das Ausgangsniveau (Abb. 5d, e). Auch die Zellproliferation wurde durch die Anwendung von T16A reduziert (Abb. 5f). Diese Ergebnisse legen die Bedeutung von Chloridionen für die Zellmigration und -proliferation nahe. Daher führten wir einen Assay mit einem Kultureinsatz in einem Medium mit niedrigem Chloridgehalt durch (Abb. 6). Die intrazellulären Chloridkonzentrationen sollten bei Erschöpfung des extrazellulären Chlorids verringert werden28. Nach dem Entfernen der Kultureinsätze wurden die gefüllten Bereiche im chloridarmen Medium drastisch reduziert, ein Effekt, der nach dem Wechsel zurück zum Kontrollmedium verloren ging (Abb. 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Chloridfluss durch ANO1 eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und/oder -proliferation spielt.

a Schematische Darstellung des Kulturinsert-Assays. b Kulturinsert-Assay in Medium mit oder ohne 5 μM T16A. Hellfeld bei 0 Stunden und Calcein-Färbung bei 24 Stunden. Weiße gepunktete Linien bei 0 Uhr zeigen die Grenzen der Zellen an. Auswaschen zeigt den Wechsel des Mediums vom T16A-haltigen Medium zum Kontrollmedium nach 12 Stunden an. Maßstabsbalken zeigen 500 μm an. c Messungen vergrößerter Flächen (Δ-Fläche) nach 12 oder 24 Stunden im Medium mit oder ohne 5 μM T16A. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 5). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test bestimmt. d Migrationsgeschwindigkeit von NHEKs mit oder ohne 5 μM T16A im Kulturinsert-Assay. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 50). e Durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit aus (d). Jede Spalte gibt die Durchschnittsgeschwindigkeit während des angegebenen Zeitraums an. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 50). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test bestimmt. f MTT-Assay von NHEKs, die im angegebenen Medium kultiviert wurden. ABS zeigt die Absorption an. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 6). Die statistische Signifikanz wurde mit der einfaktoriellen ANOVA und anschließender Dunnett-Korrektur bestimmt.

ein Kultureinsatztest in einem Medium mit niedrigem Chloridgehalt oder Kontrollmedium. Helle Felder bei 0 h und Calcein-Färbung bei 24 h. Weiße gepunktete Linien bei 0 Uhr zeigen die Grenzen der Zellen an. Kontrolle 12 Stunden zeigt einen Wechsel des Mediums vom Medium mit niedrigem Chloridgehalt zum Kontrollmedium nach 12 Stunden an. Maßstabsbalken zeigen 500 μm an. b Messungen vergrößerter Flächen (Δ-Fläche) nach 12 oder 24 Stunden im chloridarmen Medium oder Kontrollmedium. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 6). Die statistische Signifikanz wurde mit dem Mann-Whitney-Test oder einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von einer Tukey-Korrektur bestimmt.

Obwohl die bisherigen Ergebnisse die Bedeutung von Chloridionen für die Zellmigration und/oder -proliferation nahelegen, sind die tatsächlichen Rollen von Chloridionen in Keratinozyten weitgehend unbekannt. Um diese Frage zu beantworten, haben wir versucht, die Richtung der Chloridbewegung zu bestimmen. Die Chloridpermeation durch Chloridkanäle hängt von intrazellulären Chloridkonzentrationen und Membranpotentialen ab. Obwohl die Chloridkanalfunktion die intrazellulären Chloridkonzentrationen beeinflussen könnte, sollten diese durch die Funktion mehrerer Chloridtransporter aufrechterhalten werden29. Daher untersuchten wir die Expressionsmuster von Chloridtransportern, einschließlich Na-K-Cl-Cotransportern (NKCCs) und K-Cl-Cotransportern (KCCs), mithilfe von RT-PCR. Es wurde eine mRNA-Expression der Gene vorgeschlagen, die für NKCC1, KCC1, KCC2, KCC3 und KCC4 kodieren (Abb. 7a und ergänzende Abb. 11). KCC2 ist ein neuronenspezifisches KCC, und die intrazellulären Chloridkonzentrationen werden durch den Chloridausfluss von KCC2 in Zellen im Zentralnervensystem auf einem niedrigen Niveau gehalten, und die Öffnung der chloriddurchlässigen Kanäle verursacht einen Chlorideinstrom. Daher führten wir Chlorid-Bildgebungsexperimente mit dem Chloridindikator MQAE30,31,32 durch. Die berechneten intrazellulären Chloridkonzentrationen von NHEKs waren relativ niedrig (6,8 ± 1,3 mM) (Abb. 7b, c), was mit der KCC2-Expression zumindest auf mRNA-Ebene in NHEKs übereinstimmt. Das berechnete Gleichgewichtspotential für Chloridionen (–75,7 mV) legt nahe, dass ein Chlorideinstrom durch ANO1 bei den angegebenen Ruhemembranpotentialen in NHEKs (–24 bis –40 mV) erfolgen würde33,34,35.

eine RT-PCR-Bewertung von Kationen-Chlorid-Cotransporter-Genen in NHEKs. RT bedeutet Reverse Transkription. Unbeschnittene Gelbilder sind in Suppl dargestellt. Abb. 11. b Ein repräsentatives Bild des mit Chloridionen gelöschten Fluoreszenzindikators, MQAE, in NHEKs. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. c Eine Kalibrierungskurve und berechnete intrazelluläre Chloridkonzentrationen in NHEKs. Die Kalibrierungskurve wurde mit einem Stern-Volmer-Diagramm erstellt, F0/F = 1 + Kq[Cl]. F0: Fluoreszenzintensität bei 0 mM Chlorid, F Fluoreszenzintensität bei jeder Chloridkonzentration, Kq-Extinktionskoeffizient.

Frühere Studien legten nahe, dass niedrige intrazelluläre Chloridkonzentrationen die Phosphorylierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) induzieren, obwohl die genauen Mechanismen nicht genau bekannt sind. MAPK-Kaskaden sind am Leben und Tod vieler Zellen beteiligt36,37 (Abb. 8a). Beispielsweise ist die extrazelluläre signalbezogene Kinase (ERK), die durch die MAPK-Kinase (MKK)1/2 phosphoryliert wird, an der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt. Andererseits induzieren p38 und c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die durch MKK3/4/6 bzw. MKK4/7 phosphoryliert werden, einen Stillstand des Zellzyklus und Apoptose. Daher untersuchten wir die MAPK-Phosphorylierung mithilfe einer Western-Blot-Methode (Abb. 8b, c und Suppl. Abb. 11). Ein ANO1-Inhibitor, T16A, erhöhte die Phosphorylierung von p38, nicht jedoch die von ERK oder JNK. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ANO1 am Stillstand des Zellzyklus und/oder der Apoptose beteiligt ist. Allerdings induzierte die ANO1-Hemmung im Kulturinsert-Assay keinen Zelltod, da das mit einer Calcein-AM-Färbung sichtbar gemachte Erscheinungsbild der Zellen durch die ANO1-Hemmung nicht beeinflusst wurde (Abb. 5). Darüber hinaus gab es keine Auswirkungen der T16A-Behandlung auf die Expression differenzierungsbezogener Gene, einschließlich KRT1, IVL und TGM1, sowohl unter differenzierten als auch unter undifferenzierten Bedingungen (Suppl. Abb. 10, 11). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem Fehlen von Auswirkungen der T16A-Behandlung auf die ERK-Phosphorylierung (Abb. 8b), die bekanntermaßen mit der Differenzierung zusammenhängt (Abb. 8a). Deshalb haben wir uns entschieden, uns auf den Stillstand des Zellzyklus zu konzentrieren.

a Schematische Darstellung der MAP-Kinase-Signalisierung. b Repräsentative Bilder des Western Blots für Gesamt-MAP-Kinasen und phosphorylierte MAP-Kinasen. Unbeschnittene Gelbilder sind in Suppl dargestellt. Abb. 11. c Quantitative Analyse des Western Blot für phosphorylierte/gesamte MAP-Kinasen. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 7 für pERK und pp38, N = 4 für pJNK. Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test bestimmt.

Da die MAPK-Analysen auf einen Stillstand des Zellzyklus durch ANO1-Hemmung schließen ließen, führten wir einen Zellzyklustest unter Verwendung eines Redoxfarbstoffs durch (Abb. 9). Redoxbedingungen stehen in engem Zusammenhang mit dem Zellzyklus38. Beispielsweise sind die intrazellulären Redoxbedingungen in Zellen in den G0/G1-Phasen relativ reduktiv, während sich die Redoxbedingungen beim Übergang in die G2/M-Phasen allmählich zu oxidativeren Bedingungen verschieben. In diesem Testsystem können Zellen in der G0/G1-Phase, der S-Phase und der G2/M-Phase als gelbgrün, grün bzw. dunkelblau dargestellt werden (Abb. 9a). Um die Farbvariation zu verdeutlichen, wurde jede Zelle je nach Signalpegel als rote Farbe dargestellt (Abb. 9b). Die T16A-Behandlung erhöhte die Zellpopulationen in den G0/G1-Phasen und reduzierte die Zellpopulationen in der S-Phase während des Kulturinsert-Assays (Abb. 9b, c). Dieses Ergebnis zeigte, dass das Fortschreiten des Zellzyklus von G0/G1 zur S-Phase durch ANO1-Hemmung unterdrückt wurde.

a Ein repräsentatives Bild der Redoxfarbstofffärbung für die Zellzyklusanalyse. Der Maßstabsbalken zeigt 100 μm an. b Repräsentative Bilder von Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 μM T16A im Zellkultureinsatz. Rot markierte Zellen befinden sich in der angegebenen Phase. Der Maßstabsbalken zeigt 500 μm an. c Vergleich der Prozentsätze jeder Phase. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar (N = 7). Die statistische Signifikanz wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA und anschließender Dunnett-Korrektur bestimmt.

Im Gegensatz zu früheren Studien zeigten unsere Ergebnisse, dass die funktionelle Expression von TRP-Kanälen auf TRPV3 und TRPV4 beschränkt war, obwohl in NHEKs die mRNA-Expression einer Reihe anderer TRP-Kanäle beobachtet wurde (Abb. 1 und ergänzende Abb. 2). Berichten zufolge ändert sich die Proteinexpression in Abhängigkeit von den Differenzierungsbedingungen in Keratinozyten39. Somit könnten TRP-Kanäle, deren funktionelle Expression in unseren Experimenten nicht bestätigt wurde, unter anderen spezifischen Differenzierungsbedingungen funktionsfähig sein. Insbesondere wurde berichtet, dass TRPV6 und TRPC6 an der Keratinozytendifferenzierung beteiligt sind und die TRPC6-Expression durch Differenzierungsstimuli erhöht wurde40,41. Wir haben in dieser Studie eine TRPV3-ANO1-Interaktion beobachtet und unser Labor berichtete über ähnliche Ergebnisse für TRPV4-ANO1 in Epithelzellen2,3. Allerdings könnte die Interaktion zwischen ANO1 und anderen TRP-Kanälen, deren funktionelle Expression in dieser Studie nicht bestätigt wurde, in differenzierten Zellen auftreten.

Es ist bekannt, dass TRPV4 mit ANO1 interagiert, und TRPV3 erwies sich als neuer Partnerkandidat von ANO1 in NHEKs. Patch-Clamp-Experimente zeigten eine TRPV3-ANO1-Wechselwirkung in HEK293T-Zellen und NHEKs (Abb. 2, 3 und ergänzende Abb. 11). Darüber hinaus wurde TRPV3 unter Verwendung eines Anti-ANO1-Antikörpers in HEK293T-Zellen, die sowohl TRPV3 als auch ANO1 exprimierten, co-immunpräzipitiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass TRPV3 und ANO1 einen Komplex mit einer Calcium-Nanodomäne bilden und dass ANO1 effektiv durch Calcium aktiviert wird, das über TRPV3 in die Zellen gelangt, wie es bei TRPV4 der Fall ist. Es ist bekannt, dass ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentrationen nach der Aktivierung des Calcium-Sensing-Rezeptors (CaSR) die Differenzierung in Keratinozyten induziert42. Daher könnte es zwei verschiedene Arten von Erhöhungen der intrazellulären Kalziumkonzentrationen geben: eine lokale durch TRPV3-Aktivierung, die ANO1 aktiviert, und eine globale, die durch verschiedene Mechanismen wie die CaSR-Signalisierung verursacht werden kann.

Wir haben die physiologische Funktion der TRPV3-ANO1-Interaktion untersucht. Eine frühere Studie zeigte, dass TRPV3 an der Wundheilung in Keratinozyten beteiligt ist5. Tatsächlich wird TRPV3 durch den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) nach Stimulation durch EGF, das während der Wundheilung freigesetzt wird, sensibilisiert. Darüber hinaus wird der transformierende Wachstumsfaktor Alpha (TGFα), ein EGFR-Ligand, durch TRPV3-Aktivierung aus Keratinozyten freigesetzt. Es wird angenommen, dass dieses autokrine System einen der molekularen Mechanismen für die Wundheilung über die TRPV3-Aktivität darstellt. Unsere Tests mit Kultureinsätzen zeigen, dass die Hemmung von TRPV3 oder ANO1 die Zellmigration und/oder -proliferation verringert (Abb. 5 und ergänzende Abb. 6, 9). Somit könnte die TRPV3-ANO1-Wechselwirkung ein wichtiger molekularer Mechanismus für die Wundheilung in der Haut sein, was darauf hindeutet, dass es zwei Prozesse der Wundheilung gibt, an denen TRPV3-Aktivität beteiligt ist. Ein früherer Bericht legte nahe, dass die Membranlokalisierung von ANO1 unabhängig von der Chloridkanalaktivität für die Migration von Krebszellen wichtig ist43. In diesem Experiment verringerte nur CaCCinh-A01 die Zellproliferation und induzierte den Abbau des ANO1-Proteins bei mehreren von ihnen verwendeten ANO1-Inhibitoren (einschließlich T16A). In unseren Experimenten verringerte die T16A-Behandlung jedoch die NHEK-Proliferation ohne Auswirkungen auf die ANO1-Proteinspiegel (Abb. 5 und ergänzende Abb. 8, 11). Darüber hinaus untermauert unsere Feststellung, dass Bedingungen mit niedrigem Chloridgehalt auch die Zellmigration und/oder -proliferation in Kulturinsert-Assays hemmen (Abb. 6), die Bedeutung der Chloridbewegung durch ANO1 für die Wundheilung.

Ein anderer Bericht ergab, dass ANO1 eine Hyperproliferation von HaCaT-Zellen, einer speziellen Zelllinie von Keratinozyten, induziert14, ein Ergebnis, das mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Die Autoren zeigten jedoch, dass die Hemmung von ANO1 die Phosphorylierung von ERK, einem der MAPKs, verringerte, und diskutierten nicht die Beteiligung von p38. In unseren Experimenten hatte die ANO1-Hemmung keinen Einfluss auf die ERK-Phosphorylierung, während die p38-Phosphorylierung induziert wurde. Dieser Unterschied könnte darauf zurückzuführen sein, dass es sich bei HaCaT um eine Zelllinie mit einem besonderen Kalziumbedarf handelt, der sich von normalen Keratinozyten unterscheidet.

Die Richtung der Chloridbewegung wird streng durch das Gleichgewicht der intrazellulären Chloridkonzentrationen und Membranpotentiale reguliert. Beispielsweise werden die intrazellulären Chloridkonzentrationen durch die KCC2-Aktivität in reifen Neuronen des Zentralnervensystems auf einem niedrigen Niveau gehalten29, was bei Chlorideinstrom zu einer Hyperpolarisierung führt. Wir haben gezeigt, dass die basalen intrazellulären Chloridkonzentrationen in Keratinozyten niedrig waren, was mit der Expression von KCC2 übereinstimmt (Abb. 7 und ergänzende Abb. 11). Da die Ruhemembranpotentiale von Hautkeratinozyten Berichten zufolge zwischen –24 und –40 mV liegen33,34,35, sollte die Öffnung von ANO1 einen Chlorideinstrom induzieren und seine Hemmung verringert wahrscheinlich die intrazellulären Chloridionen innerhalb der Keratinozyten. Obwohl allgemein angenommen wird, dass KCC2 neuronenspezifisch ist44, zeigte ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass Pankreas-β-Zellen auch KCC245 exprimierten, was darauf hindeutet, dass KCC2 möglicherweise häufiger exprimiert wird als erwartet. Da sowohl Keratinozyten als auch Neuronen ihrem Ursprung nach ektodermale Zellen sind46,47, wäre es sinnvoll, dass neuronenspezifisches KCC2 die intrazellulären Chloridkonzentrationen sowohl in Neuronen als auch in Keratinozyten steuern könnte.

In Krebszellen führt eine Abnahme der intrazellulären Chloridkonzentration zur Phosphorylierung von p38 und JNK. Diese Veränderung wiederum erhöht die p21-Expression, was zur Hemmung der Funktion des CDK2/Cyclin E-Komplexes führt, gefolgt vom Stillstand des Zellzyklus in der G1-Phase48,49. In Übereinstimmung mit früheren Berichten in Krebszellen wurde die p38-Phosphorylierung durch ANO1-Hemmung in NHEKs induziert (Abb. 8 und ergänzende Abb. 11). Es ist bekannt, dass p38 den Zellzyklus negativ reguliert36. Dieser Befund legt zusammen mit der durch die ANO1-Hemmung erreichten Verringerung der Zellproliferation (Abb. 5f) nahe, dass die ANO1-Hemmung zum Stillstand des Zellzyklus führt. Wie erwartet erhöhte die T16A-Behandlung den Anteil der Zellen innerhalb der G0/G1-Phasen und reduzierte die Zellen innerhalb der S-Phase im Kulturinsert-Assay (Abb. 9b, c). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es zwischen den G0/G1-Phasen und der S-Phase zum Stillstand des Zellzyklus kommt. Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigten, dass Zellen am G1/S-Kontrollpunkt angehalten wurden, als die intrazellulären Chloridkonzentrationen in Krebszellen reduziert wurden48,49. Diese Beobachtungen legen daher nahe, dass der Zellzyklus von Keratinozyten auch durch Änderungen der intrazellulären Chloridkonzentrationen stromabwärts der TRPV3-ANO1-Signalisierung gesteuert wird.

Unsere Studie legt nahe, dass TRPV3 den Chlorideinstrom durch ANO1 induziert. Dieser Chlorideinstrom könnte den Zellzyklus durch die Hemmung der p38-Phosphorylierung ordnungsgemäß aufrechterhalten. Somit könnte die durch T16A verursachte Abnahme der Zellproliferation (Abb. 5f) teilweise durch den Stillstand des Zellzyklus durch ANO1-Hemmung erklärt werden. Unsere Daten zeigten auch, dass die ANO1-Hemmung die Zellmigration verlangsamte (Abb. 5d, e). Obwohl die Mechanismen zur Steuerung der Migrationsgeschwindigkeit durch ANO1 unbekannt sind, zeigte ein früherer Bericht, dass Moleküle, die den Zellzyklus hemmen, wie z. B. p21, das Zytoskelett über einen ROS-vermittelten Weg neu ordnen und dadurch die Zellmigration regulieren50. Somit könnte Chlorid auch die Zellmigration durch dieselben Moleküle steuern, die den Zellzyklus hemmen. Während der genaue Mechanismus, durch den Chlorid die MAPK-Phosphorylierung reguliert, unbekannt ist, könnten intrazelluläre Chloridkonzentrationen die Phosphorylierungsniveaus direkt regulieren, wie für die Regulierung der Phosphataseaktivität berichtet51. Weitere Studien sind unbedingt erforderlich, um die Rolle von Chlorid in den Zellsignalwegen von Keratinozyten zu klären. Dennoch legt die in dieser Studie festgestellte Interaktion von TRPV3 und ANO1 nahe, dass sie die Keratinozytenproliferation und -migration während der Wundheilung positiv regulieren könnten.

Diese Studie zeigt, dass Chloridionen den Zellzyklus in Keratinozyten regulieren. Diese Daten legen neue Ansätze zur Förderung der Wundheilung nahe. Die Hyperproliferation von Keratinozyten ist die Ursache für Akne an der Follikelstelle. Die Normalisierung dieser Hyperproliferation ist eine wichtige Therapiestrategie bei Akne52. Die Bedeutung von Chloridionen in einem solchen therapeutischen Umfeld wurde jedoch nicht betont. Unsere Analyse der TRPV3-ANO1-Wechselwirkung stellt einen vielversprechenden Ausgangspunkt für zukünftige Untersuchungen der detaillierten Mechanismen dar, die den intrazellulären Chloridkonzentrationen zugrunde liegen. Somit könnte unsere Studie Aufschluss über die Bedeutung von Chloridionen für die Hauthomöostase geben.

Homozygote TRPV3-defiziente (TRPV3−/−) Mäuse wurden von Dr. Patapoutian bereitgestellt. Wildtyp- (WT) und TRPV3-/-Mäuse mit C57BL/6-Hintergrund wurden unter SPF-Bedingungen in einer kontrollierten Umgebung gehalten (12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser, 25 °C und 50–60 °C). % Feuchtigkeit). Es wurden sieben Wochen alte männliche Mäuse verwendet. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Institute of Natural Sciences genehmigt und gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health und des National Institute for Physiological Sciences durchgeführt.

Als Ano1-Inhibitor wurden T16Ainh-A01 (T16A, Calbiochem) und Ani9 (Sigma-Aldrich) verwendet. Als TRPV3-Inhibitor wurde Dyclonin (MedChemExpress) verwendet. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-ANO1-Antikörper (Abcam, ab53213, 1:5 für Western Blot), (Abcam, ab53212, 1:100 für Immunpräzipitation), Kaninchen-Anti-Phospho-ERK-Antikörper (extrazelluläre signalbezogene Kinase). (Cell Signaling Technology, #4370, 1:1000), Kaninchen-Anti-Phospho-p38-Antikörper (Cell Signaling Technology, #4511, 1:1000), Kaninchen-Anti-Phospho-JNK (c-Jun N-terminale Kinase)-Antikörper ( Cell Signaling Technology, #4668, 1:1000), Kaninchen-Anti-ERK-Antikörper (Cell Signaling Technology, #4695, 1:1000), Kaninchen-Anti-p38-Antikörper (Cell Signaling Technology, #8690, 1:1000), Kaninchen-Anti -JNK-Antikörper (Cell Signaling Technology, #9252, 1:1000), Maus-Anti-β-Actin-Antikörper (Abcam, ab6276, 1:2500), Kaninchen-Anti-TRPV3-Antikörper (Cell Signaling Technology, #3484, 1:1000 für Western Blot; 1:50 für Immunpräzipitation), Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper (Cell Signaling Technology, Nr. 7074, 1:2000) und Anti-Maus-HRP-Antikörper (Cell Signaling Technology, Nr. 7076, 1:2000).

HEK293T-Zellen (ATCC CRT-3216) wurden bei 37 °C in 5 % CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Wako) gehalten, das 10 % fötales Rinderserum (BioWest), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Life Technologies) enthielt ) und 2 mM/L Glutamin (GlutaMAX, Life Technologies). Normale menschliche epidermale Keratinozyten (NHEK, Adult, KURABO) wurden in Humedia-KG2 (KURABO) bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten. Für Experimente mit niedrigem Chloridgehalt wurde kundenspezifisches MCDB153-Medium ohne NaCl (Research Institute for Functional Peptides) verwendet. Benutzerdefiniertes MCDB153-Medium wurde durch Zugabe von 130 mM NaCl oder 130 mM Natriumaspartat und 0,1 mM O-Phosphorylethanolamin (Sigma), 0,1 mM Ethanolamin (Sigma), 0,5 μg/ml Hydrocortison (Sigma) und 5 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) verwendet , Miltenyi Biotec) und 5 μg/ml Insulin (Sigma).

Hautkeratinozyten wurden basierend auf der vorherigen Beschreibung mit geringfügigen Modifikationen isoliert53. Kurz gesagt, Mäuseschwänze wurden zur Herstellung der Keratinozyten verwendet. Die dissoziierten Schwänze wurden über Nacht bei 4 °C in 4 mg/ml DISPASE II (Wako, 383-02281) in maßgeschneidertem MCDB153-Medium (CSR) inkubiert, das 5 µg/ml Insulin (Sigma, I1882) und 0,4 µg/ml Hydrocortison (Sigma) enthielt , H0888), 10 ug/ml Transferrin (Sigma, T8158), 14,1 ug/ml Phosphorylethanolamin (Sigma, P0503), 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (Sigma, E4127), 25 ug/ml Gentamicin (Gibco, 15710064), 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 µg/ml Streptomycin und 40 µg/ml Rinderhypophysenextrakte (Kyokuto, 20200). Nach 16-stündiger Inkubation wurde die Epidermis abgelöst und mit 0,25 % Trypsin (Gibco, 15050065) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der Basalschicht nach unten inkubiert. Als nächstes wurden die Keratinozyten mechanisch mit einer Präparierzange dissoziiert und durch ein 100-um-Zellsieb filtriert. Als nächstes wurden die Zellen für Patch-Clamp-Experimente auf Deckgläser ausgesät. Alle Aufzeichnungen wurden am 3. und 4. Tag nach der Isolierung durchgeführt.

Die Gesamt-RNA wurde aus NHEKs mit Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque) oder RNeasy Micro (QIAGEN) gereinigt. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung der Reverse Transkriptase Super Script III (Invitrogen) 50 Minuten lang bei 50 ° C durchgeführt. Zur Untersuchung der mRNA-Expression von transienten Rezeptorpotentialen (TRPs), Anoctaminen (ANOs) und Kationen-Chlorid-Cotransportern (CCCs) in NHEKs wurden DNA-Fragmente mit EmeraldAmp PCR Master Mix (TAKARA) mit den in Tabelle 1 gezeigten PCR-Primern amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 2 %igen Agarosegel mit Ethidiumbromid bestätigt.

Proteine ​​wurden aus NHEKs extrahiert, die 13 Stunden lang mit 10 μM T16A oder Kontrollmedium behandelt wurden. Die Zellen wurden mit kaltem PBS gewaschen und durch Behandlung mit Lysepuffer lysiert (1 % Triton pH-Wert 7,5). Nach 30-sekündiger Zentrifugation bei 10.000 × g wurden die Überstände durch Behandlung mit SDS-Puffer, der 0,5 M Tris-HCl, 10 % Natriumdodecylsulfat, 6 % β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin, 0,01 % Bromphenolblau und 100 mM Dithiothreitol enthielt, denaturiert , bei 90 °C für 5 Min. Die Proteinproben wurden in der SDS-PAGE verwendet.

Die vorübergehende Transfektion von HEK293-Zellen wurde mit Lipofectamine Transfection Reagent (Life Technologies), PLUS Reagent (Life Technologies) und Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Life Technologies) erreicht. Plasmid-DNAs (hTRPV6/pcDNA3.1, hTRPV3/pcDNA3, hANO1/pcDNA3.1 oder pcDNA3.1) wurden mit pGreen Lantern 1 in HEK293T-Zellen transfiziert, und die transfizierten Zellen wurden für die Patch-Clamp-Aufzeichnung und Immunpräzipitation verwendet 16–30 h nach der Transfektion.

NHEKs auf Deckgläsern wurden 30 Minuten lang bei 37 °C in Humedia-KG2 mit 5 μM Fura-2-acetoxymethylester (Molecular Probes) inkubiert. Die Deckgläser wurden mit einer Standardbadlösung gewaschen, die 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES und 10 mM d-Glucose enthielt, bei pH 7,4, eingestellt mit NaOH. Eine kalziumfreie Badlösung wurde hergestellt, indem 2 mM CaCl2 aus der Standardbadlösung weggelassen und 5 mM EGTA hinzugefügt wurden. Fura-2 wurde mit Licht der Wellenlänge 340 und 380 nm angeregt und die Emission bei 510 nm mit einer CCD-Kamera, Cool Snap ES (Roper Scientific/Photometrics), bei Raumtemperatur überwacht. Die Daten wurden mit IP-Laborsoftware (Scanalytics) erfasst und mit ImageJ-Software (National Institutes of Health) analysiert. Ionomycin (5 μM, Sigma-Aldrich) wurde angewendet, um die maximale Reaktion jeder Zelle zu bestätigen. Die Badlösung mit hohem K+-Gehalt enthielt 65 mM NaCl, 80 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES und 10 mM d-Glucose bei pH 7,4, eingestellt mit NaOH.

Für Ganzzellaufzeichnungen wurden transfizierte HEK293T-Zellen, NHEKs oder isolierte Maus-Keratinozyten verwendet. Patchpipetten wurden aus Borosilikatglas (Typ 8250, King Precision Glass) mit einem Fünf-Schritte-Protokoll unter Verwendung eines P-2000 (Sutter Instrument) hergestellt. Der Pipettenwiderstand betrug 3–8 MΩ. Die Ströme wurden mit einem Axopatch 200B-Verstärker (Molecular Devices) bei 10 kHz aufgezeichnet und mit einem Tiefpassfilter bei 5 kHz gefiltert. Die Ströme wurden mit einem Digidata 1440 A oder 1550 (Axon Instruments) digitalisiert. Die Datenerfassung erfolgte mit der Software pCLAMP 10 (Axon Instruments). Vier extrazelluläre Lösungen für die Ganzzellaufzeichnung waren wie folgt: (1) eine Standardbadlösung (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES und 10 mM D-Glucose bei pH 7,4, eingestellt mit NaOH); (2) eine NMDG-Cl-Badlösung (140 mM NMDG, 140 mM HCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES und 10 mM d-Glucose bei pH 7,4, eingestellt mit HCl); (3) eine kalziumfreie NMDG-Cl-Badlösung, die durch Weglassen von 2 mM CaCl2 aus der NMDG-Cl-Badlösung und Zugabe von 5 mM EGTA hergestellt wurde, und (4) eine NMDG-Aspartat-Badlösung, die unter Verwendung von l- Asparaginsäure statt HCl. Die Pipettenlösungen waren wie folgt: (1) eine Standardpipettenlösung (140 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl2 und 10 mM HEPES bei pH 7,3, eingestellt mit KOH) oder (2) eine NMDG-Cl-Pipettenlösung ( 140 mM NMDG, 140 mM HCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2 und 10 mM HEPES bei pH 7,3, eingestellt mit HCl. Der Pipettenlösung wurde CaCl2 zugesetzt, sodass die Konzentration an freiem Calcium 100 oder 500 nM betrug. Die Konzentrationen an freiem Kalzium wurden mit dem MAXC-Programm der Stanford University berechnet.

Proteine ​​wurden nach der Transfektion aus HEK293T-Zellen extrahiert. Die Zellen wurden wie im Western Blot beschrieben lysiert. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 16.100 × g wurden die Überstände 2 Stunden lang in einem Rotator mit Protein G Mag Sepharose (GE Healthcare) inkubiert. Nach der Entfernung der Magnetkügelchen wurden die Überstände über Nacht in einem Rotator mit einem Anti-TRPV3-Antikörper oder Anti-ANO1-Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation wurde Protein G Mag Sepharose zugegeben und die Lösungen 2 Stunden lang in einem Rotator inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Magnetkügelchen mit Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) gespült. Die Proteine ​​wurden 5 Minuten lang mit SDS-Puffer bei 95 °C denaturiert. Die Proteinproben wurden mittels SDS-PAGE bewertet. Das Blotting erfolgte mit Anti-TRPV3- und Anti-Kaninchen-HRP-Antikörpern.

NHEKs wurden konfluent in Kultureinsätzen mit zwei Vertiefungen (ibidi) auf Glasbodenschalen (Matsunami) ausgesät. Die Kultureinsätze wurden nach Inkubation über Nacht entfernt und anschließend mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in Humedia-KG2, MCDB153-Medium oder MCDB153-Medium mit niedrigem Chloridgehalt kultiviert. Nach 12 oder 24 Stunden Kultivierung wurde dem Kulturmedium Calcein-AM (Dojindo) zugesetzt, um die Zellen sichtbar zu machen. Zur Datenanalyse wurde die ImageJ-Software verwendet. Für die Zeitrafferanalyse wurden die Zellen in einem Stage Top Incubator (TOKAI HIT) auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (IX83 Olympus) kultiviert und alle 10 Minuten Bilder aufgenommen.

NHEKs wurden auf 96-Well-Platten (Falcon) ausgesät. Die Zellen wurden in einem Kontrollmedium, 10, 5 oder 2,5 μM T16A-haltigem Medium, 24 oder 48 Stunden lang kultiviert. Nach der Kultur wurden MTT-Assays mit einem MTT Cell Proliferation Assay Kit (Cayman) durchgeführt. Die Absorption des Formazans wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Multiskan Spectrum, Thermo Fisher) bei 570 nm gemessen.

NHEKs wurden auf Glasbodenschalen (Matsunami) ausgesät. Die Zellen wurden mit 10 mM MQAE (Chloridionen-gelöschter Fluoreszenzindikator, Dojindo) 60 Minuten lang bei 37 °C in einem Stage-Top-Inkubator (TOKAI HIT) auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 510META, Carl Zeiss) inkubiert. MQAE wurde mit einem Zwei-Photonen-Anregungslasersystem (Mai Tai, Spectra-Physics) bei 780 nm angeregt und die Emission erfolgte bei 458–479 nm.

Die 0 mM Chlorid-Kalibrierungslösung enthielt 10 mM NaNO3, 140 mM KNO3, 0,5 mM Ca(NO3)2, 0,5 mM Mg(NO3)2, 10 mM HEPES und 5 mM d-Glucose bei pH 7,4, eingestellt mit CsOH. Die 100 mM Chlorid-Kalibrierungslösung enthielt 10 mM NaNO3, 100 mM KCl, 40 mM KNO3, 0,5 mM Ca(NO3)2, 0,5 mM Mg(NO3)2, 10 mM HEPES und 5 mM d-Glucose bei pH 7,4, eingestellt mit CsOH. Die 50 mM Chlorid-Kalibrierungslösung wurde durch Mischen von 0 und 100 mM Chlorid-Kalibrierungslösung im Verhältnis 1:1 hergestellt. Jede Kalibrierungslösung wurde durch Zugabe von Nigericin (einwertiges Kation-Ionophor), Valinomycin (Kalium-Ionophor) und Tributylzinn (Chlorid-Ionophor) verwendet, sodass die Endkonzentrationen jeweils 5, 10 und 10 μM betrugen. Alle Experimente wurden bei 37 °C durchgeführt.

NHEKs wurden auf die gleiche Weise wie beim Wundheilungstest ausgesät. Nach dem Entfernen des Kultureinsatzes nach 12 Stunden wurden die Zellen mit einem Cell-Clock Cell Cycle Assay Kit (Biocolor) gefärbt. Zur Datenanalyse wurde die ImageJ-Software verwendet. Als Schwellenfarbe wurde die Verteilung der Zellzyklusphasen definiert. G2/M-Phasenzellen (dunkelblau) wurden als Hlu 0–255, Sättigung 40–255, Helligkeit 0–90 definiert. S-Phasen-Zellen (grün) wurden als Hlu 70–255, Sättigung 40–255, Helligkeit 90–255 definiert. G0/G1-Phasenzellen (gelbgrün) wurden als Hlu 0–70, Sättigung 40–255, Helligkeit 90–255 definiert.

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Tests oder der einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu berechnen. Zur Berechnung der Signifikanz von Unterschieden zwischen mehreren Vergleichen wurde die Bonferroni-Korrektur oder der Dunnett-Test verwendet. p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in der Analyse verwendeten Daten und Materialien sind im Haupttext mit Abbildungen und ergänzenden Informationen verfügbar. Alle unbeschnittenen Gelbilder sind in Suppl verfügbar. Feigen. 11. Statistische Analysedaten waren in Supplementary Data 1 verfügbar. Weitere Daten oder Informationen, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor MT ([email protected]) erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an MT aus einem Zuschuss für wissenschaftliche Forschung des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan unterstützt (#21H02667 und #20H05768; Wissenschaftliche Forschung in innovativen Bereichen „Thermische Biologie“). .

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Yoshinori Marunaka

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YY, YT, JL und MT haben Experimente entworfen und Daten interpretiert. YY und JL führten Experimente durch und analysierten die Daten. SH und YM trugen zum Chlorid-Bildgebungsexperiment bei. Das Manuskript wurde von YY, YT und MT erstellt. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Makoto Tominaga.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Viktorie Vlachova, KeWei Wang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Janesh Kumar und Zhijuan Qiu. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yamanoi, Y., Lei, J., Takayama, Y. et al. Die TRPV3-ANO1-Interaktion reguliert die Wundheilung in Keratinozyten positiv. Commun Biol 6, 88 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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Eingegangen: 3. April 2022

Angenommen: 13. Januar 2023

Veröffentlicht: 23. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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